KR102371465B1

KR102371465B1 - 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 ｎ-아세틸갈락토사민 전이효소와 갈락토즈 전이효소, 및 이를 이용한 대장균 기반의 가용성 전이효소 생산 방법

Info

Publication number: KR102371465B1
Application number: KR1020200145673A
Authority: KR
Inventors: 김창섭; 양종민; 김경록
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-03-08
Also published as: KR20210056242A

Abstract

본 발명은 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 N-아세틸갈락토사민 전이효소와 갈락토즈 전이효소, 및 이를 이용한 대장균 기반의 전이효소 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 기존에 보고된 화학적 방법의 강글리오시드 합성을 위한, 고수율 및 가용성 당전이효소의 효율적인 합성을 기대할 수 있다.

Description

코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 Ｎ-아세틸갈락토사민 전이효소와 갈락토즈 전이효소, 및 이를 이용한 대장균 기반의 가용성 전이효소 생산 방법{Codon-optimized N-acetylgalactosamine transferase and galactose transferase derived from Campylobacter jejuni, and production method of E. coli-based soluble transferase using the same}

본 출원은 캄필로박터제주니에서 유래한 N-아세틸갈락토사민 전이효소 CgtA₄₃₄₅₆와 갈락토즈 전이효소 CgtB₁₁₁₆₈를 코딩하는 유전자의 최적화, 최적화된 유전자 서열, 상기 유전자를 대장균에서 높은 수율로 생산하는 방법 및 정제 방법에 관한 것이다.

강글리오시드(Gangliosides)는 시알산(sialic acid)을 가지는 당지질의 일종이며 대부분의 세포에서 발견 되고 특히 신경세포에 많이 존재한다. 강글리오시드는 세포의 성장, 증식, 분화, 세포 자살사등의 현상에 중요한 역할을 하며 바이러스 및 독소에 대한 수용체 역할, 흑색종과 유방암 및 폐암과 같은 특정암을 억제하는 효과도 가진다.

한편, 기존의 강글리오시드의 합성은 화학적 방법과 화학 효소적 방법이 보고되었다. 강글리오시드의 전구물질로 사용되는 글리칸(glycan)은 여러 개의 수산기(hydroxyl group)를 가지기 때문에 앞서 언급한 방법들을 사용한 특정 강글리오시드의 합성은 반응이 불필요한 위치의 수산기에 대한 보호/탈보호 및 추가적인 정제 과정 등 합성 과정이 복잡하다. 그리고 합성이 되더라도 원하지 않는 이성질체가 함께 만들어져 최종 산물의 수율이 낮다는 한계점을 가진다. 이러한 한계점은 글리칸에 대한 기질 특이성, 자리 특이성 및 입체 특이성을 갖는 글리칸 변형효소를 사용하는 방법으로 극복이 가능하다.

한편, 다양한 병원체의 동정 및 특성 분석의 결과 포유동물의 당전이효소와 유사한 특징을 가지는 몇 가지의 박테리아 당전이효소들이 발견되었다. 이 중에서 캄필로박터제주니 균주는 GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1c, GD3 및 GT1a 강글리오시드와 같은 말단 올리고당을 합성하는 당전이효소들을 가지고 있다. 캄필로박터제주니의 혈청형에 따라 CgtA와 CgtB 당전이효소는 다른 기질에 대한 특이성과 비활성도(specific activity)를 가진다. 최근 연구에서 캄필로박터제주니 O:36 균주(ATCC 43456)에서 유래된 CgtA₄₃₄₅₆ (β-(1→4)-N-아세틸갈락토사민 전이효소)와 캄필로박터제주니 O:2 균주(NCTC 11168)에서 유래된 CgtB₁₁₁₆₈ (β-(1→3)-갈락토즈 전이효소)를 대장균에서의 발현을 성공했으며 이 전이효소들을 사용해 시험관에서 GM3 삼탄당로부터 GM2 사탄당와 GM1 오탄당을 합성했다. 하지만 위 연구에선 당전이효소가 낮은 수준으로 발현되었고, 이 때문에 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통한 효소의 정제는 불가능했기 때문에 대장균 파쇄액 자체를 합성에 사용하였다. 대장균 파쇄액 속엔 전이효소 이외의 다른 성분들이 존재하기 때문에 원하지 않는 화학반응을 유발할 수 있고 다른 많은 오염물질들이 존재하기 때문에 강글리오시드 합성 효율이 감소할 수 있다. 또한 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈은 시중에 판매되지 않으며 비활성도가 분석되지 않았다.

미국 특허 제7238509호

본 발명자들은 기존에 보고된 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈재조합 단백질의 생산량과 가용성을 증가시키기 위하여 연구 노력한 결과 캄필로박터제주니 유래 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈를 암호화하는 유전자의 구성을 대장균이 사용하는 코돈에 맞게 최적화시켰다. 대장균 코돈에 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈단백질을 암호하는 유전자를 여러 종류의 대장균 균주에서 발현시켜 각 균주별 재조합 단백질의 생산량과 가용성 조사하여 최적의 대장균 균주를 선별하였다.

