KR20140028013A

KR20140028013A - 개선된 특성을 갖는 Fc-함유 폴리펩티드를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20140028013A
Application number: KR1020137030761A
Authority: KR
Inventors: 동징 자
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2014-03-07
Also published as: JP2014517846A; CA2834589A1; CN103582650A; EP2714732A1; WO2012162277A1; AU2012258907A1; US9328170B2; US20140086916A1; EP2714732A4

Abstract

본 발명은 Fc 영역의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드의 생산을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

개선된 특성을 갖는 Fc-함유 폴리펩티드를 제조하는 방법 {METHOD FOR PREPARING Fc-CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING IMPROVED PROPERTIES}

본 발명은 인간 또는 동물 치료제로서 유용한 글리코실화 단백질 (당단백질), 구체적으로 Fc-함유 폴리펩티드의 생산을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

모노클로날 항체는 종종 2가지 결합 사건을 통해 그의 치료 이익을 달성한다. 먼저, 항체의 가변 도메인은 표적 세포 상의 특이적 단백질에 결합한다. 이후에 항체의 불변 영역 (Fc)에 결합하여 항체가 결합된 세포를 파괴시키는 이펙터 세포의 동원이 이어진다.

항체 (또는 다른 면역요법제 조성물)의 효력은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 이펙터 세포에 의해 매개되는 것들을 비롯한 다중 작용 메카니즘에 의존적이다. Fc 수용체는 활성화 또는 억제 기능 역할을 가지며, 이펙터 세포 중에서의 그의 분포에 있어서 상이하다. 단핵구, 대식세포 및 호중구는 활성화 및 억제 FcR을 둘 다 발현하고, 반면에 자연 킬러 (NK) 세포는 활성화 FcRIIIa를 단독으로 발현한다. 따라서, 항체 (또는 다른 면역요법제)가 다양한 Fc 수용체에 회합할 수 있는 정도는 임상 결과에 있어 중요하다.

항체 Fc 도메인의 아미노산- 및 당-조작은 항체 및 다른 면역요법제의 이펙터 세포 기능을 변형시키기 위한 2가지 방법이다. 예를 들어, 문헌 [Chu et al., Molecular Immunology 45:3926-3933 (2008)]을 참조한다.

개선된 특성을 포함하는 항체 또는 Fc 융합 단백질을 조작하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, Fc 감마 수용체 IIB (CD32B)에는 결합하지만 Fc 감마 수용체 IIA (CD32A) 및 Fc 감마 수용체 IIIA (CD16A) 및 Fc 감마 수용체 I (CD64)에는 결합하지 않는 (또는 감소된 친화도로 결합하는) 항체 또는 다른 면역요법제를 조작하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 항체는 그의 이펙터 기능의 결핍 (또는 이펙터 기능에서의 상당한 감소) 및 증가된 항염증 특성을 특징으로 할 것이다.

N-글리코실화의 존재가 항체의 이펙터 기능에서 역할을 수행할 뿐만 아니라, N-연결된 올리고사카라이드의 특정한 조성이 그의 최종 기능을 위해 중요하다. 예를 들어, 푸코스의 결핍 또는 양분성 N-아세틸 글루코사민의 존재는 ADCC의 효력과 긍정적 상관관계가 있다 (문헌 [Rothman (1989), Umana et al., Nat. Biotech. 17: 176-180 (1999), Shields et al., J. Biol. Chem. 277: 26733-26740 (2002), 및 Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]). 또한, Fc 영역 내의 시알릴화가 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)의 항염증 특성과 긍정적 상관관계가 있다는 증거가 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Kaneko et al., Science, 313: 670-673, 2006; Nimmerjahn and Ravetch, J. Exp. Med., 204: 11-15, 2007]을 참조한다.

항체의 기능 및 효력에 있어서 특이적 N-글리코실화의 유용성을 고려하면, 항체의 N-연결된 올리고사카라이드의 조성을 변경하는 방법, 및 항체 및 다른 면역요법제의 이펙터 기능을 변경하는 방법이 바람직할 것이다.

효모 및 다른 진균 숙주는 재조합 단백질의 생성을 위한 중요한 생산 플랫폼이다. 효모는 진핵생물이고, 따라서 분비 경로에서 발생하는 번역후 변형 중 대다수를 비롯한 고등 진핵생물과의 공통적인 진화 과정을 공유한다. 최근 당조작에서의 발전은 인간에서의 글리코실화 과정을 모방하는, 일련의 효소 반응을 수행하도록 할 수 있는 유전자 변형된 글리코실화 경로를 갖는 효모 균주 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 세포주를 생성하였다. 예를 들어, 인간 대응물과 실질적으로 동일한, 하등 진핵생물 숙주 세포에서의 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 기재한 미국 특허 번호 7,029,872, 7,326,681 및 7,449,308을 참조한다. 상기 방법으로부터 피키아 파스토리스에서 생산된 것과 유사한 인간-유사 시알릴화 이중-안테나 복합 N-연결 글리칸은 치료 당단백질의 생산에 대한 유용성을 입증하였다. 따라서, 효모, 예컨대 피키아 파스토리스에서 항체의 생산을 추가로 변형 또는 개선하는 방법이 바람직할 것이다.

본 발명은 Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 Fc-함유 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 위치 243에서의 돌연변이는 F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I, F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W 및 F243K로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 264에서의 돌연변이는 V264A, V264R, V264G, V264S, V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q 및 V264L로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 267에서의 돌연변이는 S267D, S267Y, S267T로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 328에서의 돌연변이는 L328Y, L328W, L328H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 위치 243 및 264에서의 돌연변이는 F243A 및 V264A; F243Y 및 V264G; F243T 및 V264G; F243L 및 V264A; F243L 및 V264N; 및 F243V 및 V264G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 F243A, V264A, S267E 및 L328F이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8 또는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다.

한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 4의 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체, 및 서열 2의 경쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 11의 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체, 및 서열 10의 경쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 항체이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 12의 중쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체, 및 서열 13의 경쇄 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 항체이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 시알산 (NANA, NGNA, 및 그의 유사체 및 유도체 포함)을 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 한 실시양태에서, N-글리칸은 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 α-2,3 및 α-2,6 연결된 시알산의 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 α-2,6 연결된 시알산만을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 α-2,6 연결된 시알산을 포함하고, 검출가능한 수준의 α-2,3 연결된 시알산은 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산 (NANA) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA), 또는 그의 혼합물이다. 또 다른 실시양태에서, 시알산은 시알산 상의 위치 9에서 아세틸화된 NANA 또는 NGNA의 유사체 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 NANA를 포함하고, NGNA는 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 α-2,6 연결된 NANA를 포함한다 (그리고 NGNA는 포함하지 않는다). 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통한 것이다.

본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 임의로 푸코스를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 푸코실화 및 비-푸코실화 N-글리칸의 혼합물을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 푸코스가 결핍되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) 감소된 이펙터 기능; (ii) 증가된 항염증 특성; (iii) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합; (iv) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (v) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (vi) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (v) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합 중 하나 이상을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 적어도 100배 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 적어도 500배 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 적어도 1000배 감소된 ADCC 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 검출가능한 ADCC 활성을 갖지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 ADCP 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 검출가능한 ADCP 활성을 갖지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 CDC 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 적어도 100배 감소된 CDC 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 검출가능한 CDC 활성을 갖지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (ii) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (iii) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (iv) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (ii) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; 및 (iii) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 FcγRIIa, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb에 대한 검출가능한 결합을 갖지 않을 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 결합이 ELISA 검정을 이용하여 검출되는 경우에, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 FcγRIIa, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb에 대한 검출가능한 결합을 갖지 않을 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 적어도 2배의 증가 친화도로 FcγRIIb에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 적어도 4배의 증가 친화도로 FcγRIIb에 결합한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 증가된 항염증 특성을 갖는다.

한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 V264A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이 및 V264A 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 또한 (i) Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서의 돌연변이를 코딩하는 핵산을 포함하는, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하도록 유전자 조작된 숙주 제포를 제공하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고; (ii) 숙주 세포를 Fc-함유 폴리펩티드의 발현을 유발하는 조건 하에 배양하고; (iii) Fc-함유 폴리펩티드를 숙주 세포로부터 단리하는 것을 포함하는, 숙주 세포에서 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 위치 243에서의 돌연변이를 코딩하는 핵산은 F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I, F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W 및 F243K로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 264에서의 돌연변이는 V264A, V264R, V264G, V264S, V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q 및 V264L로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 267에서의 돌연변이는 S267D, S267Y, S267T로 이루어진 군으로부터 선택되고; 위치 328에서의 돌연변이는 L328Y, L328W, L328H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 위치 243 및 264에서의 돌연변이는 F243A 및 V264A; F243Y 및 V264G; F243T 및 V264G; F243L 및 V264A; F243L 및 V264N; 및 F243V 및 V264G로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 핵산은 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8 또는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다.

한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 포유동물 세포에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 식물 세포에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 박테리아에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 곤충 세포에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 하등 진핵 세포에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 효모 세포에서 수행된다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법은 피키아 파스토리스에서 수행된다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 시알산 (NANA, NGNA, 및 그의 유사체 및 유도체 포함)을 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는, Fc-함유 폴리펩티드 상의 적어도 40 mol%, 70 mol% 또는 90 mol%의 N-글리칸이 시알릴화된 (SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 갖는) N-글리칸 조성을 갖는다. 한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 α-2,3 및 α-2,6 연결된 시알산의 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 단지 α-2,6 연결된 시알산만을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 α-2,6 연결된 시알산을 포함하고, 검출가능한 수준의 α-2,3 연결된 시알산은 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산 (NANA) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA), 또는 그의 혼합물이다. 또 다른 실시양태에서, 시알산은 시알산 상의 위치 9에서 아세틸화된 NANA 또는 NGNA의 유사체 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 NANA를 포함하고, NGNA는 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 α-2,6 연결된 NANA를 포함한다 (그리고 NGNA는 포함하지 않는다).

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통한 것이다.

특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 임의로 푸코스를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 푸코실화 및 비-푸코실화 N-글리칸의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 푸코스가 결핍되어 있다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는, 전체 시알릴화 N-글리칸의 양 및 백분율이 모 Fc-함유 폴리펩티드에 비해 증가된 N-글리칸 조성을 갖는 것이다.

일부 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) 감소된 이펙터 기능; (ii) 증가된 항염증 특성; (iii) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합; (iv) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (v) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (vi) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (v) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합 중 하나 이상을 갖는다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다.

또 다른 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 CDC 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 적어도 100배 감소된 CDC 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 검출가능한 CDC 활성을 갖지 않는다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (ii) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (iii) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (v) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합을 갖는다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성: (i) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (ii) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; 및 (iii) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합을 갖는다.

한 실시양태에서, 특허청구된 방법에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드에 비해 증가된 항염증 특성을 갖는다.

본 발명은 또한 모 Fc-함유 폴리펩티드의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상기 Fc 함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 이펙터 기능을 갖고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 이펙터 기능을 감소시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 연결된다. 한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 V264A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이 및 V264A 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 또한 모 Fc-함유 폴리펩티드의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고, 여기서 상기 Fc 함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 증가된 항염증 활성을 갖는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성을 증가시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 APRIL, INF-α, BAFF (BLys), CD22, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD38, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-인테그린, E-셀렉틴, 팩트 II, ICAM-3, 베타2-인테그린, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC, 또는 상기 언급된 임의의 분자에 대한 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 TNF-α에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 Her2에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 PCSK9에 결합할 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 연결된다. 한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 V264A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이 및 V264A 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 또한, 염증 치료에 유용한 모 Fc-함유 폴리펩티드 (예를 들어, 염증에 관여하는 항원에 결합하는 항체 또는 이뮤노어드헤신)를 선택하고, Fc-영역의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 증가된 항염증 활성을 갖는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성을 증가시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산은 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 코딩한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 APRIL, INF-α, BAFF (BLys), CD22, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD38, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-인테그린, E-셀렉틴, 팩트 II, ICAM-3, 베타2-인테그린, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC, 또는 상기 언급된 임의의 분자에 대한 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 TNF-α에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 Her2에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 PCSK9에 결합할 것이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 연결된다. 한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 V264A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이 및 V264A 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 또한 염증성 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 상기 대상체에서 염증성 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 IL-1β, IL-6, RANKL, TRAP, ATP6v0d2, MDL-1, DAP12, CD11b, TIMP-1, MMP9, CTSK, PU-1, MCP1, MIP1α, Cxcl1-Groa, CXcl2-Grob, CD18, TNF, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현을 감소시킨다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 비경구로 투여된다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 피하로 투여된다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 염증성 상태의 치료에 유용한 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 APRIL, INF-α, BAFF (BLys), CD22, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD38, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-인테그린, E-셀렉틴, 팩트 II, ICAM-3, 베타2-인테그린, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC, 또는 상기 언급된 임의의 분자에 대한 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 TNF-α에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 Her2에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 PCSK9에 결합할 것이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 연결된다.

본원에 개시된 또 다른 발명은 Fc-함유 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드 상의 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 N-글리칸은 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 및SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고사카라이드 구조를 포함하고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 F243A, V264A, S267E 및 L328F이다. 한 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,3 및 α-2,6 연결된 시알산의 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,6 연결된 시알산만을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,6 연결된 시알산을 포함하고, 검출가능한 수준의 α-2,3 연결된 시알산은 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산 (NANA) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA), 또는 그의 혼합물이다. 또 다른 실시양태에서, 시알산은 시알산 상의 위치 9에서 아세틸화된 NANA 또는 NGNA의 유사체 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 NANA를 포함하고, NGNA는 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan5GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 연결된다.

본원에 개시된 또 다른 발명은 Fc-함유 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드 상의 적어도 70%, 80% 또는 90%의 N-글리칸은 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 및 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고사카라이드 구조를 포함하고, 여기서 시알산 잔기는 독점적으로 α-2,6 연결을 통해서만 부착되고, 여기서 N-글리칸은 푸코스가 결핍되어 있고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 F243A, V264A, S267E 및 L328F이다. 한 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,3 및 α-2,6 연결된 시알산의 혼합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,6 연결된 시알산만을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 α-2,6 연결된 시알산을 포함하고, 검출가능한 수준의 α-2,3 연결된 시알산은 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산 (NANA) 또는 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA), 또는 그의 혼합물이다. 또 다른 실시양태에서, 시알산은 시알산 상의 위치 9에서 아세틸화된 NANA 또는 NGNA의 유사체 또는 유도체이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 NANA를 포함하고, NGNA는 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 상의 N-글리칸은 α-2,6 연결된 NANA를 포함한다 (그리고 NGNA는 포함하지 않는다). 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다.

본 발명은 또한 서열 4의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열 2의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하며, 여기서 변이체는 서열 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교시 하기 특성: (i) 감소된 이펙터 기능; (ii) 증가된 항염증 특성; (iii) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합; (iv) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (v) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (vi) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (vii) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합 중 하나 이상을 포함하는 것인 Fc-함유 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 변이체는 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 변이체는 특허청구된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다.

