ES2650799T3 - Bacteria que produce condroitina y procedimiento de producción de condroitina - Google Patents

Bacteria que produce condroitina y procedimiento de producción de condroitina Download PDF

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Abstract

Bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, en la que se introducen un gen kfoA de la cepa K4 de Escherichia coli y un gen kfoC de la cepa K4 de Escherichia coli, en la que dicha bacteria tiene la capacidad de producir condroitina como un polisacárido capsular, y en la que el gen kfoA codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (A) y (B) (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa; y en la que el gen kfoC codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (C) a (F); (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (D) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de condroitina sintasa; (E) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (F) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de condroitina sintasa.

Description

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DESCRIPCIÓN
Bacteria que produce condroitina y procedimiento de producción de condroitina Sector técnico
La presente invención se refiere a una bacteria que produce condroitina y a un procedimiento de producción de condroitina.
Antecedentes técnicos
La condroitina es un polisacárido que comprende una estructura repetida de disacáridos de un resto de ácido glucurónico (GlcUA) y un resto de N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) (-GlcUAp (1-3)-GalNAcp (1-4)-; en la presente memoria también se denomina un esqueleto de hidratos de carbono con condroitina). El sulfato de condroitina es un polisacárido que consiste en la sulfatación de la condroitina.
De manera convencional, la condroitina y el sulfato de condroitina se extraen y se purifican a partir de cartílagos, órganos y similares de animales. Sin embargo, en los últimos años, se ha estudiado una técnica para sintetizar artificialmente un esqueleto de hidratos de carbono común a la condroitina y al sulfato de condroitina, debido a la escasez de materiales, tales como cartílagos y órganos.
Se han descrito condroitina sintasas, que producen condroitina mediante la transferencia alternativa de GlcUA y GalNAc desde sus sustratos donantes a oligosacáridos aceptores y se ha propuesto un procedimiento de producción de condroitina utilizando la enzima.
El documento J. Biol. Chem. 275(31), 24124-24129 (2000) da a conocer una condroitina sintasa derivada de Pasteurella multocida.
Además, los documentos WO 2003/102193 y WO 2003/102194 dan a conocer condroitina sintasas derivadas de ser humano.
Además, el documento US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A) da a conocer una condroitina sintasa novedosa (KfoC) producida por la cepa K4 de Escherichia coli.
Sin embargo, en el caso de producir condroitina mediante los procedimientos enzimáticos, es necesario preparar materiales costosos, tales como oligosacáridos como aceptores y nucleótidos de azúcar para los donantes de GlcUA y GalNAc, y, de este modo, se ha deseado un procedimiento de producción de condroitina que utilice materiales más económicos.
Es conocido que la cepa K4 de Escherichia coli produce un polisacárido que tiene una estructura de esqueleto de condroitina como una cápsula. Sin embargo, su estructura consiste en una unidad de repetición que comprende trisacáridos de un resto de GalNAc, un resto de GlcUA y un resto de fructosa que está unida a un grupo hidroxilo en C3 de un resto de GlcUA. Además, se han detectado más de 100 polisacáridos capsulares químicamente diferentes en Escherichia coli. Por ejemplo, la cepa K5 de Escherichia coli produce un polisacárido capsular K5 que tiene un esqueleto de hidratos de carbono con heparina/sulfato de heparán (J. Biol. Chem., 272 (5), pág. 2682-2687, 1997). Sin embargo, la existencia de Escherichia coli que produce condroitina en sí no es conocida. Por lo tanto, se desconoce un procedimiento de producción de condroitina utilizando una bacteria de Escherichia.
Aunque la solicitud de patente publicada de Estados Unidos 2007-0281342 da a conocer un procedimiento de producción de condroitina mediante la utilización de una bacteria Bacillus gram-positiva recombinante introducida con un gen de condroitina sintasa derivado de Pasteurella multocida, se ha deseado un mayor desarrollo en la producción fermentativa de condroitina. Otro documento del estado de la técnica que proporciona información de base relevante para la presente solicitud es Ninomiya y otros 2002 (J. Biol. Chem, vol. 277, No. 24, páginas 21575-21575), que da a conocer el procedimiento de clonación y caracterización de condroitina polimerasa. El documento WO0180810 da a conocer un procedimiento para aislar y producir un gen de condroitina sintasa a partir de Pasteurella multocida y la utilización de condroitina no sulfatada. Lidholt y otros 1997 (J. Biol. Chem, vol. 272, no. 5, páginas 2682-2687) da a conocer la síntesis del polisacárido capsular de E. coli K4. El documento EP1283259 da a conocer un procedimiento para producir una condroitina polimerasa, y Rodríguez y otros 1988 (Eur. J. Biochem. Vol. 177, páginas 117-124) da a conocer las características estructurales y serológicas del antígeno K4 capsular de E. coli.