위에서 언급한 방법을 통해 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈의 생산량과 가용성이 증가됨을 확인했으며 고정화 금속이온 친화성 크로마토그래피를 통해 CgtA₄₃₄₅₆ 및 CgtB₁₁₁₆₈를 효율적으로 정제하였으며 정제된 CgtA₄₃₄₅₆과 CgtB₁₁₁₆₈의 당전이효소 활성도를 분석했다.

또한, CgtA₄₃₄₅₆ 단백질의 경우에는 샤페론 단백질인 GroEL-GroES(GroEL/ES)의 발현을 통해 재조합 단백질들의 가용성 증가 효과를 확인하였다.

따라서, 본 발명은 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 CgtA₄₃₄₅₆ 유전자 및 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 CgtB₁₁₁₆₈유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 본 발명은 상기 당전이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환 대장균을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 대장균에서 상기 당전이효소를 발현양 및 가용성을 증가시키는 조건 및 방법을 제공하는 것과 배양액으로부터 상기 당전이효소를 정제하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 N-아세틸갈락토사민 전이효소(N-acetylgalactosaminyltransferase, CgtA₄₃₄₅₆) 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 코돈 최적화된 캄필로박터제주니 유래 갈락토즈 전이효소 (galactosyltransferase, CgtB₁₁₁₆₈) 유전자를 제공한다.

본 발명에서, 용어 “코돈 최적화”는 N-아세틸갈락토사민 전이효소 및 갈락토즈 전이효소 유전자의 코돈에 대해 E. coli에서의 발현을 보다 효율적으로 하기 위하여 E. coli 유전자에서 높은 빈도로 사용되는 코돈으로 치환하는 것을 의미한다. 상기 서열번호 1의 캄필로박터제주니 유래 N-아세틸갈락토사민 전이효소(N-acetylgalactosaminyltransferase, CgtA₄₃₄₅₆) 유전자는 E. coli에서 이종 단백질의 발현을 개선시키기 위해 코돈최적화된 염기서열이다. 상기 서열번호 2의 캄필로박터제주니 유래 갈락토즈 전이효소 (galactosyltransferase, CgtB₁₁₁₆₈) 유전자는 E. coli에서 이종 단백질의 발현을 개선시키기 위해 코돈최적화된 염기서열이다.

코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆ 유전자 서열: 서열번호 1

ATGCTGAAGAAAATCATTAGCCTGTACAAGCGTTATAGCATCAGCAAGAAACTGGTGCTGGACAACGAGCACTTCATCAAGGAAAACAAAAACATTTACGGCAAGAAACACAAAGGTTTCTTTGACTTCGATGAGAAGGCGAAAGATGTTAAGAGCCCGCTGAACCCGTGGGGCTTTATTCGTGTGAAAAACGAGGCGCTGACCCTGCGTGTTAGCCTGGAAAGCATCCTGCCGGCGCTGCAGCGTGGCATCATTGCGTACAACGACTGCGACGATGGTAGCGAGGAACTGATTCTGGAGTTCTGCAAGCAATATCCGAACTTTATCGCGAAGAAATACCCGTATAAAGTGGACCTGGAAAACCCGAAGAACGAGGAAAACAAACTGTACAGCTACTATAACTGGGCGGCGAGCTTCATTCCGCTGGATGAGTGGTTTATCAAGATTGACGTTGATCACTACTATGACGCGAAGAAACTGTACAAGAGCTTCTATCGTATCGATCAGGAAAACAAAGCGCTGTGCTATCCGCGTATTAACTTTATCATTCTGAACGGCAACATCTACGTGCAGAACAGCGGCAACTATGGTTTCATCGGTGGCGGTGACCAACTGCTGATTAAGCGTCGTAACAGCAGCTTTATCGAGCGTCGTGTTAGCAAGAAAAGCCAGTGGATCGATCCGAAAGGCCTGATTGAGGAACTGTACAGCGAACAGCAAGTGCTGAGCCAAGGTGTTAAGATTCTGCAGGCGCCGCTGCTGCAATGGCACTTTCCGGCGCTGAAATATCGTCGTAACGACTACCAGCAATATCTGGATATTCTGAGCCTGGAGGAATTCCAGGCGTTTCACCGTAAGAGCAAAGAAGCGAAGAAAATCGATTTCGCGATGCTGAAGCGTCCGGTGATCGAGCAGATTCTGAAGAAATTTCAAGGTGAAATCAAA

