JP5393481B2 - コンドロイチン生産細菌及びコンドロイチンの製造法 - Google Patents
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Description
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつUDP-グルコース-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号1に相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルコース-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(C)配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(D)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質。
(c)配列番号3の塩基配列を含むDNA。
(d)配列番号3に相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(E)配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(F)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミ
ノ酸配列を含み、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質。
(e)配列番号5の塩基配列を含むDNA。
(f)配列番号5に相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(1)前記細菌を培養すること。
(2)培養物からコンドロイチンを回収すること。
本発明の細菌は、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が導入され、コンドロイチン生産能を有するUDP-グルクロン酸生産細菌である。
み、かつUDP-グルコース-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
UAを、GalNAc供与体からGalNAcを、交互に糖鎖の非還元末端に転移する活性を示す。
本発明のコンドロイチンの製造法は、少なくとも以下のステップ(1)及び(2)を含む。
(1)本発明の細菌を培養すること。
(2)培養物からコンドロイチンを回収すること。
本発明の開示する組み替え細菌より調製されたコンドロイチンをさらに硫酸化することによりコンドロイチン硫酸を製造できる。
。
<kfoA遺伝子の増幅>
J. Biol. Chem., Vol. 277, Issue 24, 21567-21575に記載の方法により、エシェリヒア・コリK4株の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行い、得られたPCR産物をpTrcHis(ヒスチジン融合タンパク質発現ベクター、Invitrogen)に挿入し、pTrcHis-kfoAを得た。
K4A-SP 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3'(配列番号7)及び
K4A-AS 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3'(配列番号8)
特開2003-199583に記載の方法により、エシェリヒア・コリK4株の染色体DNAを鋳型にしてPCRを行い、得られたPCR産物をpTrcHisに組み込んで、pTrcHis-kfoCを得た。
K4C-SP 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3'(配列番号9)及び
K4C-AS 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3'(配列番号10)
pTrcHis-kfoCAは前記pTrcHis-kfoA, pTrcHis-KfoCより以下の通りに作製した。
NotSal-pTrcHisC-rev 5'-GCGGCCGCAAAACAGCCAAGCTTCGAATTC-3'(配列番号11)及び
NotSal-pTrcHisC-for 5'-ACGCGTCGACGGCGGATGAGAGAAGATTTTCA-3'(配列番号12)
(配列番号13)及びSalI-KfoA-C 5'-GTCGACCTCTCATCCGCCAAAACA-3'(配列番号14))を設計し、pTrcHis-kfoAをテンプレートとして用いたPCRに用いた。続いて、得られたPCR産物をPCR4-TOPO(Invitrogen)へ挿入し、PCR4-TOPO-kfoAを得た。
-SalIのNotI-SalIサイトへ導入し、得られたプラスミドをpTrcHis-kfoCAと名づけた(図1)。
発現ベクターであるpTrcHis-kfoCAをエシェリヒア・コリK5株へエレクトロポレーション(Cell; 100 μL, 200Ω、25 μF, 2.5 kV、キュベット; 0.1 mL)により導入し、エシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoCA株を得た。コロニーを100 ppmアンピシリン添加LB培地に継代し、続いて、当該種菌を37℃、一晩培養した。1mLの種菌を20 mLの100 ppmアンピシリン添加CYG培地に継代した。組み換え細菌を37℃、3時間培養し(OD600=1.8、1.7-2.0)、その後、培養液へIPTGを終濃度1.0 mMで添加した。当該培養液をさらに37℃、5時間培養し、組み換えタンパク質の発現を誘導した。
<細菌菌体の調製>
種菌としてエシェリヒア・コリK5 (pTrcHis-kfoCA)株を100 ppmアンピシリン添加LB培地で培養した。種菌(750 μL)を100 ppmアンピシリン添加CYG培地(15 mL)に継代し、続けて37℃、3時間培養した。培養液へIPTG(終濃度1 mM)を添加し、培養はさらに5時間おこなった。細菌菌体は遠心により集菌した。
種菌(1 mL)を100 ppmアンピシリン添加CYG培地(20 mL)に継代し、続けて37℃、3時間培養した。培養液へIPTG(終濃度1 mM)を添加し、培養はさらに5時間おこなった。培養上清は遠心により回収した。
多糖は、組み換え菌体及び培養上清から以下の3つの方法により調製した。
Tris-HCl (pH8.0)で透析して試料Eを得た。
試料L、E及びS(各100 μL)を50 mM NaOAcを含有する50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中で37℃、一晩、cABC(コンドロイチナーゼABC:生化学工業製)により処理した。