본 발명은 또한 서열 4의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열 2의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하며, 여기서 변이체는 서열 3의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교시 하기 특성: (i)감소된 이펙터 기능; (ii) 증가된 항염증 특성; (iii) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합; (iv) FcγRIIa에 대한 감소된 결합; (v) FcγRIIb에 대한 증가된 결합; (vi) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및 (vii) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합 중 하나 이상을 포함하는 것인 Fc-함유 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 변이체는 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 변이체는 특허청구된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다.

도 1은 항체 1F11 F243A/V264A/S267E/L328F에 대한 발현 플라스미드인 pGLY8068의 그래프 표현이다. 중쇄 및 경쇄 둘 다는 메탄올 유도성 프로모터인 AOX1의 제어 하에 있었다. PpTrp2 유전자는 전체 카세트를 통합하기 위해 적용된 유전자좌였다. 중쇄 상의 돌연변이를 제외하면, 발현 플라스미드 구조는 야생형, 이중 뮤테인 (F243A/V264A) 및 사중 뮤테인 (F243A/V264A/S267E/L328F) IF11 발현 플라스미드에 대해 동일한 것이었다.
도 2는 본원의 물질 및 방법에 의해 생산된 비환원 (NR) 및 환원 (R) 항체를 특성화하는 SDS-PAGE 분석으로부터의 겔의 표시이다. 레인 1은 균주 YGLY25265에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 2는 균주 YGLY25266에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 3은 균주 YGLY25267에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 4는 균주 YGLY25268에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 5는 균주 YGLY25269에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 6은 균주 YGLY23258에서 생산된 항체를 함유한다. 레인 7 은 균주 GLY21351에서 생산된 항체를 함유한다.
도 3-8은 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드의 FcγR 결합 특성의 그래프 표현이다.
도 9는 뮤린 ITP 모델에서 본 발명의 일부 Fc 폴리펩티드의 효과를 나타낸다.

정의

본원에 사용된 용어 "G0"은 갈락토스 또는 푸코스가 없는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "G1"는 푸코스가 없고 1개의 갈락토실 잔기를 함유하는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "G2"는 푸코스가 없고 2개의 갈락토실 잔기를 함유하는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "G0F"는 코어 푸코스를 함유하고 갈락토스가 없는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂F를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "G1F"는 코어 푸코스 및 1개의 갈락토실 잔기를 함유하는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂F를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "G2F"는 코어 푸코스 및 2개의 갈락토실 잔기를 함유하는 복합 이중-안테나 올리고사카라이드 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂F를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Man5"는 하기와 같이 나타낸 올리고사카라이드 구조를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "M4"는 올리고사카라이드 Man₄GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "M5"는 올리고사카라이드 Man₅GlcNAc₂를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "A1"은 올리고사카라이드 NANA₁Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "A1H"는 올리고사카라이드 NANA₁GalMan_(3-5)GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "A2"는 올리고사카라이드 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GFI 5.0"은 우세하게 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하는 당조작된 피키아 파스토리스 균주를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GFI 6.0"은 우세하게 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하는 당조작된 피키아 파스토리스 균주를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GS5.0"은 N-글리코실화 구조 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GS5.5"는, α 2,6 시알릴 트랜스퍼라제가 당조작된 피키아 파스토리스 균주에서 생산될 때에는 α 2,6-연결된 시알산을 생산하고 α 2,3 시알릴 트랜스퍼라제가 당조작된 피키아 파스토리스 균주에서 생산될 때에는 α 2,3-연결된 시알산을 생산하는 N-글리코실화 구조 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GS6.0"은, α 2,6 시알릴 트랜스퍼라제가 당조작된 피키아 파스토리스 균주에서 생산될 때에는 α 2,6-연결된 시알산을 생산하고 α 2,3 시알릴 트랜스퍼라제가 당조작된 피키아 파스토리스 균주에서 생산될 때에는 α 2,3-연결된 시알산을 생산하는 N-글리코실화 구조 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 지칭한다.

피키아 파스토리스 균주와 관련하여 본원에 사용된 용어 "야생형" 또는 "wt"는 글리코실화를 제어하기 위해 유전자 변형에 적용되지 않은 천연 피키아 파스토리스 균주를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 특이적 항원에 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 이 용어는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉, 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍 (각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (LC) (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (HC) (약 50-70 kDa)를 가짐)로 이루어진 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 그의 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단일쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위 및 C_H2 도메인의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함하는 중쇄 이뮤노글로불린 불변 영역의 C_H2 도메인의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체형태, 또는 그의 변이체도 포함한다. 본원에 사용된 이 용어는 임의의 부류의 항체, 예컨대 각각 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "C_H2의 컨센서스 서열"은 다양한 항체로부터의 C_H2 도메인에서 발견되는 가장 공통적인 아미노산 서열로부터 유래된 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하는 중쇄 불변 영역의 C_H2 도메인의 아미노산 서열을 지칭한다.

용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 정의된다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인 C_H2 및 C_H3을 포함하고, 임의로 힌지 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 서열 7의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 3' 말단에 리신 (K) 잔기가 부가된 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. Fc 영역은 항체의 전장 중쇄의 Asn297 부위에 상응하는, C_H2 도메인 내의 단일 N-연결된 글리코실화 부위를 함유한다.

용어 "Fc-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 이뮤노어드헤신을 지칭한다. 이 용어는 Fc 영역을 포함하거나 또는 이로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 폴리펩티드를 포함한다. Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 항체의 파파인 소화에 의해 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.

용어 "모 항체", "모 이뮤노글로불린" 또는 "모 Fc-함유 폴리펩티드"는 본원에서 사용되는 경우에 본원에 개시된 Fc 영역 돌연변이가 결핍된 항체 또는 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다. 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 천연 서열 Fc 영역은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열에 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역, 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역, 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 비교자로서 사용되는 경우에, 모 항체 또는 모 Fc-함유 폴리펩티드는 임의의 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 모 항체 또는 모 Fc-함유 폴리펩티드는 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드와 동일한 세포에서 발현된다.

본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인을 갖는 이종 "어드헤신" 단백질 (예를 들어, 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"을 조합한 항체-유사 분자를 지정한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 결합 부위)가 아닌 (즉,"이종"인) 바람직한 결합 특이성을 갖는 어드헤신 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "리간드 결합 도메인"은 상응하는 천연 수용체의 적어도 정량적 리간드 결합 능력을 보유하는 임의의 천연 세포-표면 수용체 또는 그의 임의의 영역 또는 유도체를 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 수용체는 이뮤노글로불린 초유전자 패밀리의 구성원에 상동성인 세포외 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터의 것이다. 이뮤노글로불린 초유전자 패밀리의 구성원은 아니지만, 그럼에도 불구하고 상기 정의에 의해 구체적으로 포함되는 다른 수용체는 시토카인에 대한 수용체, 특히 포유동물을 논의되는 장애에 걸리기 용이하게 만드는 헤마토포이에틴 및 신경 성장 인자의 구성원인 티로신 키나제 활성 (수용체 티로신 키나제)을 갖는 수용체이다. 한 실시양태에서, 장애는 암이다. 이뮤노어드헤신의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, WO00/42072를 참조한다.

"1F11"로서 지칭된 항체는 실시예 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항-PCSK9 항체를 지칭한다.

용어 "헤르셉틴(Herceptin)®"은 또한 라스투주맙으로도 공지된, CHO 세포에서 생산된 시판되는 항-Her2 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Fc 뮤테인 항체"는 본원에 기재된 단일 Fc 뮤테인 또는 이중 Fc 뮤테인 중 하나를 포함하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Fc 뮤테인"은 하나 이상의 점 돌연변이가 Fc 영역에 대해 만들어진 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Fc 돌연변이"는 Fc-함유 폴리펩티드의 Fc 영역에 대해 만들어진 돌연변이를 지칭한다. 이러한 돌연변이의 예는 본원에 기재된 F243A, V264A, S267E 또는 L328F 돌연변이를 포함한다.

용어 "F243A"는 항체 중쇄의 Fc 영역의 위치 243에서 F (야생형)로부터 A로의 돌연변이를 지칭한다. 용어 "V264A"는 항체 중쇄의 Fc 영역의 위치 264에서 V (야생형)로부터 A로의 돌연변이를 지칭한다. 용어 "S267E"은 항체 중쇄의 Fc 영역의 위치 267에서 S (야생형)로부터 E로의 돌연변이를 지칭한다. 용어 "L328F"는 항체 중쇄의 Fc 영역의 위치 328에서 L (야생형)로부터 F로의 돌연변이를 지칭한다. 위치 243, 264, 267 및 328은 EU 넘버 시스템에 따라서와 같이 항체 중쇄의 Fc 영역의 C_H2 도메인에서의 아미노산 위치를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "이중 Fc 뮤테인" 또는 "DM"은 Fc 영역의 위치 243 및 264에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "F243A/V264A"는 2개의 특정된 돌연변이를 포함하는 이중 Fc 뮤테인을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "사중 Fc 뮤테인" 또는 "QM"은 항체 중쇄의 Fc 영역의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "F243A/V264A/S267E/L328F"는 4개의 특정된 돌연변이를 포함하는 사중 Fc 뮤테인을 지칭한다.

본원 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐서, 이뮤노글로불린 중쇄 또는 Fc-함유 폴리펩티드 내의 잔기의 넘버링은 본원에 명백하게 참고로 포함된 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드와의 상호작용으로부터 생성된 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 당업계에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "당조작된 피키아 파스토리스"는 인간-유사 N-글리칸을 발현하도록 유전자 변경된 피키아 파스토리스의 균주를 지칭한다. 예를 들어, GFI 5.0, GFI 5.5 및 GFI 6.0 균주가 상기 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "N-글리칸" 및 "당형태"는 N-연결된 올리고사카라이드, 예를 들어, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. 당단백질 상에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 (SA, 예컨대 NANA, NGNA, 및 그의 유도체 및 유사체, 예컨대 아세틸화 NANA 또는 아세틸화 NGNA)이다. 당조작된 피키아 파스토리스에서, 시알산은 독점적으로 N-아세틸-뉴라민산 (NANA)이다 (문헌 [Hamilton et al., Science 313 (5792): 1441-1443 (2006)]). N-글리칸은 Man₃GlcNAc₂의 통상의 펜타사카라이드 코어이며, 여기서 "Man"은 만노스를 지칭하고, "Glc"는 글루코스를 지칭하고, "NAc"는 N-아세틸을 지칭하고, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭한다. N-글리칸은 "트리만노스 코어", "펜타사카라이드 코어" 또는 "소수-만노스 코어"로도 언급되는 Man₃GlcNAc₂ ("Man3") 코어 구조에 부가되는 주변 당 (예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스 및 시알산)을 포함하는 분지 (안테나)의 수에 대해 상이하다. N-글리칸은 그의 분지형 구성성분에 따라 분류된다 (예를 들어, 고 만노스, 복합 또는 하이브리드).

본원에 사용된 용어 "시알산" 또는 "SA"는 비제한적으로 N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac 또는 NANA), N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA), 및 그의 임의의 유사체 또는 유도체 (시알산 분자의 임의의 위치에서 아세틸화로부터 발생하는 것들 포함)를 비롯한 시알산 패밀리의 임의의 구성원을 지칭한다. 시알산은 다수의 당접합체의 필수 성분인 약 30개의 자연 발생 산성 탄수화물 군에 대한 일반 명칭이다. 문헌 [Schauer, Biochem. Society Transactions, 11, 270-271 (1983)]. 시알산은 통상적으로 올리고사카라이드의 말단 잔기이다. N-아세틸뉴라민산 (NANA)는 가장 통상적인 시알산 형태이고, N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA)은 두번째로 가장 통상적인 형태이다. 문헌 [Schauer, Glycobiology, 1, 449-452 (1991)]. NGNA는 종 및 조직에 따라 동물계 전체에 걸쳐 광범위하고, 종종 상당한 비율의 당접합체-결합된 시알산을 구성한다. 특정 종, 예컨대 닭 및 인간은 정상 조직에서 NGNA가 결핍되기 때문에 예외적이다. 문헌 [Corfield, et al., Cell Biology Monographs, 10, 5-50 (1982)]. 인간 혈청 샘플에서, NGNA 형태의 시알산의 백분율은 전체 시알산의 0.01%인 것으로 보고되어 있다. 문헌 [Schauer, "Sialic Acids as Antigenic Determinants of Complex Carbohydrates", The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates, (Plenum Press, New York, 1988)].

본원에 사용된 용어 "인간-유사 N-글리칸"은 비-조작된 야생형 인간 세포에 의해 생산된 올리고사카라이드와 매우 유사한 N-연결된 올리고사카라이드를 지칭한다. 예를 들어, 야생형 피키아 파스토리스 및 다른 하등 진핵 세포는 전형적으로 N-글리코실화 부위에서 과만노실화 단백질을 생산한다. 본원에 기재된 숙주 세포는 과만노실화되지 않은 인간-유사 N-글리칸을 포함하는 당단백질 (예를 들어, 항체)을 생산한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 하이브리드 및/또는 복합 N-글리칸인 인간-유사 N-글리칸을 생산할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포로부터 생산된 특이적 당단백질에 존재하는 "인간-유사" 글리칸의 특정한 유형은 숙주 세포에서 수행되는 특이적 당조작 단계에 따라 의존적일 것이다.

본원에 사용된 용어 "고 만노스" 유형 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는 N-글리칸을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "복합" 유형 N-글리칸은 "트리만노스" 코어의 1,3 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc 및 1,6 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc를 갖는 N-글리칸을 지칭한다. 복합 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체 (예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc", 여기서 "Neu"는 뉴라민산을 지칭하고, "Ac"는 아세틸을 지칭함)로 임의로 변형된 갈락토스 ("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민 ("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "양분성" GlcNAc 및 코어 푸코스 ("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환을 가질 수 있다. 일례로서, N-글리칸이 트리만노스 코어 상에 양분성 GlcNAc를 포함하는 경우에, 구조는 Man₃GlcNAc₂(GlcNAc) 또는 Man₃GlcNAc₃으로서 나타내어질 수 있다. N-글리칸이 트리만노스 코어에 부착된 코어 푸코스를 포함하는 경우에, 구조는 Man₃GlcNAc₂(Fuc)로서 나타내어질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 종종 "다중 안테나 글리칸"으로서 지칭되는 "트리만노스 코어" 상의 다중 안테나를 가질 수 있다.

본원에 사용된 용어 "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 아암의 말단 상에 적어도 1개의 GlcNAc 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 아암 상에 0개 또는 1개 초과의 만노스를 갖는 N-글리칸을 지칭한다.