코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆ 유전자 서열: 서열번호 2

ATGAGCCAGATCAGCATCATTCTGCCGACCTACAACGTGGAGAAATACATTGCGCGTGCGCTGGAAAGCTGCATCAACCAAACCTTCAAAGACATTGAGATCATTGTGGTTGACGATTGCGGTAACGACAAGAGCATCGATATTGCGAAGGAATACGCGAGCAAAGACGATCGTATCAAGATCATTCACAACGAGGAAAACCTGAAACTGCTGCGTGCGCGTTATGAGGGCGCGAAGGTTGCGACCAGCCCGTACATCATGTTTCTGGATAGCGACGATTATCTGGAACTGAACGCGTGCGAGGAATGCATCAAAATTCTGGACATGGGTGGCGGTGGCAAGATCGATCTGCTGTGCTTCGAGGCGTTTATTACCAACGCGAAGAAAAGCATCAAGAAACTGAACATTAAGCAGGGTAAATACAACAACAAAGAATTCACCATGCAAATCCTGAAGACCAAAAACCCGTTTTGGACCATGTGGGCGAAGATCATTAAGAAAGACATCTACCTGAAGGCGTTCAACATGCTGAACCTGAAGAAAGAGATCAAGATTAACATGGCGGAAGATGCGCTGCTGTACTATCCGCTGACCATCCTGAGCAACGAGATCTTCTACCTGACCCAGCCGCTGTATACCCAACACGTGAACAGCAACAGCATCACCAACAACATTAACAGCCTGGAGGCGAACATCCAGGAACACAAGATTGTGCTGAACGTTCTGAAGAGCATCAAAAACAAGAAAACCCCGCTGTACTTCCTGATCATTTATCTGCTGAAAATTCAGCTGCTGAAGTACGAACAAAACTTTAACAAACGTAACATCAACCTGATCTACTACAAGATCAACATCCTGTACCAGAAGTACCAATTCAAGTGGAAGAAGTTCCTGTACAACCTGATCCCG

본 발명에서, 용어 N-아세틸갈락토사민 전이효소(N-acetylgalactosaminyltransferase)는 캄필로박터제주니 O:36 균주(ATCC 43456)에서 유래된 CgtA_43456, β-(1→4)-N-아세틸갈락토사민 전이효소를 의미하며, 강글리오시드-GM3 삼탄당으로부터 강글리오시드-GM2 사탄당을 합성한다.

본 발명에서, 용어 갈락토즈 전이효소 (galactosyltransferase, CgtB₁₁₁₆₈)는 캄필로박터제주니 O:2 균주(NCTC 11168)에서 유래된 CgtB_11168, β-(1→3)-갈락토즈 전이효소를 의미하며, 강글리오시드-GM2 사탄당으로부터 강글리오시드-GM1 오탄당을 합성한다.

또한, 본 발명은 상기 코돈 최적화된 N-아세틸갈락토사민 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 코돈 최적화된 갈락토즈 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.

상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함할 수 있다. 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

상기 발현벡터는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pET계열(pET15, pET22, pET23, pET28 등), pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 상기 프로모터는 형질전환용으로 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 대장균에서 기능할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있으며 보다 바람직하게는 T7 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 N-아세틸갈락토사민 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터는 바람직하게는 도 2c에 기재된 개열지도를 가지는 벡터일 수 있다.

상기 본 발명의 갈락토즈 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터는 바람직하게는 도 2d에 기재된 개열지도를 가지는 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 미생물은 대장균(E. coli)일 수 있다.

상기 형질전환체는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 당전이 효소를 생산할 수 있다.

상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 당전이효소를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 N-아세틸갈락토사민 전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및

상기 배양물로부터 가용성의 N-아세틸갈락토사민 전이효소을 정제하는 단계

를 포함하는 가용성의 N-아세틸갈락토사민 전이효소의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 갈락토즈 전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및

상기 배양물로부터 가용성의 갈락토즈 전이효소을 정제하는 단계

를 포함하는 가용성의 갈락토즈 전이효소의 생산 방법을 제공한다.

상기 형질전환 대장균은 통상의 대장균 배양방법을 통해 배양될 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예를 들어, 대장균 발현 배지에서 배양할 수 있다.

상기 N-아세틸갈락토사민 전이효소 발현용 형질전환 대장균을 암피실린이 포함된 배지에서 배양을 수행하며, 상기 배양액의 OD₆₀₀값이 0.3~0.7일 때, 최종 농도가 0.8 내지 1.2 Mm의 IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)을 첨가한 후, 25~35 ℃에서 10~15시간 동안 배양하여 생산 효율을 높일 수 있다.

상기 갈락토즈 전이효소 발현용 형질전환 대장균을 암피실린과 클로람페니콜이 포함된 배지에서 배양을 배양을 수행하며, 상기 배양액의 OD600 값이 0.5~0.9일 때, 최종 농도가 0.8 내지 1.2 Mm의 IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)와 테트라 사이클린을 첨가한 후, 25~35 ℃에서 10~15시간 동안 배양하여 생산 효율을 높일 수 있다.

상기 배양된 형질전환 대장균을 분리 정제하는 방법은 특별히 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 친화 컬럼 크로마토그래피에서 실시하는 것이 좋다.

본 발명에 따른 가용성의 당 전이효소의 생산 방법을 이용하는 경우, 당 전이효소의 생산량은 1L 배양액당 0.1~0.5mg였다.