Descripción de la invención
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un nuevo microorganismo capaz de producir condroitina y un nuevo procedimiento de producción de condroitina utilizando el microorganismo.
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Los inventores de la presente invención han realizado amplios estudios y, como resultado, han descubierto que una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, tal como la cepa K5 de Escherichia coli, que se introduce con genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli, produce condroitina con alta eficiencia, realizando, de este modo, la presente invención.
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, en la que se introduce un gen kfoA de la cepa K4 de Escherichia coli y un gen kfoC de la cepa K4 de Escherichia coli, en la que dicha bacteria tiene la capacidad de producir condroitina como un polisacárido capsular y en la que el gen kfoA codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (A) y (B): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos; y en la que el gen kfoC codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (C) a (F); (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (D) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos; (E) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (F) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos.
El gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser, de manera preferente, un ADN seleccionado del grupo que comprende los siguientes (a) y (b):
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; y
(b) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que comprende la actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa.
El gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser, de manera preferente, un ADN seleccionado del grupo que comprende los siguientes (c) y (d):
(c) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; y
(d) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa.
El gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser, de manera preferente, un ADN seleccionado del grupo que comprende los siguientes (e) y (f):
(e) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5; y
(f) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5 en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa.
La bacteria productora de ácido glucurónico-UDP es, de manera preferente, la cepa K5 de Escherichia coli.
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento de producción de condroitina que comprende, como mínimo, las siguientes etapas (1) y (2):
(1) cultivar la bacteria, tal como se ha descrito anteriormente; y
(2) recoger la condroitina del cultivo.
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento de producción de sulfato de condroitina que comprende: producir condroitina mediante el procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente; y a continuación, sulfatar la condroitina para producir sulfato de condroitina.
Descripción breve de los dibujos
La figura 1 es un dibujo que muestra una estructura de un vector para expresar los genes kfoA y kfoC.
La figura 2 es un dibujo (fotografía) que muestra la expresión de las proteínas KfoA y kfoC. El carril 1 muestra una cepa introducida sin plásmido (control), el carril 2 muestra una cepa introducida con pTrcHis-kfoCA y M muestra un marcador de peso molecular.
La figura 3 muestra los resultados de análisis de composiciones de disacáridos utilizando un sistema de HPLC fluorescente para la fracción L tratada con condroitinasa ABC (cABC) (A), la fracción L tratada sin cABC (B) y la fracción L tratada con cABC inactivada por calor (C).
La figura 4 muestra los resultados de análisis de disacáridos por fluorescencia para la fracción E tratada con cABC (A), la fracción E tratada sin cABC (B) y la fracción E tratada con cABC inactivada por calor (C).
La figura 5 muestra los resultados de análisis de disacáridos por fluorescencia para la fracción S tratada con cABC (A), la fracción S tratada sin cABC (B) y la fracción S tratada con cABC inactivada por calor (C).
La figura 6 muestra los resultados de análisis de disacáridos por fluorescencia para el patrón de condroitina tratado con cABC (A) y una mezcla del patrón de condroitina tratado con cABC y la fracción L tratada con cABC (B).
La figura 7 es un dibujo (fotografía) que muestra la expresión de proteínas KfoA, kfoC y Kfo-^ c utilizando (A) un anticuerpo contra KfoC (EK-C) como primer anticuerpo, (B) un anticuerpo contra KfoA (EK-A) como primer anticuerpo y (C) suero de conejo normal. Los carriles 1 y 5 muestran el marcador molecular, patrón MagicMarkXP (Invitrogen), el carril 2 muestra una cepa introducida con pTrcHis-kfoCA, el carril 3 muestra una cepa introducida con
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pTrcHis-kfo^ CA y el carril 4 muestra una cepa introducida con pTrcHis-kfoA.