당단백질 제제 내에 존재하는 글리칸의 "몰 퍼센트"를 지칭하는 경우에, 이러한 용어는, 단백질 제제가 PNGase로 처리될 때 방출되고, 이어서 당형태 조성에 영향을 미치지 않는 방법에 의해 정량화된 N-연결된 올리고사카라이드의 풀 내에 존재하는 특정한 글리칸의 몰 퍼센트를 의미한다 (예를 들어, PNGase 방출된 글리칸 풀을 형광 태그, 예컨대 2-아미노벤즈아미드로 표지하고, 이어서 고성능 액체 크로마토그래피 또는 모세관 전기영동으로 분리한 다음, 형광 강도에 의해 글리칸을 정량함). 예를 들어, 50 몰 퍼센트 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂는, 방출된 글리칸의 50 퍼센트가 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂이고 나머지 50 퍼센트가 다른 N-연결된 올리고사카라이드로 이루어진 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "항염증 항체"는 염증 치료에 사용되는 것으로 의도된 항체를 지칭한다. Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성은 동물 모델, 예컨대 문헌 [Kaneko et al., Science 313:670-673 (2006), Anthony et al., Science 320:373-376 (2008)], 및 본원의 실시예 20-21에 기재된 모델을 사용하여 측정된다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성은 염증에 관련된 바이오마커 (비제한적으로 CRP, 염증유발 시토카인, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF-알파), 인터페론-감마, 인터류킨 6 (IL-6), IL-8, IL-10, 케모카인, 응고 마커 D-이량체, sCD14, 장 지방산 결합 펩티드 (IFABP), 및 히알루론산 포함)의 수준을 결정함으로써 측정된다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 C-반응성 단백질 (CRP)의 수준을 결정함으로써 측정된다. C-반응성 단백질 수준에서의 감소는 Fc-함유 폴리펩티드가 항염증 특성을 가짐을 나타낸다.

"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 변화가 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 빈번히 발생할 수 있도록 단백질 내의 아미노산을 유사한 특징 (예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수적인 영역 내의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인지한다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조상 또는 기능상 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다. 예시적인 보존적 치환을 하기에 열거한다:

Fc 영역, Asn297 (EU 넘버링 시스템에 따름)에서의 이뮤노글로불린 G (IgG)의 글리코실화는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 비롯한 이펙터 경로의 최적 인식 및 활성화에 대한 요건인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Wright & Morrison, Trends in Biotechnology, 15: 26-31 (1997), Tao & Morrison, J. Immunol., 143(8):2595-2601 (1989)]). 따라서, IgG의 불변 영역 내의 글리코실화 조작은 치료 모노클로날 항체 (mAb)의 개발을 위해 활발히 연구되는 분야가 되었다. Asn297에서 N-연결된 글리코실화의 존재가 ADCC (문헌 [Rothman (1989), Lifely et al., Glycobiology, 5:813-822 (1995), Umana (1999), Shields (2002), and Shinkawa (2003)]), 및 보체 의존성 세포독성 (CDC) (문헌 [Hodoniczky et al., Biotechnol. Prog., 21(6): 1644-1652 (2005), 및 Jefferis et al., Chem. Immunol., 65: 111-128 (1997)])을 비롯한 면역 이펙터 기능 검정에서 mAb 활성에 대해 중요하다는 것이 확립되었다. 기능에 대한 이 효과는 글리코실화가 존재하지 않는 경우에는 결핍되는 것으로 보이는, 글리코실화 Fc 도메인에 의해 채용되는 특이적 입체형태에 기인한 것이었다. 보다 구체적으로, Fc C_H2 도메인 내에 글리코실화가 결핍된 IgG는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 비롯한 FcγR에 결합하지 않는다 (문헌 [Rothman (1989)]).

글리코실화의 존재가 항체의 이펙터 기능에서 역할을 수행하는 것으로 나타날 뿐만 아니라, N-연결된 올리고사카라이드의 특정한 조성도 또한 중요하다. 예를 들어, 푸코스의 존재는 시험관내 FcγRIIIa 결합 및 시험관내 ADCC에 대해 상당한 효과를 나타낸다 (문헌 [Rothman (1989), and Li et al., Nat. Biotechnol. 24(2): 2100-215 (2006)]). 포유동물 세포 배양, 예컨대 CHO 또는 NS0에 의해 생산된 재조합 항체는 우세하게 푸코실화된 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다 (문헌 [Hossler et al., Biotechnology and Bioengineering, 95(5):946-960 (2006), Umana (1999), and Jefferis et al., Biotechnol. Prog. 21:11-16 (2005)]). 추가로, Fc 영역 내의 시알릴화가 항염증 특성을 항체에 부여할 수 있다는 증거가 존재한다. 시알릴화 형태를 농축하기 위해 렉틴 칼럼 상에서 정제된 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)은 시알릴화 Fc 단편에 제한된 분명한 항염증 효과를 보였고, 억제 수용체 FcγRIIb의 발현 증가와 연결되었다 (문헌 [Nimmerjahn and Ravetch., J. Exp. Med. 204:11-15 (2007)]).

포유동물 세포주로부터 유래된 항체의 Fc 영역에서의 글리코실화는 전형적으로 당형태의 불균일 혼합물로 이루어지고, 우세한 형태는 전형적으로 복합 푸코실화 당형태: G0F, G1F, 및 보다 낮은 정도로의 G2F로 이루어진다. G0F 구조로의 불완전한 갈락토스 전달을 생성하는 가능한 조건은, 비제한적으로, 비-최적화된 갈락토스 전달 기구, 예컨대 β-1,4 갈락토실 트랜스퍼라제, 및 골지체 내로의 불량한 UDP-갈락토스 수송, 최적 미만의 세포 배양 및 단백질 발현 조건, 및 올리고사카라이드에 인접하는 아미노산 잔기에 의한 입체 장애를 포함한다. 이들 각각의 조건은 말단 갈락토스의 최종 정도를 조정할 수 있지만, Fc 올리고사카라이드에 대한 후속 시알산 전달은 C_H2 도메인의 폐쇄형 포켓 배위에 의해 억제되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌 [Jefferis, R., Nature Biotech., 24 (10): 1230-1231, 2006]의 도 1을 참조한다. 정확한 말단 모노사카라이드, 특히 갈락토스가 없거나, 또는 불충분한 말단 갈락토실화 형태를 갖는 경우에는, 시알릴 트랜스퍼라제의 존재 하에 생산시에도 치료 단백질로 작용할 수 있는 시알릴화 형태를 생산할 가능성이 거의 없다. 인간 IgG-Fc 당형태의 단백질 조작 및 구조 분석은, 글리코실화 프로파일이 Fc 입체형태에 의해 영향받는 것으로 밝혀졌고, 예컨대 CHO-생산 IgG3으로부터 유래된 올리고사카라이드 상의 갈락토스 및 시알산의 증가된 수준이 F241, F243, V264, D265 및 R301을 비롯하여 Fc 포켓의 특이적 아미노산이 알라닌으로 돌연변이될 때 달성될 수 있다는 발견이 밝혀졌다 (문헌 [Lund et al., J. Immunol. 157(11); 4963-4969 (1996)]). 특정 돌연변이가 각각 FcγRI 및 C1q 결합에 대한 대용 마커로서 사용되는 세포 매개 슈퍼옥시드 생성 및 보체 매개 적혈구 용해에 대해 일부 효과를 갖는다는 것이 추가로 밝혀졌다.

효모를 유전자 조작하여 고도로 균일한 글리코실화를 갖는 당단백질을 분비할 수 있는 숙주 균주를 생산한다는 것이 보고되었다. 문헌 [Choi et al., PNAS, USA 100(9): 5022-5027 (2003)]에는 촉매 도메인을 분비 경로에 위치시키기 위해 α 1,2 만노시다제 촉매 도메인 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I 촉매 도메인의 라이브러리를 진균 유형 II 막 단백질 리더 서열의 라이브러리와 조합하여 사용하는 것이 기재되어 있다. 이 방식으로, 균일한 Man₅GlcNAc₂ 또는 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-글리칸 구조를 갖는 생체내 당단백질을 생산하는 균주가 단리되었다. 문헌 [Hamilton et al., Science 313 (5792): 1441-1443 (2006)]은 우세하게 이중시알릴화 글리칸 구조 GS6.0, NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ (90.5%) 및 단일시알릴화 GS5.5, NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ (7.9%)로 이루어진 글리칸 조성을 갖는 바와 같이, 피키아 파스토리스에서 생산된 당단백질 에리트로포이에틴의 생산을 기재하고 있다. 그러나, 유사한 균주에서 생산된 항체는 도 4에서 나타낸 바와 같이 항체 내의 상대적으로 낮은 수준의 말단 갈락토스 기질 때문에 현저하게 더 낮은 함량의 시알릴화 N-글리칸을 가질 것이다. 또한, 최근에 Fc 올리고사카라이드의 시알릴화가 치료적 정맥내 감마 글로불린 및 그의 Fc 단편 상에 항염증 특성을 부여하고 (문헌 [Kaneko et al., Science 313(5787): 670-673 (2006)]), 항염증 활성은 시알산의 α 2,6-연결된 형태에 의존하지만, α 2,3 형태에는 의존하지 않음 (문헌 [Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008)])이 밝혀졌다.

숙주 유기체 및 세포주

본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 임의의 숙주 유기체 또는 세포주에서 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 시알릴화 N-글리칸을 생산할 수 있는 숙주 세포에서 생산된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는, 내인성으로 또는 유전자 또는 공정 조작을 통해 말단 α2-6 및 α2-3 시알산의 혼합물 또는 말단 α2-6 시알산만을 함유하는 당단백질을 생산하는 포유동물 세포에서 생산된다. 배양액 (조직 배양액) 내의 포유동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브크로닝된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO); 마우스 세르톨리 세포 (TM4); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 하이브리도마 세포주; NS0; SP2/0; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 시알릴화 N-글리칸을 생산하도록 조작된 식물 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cox et al., Nature Biotechnology (2006) 24, 1591-1597 (2006) 및 Castilho et al., J. Biol. Chem. 285(21): 15923-15930 (2010)]을 참조한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 시알릴화 N-글리칸을 생산하도록 조작된 곤충 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harrison and Jarvis, Adv. Virus Res. 68:159-91 (2006)]을 참조한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 시알릴화 N-글리칸을 생산하도록 조작된 박테리아 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lizak et al., Bioconiueate Chem. 22:488-496 (2011)]을 참조한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 하등 진핵 숙주 세포 또는 유기체에서 생산될 수 있다. 최근의 개발은 하등 진핵 숙주 유기체, 효모 및 사상 진균, 예컨대 피키아 파스토리스에서 완전 인간화 치료제의 생산을 허용한다 (그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 7,029,872 및 미국 특허 번호 7,449,308 (Gerngross et al.) 참조). 또한 문헌 [Jacobs et al., Nature Protocols 4(1):58-70 (2009)]을 참조한다.

감소된 FcγR 및 C1q 결합 때문에, 본원에 기재된 물질 및 방법은 모 항체와 비교시 감소된 이펙터 기능을 갖는 재조합 글리코실화 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 방법에 의해 피키아 파스토리스에 의해 생산된 항체는 고수율로, 감소된 이펙터 기능을 갖도록 생산되고, 특이적 Fc 돌연변이가 결핍된 당조작된 피키아 파스토리스 세포에서 또는 그의 내인성 글리코실화 기구를 보유하는 피키아 파스토리스 숙주 세포에서 생산된 항체에 비해 말단 α 2,6-연결된 시알산 잔기를 갖는 당단백질의 우세한 종을 가졌다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 말단 시알산을 포함하는 우세한 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산하도록 조작된 숙주 세포, 보다 바람직하게는 효모 또는 사상 진균 숙주 세포에서 생산된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 우세한 N-글리칸은 임의의 α 2,3 연결된 시알산을 생산하지 않는 α 2,6 시알릴 트랜스퍼라제로 당조작된 균주에서 생산된 SA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂의 α 2,6 연결된 형태이다. 다른 실시양태에서, 균주는 단독으로 또는 α 2,6 시알릴 트랜스퍼라제와 조합되어 α 2,3 시알릴 트랜스퍼라제를 발현하도록 조작되어, 우세한 N-글리칸으로서 α 2,3 연결된 시알산 또는 α 2,6 및 α 2,3 연결된 시알산의 조합물을 생성할 것이다.

본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 세포주는 임의의 세포주, 특히 하나 이상의 시알릴화 당단백질을 생산하는 능력을 갖는 세포주일 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 물질 및 방법이 본원에서 예로서 제공된 피키아 파스토리스의 특이적 균주에 제한되는 것이 아니라, 하나 이상의 말단 갈락토스를 갖는 N-글리칸, 예컨대 Gal₂GlcNAc₂Man₃이 생산되는 임의의 피키아 파스토리스 균주 또는 다른 효모 또는 사상 진균 균주를 포함할 수 있는 것으로 인지하고 인식될 것이다. 말단 갈락토스는 α 2,6-연결된 시알산의 생산을 위한 기질로서 작용하여, N-글리칸 구조 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 생성한다. 적합한 균주의 예는 그 기재내용이 상세하게 제시된 것처럼 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,029,872, US 2006-0286637 및 문헌 [Hamilton et al., Science 313 (5792): 1441-1443 (2006)]에 기재되어 있다.

일반적으로, 하등 진핵생물, 예컨대 효모가 단백질, 특히 당단백질의 발현을 위해 사용되고, 그 이유는 이들이 경제적으로 배양되고, 고수율을 제공하고, 적절하게 변형될 경우에 적합한 글리코실화를 수행할 수 있기 때문이다. 효모는 특히 신속한 형질전환을 허용하는 확립된 유전학, 시험된 단백질 국재화 전략 및 쉬운 유전자 녹-아웃 기술을 제공한다. 적합한 벡터는 필요에 따라 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 및 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는다.

본 발명이 메틸영양 효모 피키아 파스토리스를 사용하여 본원에서 입증되지만, 다른 유용한 하등 진핵생물 숙주 세포는 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta) (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피즈페리(Pichia pijperi), 피키아 스티프티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 종, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 종, 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리우미 루크노웬세(Chrysosporiumi lucknowense), 푸사리움(Fusarium) 종, 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함한다. 다양한 효모, 예컨대 케이. 락티스(K. lactis), 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카 및 한세눌라 폴리모르파는 이들이 높은 세포 밀도로 성장하고 다량의 재조합 단백질을 분비할 수 있기 때문에 세포 배양에 특히 적합하다. 마찬가지로, 사상 진균, 예컨대 아스페르길루스 니거, 푸사리움 종, 뉴로스포라 크라사 등이 본 발명의 당단백질을 산업적 규모로 생산하기 위해 사용될 수 있다.