본 발명의 당 전이효소인 CgtA₄₃₄₅₆는 GM3 삼탄당으로부터 GM2 사탄당을 합성하며 및 CgtB₁₁₁₆₈는 GM2 사탄당으로부터 GM1 오탄당을 합성한다. 본 발명의 당전이효소는 기존에 사용되는 강글리오시드에 존재하는 말단 탄수화물 합성을 위한 화학적 합성법의 문제점인 복잡한 합성과정, 이성질체의 형성 및 낮은 수율의 한계점을 극복할 수 있다. 현재까지 상기 당 전이효소는 생산 및 높은 순도로 정제된 적이 없으며 상업적으로 판매되지 않고 있다. 본 발명을 통해 높은 순도의 상기 당전이효소를 얻을 수 있게 됨에 따라 GM1 오탄당, GM2 사탄당과 같은 소당류(oligosaccharide)를 합성하기 위한 생촉매제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 야생형 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈를 암호하는 유전자의 코돈 편향 확인을 나타낸 이미지이고,
도 1b는 대장균에서 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현양 및 가용성을 증가시키기 위한 전략을 도식화하여 나타낸 이미지이다.
도 2는 야생형 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈ 및 코돈이 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈ 발현 벡터들을 도식화하여 나타낸 이미지로,
도 2a는 야생형 CgtA₄₃₄₅₆, 도 2b는 야생형 CgtB₁₁₁₆₈, 도 2c는 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆, 도 2d는 코돈 최적화된 CgtB₁₁₁₆₈의 발현 벡터를 도식화하여 나타낸 이미지이다.
도 3a는 6개의 다른 대장균 균주에서 코돈이 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆의 발현양을 확인한 SDS-PAGE 이미지이고,
도 3b는 6개의 다른 대장균 균주에서 코돈이 최적화된 CgtB₁₁₁₆₈의 발현양을 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.
도 4는 대장균에서 야생형 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈, 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈, 그리고 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈를 샤페론 단백질인 GroEL/ES와 함께 발현할 때의 각 단백질의 발현 정도를 확인한 SDS-PAGE 이미지로, 구체적으로 도 4a는 대장균에서 야생형 CgtA₄₃₄₅₆, 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆, 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆를 샤페론 단백질인 GroEL/ES와 함께 발현했을 때의 각 단백질들의 발현 여부를 확인한 SDS-PAGE 이미지이고, 도 4b는 대장균 균주에서 야생형 CgtA₁₁₁₆₈, 코돈 최적화된 CgtA₁₁₁₆₈, 코돈 최적화된 CgtA₁₁₁₆₈를 샤페론 단백질인 GroEL/ES와 함께 발현했을 때의 각 단백질들의 발현 여부를 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.
도 5는 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 정제를 확인한 결과로, CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈를 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하여 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.
도 6은 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 비활성도를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 당전이효소 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터의 제작

1-1. 야생형 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터의 제작

야생형 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 캄필로박터제주니(ATCC 33560)의 CgtA₃₃₅₆₀를 암호화하는 유전자에 282번 트레오닌(⁸⁴⁴acc⁸⁴⁶ 코돈)을 알라닌(⁸⁴⁴gcg⁸⁴⁶ 코돈)으로 돌변변이 시켜 CgtA₄₃₄₅₆를 암호화하는 유전자로 변환시켜야 한다. 이를 위해 CgtA₃₃₅₆₀를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 F1 프라이머 (서열번호 3) 및 B2 프라이머 (서열번호 4)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 수행하여 유전자 단편을 얻었다. CgtA₃₃₅₆₀를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 F2 프라이머 (서열번호 5) 및 B1 프라이머 (서열번호 6)를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자 단편을 얻었다. 앞서 얻은 두 유전자 단편을 섞어서 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 F1 프라이머 및 B1 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR(overlap PCR)을 수행하였다. 그 결과로 서열 5′쪽에 NdeI 제한효소 자리를 가지고 3′쪽에 XhoI 제한효소 자리를 가지는 CgtA₄₃₄₅₆를 암호화하는 유전자 단편 1을 얻었다.

이와 별개로, 캄필로박터제주니(NCTC 11168)의 CgtB₁₁₁₆₈을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 주형으로 하여, 하기 표 1에 개시된 F3 프라이머 (서열번호 7) 및 B3 프라이머 (서열번호 8)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 5′쪽에 NdeI 제한효소 자리를 가지고 3′쪽에 XhoI 제한효소 자리를 가지는 CgtB₁₁₁₆₈를 암호화하는 유전자 단편 2을 얻었다.

이후, 상기 유전자 단편 1과 2를 pET22b(+) (Novagen, 미국) 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 pET-wild-CgtA₄₃₄₅₆ 및 pET-wild-CgtB₁₁₁₆₈벡터를 제조하였다. 상기 유전자 단편이 삽입된 벡터를 도식화하여 도 2a와 2b에 나타내었으며, 상기 pET22b(+)에 존재하는 His-tag은 추후 상기 유전자가 단백질로 발현되는 경우, 발현된 단백질의 C-말단에 부착되어 단백질의 정제 및 확인을 가능하도록 한다.