Descripción de las realizaciones preferentes
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle.
<1> Bacteria de la presente invención
La bacteria de la presente invención es una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP introducida con los genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coliy que tiene capacidad de producir condroitina.
La "bacteria productora de ácido glucurónico-UDP" proporciona ácido glucurónico-UDP, que se utiliza para la producción de un polisacárido compuesto por ácido glucurónico. La "bacteria productora de ácido glucurónico-UDP" no está limitada, siempre y cuando produzca ácido glucurónico-UDP y entre los ejemplos de las mismas se incluyen una bacteria que pertenece al género Gluconacetobacter, tal como Gluconacetobacter hanseniiy Gluconacetobacter xylinus, una bacteria que pertenece al género Rhizobium, tal como Rhizobium meffloti, una bacteria que pertenece al género Acetobacter, tal como Acetobacter xylinum, una bacteria que pertenece al género Erwinia, tal como Erwinia amylovora, una bacteria que pertenece al género Thiobacillus, tal como Thiobacillus ferrooxidans, una bacteria que pertenece al género Xylella, tal como Xylella fastidiosa, una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium, tal como Sinorhizobium meliloti, una bacteria que pertenece al género Rhodococcus, tal como Rhodococcus rhodochrous, una bacteria que pertenece al género Klebsiella, tal como Klebsiella aerogenes, una bacteria que pertenece al género Enterobacter, tal como Enterobacter aerogenes y una bacteria que pertenece al género Escherichia, tal como Escherichia coli.
La "bacteria productora de ácido glucurónico-UDP" es, de manera preferente, una bacteria que pertenece al género Escherichia y es capaz de producir ácido glucurónico-UDP y, de manera más preferente, una bacteria que pertenece a Escherichia coli y es capaz de producir ácido glucurónico-UDP.
Un ejemplo específico de la misma incluye la cepa K5 de Escherichia coli. La cepa K5 se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC: PO Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América) bajo el número de acceso ATCC23506 y está disponible en el catálogo o en la página principal de la ATCC.
La cepa a introducir con los genes kfoA y kfoC puede ser una cepa que es un derivado de la cepa K5 de Escherichia coli y dichas cepas derivadas se pueden obtener mediante la introducción de una mutación génica en la cepa K5 de Escherichia coli o la introducción de un gen en la cepa K5 de Escherichia coli mediante recombinación genética. Es decir, un aspecto de la bacteria de la presente invención incluye: una cepa obtenida mediante la introducción de los genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli en la cepa K5 de Escherichia col; una cepa obtenida mediante la introducción de los genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli en la cepa K5 de Escherichia coli y la introducción adicional de una mutación génica; y una cepa obtenida mediante la introducción de los genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli en la cepa K5 de Escherichia coli y la introducción adicional de otro gen.
Entre los ejemplos del gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli se incluyen un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
En general, la sustitución, deleción, inserción o adición en uno o varios aminoácidos que constituyen una proteína no tiene ningún efecto sobre la actividad de la proteína, en muchos casos y, por lo tanto, el gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser un gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, incluyendo la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos y que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa.
La frase "uno o varios aminoácidos", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al número de aminoácidos que pueden provocar una sustitución, deleción, inserción o adición sin afectar a la actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa. Específicamente, el número es, por ejemplo, un número entero de 1 a 20, de manera preferente, un número entero de 1 a 10, de manera más preferente, un número entero de 1 a 5.
Paralelamente, el gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser un gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en no menos del 90%, de manera preferente, no menos del 95%, de manera más preferente, no menos del 98% a la secuencia completa de la SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa.
El gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli se puede obtener mediante PCR utilizando un ADN cromosómico de la cepa K4 de Escherichia coli como una plantilla.
La cepa K4 de Escherichia coli se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de
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acceso ATCC23502 y está disponible en el catálogo o en la página principal de la ATCC.
El gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, incluyendo la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos o una secuencia de aminoácidos que es idéntica en no menos del 90% a la secuencia completa de la SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa, se puede obtener mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, de manera que se introduce la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 mediante mutagénesis específica de sitio (Kramer, W. y Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. y otros, Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) o similares.