하등 진핵생물, 특히 효모 및 사상 진균은 글리코실화 패턴이 인간-유사 또는 인간화된 당단백질을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "인간-유사 N-글리칸"은 비-조작된 야생형 인간 세포에 의해 생산된 올리고사카라이드와 매우 유사한 N-연결된 올리고사카라이드를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 하이브리드 및/또는 복합 N-글리칸을 갖는 인간-유사 당단백질; 즉, "인간-유사 N-글리코실화"를 생산할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포로부터 생산된 당단백질 상에 우세하게 존재하는 특이적 "인간-유사" 글리칸은 수행되는 특이적 조작 단계에 의존적일 것이다. 이러한 방식으로, 특정한 목적 당형태가 조성물에서 우세한 당단백질 조성물이 생산될 수 있다. 이것은 미국 특허 번호 7,449,308에 기재된 바와 같이 선택된 내인성 글리코실화 효소를 제거하고/거나 숙주 세포를 유전자 조작하고/거나 외인성 효소를 공급하여 포유동물 글리코실화 경로의 전부 또는 일부를 모방함으로써 달성될 수 있다. 목적하는 경우에, 코어 푸코실화의 존재 또는 코어 푸코실화의 부재 하에 당단백질이 생산될 수 있도록, 글리코실화의 추가의 유전자 조작이 수행될 수 있다. 하등 진핵생물 숙주 세포의 사용은 이들 세포가 당단백질의 우세한 당형태가 조성물 내 당단백질 30 몰 퍼센트 초과로 존재할 수 있도록 당단백질의 고도로 균질한 조성물을 생산할 수 있다는 점에서 추가로 유리하다. 특정한 측면에서, 우세한 당형태는 조성물 내 존재하는 당단백질 40 몰 퍼센트, 50 몰 퍼센트, 60 몰 퍼센트, 70 몰 퍼센트 초과, 가장 바람직하게는 80 몰 퍼센트 초과로 존재할 수 있다.

하등 진핵생물, 특히 효모는 글리코실화 패턴이 인간-유사 또는 인간화된 당단백질을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 이것은 미국 특허 번호 7,449,308 (Gerngross et al.)에 기재된 바와 같이 선택된 내인성 글리코실화 효소를 제거하고/거나 외인성 효소를 공급함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 당단백질 상의 N-글리칸에 만노스 잔기를 다르게 부가하는 α1,6-만노실 트랜스퍼라제 활성이 고갈되도록 선택되거나 조작될 수 있다.

한 실시양태에서, 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 α1,2-만노시다제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 α1,2-만노시다제 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 Man₅GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 Man₅GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,029,872 및 7,449,308 및 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0170452는 Man₅GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 당단백질을 생산할 수 있는 하등 진핵생물 숙주 세포를 개시하고 있다.

추가 실시양태에서, 바로 앞의 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 GlcNAc 트랜스퍼라제 I 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 I (GnT I) 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산한다. 미국 특허 번호 7,029,872 및 7,449,308 및 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0170452는 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 당단백질을 생산할 수 있는 하등 진핵생물 숙주 세포를 개시하고 있다. 상기 세포에서 생산된 당단백질은 시험관내 헥사미니다제로 처리되어 Man₅GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생산할 수 있다.

추가 실시양태에서, 바로 앞의 숙주 세포는, 만노시다제 II 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 만노시다제 II 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 만노시다제 II 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 GlcNAcMan₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 GlcNAcMan₃GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산한다. 미국 특허 번호 7,029,872 및 미국 공개 특허 출원 번호 2004/0230042는, 만노시다제 II 효소를 발현하고 GlcNAcMan₃GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 갖는 당단백질을 생산할 수 있는 하등 진핵생물 숙주 세포를 개시하고 있다. 상기 세포에서 생산된 당단백질은 시험관내 헥사미니다제로 처리되어 Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생산할 수 있다.

추가 실시양태에서, 바로 앞의 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 GlcNAc 트랜스퍼라제 II 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 GlcNAc 트랜스퍼라제 II (GnT II) 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산한다. 미국 특허 번호 7,029,872 및 7,449,308 및 미국 공개 특허 출원 번호2005/0170452는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 당단백질을 생산할 수 있는 하등 진핵생물 숙주 세포를 개시하고 있다. 상기 세포에서 생산된 당단백질은 시험관내 헥사미니다제로 처리되어 Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질을 생산할 수 있다.

추가 실시양태에서, 바로 앞의 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 갈락토실트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하도록 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 갈락토실트랜스퍼라제 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 또는 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태, 또는 그의 혼합물을 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태 또는 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태, 또는 그의 혼합물을 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산한다. 미국 특허 번호 7,029,872 및 미국 공개 특허 출원 번호 2006/0040353은 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 당단백질을 생산할 수 있는 하등 진핵생물 숙주 세포를 개시하고 있다. 상기 세포에서 생산된 당단백질은 시험관내 갈락토시다제로 처리되어 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 포함하는 재조합 당단백질, 예를 들어 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질 조성물을 생산할 수 있다.

추가 실시양태에서, 바로 앞의 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 시알릴트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 시알릴트랜스퍼라제 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 시알릴트랜스퍼라제는 알파2,6-시알릴트랜스퍼라제이다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태 또는 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태, 또는 그의 혼합물을 우세하게 포함하는 재조합 당단백질을 생성한다. 하등 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 효모 및 사상 진균의 경우에, 숙주 세포가 N-글리칸으로의 전달을 위해 CMP-시알산을 제공하는 수단을 추가로 포함하는 것이 유용하다. 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0260729는 하등 진핵생물을 유전자 조작하여 CMP-시알산 합성 경로를 갖도록 하는 방법이 개시되어 있고, 미국 공개 특허 출원 번호 2006/0286637은 하등 진핵생물을 유전자 조작하여 시알릴화 당단백질을 생산하도록 하는 방법을 개시하고 있다. 시알릴화의 양을 증대시키기 위해, 2 카피 이상의 CMP-시알산 합성 경로 또는 2 카피 이상의 시알릴트랜스퍼라제를 포함하는 숙주 세포를 구축하는 것이 유리할 수 있다. 상기 세포에서 생산된 당단백질은 시험관내 뉴라미니다제로 처리되어 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태 또는 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 당형태, 또는 그의 혼합물을 우세하게 포함하는 재조합 당단백질을 생산할 수 있다.

임의의 상기 숙주 세포는 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0208617 및 2007/0037248에 개시된 바와 같이 양분성 (GnT III) 및/또는 다중안테나 (GnT IV, V, VI 및 IX) N-글리칸 구조를 갖는 당단백질을 생산하기 위해 GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI 및 GnT IX로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 GlcNAc 트랜스퍼라제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 숙주 세포는 NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂,NGNA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂, 또는 NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂ 및 NGNA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂의 조합을 포함하는 항체를 비롯하여 SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂를 포함하는 재조합 당단백질 (예를 들어, 항체)을 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 당단백질은, SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man₃GlcNAc₂로 이루어지고 임의의 α2-3 연결된 SA가 없는 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 N-글리칸을 포함할 것이다.

추가 실시양태에서, GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-글리칸을 우세하게 갖는 당단백질을 생산하는 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 갈락토실트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 갈락토실트랜스퍼라제 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당형태를 우세하게 포함하는 재조합 당단백질을 생산한다.

추가 실시양태에서, GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-글리칸을 우세하게 갖는 당단백질을 생산하는 바로 앞의 숙주 세포는, 촉매 도메인과 정상적으로 회합되지 않고 시알릴트랜스퍼라제 활성을 숙주 세포의 ER 또는 골지체에 표적화하기 위해 선택된 세포 표적화 신호 펩티드에 융합된 시알릴트랜스퍼라제 촉매 도메인을 추가로 포함한다. 숙주 세포의 ER 또는 골지체를 통한 재조합 당단백질의 통과는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂ 당형태 (예를 들어 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂ 또는NGNAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂, 또는 그의 혼합물)을 포함하는 재조합 당단백질을 생산한다.

임의의 상기 숙주 세포는 하나 이상의 당 수송체, 예컨대 UDP-GlcNAc 수송체 (예를 들어, 클루이베로미세스 락티스 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) UDP-GlcNAc 수송체), UDP-갈락토스 수송체 (예를 들어, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) UDP-갈락토스 수송체), 및 CMP-시알산 수송체 (예를 들어, 인간 시알산 수송체)를 추가로 포함할 수 있다. 하등 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 효모 및 사상 진균은 상기 수송체가 결핍되어 있기 때문에, 하등 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 효모 및 사상 진균이 상기 수송체들을 포함하도록 유전자 조작되는 것이 바람직하다.

또한, 임의의 상기 숙주 세포는 N-글리칸 점유를 증가시키기 위해 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gaulitzek et al., Biotechnol. Bioengin. 103:1164-1175 (2009); Jones et al., Biochim. Biospyhs. Acta 1726:121-137 (2005)]; WO2006/107990을 참조한다. 한 실시양태에서, 임의의 상기 숙주 세포는 이종 단일-서브유닛 올리고사카릴트랜스퍼라제 (예를 들어, 리슈마니아(Leishmania) 종 STT3A 단백질, STT3B 단백질, STT3C 단백질, STT3D 단백질, 또는 그의 조합)를 코딩하는 1개 이상의 핵산 분자, 및 이종 당단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하도록 추가로 조작될 수 있고, 여기서 숙주 세포는 내인성 OTase 복합체를 포함하는 단백질을 코딩하는 내인성 숙주 세포 유전자를 발현한다. 한 실시양태에서, 임의의 상기 숙주 세포는 리슈마니아 종 STT3D 단백질을 코딩하는 1개 이상의 핵산 분자, 및 이종 당단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하도록 추가로 조작될 수 있고, 여기서 숙주 세포는 내인성 OTase 복합체를 포함하는 단백질을 코딩하는 내인성 숙주 세포 유전자를 발현한다.

숙주 세포는 α-만노시다제-저항성 N-글리칸을 갖지 않는 당단백질을 생산하도록 유전자 조작된 하등 진핵생물 세포 (예를 들어, 효모, 예컨대 피키아 파스토리스)를 추가로 포함한다. 이것은 하나 이상의 β-만노실트랜스퍼라제 유전자 (예를 들어, BMT1, BMT2, BMT3 및 BMT4)를 결실 또는 파괴시킴으로써 (미국 공개 특허 출원 번호 2006/0211085 참조) 및 포스포만노스 잔기를 갖는 당단백질의 경우에 포스포만노실 트랜스퍼라제 유전자 PNO1 및 MNN4B 중의 하나 또는 둘 다를 결실 또는 파괴시킴으로써 달성될 수 있고 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,198,921 및 7,259,007 참조), 또한 추가의 측면에서 MNN4A 유전자를 결실 또는 파괴시키는 것을 포함할 수 있다. 파괴는 특정한 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 파괴 또는 오픈 리딩 프레임 발현의 파괴 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용한 하나 이상의 β-만노실트랜스퍼라제 및/또는 포스포만노실트랜스퍼라제를 코딩하는 RNA의 번역의 불능화를 포함한다. 또한, 세포는 화학적 억제제의 첨가 또는 세포 배양 조건의 변형을 통해 α-만노시다제-저항성 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생산할 수 있다. 이들 숙주 세포는 특정한 N-글리칸 구조를 생산하기 위해 상기 기재된 바와 같이 추가로 변형될 수 있다.

숙주 세포는 하나 이상의 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 (Dol-P-Man; 단백질 (Ser/Thr) 만노실 트랜스퍼라제 유전자) (PMT)를 결실 또는 파괴시킴으로써 당단백질의 O-글리코실화를 제어하기 위해 유전자 변형되거나 (미국 특허 번호 5,714,377 참조) 또는 공개된 국제 출원 번호 WO 2007/061631에 개시된 바와 같이 Pmtp 억제제 및/또는 α-만노시다제의 존재 하에 성장하거나, 또는 둘 모두가 적용된 하등 진핵생물 세포 (예를 들어, 효모, 예컨대 피키아 파스토리스)를 추가로 포함한다. 파괴는 Pmtp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 파괴시키는 것, 또는 오픈 리딩 프레임의 발현을 파괴시키는 것, 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용하여 하나 이상의 Pmtp를 코딩하는 RNA의 번역을 폐지하는 것을 포함한다. 숙주 세포는 특정한 N-글리칸 구조를 생산하도록 변형된 상기 언급된 숙주 세포들 중 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.

Pmtp 억제제는 벤질리덴 티아졸리딘디온을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 벤질리덴 티아졸리딘디온의 예는 5-[[3,4-비스(페닐메톡시)페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 5-[[3-(1-페닐에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 및 5-[[3-(1-페닐-2-히드록시)에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산이다.

특정한 실시양태에서, 하나 이상의 내인성 PMT 유전자의 기능 또는 발현은 감소, 파괴 또는 결실된다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, PMT1, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 PMT 유전자의 기능 또는 발현은 감소, 파괴 또는 결실되거나; 또는 숙주 세포는 하나 이상의 PMT 억제제의 존재 하에 배양된다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 PMT 유전자 결실 또는 파괴를 포함하고, 숙주 세포는 하나 이상의 Pmtp 억제제의 존재 하에 배양된다. 이들 실시양태의 특정한 측면에서, 숙주 세포는 또한 분비형 α-1,2-만노시다제를 발현한다.

PMT 결실 또는 파괴 및/또는 Pmtp 억제제는 O-글리코실화 점유를 감소시킴으로써, 즉 글리코실화된 당단백질 상의 O-글리코실화 부위의 전체 수를 감소시킴으로써 O-글리코실화를 제어한다. 세포에 의해 분비되는 α-1,2-만노시다제의 추가의 첨가는 당단백질 상에 있는 O-글리칸의 만노스 쇄 길이를 감소시킴으로써 O-글리코실화를 제어한다. 따라서, PMT 결실 또는 파괴 및/또는 Pmtp 억제제를 분비형 α-1,2-만노시다제와 조합하는 것은 점유 및 쇄 길이를 감소시킴으로써 O-글리코실화를 제어한다. 특정한 상황에서, PMT 결실 또는 파괴, Pmtp 억제제 및 α-1,2-만노시다제의 특정한 조합은 실험적으로 결정되며, 이는 특정한 이종 당단백질 (예를 들어, Fab 및 항체)이 상이한 효율 정도로 발현되고 골지체로 수송될 수 있고, 따라서 PMT 결실 또는 파괴, Pmtp 억제제 및 α-1,2-만노시다제의 특정한 조합을 필요로 할 수 있기 때문이다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 내인성 만노실트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 유전자가 결실된다. 이 결실(들)은 분비형 α-1,2-만노시다제 및/또는 PMT 억제제를 제공하는 것과 조합될 수 있거나, 또는 분비형 α-1,2-만노시다제 및/또는 PMT 억제제를 제공하는 것을 대신할 수 있다.