프라이머 명칭	서열번호	내용
F1	서열번호 3	gcgccatatgcttaaaaaaatcatttc
B1	서열번호 4	gcgcctcgagttttatctctccttgaaatttc
F2	서열번호 5	ttagaagaatttcaggcgtttcatcgtaagagc
B2	서열번호 6	gctcttacgatgaaacgcctgaaattcttctaa
F3	서열번호 7	gcgccatatgagtcaaatttccatcatactac
B3	서열번호 8	gcgcctcgagcggaattaaattatataaaaattttttc

1-2. 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터의 제작

코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 Genescript 사로부터 공급받은 합성된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈를 암호화하는 유전자가 포함된 벡터에서 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈유전자를 pET 22b(+) (Novagen, 미국) 벡터의 NdeI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하여 pET-opt-CgtA₄₃₄₅₆및pET-opt-CgtB₁₁₁₆₈벡터를 제조하였다. 상기 유전자 단편이 삽입된 벡터를 도식화 하여 도 2c와 2d에 나타내었으며, 상기 pET 22b(+)에 존재하는 His-tag은 추후 상기 유전자가 단백질로 발현되는 경우, 발현된 단백질의 C-말단에 부착되어 단백질의 정제 및 확인을 가능하도록 한다.

실시예 2. 당전이효소 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

2-1. 야생형 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

야생형 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈을 발현시키는 형질전환체를 제조하기 위하여 먼저 대장균 BL21(DE3) (Novagen 사)에 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 수용(competent) 세포를 만들었다. 이 후, 42 ℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법을 이용하여 상기 수용 세포를 실시예 1-1에서 제조한 벡터로 형질전환하였다. 그리고 나서 벡터 내 포함되어 있던 암피실린 내성 유전자를 이용하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 추가적으로 벡터 내 T7 프로모터의 반응을 이용하여 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)을 통한 단백질의 발현을 유도하였다.

2-2. 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터를 도입한 형질전환체의 제조

코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈을 발현시키는 형질전환체를 제조하기 위하여 먼저 대장균 BL21(DE3) (Novagen 사), 대장균 C41(DE3) (Lucigen 사), 대장균 BLR(DE3) (Novagen 사), 대장균 BLR(DE3)pLysS (Novagen 사), 대장균 Rosetta(DE3) (Novagen 사), 대장균 Tuner(DE3) (Novagen 사)에 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 수용(competent) 세포를 만들었다. 이후, 42 ℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법을 이용하여 상기 수용 세포를 실시예 1-2에서 제조한 벡터로 형질전환하였다. 그리고 나서 벡터 내 포함되어 있던 암피실린 내성 유전자를 이용하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 추가적으로 벡터 내 T7 프로모터의 반응을 이용하여 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)을 통한 단백질의 발현을 유도하였다.

2-3. 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터와 GroEL/ES 발현 벡터를 함께 도입한 형질전환체의 제조

코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈와 샤페론 단백질인 GroEL/ES를 함께 발현시키는 형질전환체를 제조하기 위하여 먼저 대장균 C41(DE3) (Lucigen 사)에 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 수용(competent) 세포를 만들었다. 이후, 42℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법을 이용하여 상기 수용 세포를 실시예 1-2에서 제조한 벡터와 GroEL/ES의 발현 벡터인 pG-KJE8 (Takara 사)를 동시 형질전환하였다. 그리고 나서 벡터 내 포함되어 있던 암피실린 내성 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자를 이용하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 추가적으로 벡터 내 T7 프로모터와 Pzt-1 프로모터 반응을 이용하여 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)와 테트라사이클린 통한 단백질의 발현을 유도하였다.

실시예 3. CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터를 도입한 형질전환체들의 단백질 발현양 및 가용성 확인

3-1. 대장균 균주별에 따른 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 단백질 발현양 확인

최적의 발현 균주를 선별하기 위해, 상기 실시예 2-2에서 제조한 6가지의 대장균 형질전환체들로부터 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현 여부를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6~0.8 정도가 되었을 때 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 뒤 30℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8.0 결합 용액(25 mM Tris_,300 mM NaCl, 10 mM Imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기(sonicator)를 이용해 파쇄하였다.

이후, 세포 파쇄액을 SDS-PAGE 샘플 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.25% (w/v) bromophenol blue)에 희석한 후 100 ℃에서 15분간 끓여 변형시켰으며 이후, SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었으며, 도 3a는 CgtA₄₃₄₅₆의 발현량을 확인한 SDS-PAGE 이미지이고, 도 3b는 CgtB₁₁₁₆₈의 발현량을 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.

종합적으로, 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현양은 대장균 C41(DE3)에서 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인했다.