(4.6 I.D. ×150mm)を用い、蛍光検出器の励起波長及び発光波長はそれぞれ346 nm及び410 nmに設定した。
<kfoΔC遺伝子の増幅>
国際公開第2007/145197号パンフレットに記載の方法により、配列番号5の塩基配列を含み、N末を欠くkfoCをコードするDNA(kfoΔC遺伝子)をクローニングした。kfoΔ
C遺伝子をpTrcHisに挿入し、pTrcHis-kfoΔCを得た。
実施例1で調製したプラスミドpTrcHis-kfoCAを制限酵素SphI及びSmaIを用いて開裂した。
。常法により、開裂したプラスミドのSphI-SmaIサイトに挿入し、次いで、得られたプラスミドをpTrcHis-kfoΔCAと名付けた。
<抗KfoA抗体の作製>
配列番号15のペプチド配列を含むオリゴペプチド(CIVSR RDGDI AESWS SPEKA NK, Purity: > 70 %)を合成し、4 mgのオリゴペプチドを常法によりKLH(keyhole limpet hemocyanin)にコンジュゲートさせた。完全アジュバントを混合して抗原溶液を調製し、2週間の間隔で5回、免疫付与をおこなった。抗体力価を確認した後、全血を回収した。各ウサギ血液から、抗KfoA血清がそれぞれ48 ml(試料A)、60 ml(試料B)得られた。Protein Aカラムを用いて精製した後、IgG画分EK-Aが試料Aから32 ml(IgG濃度: 5.30 mg/mL)得られた。
配列番号16のペプチド配列を含むオリゴペプチド(CQEPP GKENE TDRAA GK, Purity:
> 70 %)を合成し、4 mgのオリゴペプチドを常法によりKLH(keyhole limpet hemocyanin)にコンジュゲートさせた。完全アジュバントを混合して抗原溶液を調製し、2週間の間隔で5回、免疫付与をおこなった。抗体力価を確認した後、全血を回収した。各ウサギ血
液から、抗KfoA血清がそれぞれ65 ml(試料A)、39 ml(試料B)得られた。Protein Aカラムを用いて精製した後、IgG画分EK-Aが試料Aから39 ml(IgG濃度: 4.41 mg/mL)得られた。
株に導入してエシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoΔCA株を得、当該組み換え株を培養して組み換えタンパク質の発現を評価した。
<細菌菌体の調製>
実施例3に示すのと同じ方法で、エシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoΔCA株、エシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoCA株、及びエシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoA株の培養液から121℃、5分間のオートクレーブ後に細菌菌体と上清を調製した。
上清(1 ml)を一晩、水道水を流して透析し、次いで透析された溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥した試料は100 μLの50 mM Tris-HCl (pH8.0)に溶解し、多糖画分として用いた。
実施例3に示すのと同じ方法で、得られた画分を二糖組成分析により解析した。
コンドロイチン標品溶液(200μg/mL及び100μg/mL)を蛍光HPLCで解析し、コンドロイチンの検量線を作製した。
コンドロイチン濃度と不飽和二糖ΔDi-0Sのピーク面積の相関を式1に示した。
エシェリヒア・コリK5/pTrcHis-kfoCAから調製された試料で検出された。表1は式1を用いて算出された組み換え培養物中のコンドロイチン濃度の結果を示す。
ものである。
Claims (10)
- エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K4株由来のkfoA遺伝子とエシェリヒア・コリK4株由来のkfoC遺伝子が導入され、莢膜多糖としてコンドロイチンを産生する能力を有する、UDP-グルクロン酸生産細菌。
- 前記kfoA遺伝子が(A)及び(B)からなるグループから選択されたタンパク質をコードする、請求項1に記載の細菌。
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(B)配列番号2において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつUDP-グルコース-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記kfoA遺伝子が(a)に示されるDNAである、請求項1に記載の細菌。
(a)配列番号1の塩基配列を含むDNA。 - 前記kfoC遺伝子が(C)及び(D)からなるグループから選択されたタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌。
(C)配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(D)配列番号4において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質。 - 前記kfoC遺伝子が(c)に示されるDNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌。
(c)配列番号3の塩基配列を含むDNA。 - 前記kfoC遺伝子が(E)及び(F)からなるグループから選択されたタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌。
(E)配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質。
(F)配列番号6において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつコンドロイチン合成酵素活性を有するタンパク質。 - 前記kfoC遺伝子が(e)に示されるDNAである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の
細菌。
(e)配列番号5の塩基配列を含むDNA。 - 前記細菌がエシェリヒア・コリK5株である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細菌。
- 少なくとも以下のステップ(1)及び(2)を含む、コンドロイチンの製造法。
(1)請求項1〜8のいずれか一項に記載の細菌を培養すること。
(2)培養物からコンドロイチンを回収すること。 - 請求項9に記載の方法によりコンドロイチンを製造すること、及び該コンドロイチンを硫酸化してコンドロイチン硫酸を得ることを含む、コンドロイチン硫酸の製造法。
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