El gen también se puede obtener mediante: cribado de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad UDP-glucosa-4-epimerasa mediante hibridación con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia parcial de la misma en condiciones rigurosas.
La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que se forma el denominado híbrido específico y no se forma el híbrido no específico (véase Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), etc.). Entre los ejemplos específicos de las "condiciones rigurosas" se incluyen las condiciones de hibridación a 42°C en una solución que contiene formamida al 50%, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón a 100 |xg/ml y lavado con 2 X SSC, solución de SDS al 0,1% a temperatura ambiente y, a continuación, 0,1 X SSC, solución de SDS al 0,1% a 602C.
Si el gen obtenido, tal como se ha descrito anteriormente, codifica una proteína que tiene actividad UDP-glucosa-4-epimerasa puede evaluarse mediante la introducción del gen resultante en un huésped apropiado para expresar la proteína y la medición a continuación de la actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa, según el procedimiento descrito en el documento J. Biol. Chem., 277 (24), pág. 21567-21575, 2002.
Entre los ejemplos del gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli se incluyen un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3. Entre los ejemplos del gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli también se incluyen un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
El gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser un gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 ó 6, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos y que tiene actividad de condroitina sintasa.
El gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli puede ser un gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en no menos del 90%, de manera preferente, no menos del 95%, de manera más preferente, no menos del 98% a la secuencia completa de la SEQ ID NO: 4 ó 6 y que tiene actividad de condroitina sintasa.
La expresión "actividad de condroitina sintasa", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una actividad para transferir alternativamente GlcUA de un donante de GlcUA o GalNAc de un donante de GalNAc al extremo no reducido de una cadena de azúcares.
El gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli se puede obtener mediante PCR utilizando un ADN cromosómico de la cepa K4 de Escherichia coli como plantilla. Además, el gen kfoC que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, tal como un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, se puede obtener según el procedimiento descrito en el documento WO2007/145197.
El gen que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 ó 6, incluyendo la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos o una secuencia de aminoácidos que es idéntica en no menos del 90% a la secuencia completa de la SEQ ID NO: 4 ó 6 y que tiene actividad de condroitina sintasa, se puede obtener mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 ó 5, de manera que la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos se introduce en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 ó 6 mediante mutagénesis específica de sitio o similar.
El gen también se puede obtener mediante: cribado de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa mediante hibridación con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 ó 5 o una secuencia parcial de la misma en condiciones rigurosas.
Las definiciones de las expresiones "uno o varios" y "condiciones rigurosas" son las mismas que se han descrito anteriormente.
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Si el gen obtenido, tal como se ha descrito anteriormente, codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa puede evaluarse mediante la introducción del gen resultante en un huésped apropiado para expresar la proteína y a continuación la medición de la actividad de condroitina sintasa según el procedimiento descrito en el documento US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A).
La bacteria de la presente invención se puede obtener mediante la introducción de un gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli y de un gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli en una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, tal como se ha descrito anteriormente.
El término "introducción" utilizado en la presente invención incluye la introducción de ambos genes en una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP utilizando un vector, tal como un plásmido o un bacteriófago, y la introducción de ambos genes en un cromosoma de la bacteria productora de ácido glucurónico-UDP mediante recombinación homóloga o similar.
El vector, tal como un plásmido o un bacteriófago, a utilizar en el presente documento no está particularmente limitado, siempre y cuando pueda utilizarse para la introducción de genes en Escherichia coli, y entre los ejemplos de los mismos se incluyen pTrcHis (Invitrogen Corporation), el vector pET (Novagen) y el vector pGEX (Amersham Pharmacia).
En la introducción de un gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli y de un gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli, se pueden utilizar promotores nativos de los genes, pero es preferente utilizar un promotor que sea potente en Escherichia coli, tales como el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor PR o el promotor lacUV.
El gen kfoA y el gen kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli se pueden introducir uno por uno o de manera simultánea utilizando un único vector. Es más preferente utilizar un vector, tal como un plásmido o un bacteriófago, que contiene ambos genes kfoA y kfoC, ya que la introducción y la expresión de los genes se pueden realizar fácilmente.