3-2. 야생형 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체, 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체와 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터와 GroEL/ES발현 벡터를 함께 포함하는 C41(DE3) 형질전환체들의 단백질 발현양 및 가용성 비교

3-2-1. 야생형 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체, 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체들의 발현양 및 가용성 확인

상기 실시예 2-1, 2-2에서 제조한 C41(DE3) 형질전환체로부터 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현여부와 가용성 정도를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6~0.8 정도가 되었을 때 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 30 ℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8.0 결합 용액(25 mM Tris_,300 mM NaCl, 10 mM Imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플을 원심분리를 통해 수용성 분액(soluble fraction)과 비수용성 분액(insoluble fraction)을 분리하였다.

이후, 파쇄액전체, 수용성 분액, 비수용성 분액을 SDS-PAGE 샘플 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.25% (w/v) bromophenol blue)에 희석한 후 100 ℃에서 15분간 끓여 변형시켰으며 이후, SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다.

그 결과는 도 4에 나타내었으며, 구체적으로 도 4a는 CgtA₄₃₄₅₆의 단백질 발현여부와 가용성에 대한 결과를 확인한 SDS-PAGE 이미지이고, 도 4b는 CgtB₁₁₁₆₈의 단백질 발현여부와 가용성에 대한 결과를 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.

3-2-2. 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터 및 GroEL/ES의 발현 벡터을 포함하는 C41(DE3) 형질전환체의 단백질 발현양 및 가용성 확인

상기 실시예 2-3에서 제조한 C41(DE3) 형질전환체로부터 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 발현여부와 가용성 정도를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린과 20 μg/ml 농도의 클로람페니콜이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.4~0.6 정도가 되었을 때 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG와 Pzt-1 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 5 ng/ml농도의 테트라사이클린을 첨가한 뒤 30 ℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8.0 결합 용액(25 mM Tris_,300 mM NaCl, 10 mM Imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플을 원심분리를 통해 수용성 분액과 비수용성 분액을 분리하였다.

이후, 세포파쇄액, 수용성 분액, 비수용성 분액을 SDS-PAGE 샘플 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.25% (w/v) bromophenol blue)에 희석한 후 100 ℃에서 15분간 끓여 변형시켰으며 이후, SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, 구체적으로 도 4a는 CgtA₄₃₄₅₆의 단백질 발현여부와 가용성에 대한 결과를 확인한 SDS-PAGE 이미지이고, 도 4b는 CgtB₁₁₁₆₈의 단백질 발현여부와 가용성에 대한 결과를 확인한 SDS-PAGE 이미지이다.

종합적으로, 상기 실시예 2-4의 결과, CgtA₄₃₄₅₆는 C41(DE3)에서 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆와 GroEL/ES를 함께 발현시킬 때 단백질의 발현양과 가용성이 가장 우수하고 CgtB₁₁₁₆₈는 C41(DE3)에서 코돈 최적화된 CgtA₄₃₄₅₆만을 발현할 때 단백질의 발현양과 가용성이 가장 우수함을 확인했다.

실시예 4. CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 발현 벡터를 포함하는 C41(DE) 형질전환체들로부터 생산된 단백질들의 정제

4-1. 코돈 최적화된 CgtA ₄₃₄₅₆ 발현 벡터를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체의 단백질 발현 및 정제

상기 실시예 2-3에서 제조한 C41(DE3) 형질전환체로부터 생산된 CgtA₄₃₄₅₆의 정제를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린과 20 μg/ml 농도의 클로람페니콜이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.4~0.6 정도가 되었을 때 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG와 Pzt-1 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 5 ng/ml농도의 테트라사이클린을 첨가한 뒤 30 ℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8.0 결합 용액(25 mM Tris_,300 mM NaCl, 10 mM Imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플을 원심분리를 통해 수용성 분액만 분리한 뒤 Ni-NTA 컬럼을 이용한 친화력 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 수용성 CgtA₄₃₄₅₆을 분리 정제하였다. 최종 생산량은 1L 배양액당 약 0.3 mg였다.

이후, 투석을 통해 imidazole 성분을 제거한 뒤, 단백질을 SDS-PAGE 샘플 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.25% (w/v) bromophenol blue)에 희석한 후 100 ℃에서 15분간 끓여 변형시켰으며 이후, SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었으며, 레인(lane) 1이 정제한 CgtA₄₃₄₅₆이다.

4-2. 코돈 최적화된 CgtB ₁₁₁₆₈ 발현 벡터의를 포함하는 C41(DE3) 형질전환체의 단백질 발현 및 정제

상기 실시예 2-2에서 제조한 C41(DE3) 형질전환체로부터 생산된 CgtB₁₁₁₆₈의 정제를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 우선, 실험 수행에 필요한 배지로 50 μg/ml 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지(Merck사)를 이용하였으며, 상기 배지 내 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6~0.8 정도가 되었을 때 T7 프로모터를 자극하는 발현 유도물질인 1 mM의 IPTG을 첨가한 뒤 30 ℃ 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 4,000 g에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 제거한 후 침전물 내에서 세포를 회수하였다. 회수한 세포들은 pH 8.0 결합 용액(25 mM Tris_,300 mM NaCl, 10 mM Imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 해체기를 이용해 파쇄하였다. 파쇄된 샘플을 원심분리를 통해 수용성 분액만 분리한 뒤 Ni-NTA 컬럼을 이용한 친화력 크로마토그래피를 통해 수용성 CgtB₁₁₁₆₈을 분리 정제하였다. 최종 생산량은 1L 배양액당 약 0.3 mg였다.