따라서, O-글리코실화의 제어는 본원에 개시된 숙주 세포에서 더 양호한 총 수율로 또는 적합하게 어셈블리된 당단백질의 산출로 특정한 당단백질을 생산하는데 유용할 수 있다. O-글리코실화의 감소 또는 제거는 전체 항체 및 Fab 단편의 어셈블리 및 수송에 대한 유익한 효과를 갖는 것으로 보이며, 그 이유는 이들이 분비 경로를 가로질러 세포 표면으로 수송되기 때문이다. 따라서, O-글리코실화가 제어된 세포에서, 적절하게 어셈블리된 항체 또는 Fab 단편의 수율은 O-글리코실화가 제어되지 않은 숙주 세포에서 얻어진 수율보다 증가한다.

α-만노시다제에 대해 저항성인 β-연결된 만노스 잔기를 갖는 N-글리칸 및 O-글리칸의 가능성을 감소 또는 제거하기 위해, β-만노실트랜스퍼라제 유전자 (예를 들어, BMT1, BMT2, BMT3 및 BMT4) 중 하나 이상을 결실 또는 파괴시킴으로써 α-만노시다제-저항성 N-글리칸을 갖는 당단백질을 제거하도록 재조합 당조작된 피키아 파스토리스 숙주 세포가 유전자 조작된다 (미국 특허 번호 7,465,577 및 미국 특허 번호 7,713,719 참조). BMT2, 및 BMT1, BMT3 및 BMT4 중 하나 이상의 결실 또는 파괴는 또한 숙주 세포 단백질에 대한 항체의 검출가능한 교차 반응성을 감소 또는 제거한다.

당단백질의 수율은 일부 경우에 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 과다발현함으로써 또는 하나 이상의 내인성 샤페론 단백질을 코딩하는 유전자를 하나 이상의 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 교체함으로써 개선될 수 있다. 또한, 숙주 세포에서의 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질의 발현은 또한 세포에서 O-글리코실화를 제어하는 것으로 보인다. 따라서, 샤페론 단백질을 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자가 감소 또는 제거되고, 샤페론 단백질의 하나 이상의 포유동물 또는 인간 상동체를 코딩하는 벡터가 숙주 세포 내에서 발현되는 본원의 숙주 세포가 추가로 포함된다. 내인성 숙주 세포 샤페론 및 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질이 발현되는 숙주 세포가 또한 포함된다. 추가 측면에서, 하등 진핵생물 숙주 세포는 효모 또는 사상 진균 숙주 세포이다. 재조합 단백질의 수율을 개선하거나 또는 O-글리코실화를 감소 또는 제어하기 위해 인간 샤페론 단백질이 도입된 숙주 세포의 샤페론의 사용의 예는 공개된 국제 출원 번호 WO 2009105357 및 WO2010019487에 개시되어 있다 (그 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). 상기와 마찬가지로, 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 내인성 샤페론 단백질을 코딩하는 유전자를 하나 이상의 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 교체하거나 또는 하나 이상의 포유동물 또는 인간 샤페론 단백질을 과다발현하는 것 외에도, 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 (PMT) 단백질을 코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 기능 또는 발현이 감소, 파괴 또는 제거된 하등 진핵 숙주 세포가 추가로 포함된다. 특정한 실시양태에서, PMT1, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 PMT 유전자의 기능이 감소, 파괴 또는 제거된다.

또한, O-글리코실화는 항원에 대한 항체 또는 Fab 단편의 친화도 및/또는 결합력에 대해 효과를 가질 수 있다. 이것은 항체 또는 Fab의 생산을 위한 최종 숙주 세포가 항체를 선택하기 위해 사용된 숙주 세포와 동일하지 않은 경우에 특히 유의할 수 있다. 예를 들어, O-글리코실화는 항원에 대한 항체 또는 Fab 단편의 친화도를 방해하고, 따라서 그렇지 않으면 항원에 대한 높은 친화도를 가질 수 있는 항체 또는 Fab 단편이 확인되지 않을 수 있으며, 그 이유는 O-글리코실화가 항원에 결합하는 항체 또는 Fab 단편의 능력을 방해할 수 있기 때문이다. 다른 경우에, 항원에 대한 높은 결합력을 갖는 항체 또는 Fab 단편이 확인되지 않을 수 있으며, 그 이유는 O-글리코실화가 항원에 대한 항체 또는 Fab 단편의 결합력을 방해하기 때문이다. 상기 두 경우에, 포유동물 세포주에서 생산되는 경우에 특히 효과적일 수 있는 항체 또는 Fab 단편은 확인되지 않을 수 있으며, 그 이유는 항체 또는 Fab 단편을 확인하고 선택하기 위한 숙주 세포가 또 다른 세포 유형, 예를 들어, 효모 또는 진균 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스 숙주 세포)이기 때문이다. 효모 내 O-글리코실화가 포유동물 세포 내 O-글리코실화로부터 유의하게 상이할 수 있음은 잘 공지되어 있다. 이것은 야생형 효모 O-글리코실화를 포유동물에서의 뮤신-유형 또는 디스트로글리칸 유형 O-글리코실화와 비교시 특히 관련이 있다. 특정한 경우에, O-글리코실화는 항원 결합을 방해하는 대신에 항원에 대한 항체 또는 Fab 단편 친화도 또는 결합력을 증진시킬 수 있다. 이 효과는 생산 숙주 세포가 항체 또는 Fab 단편을 확인하고 선택하기 위해 사용되는 숙주 세포로부터 상이한 경우에 바람직하지 않으며 (예를 들어, 확인 및 선택은 효모에서 수행되고, 생산 숙주는 포유동물 세포임), 그 이유는 생산 숙주에서 O-글리코실화는 항원에 대한 증진된 친화도 또는 결합력을 야기하는 유형이 더 이상 아닐 것이기 때문이다. 따라서, O-글리코실화의 제어는 숙주 세포의 O-글리코실화 시스템에 의해 영향받는 항체 또는 Fab 단편의 확인 및 선택 없이 항원에 대한 항체 또는 Fab 단편의 친화도 또는 결합력을 기초로 하여 특정한 항원에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 Fab 단편을 확인하고 선택하기 위해 본원의 물질 및 방법을 사용을 가능하게 한다. 따라서, O-글리코실화의 제어는 포유동물 세포주에서 최종적으로 생산될 항체 또는 Fab 단편을 확인하고 선택하기 위해 효모 또는 진균 숙주 세포의 유용성을 추가로 증진시킨다.

당업자는 본원에 기재된 방법 및 물질을 특이적 N-글리칸 또는 시알릴화 당단백질을 생산하도록 유전자 조작된 다른 피키아 파스토리스 및 효모 세포주, 예컨대 비제한적으로, 특이적 갈락토실화 또는 시알릴화 형태를 생산하도록 유전자 조작된 상기 기재된 숙주 유기체 및 세포주와 조합하여 이용하는 방법을 추가로 인지하고 이해할 것이다. 예를 들어, 그 기재내용이 자세하게 제시된 바와 같이 본원에 포함되는, 탄소원으로서 갈락토스의 흡수 및 이용을 위한 경로가 유전자 변형된, 하등 진핵생물에서 시알릴화 N-글리칸의 생산이 기재된 US 2006-0286637을 참조한다.

추가로, 본원의 방법은 α2,6 시알릴트랜스퍼라제 활성을 갖지 않는 인간-유사 및 인간 당단백질을 생산하도록 조작된 다른 하등 진핵 세포주에서 상기 기재된 재조합 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 시알릴화 N-글리칸의 생산이 고유한 특징인 진핵 세포주에서 상기 기재된 재조합 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하기 위해 이용될 수 있다.

Fc-함유 폴리펩티드 상의 α2,3- 및 α2,6-연결된 시알산의 수준은 핵 자기 공명 (NMR), 정상상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 펄스식 전류측정 검출을 갖는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC-PAD)를 비롯한 널리 공지된 기술을 이용하여 측정될 수 있다.

Fc 뮤테인의 생물학적 특성

다수의 Fc-함유 폴리펩티드의 경우에, 감소된 FcγR 및 C1q 결합에 의해 제시되는 바와 같은 이펙터 기능에서의 결핍 또는 유의한 감소 (문헌 [Idusogie et al., J. Immunology, 164(8): 4178-84 (2000) 및 Shields et al., J. Biol. Chem., 276: 6591-6604 (2001)]), 및 증가된 항염증 특성이 바람직한 특징일 것이다.

본 발명자들은 상기 목적하는 특징을 갖는 Fc-함유 폴리펩티드를 생산할 사중 Fc 뮤테인 F243A/V264A/S267E/L328F를 개발하였다. 본원의 실시예는 숙주 세포를 Fc 영역의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함한다.

Fc-함유 폴리펩티드의 생산

본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 생성하는데 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편 (항체의 Fc 영역을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않음)이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 이뮤노어드헤신이다. 항체 및 항체 단편의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 점 돌연변이를 폴리펩티드 내에 도입하는 방법, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발도 당업계에 널리 공지되어 있다.

본원에 개시된 실시예에서, 컨센서스 C_H2 서열 및 본원에 기재된 Fc 이중 돌연변이체를 함유하는 IgG1 중쇄 및 경쇄는 2개의 상이한 당조작된 피키아 파스토리스 균주에서 발현되었다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 유전자 서열은 메탄올 유도성 프로모터 AOX1의 제어 하에 있고, 블레오마이신 (제오신(Zeocin)) 선택 마커를 혼입하였다. 이 전략은 전체 발현 카세트를 상동성 DNA 재조합에 의해 Trp2 좌위 내로 통합한다.

분비형 항체는 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 이어서 소스(Source) 30S 양이온 교환 정제 단계에 의해 발효 브로쓰로부터 포획하였다. 정제된 항체는 SDS-PAGE에 의해 특성화되어 (도 2) 적절한 어셈블리를 평가하였다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본원의 물질 및 방법에 의해 생산된 항체는 적절하게 어셈블리되었다.

본원의 물질 및 방법에 의해 제조된 다양한 항체에 대한 항원 친화도는 비아코어를 이용하는 세포 기반 검정에 의해 결정되었다. 예상되는 바와 같이, Fc 뮤테인을 비롯한 모든 항체는 PCSK9 항원에 동등하게 잘 결합하였다.

Fc 뮤테인의 N-글리칸 분석

특정 항체를 비롯한 다수의 당단백질에 대해, IgG Fc 영역의 말단 N-연결된 글리칸의 시알릴화는 치료 활성을 부여하기 위해 정확한 입체형태를 갖는 당단백질 및 항체의 생산에 필수적이다. 예를 들어, 문헌 [Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008)]을 참조하고, 여기서 말단 시알릴화는 IVIG 제제에 대한 항염증 활성과 상관관계가 있었다. 시알릴화는 시알릴 트랜스퍼라제가 시알릴화 글리칸 형성을 위해 작용하는, 말단에서 두번째의 갈락토스의 존재를 필요로 한다. 따라서, 하나 이상의 말단 갈락토스 당형태가 결핍된 당단백질은 항염증 활성과 연관된 α2,6-연결된 시알산 조성을 갖는 항체를 생산할 수 없다.

포유동물 세포는 그의 당단백질 상에서의 완전 시알릴화 능력을 갖지만, 그러나 공간적 수축으로 인해, 포유동물 세포 배양물, 예컨대 CHO 세포에서 생산된 항체는 심지어 그의 N297 연결된 글리칸으로의 불완전 갈락토스 전달을 갖는다. 더욱이, 추가의 공간적 장애물 때문에, 포유동물 세포, 예컨대 CHO로부터의 항체의 시알릴화 수준은 통상적으로 그의 N297 연결된 글리칸에서 시알산을 거의 함유하지 않거나 또는 전혀 함유하지 않는다. CHO 세포 생산의 경우에, 시알산을 첨가할 때, 이는 α2,3-연결에 의해 연결된다. CHO 세포는 시알산의 α2,6-연결된 형태를 생산하기 위해 필수적인 α2,6 시알릴 트랜스퍼라제를 발현하지 않고, 이는 항염증 활성과 연관되어 있다 (문헌 [Lee et al., J. Biol. Chem. 264: 13848-13855 (1989)]). CHO에서 특이적 α2,6 시알릴트랜스퍼라제의 과다발현은 α2,3-연결된 및 α2,6-연결된 시알산의 혼합물을 생성할 수 있다 (문헌 [Bragonzi et al., BBA 1474:273-282 (2000); Biochem. Biophys. Res. Comm. 289: 243-249 (2001)]).

높은 수준의 갈락토실화된 비-항체 단백질, 예컨대 에리트로포이에틴을 생산할 수 있는 당조작된 피키아 파스토리스 GFI5.0 균주 (문헌 [Hamilton et al., Science, 313: 1441-1443 (2006)])는 α 2,6-연결된 시알릴화 형태를 형성하기 위해 작용할 수 있는 말단 갈락토스의 비교적 적은 양을 갖는 항체를 생산한다. 이러한 피키아 파스토리스 균주에서 생산된 항체는 전형적으로 당형태 G0 (60%), G1 (17%), G2 (4%) 및 Man5 (8%)를 포함하는 조성을 갖는다. 심지어 G0 (43.5%), G1 (20.8%), G2(2.7%), NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂ (5.5%) 및 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ (4.9%)를 포함하는 글리칸 조성을 갖는 피키아 파스토리스 GFI6.0 균주에서 생산된 항체도 비교적 낮은 수준의 α 2,6-연결된 시알릴화 형태를 갖는다. 따라서, GFI 5.0 및 6.0 균주에서 생산된 항체는 동일한 균주에서 생산된 비-항체 단백질 (예컨대 에리트로포이에틴)에 비해 보다 더 낮은 수준의 갈락토실화 및 시알릴화를 갖는다.

GFI5.0 균주 (YGLY21351)로부터의 피키아 파스토리스 야생형 PCSK-9 항체 (1F11)의 당형태는 M4, G0, G1, M6, G2 글리칸을 포함한다. GFI 6.0 균주 (YGLY23258)로부터의 피키아 파스토리스 이중 뮤테인 PCSK-9 항체 (1F11 F243A/V264A)의 당형태는 G0, M5, G1, G2, A1 및 A2 글리칸을 포함한다. GFI 6.0 균주로부터의 피키아 파스토리스 1F11 F243A/V264A/S267E/L328F)의 당형태는 A1, A1H 및 A2 (YGLY25267) 및 G2, Man5, A1 및 A2 (YGLY25269)를 포함한다.

Fc 뮤테인의 FcγR 결합

ELISA 기반 검정을 이용하여, 출원인은 상업적으로 입수가능한 헤르셉틴, 야생형 항-PCSK9 항체 (1F11), F243A/V243A 돌연변이를 갖는 이중 뮤테인 항-PCSK9 (1F11) 항체, 및 F243A/V264A/S267E/L328F 돌연변이를 갖는 사중 뮤테인 항-PCSK9 (1F11) 항체에 대한 Fc 감마 수용체 (FcγR) 결합을 비교하였다. 실시예에 나타낸 바와 같이, Fc 사중 뮤테인은 천연 Fc 영역을 갖는 항체와 비교시 또는 F243A/V264A 이중 돌연변이를 갖는 항체와 비교시, FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIa에 대한 감소된 친화도 및 FcγRIIb에 대한 상승된 친화도를 갖는다.