Los genes kfoA y kfoC derivados de la cepa K4 de Escherichia coli se pueden introducir de manera que se expresen como proteínas de fusión con otros péptidos.
Entre los ejemplos de los otros péptidos se incluyen etiqueta de polihistidina y etiqueta de GST (glutatión-S-transferasa). La expresión de los productos génicos como proteínas de fusión es preferente porque la detección (confirmación de la expresión) de los productos génicos se puede realizar fácilmente.
La introducción de un gen se puede realizar mediante un procedimiento de transformación conocido. Entre los ejemplos del procedimiento se incluyen el procedimiento de electroporación, el procedimiento de DEAE-dextrano y el procedimiento de fosfato de calcio.
La introducción de un gen se puede confirmar mediante: un procedimiento de detección de un gen, tal como RT-PCR o transferencia Northern; un procedimiento de expresión de detección particular de una proteína recombinante, tal como transferencia de Western; y un procedimiento de medición de la actividad, tal como se ha descrito anteriormente.
Si el gen kfoA derivado de la cepa K4 de Escherichia coli y el gen kfoC derivado de la cepa K4 de Escherichia coli introducidos funcionan en una bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, la bacteria adquiere la capacidad de producir condroitina como un polisacárido capsular.
<2> Procedimiento de producción de condroitina
El procedimiento de producción de condroitina de la presente invención comprende, como mínimo, las siguientes etapas (1) y (2).
(1) cultivar una bacteria de la presente invención.
(2) recoger la condroitina del cultivo.
El cultivo se puede realizar mediante un procedimiento general para el cultivo de bacterias que pertenecen al género Escherichia.
El medio de cultivo no está particularmente limitado, siempre y cuando se pueda utilizar para el cultivo de bacterias que pertenecen al género Escherichia y entre los ejemplos preferentes del mismo se incluyen medio LB (medio de Luria-Bertani) (que contiene 10,0 g de triptona Bacto, 5,0 g de extracto de levadura Bacto y 5,0 g de NaCl por litro) y medio CYG (ácido casamino al 2,0%, extracto de levadura al 0,5% y glucosa al 0,2%, ajustar el pH a 7,0 antes de utilizar el autoclave). En el caso en el que se introduce un gen utilizando un vector que contiene un gen resistente a antibióticos, el medio contiene, de manera preferente, un antibiótico correspondiente al gen.
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Las condiciones de cultivo no están particularmente limitadas, siempre y cuando las bacterias que pertenecen al género Escherichia puedan crecer y, a efectos de producir condroitina con alta eficacia, el cultivo se realiza, de manera preferente, a una temperatura de 20°C a 40°C durante de 8 a 72 horas.
A efectos de producir la condroitina con alta eficacia, una bacteria se puede precultivar en una placa o medio líquido.
El procedimiento de recogida de la condroitina del cultivo no está particularmente limitado, siempre y cuando la condroitina se pueda recoger, y entre los ejemplos se incluye el procedimiento, tal como se describe en los ejemplos mostrados a continuación. Específicamente, las células recombinantes recogidas se suspenden en PBS (solución salina tamponada con fosfato) o similares; se tratan las células con lisozima, ADNasa I y proteinasa K; y se extraen las proteínas. La condroitina se puede detectar, por ejemplo, mediante el tratamiento de la fracción con condroitinasa y la realización de un análisis de la composición de disacárido.
<3> Procedimiento de producción de sulfato de condroitina
El sulfato de condroitina se puede producir mediante la sulfatación adicional de condroitina preparada a partir de las bacterias recombinantes descritas en la presente invención.
La sulfatación se puede realizar mediante un procedimiento conocido de sulfatación de glicosaminoglicanos, que no está particularmente limitado, y entre los ejemplos del mismo se incluye el procedimiento descrito en el documento JP 61-47701 A.
Además, la sulfatación se puede realizar utilizando una enzima para transferir un grupo sulfato a la condroitina (sulfotransferasa). Bajo la existencia del 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) como donante de sulfato, las sulfotransferasas pueden producir sulfato de condroitina mediante reacción a condroitina producida por las bacterias recombinantes descritas en la presente invención. Entre los ejemplos de una sulfotransferasa conocida para la transferencia de un grupo sulfato a la condroitina se incluyen la transferasa de grupo 6-O-sulfato de condroitina (J. Biol. Chem., 275 (28), 21075-21080 (2000)) y la transferasa del grupo 4-sulfato de galactosaminoglicano (Jp 2000-4877 A).