이후, 투석을 통해 imidazole 성분을 제거한 뒤, 단백질을 SDS-PAGE 샘플 버퍼(0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, 5% (w/v) SDS, 5% (w/v) β-mercaptoethanol, 0.25% (w/v) bromophenol blue)에 희석한 후 100°C에서 15분간 끓여 변형시켰으며 이후, SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었으며, 레인(lane) 2가 정제한 CgtB₁₁₁₆₈이다.

종합적으로, 상기 실시예 4의 실험결과에서 확인할 수 있듯이, 수용성 CgtA₄₃₄₅₆와 CgtB₁₁₁₆₈를 친화성 크로마토그래피를 통해 좋은 순도로 정제됨을 확인했다.

실시예 5. 정제된 CgtA ₄₃₄₅₆ 및 CgtB ₁₁₁₆₈ 의 비활성도 확인

정제된 CgtA₄₃₄₅₆와 CgtB₁₁₁₆₈의 비활성도를 확인하기 위해 당전이효소 활성도 확인 키트(Glycosyltransferase Activity Kit) (R&D Systems 사)를 사용했다. 활성도 확인에 사용되는 Coupling Phosphatase 1의 반응조건과 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 반응 조건이 다르기 때문에 CgtA₄₃₄₅₆및 CgtB₁₁₁₆₈의 반응을 우선적으로 수행한 뒤 Coupling Phosphatase 1의 반응을 진행했다.

구체적으로, 2 ng의 CgtA₄₃₄₅₆과 10 nmol UDP-N-아세틸갈락토사민 (Sigma-Aldrich 사), 10 nmol GM3 삼탄당 (Oligotech® 사)을 45 uL의 반응 버퍼 (100 mM HEPES 버퍼, 2.25 mM MnCl₂, pH 7.0)에 섞어준 뒤 37℃에서 1~2시간 반응시켰다. 6 ng의 CgtB₁₁₁₆₈과 10 nmol UDP-갈락토즈 (Sigma-Aldrich 사), 10 nmol GM2 사탄당 (Oligotech® 사)을 45 uL의 반응 버퍼 (100 mM MES 버퍼, 2.25 mM MnCl₂, pH 6.0)에 섞어준 뒤 37℃에서 1~2시간 반응시켰다. 음성 대조군으로 앞선 두 반응물에서 당전이효소만 빠진 반응물을 만들었다. 반응이 끝난 뒤, 반응물은 동결건조를 진행하였다. 그 후에 45 uL의 Coupling Phosphatase 반응 버퍼(CgtA₄₃₄₅₆: 60 mM Tris 버퍼, 10 mM CaCl₂, pH 7.5; CgtB₁₁₁₆₈: 113 mM Tris 버퍼, 10 mM CaCl₂, pH 7.5)로 건조물을 풀어준 뒤 25℃에서 30분간 배양시킨다. 배양이 끝난 후 당전이효소만 제거하기 위해 10000 g 속도로 10분간 원심분리 후 상층액만 회수하였다. 각 상층액을 96-well plate에 옮긴 뒤 5 uL의 Coupling Phosphatase 1용액을 섞어주고 37 ℃에서 1시간 반응하였다. 반응이 종료된 후 30 uL의 Malachite Green Reagent A와 100 uL의 증류수를 각 well에 넣어 섞어준 뒤, 30 uL의 Malachite Green Reagent B를 넣어 실온에서 20분간 반응을 시켜 발색시킨다. 그 후에 multi-well microplate 리더(SPECTROstar^Nano) (BMG LABTECH 사)를 사용하여 620 nm에서 흡광도를 측정한 뒤 CgtA₄₃₄₅₆와 CgtB₁₁₁₆₈의 비활성도를 계산했다.

종합적으로, 정제된 CgtA₄₃₄₅₆는 21 mU/mg, 정제된 CgtB₁₁₁₆₈는 16 mU/mg의 비활성도를 가짐을 확인하였다(도 6).