이중 또는 사중 뮤테인 중 어느 것도 FcγRIIa에 결합하지 않는다.

이중 또는 사중 뮤테인 중 어느 것도 FcγRIIIa-F158 또는 FcγRIIIa-V158에 결합하지 않는다.

그러나, 사중 뮤테인은 FcγRIIb에 대한 증가된 결합을 가지며, 이는 이중 뮤테인이 이 수용체에 단지 최소 결합을 보여주기 때문에 놀라운 것이다.

함께 고려하여, 이들 데이터는 사중 Fc 뮤테인이 항체의 이중 뮤테인 또는 비-뮤테인 (천연) 버전과 비교시 면역 세포, 예컨대 대식세포, 단핵구 및 자연 킬러 세포를 활성화하고 동원하는 경향이 적음을 시사한다.

생물학적 표적

하기 실시예에서 출원인이 항-PCSK9 항체를 이용하여 본 발명의 물질 및 방법을 예시하지만, 본 발명이 개시된 항체에 제한되지 않는다는 것을 주의해야 한다. 당업자는 증진된 항염증 활성 또는 감소된 이펙터 기능의 특징이 바람직할 임의의 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하기 위해 본원의 물질 및 방법이 사용될 수 있음을 인지하고 인식할 것이다. 또한, 이와 같이 본 발명에 의해 생산된 Fc-함유 폴리펩티드 또는 항체의 유형에 대한 제한이 존재하지 않음을 주의해야 한다. Fc-함유 폴리펩티드의 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM의 것일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 비롯한 IgG로부터의 것이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드의 Fc 영역은 IgG1로부터의 것이다. 구체적 실시양태에서, 본원의 물질 및 방법에 의해 생산된 항체 또는 항체 단편은 인간화, 키메라 또는 인간 항체일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 염증에 관여하는 생물학적 표적에 결합할 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 염증유발 시토카인에 결합할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 APRIL, INF-α, BAFF (BLys), CD22, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD38, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-인테그린, E-셀렉틴, 팩트 II, ICAM-3, 베타2-인테그린, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC, αBLys, 또는 상기 언급된 임의의 분자에 대한 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 결합할 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 TNF-α에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 Her2에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 PCSK9에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 TNFR에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 LCAT에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 TSLP에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 PD-1에 결합할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 IL-23에 결합할 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 자가면역 항원, 알레르겐, MHC 분자 또는 레서스 인자 D 항원으로부터 선택된 항원에 대해 특이적일 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO2010/10910의 표 1에 열거된 항원을 참조한다.

항염증 특성을 증가시키거나 또는 이펙터 기능/세포독성을 감소시키는 방법

본 발명은 또한, 염증성 상태를 치료하는데 유용한 모 Fc-함유 폴리펩티드 (예를 들어, 염증에 관여하는 항원에 결합하는 항체 또는 이뮤노어드헤신)를 선택하고, Fc-함유 폴리펩티드의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 증가된 항염증 특성을 갖는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성을 증가시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 염증에 관여하는 항원에 결합하는 항체, 항체 단편 또는 이뮤노어드헤신이다. 한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 염증성 상태의 치료를 위해 이미 시판되거나 개발 중인 항체, 항체 단편 또는 이뮤노어드헤신이다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 무로모납-CD3 (항-CD3 수용체 항체), 압식시맙 (항-CD41 7E3 항체), 리툭시맙 (항-CD20 항체), 다클리주맙 (항-CD25 항체), 바실릭시맙 (항-CD25 항체), 팔리비주맙 (항-RSV (호흡기 세포융합 바이러스) 항체), 인플릭시맙 (항-TNFα 항체), 트라스투주맙 (항-Her2 항체), 겜투주맙 오조가미신 (항-CD33 항체), 알렘투주맙 (항-CD52 항체), 이브리투모맙 티욱세탄 (항-CD20 항체), 아달리무맙 (항-TNFα 항체), 오말리주맙 (항-IgE 항체), 토시투모맙-131I (항-CD20 항체의 아이오딘화 유도체), 에팔리주맙 (항-CD11a 항체), 세툭시맙 (항-EGF 수용체 항체), 골리무맙 (항-TNFα 항체), 베바시주맙 (항 VEGF-A 항체), 나탈리주맙 (항 α4 인테그린), 에팔리주맙 (항 CD11a), 세톨리주맙 (항-TNFα 항체), 토실리주맙 (항-IL-6R), 우스텐키누맙 (항 IL-12/23), 알렘투주맙 (항 CD52) 및 나탈리주맙 (항 α4 인테그린), 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 아르칼리스트/ 릴로나셉트 (IL1R-Fc 융합체), 오렌시아/ 아바타셉트 (CTLA-4-Fc 융합체), 아메비브/ 알레파셉트 (LFA-3-Fc 융합체), 아나킨라-Fc 융합체 (IL-1Ra-Fc 융합 단백질), 에타네르셉트 (TNFR-Fc 융합 단백질), FGF-21-Fc 융합 단백질, GLP-1-Fc 융합 단백질, RAGE-Fc 융합 단백질, ActRIIA-Fc 융합 단백질, ActRIIB-Fc 융합 단백질, 글루카곤-Fc 융합 단백질, 옥신토모듈린-Fc-융합 단백질, GM-CSF-Fc 융합 단백질, EPO-Fc 융합 단백질, 인슐린-Fc 융합 단백질, 프로인슐린-Fc 융합 단백질 및 인슐린 전구체-Fc 융합 단백질, 및 그의 유사체 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc-융합 단백질이다.

본 발명은 또한 모 Fc-함유 폴리펩티드의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 상기 Fc 함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 이펙터 기능을 갖고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 이펙터 기능을 감소시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 또 다른 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC이다.

본 발명은 또한 염증에 관여하는 항원에 결합하는 염증성 상태를 치료하는데 유용한 모 Fc-함유 폴리펩티드 (예를 들어, 염증에 관여하는 항원에 결합하는 항체 또는 이뮤노어드헤신)를 선택하고, Fc-함유 폴리펩티드의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 감소된 세포독성을 갖는 것인 Fc-함유 폴리펩티드의 세포독성을 감소시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다.

한 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 천연 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 V264A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모 Fc-함유 폴리펩티드는 F243A/V264A 돌연변이를 포함한다.

치료 방법

본 발명은 또한 대상체에게 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 염증성 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드 비경구로 투여된다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 피하로 투여된다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 원치 않는 염증성 면역 반응이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 자가면역 질환이다. 한 실시양태에서, 염증성 상태는 다발성 경화증일 것이다. 한 실시양태에서, 염증성 상태는 전신 홍반성 루푸스이다. 한 실시양태에서, 염증성 상태는 제I형 당뇨병이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 선천성 무감마글로불린혈증 및 저감마글로불린혈증, 공통 가변성 면역결핍, 중증 복합 면역결핍, 또는 비스코트 알드리치 증후군을 비롯한 원발성 면역결핍 증후군이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 B-세포 림프구성 백혈병, HIV 감염 또는 동종 골수 이식을 비롯한 속발성 면역결핍 증후군이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 특발성 혈소판감소성 자반증이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 다발성 골수종이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 길랑-바레 증후군이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 가와사키병이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP)이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 자가면역 호중구감소증이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 용혈성 빈혈이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 항-인자 VIII 자가면역 질환이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 다초점 신경병증이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 전신 혈관염 (ANCA 양성)이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 다발근염이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 피부근염이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 항인지질 증후군이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 패혈증 증후군이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 이식편-대-숙주 질환이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 알레르기이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 항-레서스 인자 D 반응이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 전신 홍반성 루푸스 (SLU)이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 심혈관계의 염증성 상태이다. 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 모두 염증과 연관된, 아테롬성동맥경화증, 아테롬성혈전증, 관상 동맥 고혈압, 급성 관상동맥 증후군 및 심부전의 치료를 위해 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 중추 신경계의 염증성 상태이다. 또 다른 실시양태에서, 염증성 상태는 말초 신경계의 염증성 상태일 것이다. 예를 들어, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 예를 들어 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (일명 ALS; 루게릭병), 허혈성 뇌 손상, 프리온 질환 및 HIV-연관 치매의 치료를 위해 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 위장관의 염증성 상태이다. 예를 들어, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 염증성 장 장애, 예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 복강 질환 및 과민성 장 증후군의 치료를 위해 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 건선, 아토피성 피부염, 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염, 골관절염 및 건선성 관절염이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 스테로이드-의존성 아토피성 피부염이다.

한 실시양태에서, 염증성 상태는 악액질이다.

본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드를 사용하여 치료될 수 있는 다른 염증성 장애의 예는 또한 심상성 여드름, 천식, 자가면역 질환, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 사르코이드증, 이식 거부, 혈관염, 간질성 방광염 및 근병증을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 체중 킬로그램당 1 내지 100 밀리그램의 용량으로 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 체중 킬로그램당 0.001 내지 10 밀리그램의 용량으로 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 체중 킬로그램당 0.001 내지 0.1 밀리그램의 용량으로 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 체중 킬로그램당 0.001 내지 0.01 밀리그램의 용량으로 투여될 것이다.

제약 제제

본 발명은 또한 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-함유 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드 상의 적어도 70%의 N-글리칸은 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고사카라이드 구조를 포함하고, 여기서 Fc-함유 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 F243A/V264A/S267E/L328F이다. 한 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 서열 17을 포함하는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, Fc-함유 폴리펩티드는 서열 7 또는 서열 8 또는 서열 17로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 적어도 47 몰%의 N-글리칸은 구조 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂를 갖는다. 한 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸 내의 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 부착된다. 한 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸 내의 시알산 잔기는 α-2,6 연결을 통해 부착되고, 검출가능한 수준의 α-2,3 연결된 시알산은 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 시알릴화 N-글리칸은 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA)을 포함하지 않을 것이다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 동물에서, 보다 구체적으로 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인정된 다른 약전에 열거된 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미하고, 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 담체의 특성은 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

치료제 및 진단제의 제약 제제는 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와, 예를 들어, 동결건조 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로 혼합함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc, New York, NY] 참조).

투여 방식은 다양할 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 골수내, 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 침습 경로에 의해, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다 (상기 참조). 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드 또는 그의 제약 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 동맥내로, 관절내로 (예를 들어 관절염 관절에서), 종양내로, 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비-침습 경로 (예를 들어, 경구로; 예를 들어, 환제, 캡슐 또는 정제)에 의한 투여가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어 미리 충전된 시린지 또는 자동주입기를 비롯한 피하 바늘을 갖는 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대 미국 특허 번호 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 개시된 장치를 이용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 주입에 의해 투여될 수 있다. 제약 조성물 투여를 위한 널리 공지된 임플란트 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능한 미세주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,487,603; 정밀한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,439,196. 다수의 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

대안적으로, 항체는 전신 방식보다는 국부 방식으로, 예를 들어 관절염성 관절 내로의 항체의 직접 주사를 통해, 종종 데포 또는 지속 방출 제제로 투여될 수 있다. 또한, 항체는 표적화 약물 전달 시스템으로, 예를 들어 관절염성 관절 또는 면역병리학에 의해 특성화되는 병원체-유도 병변을 표적화하는, 예를 들어 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜으로 투여될 수 있다. 리포솜은 이환된 조직에 대해 표적화되고 이에 의해 선택적으로 흡수될 것이다.

투여 요법은 치료 항체의 혈청 또는 조직 교체율, 증상의 수준, 치료 항체의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 비롯한 여러 인자에 따라 의존적이다. 바람직하게는, 투여 요법은 원치 않는 부작용을 동시에 최소화하면서 표적 질환 상태의 개선을 달성하기 위해 충분한 치료 항체를 전달한다. 따라서, 전달되는 생물학적 물질의 양은 부분적으로는 특정한 치료 항체 및 치료할 상태의 중증도에 따라 의존적이다. 치료 항체의 적절한 용량 선택에 대한 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).

적절한 용량의 결정은 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있거나 의심되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양에서 시작하며, 그후 임의의 부정적 부작용에 비해 바람직하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량 증분으로 증가시킨다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다. 바람직하게는, 사용될 생물 물질은 치료를 위해 표적화되는 동물과 동일한 종으로부터 유래되고, 따라서 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화한다. 인간 대상체의 경우에, 예를 들어, 키메라, 인간화 및 완전 인간 Fc-함유 폴리펩티드가 바람직하다.

Fc-함유 폴리펩티드는 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 매일, 1주에 1-7회, 매주, 격주, 매달, 격월, 매분기, 매반년, 매년 등으로 투여되는 용량에 의해 제공될 수 있다. 용량은 예를 들어 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비내, 직장으로, 근육내, 뇌내, 척수내, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 총 1주 용량은 일반적으로 적어도 0.05 μg/kg 체중, 보다 일반적으로 적어도 0.2 μg/kg, 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0.25 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과이다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., New Engl. J. Med. 349:427-434 (2003); Herold et al., New Engl. J. Med. 346:1692-1698 (2002); Liu et al., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999); Portielji et al., Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003)] 참조). 다른 실시양태에서, 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드는 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 2500 mg/kg 대상체로 매주, 격주, "매 4주", 매달, 격월 또는 매분기 기준으로 피하로 또는 정맥내로 투여된다.

본원에 사용된 용어 "치료 유효량", "치료 유효 용량" 및 "유효량"은 단독으로 또는 추가의 치료제와 조합하여 세포, 조직 또는 대상체에게 투여될 때 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 상기 질환 또는 상태의 진행의 측정가능한 개선을 유발하기에 효과적인 본 발명의 Fc-함유 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 치료 유효 용량은 또한 증상의 적어도 부분적 개선, 예를 들어 관련 의학적 상태의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 이러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 개선 속도의 증가를 유도하기에 충분한 Fc-함유 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 단독으로 투여된 개별 활성 성분에 적용되는 경우에, 치료 유효 용량은 그 성분 단독을 지칭한다. 조합하여 적용되는 경우에, 치료 유효 용량은, 조합하여, 순차적으로 또는 동시에 투여하든지 간에, 치료 효과를 생성하는 활성 성분의 합한 양을 지칭한다. 치료제의 유효량은 진단 척도 또는 파라미터를 적어도 10%; 통상적으로 적어도 20%; 바람직하게는 적어도 약 30%; 보다 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50%의 개선을 생성할 것이다. 또한, 유효량은 주관적인 척도가 질환의 중증도 평가에 사용되는 경우에 주관적인 척도의 개선을 생성할 수 있다.

실시예 1

균주 및 시약

에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 TOP10 또는 DH5α (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주)를 재조합 DNA 연구에 사용하였다. 제한 엔도뉴클레아제, DNA 변형 효소 및 PNGase F는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs; 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies, 아이오와주 코랄빌)로부터 주문하였다.

실시예 2

IgG1 Fc 뮤테인 및 피키아 파스토리스 재조합 발현 벡터의 구축

피키아 파스토리스에서 1F11 IgG1 모노클로날 항체의 이중 및 사중 Fc 뮤테인의 제조를 하기 열거된 서열 및 프로토콜을 사용하여 수행하였다.

A. 중쇄 및 경쇄

야생형 (모) 1F11 모노클로날 IgG1 항체의 제조에 사용된 중쇄 및 경쇄 서열, 각각 서열 1 및 2는 하기 나타낸 바와 같다. 1F11 이중 뮤테인 항체의 제조에 사용된 중쇄 서열은 서열 3에 나타낸다. 1F11 사중 뮤테인 항체의 제조에 사용된 중쇄 서열은 서열 4에 나타낸다. 모든 항체에 대한 모든 경쇄 서열은 동일한 것이었다. 중쇄 및 경쇄는 피키아 파스토리스 코돈 용법에 따라 최적화된 코돈이고, 진스크립트 USA 인크.(GenScript USA Inc., 08854 뉴저지주 피스카타웨이 센테니얼 애비뉴 860)에 의해 합성되었다.

B. 신호 서열

α-교배 인자 프리도메인의 신호 서열을 PCR 융합에 의해 경쇄 또는 중쇄의 5' 말단에서 프레임 내 융합하였다. 서열을 상기 기재된 바와 같이 코돈 최적화시켰다. 코작(Kozak) 서열 AAACG를 메티오닌의 5' 말단에 부가하고, EcoR1 부위를 클로닝 목적을 위해 코작 서열 앞에 부가하였다. DNA 서열 (서열 5) 및 아미노산 (서열 6) 번역은 하기 나타낸 바와 같다.

C. IgG1 및 IgG1 Fc 뮤테인의 발현을 위한 재조합 플라스미드

IgG1 및 그의 뮤테인의 융합된 신호 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 각각 피키아 파스토리스 AOX1 프로모터 하에 및 에스. 세레비지아에 Cyc 종결인자 앞에 클로닝하였다. 완성된 중쇄 및 경쇄의 발현 카세트를 함께 최종 발현 벡터 내에 넣었다. 피키아 파스토리스 내로의 게놈 삽입은 Spe1을 사용한 벡터의 선형화 및 Trp2 부위 내로의 표적화된 통합에 의해 달성되었다.

본원에 사용된 플라스미드의 개요를 하기 표 1에 제시하였다. 1F11 사중 Fc 뮤테인에 대한 최종 발현 플라스미드의 그래픽 표현은 도 1에 제공한다.

<표 1>

실시예 3

1F11 및 그의 Fc 뮤테인을 생산하기 위한 당조작된 피키아 GFI5.0 및 GFI6.0 숙주

2종의 상이한 당조작된 피키아 숙주 GFI5.0 및 GFI 6.0을 본 발명에서 적용하였다. US 7,029,872 (Gerngross) 및 US 7,449,308 (Gerngross)에 개시된 절차에 따라, 우세한 종으로서 목적하는 N-당형태를 갖는 목적하는 폴리펩티드를 발현할 수 있도록 하등 진핵 숙주 세포를 유전자 조작하기에 유용한 벡터를 구축할 수 있다. GFI 5.0 및 GFI6.0 균주는 문헌 [Hamilton et al., Science, 313: 1441-1443 (2006)] 및 US 2006/0286637 (Hamilton)에 기재된 방법에 따라 NRRL11430 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC), 미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)으로부터 조작하였다. 조작된 피키아 파스토리스 균주 GFI5.0은 말단 갈락토스를 갖는 이중-안테나 N-글리칸 구조를 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 여기서 사용되는 GFI5.0 균주 YGLY17108의 유전자형은 하기와 같다: ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2-2 mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3 pno1Δ::lacZ ADE1::lacZ/FB8/NA10/MmSLC35A3 his1::lacZ-URA5-lacZ/XB33/SpGALE/DmUGT arg1::HIS1/KD53/TC54PRO1::ARG1/AOX1-ScMFpreTrMNS1URA6-LmSTT3d. 조작된 피키아 파스토리스 균주 GFI 6.0 YGLY3582의 유전자형은 하기와 같다: ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2-2 mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3 pno1Δ mnn4Δ::lacZADE1:lacZ/NA10/MmSLC35A3/FB8his1Δ::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGTarg1Δ::HIS1/KD53/TC54bmt4Δ::lacZ bmt1Δ::lacZ bmt3Δ::lacZTRP2:ARG1/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33ste13Δ::lacZ/TrMDS1 dap2Δ::Nat^RTRP5:Hyg^RMmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33 Vps10-1Δ:: AOX1p_LmSTT3d pGAPDH-mPomGnT1-56. YGLY17159는 말단 α 2,6-연결된 시알산이 갈락토스에 부착된 이중-안테나 N-글리칸 구조를 갖는 단백질을 생산할 수 있다.

유전자형을 기재하기 위해 사용된 약어는 일반적으로 공지되어 있고, 당업자에 의해 이해되고, 하기 약어를 포함한다:

ScSUC2 에스. 세레비지아에 인버타제

OCH1 알파-1,6-만노실트랜스퍼라제

KlMNN2-2 케이. 락티스 UDP-GlcNAc 수송체

BMT1 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT2 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT3 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

BMT4 베타-만노스-전달 (베타-만노스 제거)

MNN4L1 MNN4-유사 1 (전하 제거)

MmSLC35A3 UDP-GlcNAc 수송체의 마우스 동족체

PNO1 N-글리칸의 포스포만노실화 (전하 제거)

MNN4 만노실트랜스퍼라제 (전하 제거)

ScGAL10 UDP-글루코스 4-에피머라제

XB33 ScKRE2 리더에 융합된 말단절단된 HsGalT1

DmUGT UDP-갈락토스 수송체

KD53 ScMNN2 리더에 융합된 말단절단된 DmMNSII

TC54 ScMNN2 리더에 융합된 말단절단된 RnGNTII

NA10 PpSEC12 리더에 융합된 말단절단된 HsGNTI

FB8 ScSEC12 리더에 융합된 말단절단된 MmMNS1A

TrMDS1 분비형 티. 레세에이(T. reseei) MNS1

ADE1 N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보티드 (SAICAR) 신테타제

MmCST 마우스 CMP-시알산 수송체

HsGNE 인간 UDP-GlcNAc 2-에피머라제/N-아세틸만노스아민 키나제

HsCSS 인간 CMP-시알산 신타제

HsSPS 인간 N-아세틸뉴라미네이트-9-포스페이트 신타제

MmST6-33 ScKRE2 리더에 융합된 말단절단된 마우스 알파-2,6-시알릴 트랜스퍼라제

LmSTT3d 리슈마니아 메이저(Leishmania major)로부터의 올리고사카릴트랜스퍼라제의 촉매 서브유닛

실시예 4

효모 형질전환 및 스크리닝

당조작된 GFI5.0 및 GS6.0 균주를 YPD 풍부 배지 (효모 추출물 1%, 펩톤 2% 및 2% 덱스트로스)에서 성장시키고, 원심분리에 의해 대수기에서 수확하고, 빙냉 1M 소르비톨로 3회 세척하였다. 1 내지 5 μg의 Spe1 소화된 플라스미드를 적격 효모 세포와 혼합하고, 피키아 파스토리스 전기천공 프로그램을 예비설정한 바이오-라드 진 펄서 엑스셀(Bio-Rad Gene Pulser Xcell)™ (바이오-라드, 94547 캘리포니아주 허큘레스 알프레드 노벨 드라이브 2000)을 사용하여 전기천공하였다. 24℃에서 회수 풍부 배지에서 1시간 후에, 세포를 300 μg/ml 제오신을 함유하는 최소 덱스트로스 배지 (1.34% YNB, 0.0004% 비오틴, 2% 덱스트로스, 1.5% 한천) 플레이트 상에 플레이팅하고, 형질전환체가 나타날 때까지 24℃에서 인큐베이션하였다.

고역가 균주를 스크리닝하기 위해, 96개의 형질전환체를 완충된 글리세롤-복합 배지 (BMGY)에 접종하고, 72시간 동안 성장시킨 후, 완충된 메탄올-복합 배지 (BMMY)에서 24시간 동안 유도하였다. 항체의 분비는 단백질 A 비드 검정에 의해 하기와 같이 평가하였다. 96웰 플레이트 배양액으로부터의 50 마이크로 리터 상청액을 비-결합 96웰 검정 플레이트 내에서 50 mM 트리스(Tris) pH 8.5를 사용하여 1:1로 희석하였다. 각각의 96웰 플레이트에 대해, 2 ml의 자기 바이오맥(BioMag) 단백질 A 현탁액 비드 (퀴아젠(Qiagen); 캘리포니아주 발렌시아)를 자기 랙 내에 유지된 튜브에 넣었다. 2-3분 후에 비드가 튜브의 측면에 수집되면 완충제를 따라버렸다. 비드를 원래 부피와 동일한 부피의 세척 완충제 (100 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.0)로 3회 세척하고, 동일한 세척 완충제 중에 재현탁하였다. 20 μl의 비드를 희석된 샘플을 함유한 검정 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 부드럽게 와류시킨 후, 15분마다 와류시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 샘플 플레이트를 자기 플레이트 상에 놓아 비드가 각각의 웰의 한 측면에 수집되도록 유도하였다. 바이오멕(Biomek) NX 액체 취급기 (벡크만 쿨터(Beckman Coulter; 캘리포니아주 풀러튼)) 상에서, 플레이트로부터 상청액을 폐기 용기로 제거하였다. 이어서, 샘플 플레이트를 자석으로부터 제거하고, 비드를 100 μl 세척 완충제로 세척하였다. 플레이트를 다시 자석 상에 놓은 후 세척 완충제를 흡인에 의해 제거하였다. 20 μl 로딩 완충제 (25 mM NEM (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 함유한 인비트로젠 E-PAGE 겔 로딩 완충제)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 잠깐 와류시켰다. 500 rpm에서 벡크만 알레그라(Beckman Allegra) 6 원심분리기 상에서 원심분리한 후, 샘플을 99℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, E-PAGE 고-처리량 프리-캐스트 겔 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 진행시켰다. 겔을 겔 염색 용액 (0.5 g 쿠마시 G250 브릴리언트 블루(Coomassie G250 Brilliant Blue), 40% MeOH, 7.5% 아세트산)으로 덮고, 마이크로웨이브에서 35초 동안 가열한 다음, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 겔을 증류수 중에서 밤새 탈염색하였다. 실시예 5에서 상세히 설명되는 추가의 식스포르스(Sixfors) 발효 스크리닝을 위해 고역가 콜로니를 선택하였다. IgG1 야생형 및 Fc 뮤테인 생산 균주의 개요는 하기 표 2에 제공한다.

<표 2>

실시예 5

진탕 플라스크에서의 항체 생산

균주를 300 ml의 2% BMGY 배지가 담긴 500ml 진탕 플라스크 내에서 배양하고, 24℃에서 3일 동안 진탕하였다.

진탕 플라스크의 유도를 위한 프로토콜: 각각의 배양액의 총 부피 (300ml)를 팔콘 튜브에 수집하고, 2500rpm에서 5분 동안 스피닝시켰다. 상청액을 부어버리고, 세포 펠릿을 150ml 2% BMMY 및 360ul PMTi4 (원액 농도 0.65mg/ml)의 최종 부피 중에 재현탁하였다. 새로운 500ml 진탕 플라스크에 옮기고, 24℃에서 2일 동안 진탕시켰다. 유도된 배양액을 스핀 다운시키고, 상청액을 새로운 팔콘 튜브 내로 수집하였다.

분비형 항체를 지이 헬스케어(GE Healthcare), 스트림라인(STREAMLINE) r단백질 A (카탈로그 번호 17-1281-01)를 사용한 단백질 A 칼럼 및 바이오라드 다중-정제용 크로마토그래피 칼럼 (10ml) (카탈로그 번호 731-1550)에 의해 정제하였다. 하기 완충제를 사용하였다:

· 세척 완충제 #1: 20mM 트리스 pH 7.0, 1M NaCl

· 세척 완충제 #2: 20mM 트리스 pH 7.0

· 중화 완충제: 1M 트리스 pH 8.0- pH 9.0

· 용리 완충제: 100 mM 또는 50 mM 시트르산나트륨 pH 3.0

· 세정 용액: 물 중 6M 우레아.

정제 프로토콜은 하기와 같다:

· 500ul의 스트림라인 r단백질 A 비드를 각각의 바이오라드 칼럼에 첨가한다. 비드는 20% 에탄올 중에 있어야 한다. 비드 슬러리의 조성은 50% 비드, 50% 액체이어야 한다.

· 단백질 A 비드가 칼럼 내에 있으면, 이들은 5ml의 세척 완충제 #2로 세척해야 한다. (통과액은 폐기함)

· 10ml의 상청액을 바이오라드 칼럼에 첨가한다. 이 단계 동안, 항체는 단백질 A 비드에 결합할 것이다. (통과액은 폐기함)

· 5ml의 세척 완충제 #1을 칼럼에 첨가함으로써 원치 않는 과량의 단백질을 세척 제거한다. (통과액은 폐기함)

· 5ml의 세척 완충제 #2를 첨가함으로써 칼럼을 다시 세척한다. (통과액은 폐기함)

· 1ml의 중화 완충제를 15ml 단백질 수집 튜브에 첨가한다.

· 바이오라드 칼럼을 15ml 수집 튜브 내에 넣는다.

· 3ml의 용리 완충제를 바이오라드 칼럼에 첨가한다. 이것은 단백질 A 비드로부터 목적하는 항체를 제거할 것이다.

· 용리된 단백질을 15ml 단백질 수집 튜브 내에 수집한다.

· 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 용리된 단백질의 농도를 결정한다 (브래드포드 검정을 위해 10ul의 단백질을 사용함).

실시예 6

HPLC에 의한 N-연결된 글리칸 분석

각각의 당형태의 상대적인 양을 정량하기 위해, N-글리코시다제 F 방출된 글리칸을 2-아미노벤지딘 (2-AB)으로 표지하고, 문헌 [Choi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 100: 5022-5027 (2003) 및 Hamilton et at, Science 313: 1441-1443 (2006)]에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 분석하였다. 표 2는 GFI 6.0 숙주에서의 이중 뮤테인 및 사중 뮤테인 발현 및 GFI 5.0 숙주에서의 1F11 IgG1의 글리칸 프로파일을 보여준다. 이들 균주는 진탕 플라스크에서 배양하였다. 결과는 하기 표 2에 제시한다.