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Codon-optimized N-acetylgalactosamine transferase and galactose transferase derived from Campylobacter jejuni, and production method of E. coli-based soluble transferase using the same <130> P20U10C1928 <150> KR 10-2019-0142201 <151> 2019-11-08 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized CatA gene <400> 1 atgctgaaga aaatcattag cctgtacaag cgttatagca tcagcaagaa actggtgctg 60 gacaacgagc acttcatcaa ggaaaacaaa aacatttacg gcaagaaaca caaaggtttc 120 tttgacttcg atgagaaggc gaaagatgtt aagagcccgc tgaacccgtg gggctttatt 180 cgtgtgaaaa acgaggcgct gaccctgcgt gttagcctgg aaagcatcct gccggcgctg 240 cagcgtggca tcattgcgta caacgactgc gacgatggta gcgaggaact gattctggag 300 ttctgcaagc aatatccgaa ctttatcgcg aagaaatacc cgtataaagt ggacctggaa 360 aacccgaaga acgaggaaaa caaactgtac agctactata actgggcggc gagcttcatt 420 ccgctggatg agtggtttat caagattgac gttgatcact actatgacgc gaagaaactg 480 tacaagagct tctatcgtat cgatcaggaa aacaaagcgc tgtgctatcc gcgtattaac 540 tttatcattc tgaacggcaa catctacgtg cagaacagcg gcaactatgg tttcatcggt 600 ggcggtgacc aactgctgat taagcgtcgt aacagcagct ttatcgagcg tcgtgttagc 660 aagaaaagcc agtggatcga tccgaaaggc ctgattgagg aactgtacag cgaacagcaa 720 gtgctgagcc aaggtgttaa gattctgcag gcgccgctgc tgcaatggca ctttccggcg 780 ctgaaatatc gtcgtaacga ctaccagcaa tatctggata ttctgagcct ggaggaattc 840 caggcgtttc accgtaagag caaagaagcg aagaaaatcg atttcgcgat gctgaagcgt 900 ccggtgatcg agcagattct gaagaaattt caaggtgaaa tcaaa 945 <210> 2 <211> 909 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized CatB gene <400> 2 atgagccaga tcagcatcat tctgccgacc tacaacgtgg agaaatacat tgcgcgtgcg 60 ctggaaagct gcatcaacca aaccttcaaa gacattgaga tcattgtggt tgacgattgc 120 ggtaacgaca agagcatcga tattgcgaag gaatacgcga gcaaagacga tcgtatcaag 180 atcattcaca acgaggaaaa cctgaaactg ctgcgtgcgc gttatgaggg cgcgaaggtt 240 gcgaccagcc cgtacatcat gtttctggat agcgacgatt atctggaact gaacgcgtgc 300 gaggaatgca tcaaaattct ggacatgggt ggcggtggca agatcgatct gctgtgcttc 360 gaggcgttta ttaccaacgc gaagaaaagc atcaagaaac tgaacattaa gcagggtaaa 420 tacaacaaca aagaattcac catgcaaatc ctgaagacca aaaacccgtt ttggaccatg 480 tgggcgaaga tcattaagaa agacatctac ctgaaggcgt tcaacatgct gaacctgaag 540 aaagagatca agattaacat ggcggaagat gcgctgctgt actatccgct gaccatcctg 600 agcaacgaga tcttctacct gacccagccg ctgtataccc aacacgtgaa cagcaacagc 660 atcaccaaca acattaacag cctggaggcg aacatccagg aacacaagat tgtgctgaac 720 gttctgaaga gcatcaaaaa caagaaaacc ccgctgtact tcctgatcat ttatctgctg 780 aaaattcagc tgctgaagta cgaacaaaac tttaacaaac gtaacatcaa cctgatctac 840 tacaagatca acatcctgta ccagaagtac caattcaagt ggaagaagtt cctgtacaac 900 ctgatcccg 909 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 3 gcgccatatg cttaaaaaaa tcatttc 27 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B1 primer <400> 4 gcgcctcgag ttttatctct ccttgaaatt tc 32 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer <400> 5 ttagaagaat ttcaggcgtt tcatcgtaag agc 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2 primer <400> 6 gctcttacga tgaaacgcct gaaattcttc taa 33 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 7 gcgccatatg agtcaaattt ccatcatact ac 32 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 8 gcgcctcgag cggaattaaa ttatataaaa attttttc 38

Claims

서열번호 1로 표시되며, 코돈 최적화된 캄필로박터제주니에서 유래한 N-아세틸갈락토사민 전이효소(N-acetylgalactosaminyltransferase, CgtA₄₃₄₅₆)유전자.
서열번호 2로 표시되며, 코돈 최적화된 캄필로박터제주니에서 유래한 갈락토즈 전이효소 (galactosyltransferase, CgtB₁₁₁₆₈)유전자.
제 1 항의 코돈 최적화된 N-아세틸갈락토사민 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 2 항의 코돈 최적화된 갈락토즈 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 3 항의 재조합 발현벡터; 및
샤페론 단백질 GroEL-GroES 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균.
제 4 항의 재조합 발현베터를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 5 항에 있어서,
상기 대장균은 대장균 C41(DE3)인 형질전환 대장균.
제 6 항에 있어서,
상기 대장균은 대장균 C41(DE3)인 형질전환 대장균.
제 5 항의 형질전환 대장균을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
상기 배양물로부터 가용성의 N-아세틸갈락토사민 전이효소을 정제하는 단계
를 포함하는 가용성의 N-아세틸갈락토사민 전이효소의 생산 방법.
제 6 항의 형질전환 대장균을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
상기 배양물로부터 가용성의 갈락토즈 전이효소을 정제하는 단계
를 포함하는 가용성의 갈락토즈 전이효소의 생산 방법.