<표 2>

실시예 7

FcγR 결합 검정

Fcγ 수용체 결합 검정은 문헌 [Shields, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604]에 기재된 바와 같이 약간 변형하여 수행하였다. 높은 단백질 결합 96-웰 플레이트 (코닝 코스타(Corning Costar))를 하기 농도의 PBS 중 Fcγ 수용체 용액 웰당 100μL로 코팅하였다: FcγRI (R&D 시스템즈(R&D Systems)) 및 FcγRIIa (피키아 파스토리스 생산) 둘 다에 대해 1μg/mL, FcγRIIb (피. 파스토리스 생산)에 대해 2μg/mL, FcγRIIIa-F158에 대해 0.8μg/mL 및 FcγRIIIa-V158에 대해 0.4μg/mL (둘 다 피. 파스토리스 생산). 모든 피키아 파스토리스 생산 수용체를 발현하고, 기재된 바와 같이 정제하였다 (문헌 [Li, et al. (2006) Nature Biotechnology 24:210-215]). 단량체 항체 샘플을 FcγRI 플레이트에 첨가하고, 검정 희석제 (1x PBS, 1% BSA 및 0.05% 트윈20(Tween20))로 연속 희석하고, 웰당 100μL를 플레이트에 첨가하였다. 나머지 수용체에 대해 제조된 항체 샘플은, 검출을 위해 알칼리성 포스파타제와 접합된 1/2 몰비의 염소 항-인간 IgG F(ab')2 F(ab')2와의 1시간 이량체화 단계를 필요로 한다. 이들 이량체화된 F(ab')2/항체 복합체를 또한 연속 희석하고, 웰당 100μL를 나머지 수용체 플레이트에 첨가하고, 모든 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FcγRI 결합 샘플 항체를 동일한 염소 항-인간 IgG F(ab')2 알칼리성 포스파타제 접합된 F(ab')2를 사용하여 검출하였다. 샘플 항체 결합은 슈퍼포스(SuperPhos), 4-MUP 형광 AP 기질 검출 시스템 (비로랩스(Virolabs))을 이용하여 18시간 인큐베이션 후에 340nm에서의 여기 및 465nm에서의 방출을 측정함으로써 정량화하였다.

결과는 표 3-7에 제시한다. 각각의 표는 개별 실험의 결과를 나타낸다. 표 3에 나타낸 데이터의 그래픽 표현은 도 3에서 발견된다. 표 4에 나타낸 데이터의 그래픽 표현은 도 4에서 발견된다. 표 5에 나타낸 데이터의 그래픽 표현은 도 5에서 발견된다. 표 6에 나타낸 데이터의 그래픽 표현은 도 6에서 발견된다. 표 7에 나타낸 데이터의 그래픽 표현은 도 7에서 발견된다.

<표 3>

<표 4>

<표 5>

<표 6>

<표 7>

표 8은 GS 5.0에서 생산된 야생형 모 항체와 비교시 다양한 수용체에 대한 결합에서의 상대적인 감소를 요약한다. 이 데이터는 도 8에 또한 나타낸다.

<표 8>

실시예 8

항원 친화도 검정

본 발명의 항-PCSK9 항체의 결합 친화도는 카르복시메틸화 덱스트란 (CM5, cat# BR-1006-68) 칩 및 1x HBS-EP+ (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% 계면활성제 P20)를 진행 완충제로서 사용하는 비아코어(Biacore) T100 기기 상에서 측정하였다. 비아코어 인간 항체 포획 키트 (Cat# BR-1008-39)에 따라 ~7000RU까지 마우스 항-인간 IgG (Fc 특이적)를 갖는 CM5 칩을 모든 플로우셀 상에 고정시켰다. 항-PCSK9 항체를 ~500RU까지 칩 상에 포획시킨 다음, 야생형 인간 PCSK9 64.1nM 내지 2.0nM을 분석물 주입하였다. 각각의 플로우셀을 10uL/분으로 40초 동안 3M MgCl을 사용하여 각각의 분석물 주입 사이에 재생하였다. 적어도 5점 농도 범위 센소그램을 이용하는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 비아코어 T100 평가 소프트웨어로 분석하였다.

표 9에 제시된 바와 같이, 본원의 물질 및 방법에 의해 제조된 다양한 항-PCSK9 항체에 대한 항원 친화도는 유사하다.

<표 9>

실시예 9

추가의 IgG1 Fc 뮤테인의 구축, 발현 및 특성화

추가의 Fc 뮤테인 (표 10)을 실시예 2의 방법에 따라 구축하였다.

<표 10>

표 10에 기재된 Fc 뮤테인을 함유하는 발현 벡터를 알파 2, 6 시알산을 이중-안테나 갈락토실화 글리칸 (G2) 상에 부가할 수 있는, 당조작된 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0) 내에 형질전환시켰다. 사용된 YGLY22834 균주의 유전자형은 하기와 같다: ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2-2; mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3 pno1Δ mnn4Δ::lacZ; ADE1::lacZ/NA10/MmSLC35A3/FB8; his1Δ::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT; arg1Δ::HIS1/KD53/TC54; bmt4Δ::lacZ bmt1Δ::lacZ bmt3Δ::lacZ; TRP2::ARG1/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33; ste13Δ::lacZ-URA5-lacZ/TrMDS1 dap2Δ::NatR; TRP5::HygRMmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33; vps10-1::pAOX1-LmSTT3d.

Fc 뮤테인 항체를 실시예 4-5에 나타낸 바와 같이 생산하고 정제하였다.

본원에서 생산된 Fc 뮤테인의 글리코실화를 실시예 6에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 정량화하고, 그 결과를 표 11에 나타내었다.

<표 11>

다양한 FcγR에 대한 이들 Fc 뮤테인의 친화도를 실시예 7에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과는 표 12 및 13에 제시한다.

"항-TNF IgG1 GS5"로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 GFI 5.0에서 생산된 서열 15의 중쇄 및 서열 13의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

"1F11 IgG1 GS5.0"으로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 GFI 5.0에서 생산된 서열 1의 중쇄 및 서열 2의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

"항-TNF DM"으로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 16의 중쇄 및 서열 13의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

"1F11 DM"으로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 3의 중쇄 및 서열 2의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

"인간 IgG Fc DM" 또는 "hFC DM"으로서 확인된 샘플은 상기 기재된 방법에 따라 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.

<표 12>

*주 - ~5000nM 초과로 보고된 임의의 값은 이들 값이 시험 농도 범위를 상당히 벗어나기 때문에 실제 값에 의존적이기보다는 불량한 결합제로서 해석되어야 한다.

<표 13>

실시예 10

면역 혈소판감소증 ("ITP")의 모델에서 Fc 뮤테인의 효과

동물: 14주령 C57BL/6 암컷 마우스를 타코닉 팜스(Taconic Farms)로부터 입수하였다.

모델 유도: 마우스에게 제0일에 정맥내 (iv) 주입에 의해 표 14에 열거된 시약을 투여하였다. 24시간 후에, BD 바이오시스템즈(BD Biosystems)로부터 입수된 항-CD41 항체 (MWReg30)의 2 μg iv 용량을 사용하여 ITP를 유도하였다. ITP 유도 24시간 후에, 헤마베트(Hemavet) 혈액 세포 분석기를 이용하여 전혈 샘플에 대해 혈소판 계수를 수행하였다.

<표 14>

물질

"hFC DM 시알릴화"로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.

"hFC DM 비-시알릴화"로서 확인된 샘플은, 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 14의 아미노산 서열을 포함하며, 후속적으로 뉴라미니다제로 시험관내 처리되어 말단 갈락토스를 갖는 단백질의 비-시알릴화 형태를 생산하는 폴리펩티드를 지칭한다.

"hFC QM 시알릴화"로서 확인된 샘플은 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.

"hFC QM 비-시알릴화"로서 확인된 샘플은, 재조합 피키아 파스토리스 균주 YGLY22834 (GFI6.0)에서 생산된 서열 8의 아미노산 서열을 포함하며, 후속적으로 뉴라미니다제로 시험관내 처리되어 말단 갈락토스를 갖는 단백질의 비-시알릴화 형태를 생산하는 폴리펩티드를 지칭한다.

모든 경우에 15 L 유리 생물반응기에서 피키아 파스토리스 균주의 배양을 수행하였다. 간략하게, BSGY 배지 (4% 글리세롤, 1% 효모 추출물, 2% 소이톤, 100 mM 인산칼륨 완충제, pH 6.5, 100 mM D-소르비톨, 1.34% 효모 질소 염기, 및 4x10-5% 비오틴) 500 mL를 함유하는 2개의 3 L 배플 시드 플라스크를 한천 플레이트 상에서 성장 중인 효모 패치로 접종하였다. 플라스크를 48시간 동안 24℃ 및 180 rpm에서 인큐베이션하여, 세포가 10% 부피비로 BSGY 배지를 함유하는 생물반응기에 전달되는 경우에 지수 성장하도록 하였다. 온도를 24℃에서 제어하고, 28% 수산화암모늄을 사용하여 pH를 6.5에서 제어하고, 공기 흐름 속도를 0.7 vvm에서 고정시키고 교반을 캐스캐이드함으로써 대기압 및 24℃에서 용존 산소 (DO)를 20% 포화도로 유지하였다. 산소 공급 속도 (OUR, mmol L^-1 h^-1 단위)에서의 신속한 감소에 따라 초기 40 g L^-1 글리세롤의 고갈이 검출되었고, 이어서 5.3 g L^-1 h^-1에서 시작하여 0.08 h^-1의 속도로 지수적으로 증가시키면서, 지수적으로 50% 글리세롤을 공급하였다. 글리세롤 유가 배양기의 8시간 후에, 산소-제한 환경에서의 메탄올 유도를 개시하였다. DO 캐스케이드를 끄고, 460 rpm의 설정점에서 교반을 설정하여 20-25 mmol/L/h의 OUR을 달성하였다. DO를 1% 미만으로 감소시킨 후에, 100% 메탄올의 첫번째 1% (w/v) 볼루스 샷을 전달하였다. 모든 후속적 메탄올 1% (w/v) 볼루스 샷은 메탄올 고갈을 표시하는 DO에서의 급속한 증가에 의해 촉발되었다.

샘플 ("hFC DM 시알릴화", "hFC DM 비-시알릴화", "hFC QM 시알릴화" 및 "hFC QM 시알릴화")을 맵셀렉트(MabSelect) (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)로부터)를 이용하여 정제하였다.

"hFC DM 시알릴화" 및 "hFC QM 시알릴화" 샘플의 N-글리칸 분석은 HPLC에 의해 결정되었고, 하기 N-글리칸 특성을 가졌다:

GAMMAGARD는 백스터 헬스케어(Baxter Healthcare)로부터 입수하였다.

GAMMUNEX는 탈레크리스 바이오테라퓨틱스 인크.(Talecris Biotherapeutics Inc.)로부터 입수하였다.

샘플 "ITP 대조군"은 BD 바이오시스템즈로부터 입수된 항-CD41 항체 (MWReg30)였다.

결과

수득된 혈소판 값을 표 15에 열거하고 (K/μL), 도 9에 플로팅하였다. hFc DM 시알릴화 및 hFc QM 시알릴화는 일원 분산 분석에 따라 ITP로부터의 통계적으로 유의한 보호를 나타내었다.

본 발명은 예시된 실시양태들을 참조하여 본원에서 기재되어 있지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원의 교시내용에 접근할 수 있는 당업자는 본 발명의 범주 내의 추가적인 변형 및 실시양태를 인지할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Zha, Dongxing <120> METHOD FOR PREPARING Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING IMPROVED PROPERITES <130> 23079 <150> US 61/489,743 <151> 2011-05-25 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Gly Ile Ile Thr Glu Ile Ala Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 His Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Gly Ile Ile Thr Glu Ile Ala Glu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 4 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr 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Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Glu His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 5 gaattcgaaa cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc 60 gcattagct 69 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 6 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala <210> 7 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc domain <400> 7 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 9 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ala Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly 450 <210> 10 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody light chain <400> 10 Asp Ile Gln Leu 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Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc domain <400> 14 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Ala Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val 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Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims

Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인 Fc-함유 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 돌연변이가 F243A, V264A, S267E 및 L328F인 Fc-함유 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 서열 7, 서열 8 또는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알릴화 N-글리칸에서의 시알산 잔기가 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 Fc-함유 폴리펩티드.
제1항에 있어서, SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기가 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 Fc-함유 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성:
a) 감소된 이펙터 기능;
b) 증가된 항염증 특성;
c) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합;
d) FcγRIIa에 대한 감소된 결합;
e) FcγRIIb에 대한 증가된 결합;
f) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합;
g) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합
중 하나 이상을 갖는 Fc-함유 폴리펩티드.
a) Fc 영역의 아미노산 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 코딩하는 핵산을 포함하는, Fc-함유 폴리펩티드를 생산하도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고;
b) 숙주 세포를 Fc-함유 폴리펩티드의 발현을 유발하는 조건 하에 배양하고;
c) Fc-함유 폴리펩티드를 숙주 세포로부터 단리하는 것
을 포함하는, 숙주 세포에서 Fc-함유 폴리펩티드를 생산하는 방법.
제7항에 있어서, 핵산이 돌연변이 F243A, V264A, S267E 및 L328F를 코딩하는 것인 방법.
제7항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 서열 7, 서열 8 또는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알릴화 N-글리칸이 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 방법.
제10항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가, 전체 시알릴화 N-글리칸의 양 및 백분율이 모 Fc-함유 폴리펩티드에 비해 증가된 N-글리칸 조성을 갖는 것인 방법.
제7항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기가 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 방법.
제7항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 하기 특성:
a) 감소된 이펙터 기능;
b) 증가된 항염증 특성;
c) 렉틴 (예를 들어, CD22 (Siglec 2))에 대한 증가된 결합;
d) FcγRIIa에 대한 감소된 결합;
e) FcγRIIb에 대한 증가된 결합;
f) FcγRIIIa에 대한 감소된 결합; 및
g) FcγRIIIb에 대한 감소된 결합
중 하나 이상을 갖는 것인 방법.
Fc 영역의 위치 243, 264, 267 및 328에서 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르고;
Fc-함유 폴리펩티드가 모 Fc-함유 폴리펩티드와 비교시 증가된 항염증 특성 또는 감소된 세포독성을 갖는 것인
Fc-함유 폴리펩티드의 항염증 특성을 증가시키거나 또는 세포독성을 감소시키는 방법.
제14항에 있어서, 돌연변이가 F243A, V264A, S267E 및 L328F인 방법.
제14항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 서열 7, 서열 8 또는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기가 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 방법.
염증성 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 Fc 영역의 위치 243 및 264에서 돌연변이를 포함하는 Fc-함유 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따르는 것인, 상기 대상체에서 염증성 상태를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 돌연변이가 F243A, V264A, S267E 및 L328F인 방법.
제18항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 서열 7, 서열 8 또는 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, Fc-함유 폴리펩티드가 SA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂ 또는 SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂로부터 선택된 구조를 포함하는 시알릴화 N-글리칸을 포함하는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 시알산 잔기가 α-2,6 연결을 통해 부착된 것인 방법.