EJEMPLOS
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle haciendo referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación del vector de coexpresión de kfoC/KfoA <Amplificación del gen kfoA>
Se realizó una PCR utilizando un ADN cromosómico de la cepa K4 de E. colicomo plantilla, según el procedimiento descrito en el documento J. Biol. Chem., Vol. 277, Edición 24, 21567-21575, y el producto de PCR resultante se insertó en pTrcHis (vector de expresión de la proteína de fusión con histidina, Invitrogen), para producir de este modo pTrcHis-kfoA.
Los cebadores utilizados son los siguientes:
K4A-SP: 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3' (SEQ ID NO: 7) y K4A-AS: 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3' (SEQ ID NO: 8)
<Amplificación del gen kfoC>
Se realizó una PCR utilizando un ADN cromosómico de la cepa K4 de E. coli como plantilla, según el procedimiento descrito en el documento JP 2003-199583 A, y el producto de PCR resultante se insertó en pTrcHis, para producir de este modo pTrcHis-kfoC.
Los cebadores utilizados son los siguientes:
K4C-SP: 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3' (SEQ ID NO: 9) y K4C-AS: 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3' (SEQ ID NO: 10).
<Preparación de pTrcHis-kfoCA>
El pTrcHis-kfoCA se preparó a partir de los pTrcHis-kfoA y pTrcHis-kfoC mencionados anteriormente de la siguiente manera.
En primer lugar, se introdujo el sitio NotI-SalI en la secuencia C-terminal de pTrcHis-kfoC mediante PCR. La PCR se realizó utilizando los cebadores mostrados a continuación para amplificar la longitud completa de pTrcHis-kfoC desde el lado C-terminal de kfoC, y el producto de PCR resultante se autoligó para producir de este modo un plásmido pTrcHis-kfoC-NotI-SalI.
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Los cebadores utilizados son los siguientes:
NotSal-pTrcHisC-rev: 5'-GCGGCCGCAAAACAGCCAAGCTTCGAATTC-3' (SEQ ID NO: 11) y NotSal-pTrcHisC-for: 5'-ACGCGTCGACGGCGGATGAGAGAAGATTTTCA-3' (SEQ ID NO: 12)
A continuación, se diseñaron los cebadores (NotI-RBS-KfoA-N:
5'-GCGGCCGCAAAATT AAAGAGGT AT AT ATT AATGT ATCGA-3' (SEQ ID NO: 13) y SalI-KfoA-C:
5'-GTCGACCTCTCATCCGCCAAAACA-3' (SEQ ID NO: 14)) en dirección 5’ del sitio de unión al ribosoma (RBS) y la región C-terminal de kfoA de pTrcHis-kfoA, respectivamente, y se utilizaron para PCR utilizando pTrcHis-kfoA como plantilla. A continuación, el producto de PCR resultante se insertó en pCR4-TOPO (Invitrogen) para producir de este modo pCR4-TOPO-kfoA.
Se escindió un inserto que contenía kfoA de pCR4-TOPO-kfoA con NotI-SalI y se introdujo en el sitio NotI-SalI de pTrcHis-kfoC-NotI-SalI, y el plásmido resultante se denominó pTrcHis-kfoCA (figura 1).
Ejemplo 2
Coexpresión de la kfoC y KfoA recombinante
Se introdujo el vector de expresión, pTrcHis-kfoCA, en la cepa K5 de Escherichia coli mediante electroporación (100 pl de células, 200 Q, 25 pF, 2,5 kV, cubeta de 0,1 cm) para producir de este modo la cepa K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli. Las colonias se transfirieron a medio LB complementado con 100 ppm de ampicilina y, a continuación, el cultivo de siembra se incubó a 37°C durante una noche. Se transfirió un ml del cultivo de siembra a 20 ml de medio CYG complementado con 100 ppm de ampicilina. Las bacterias recombinantes se cultivaron a 37°C durante 3 horas (DO600 = 1,8, 1,7-2,0) y, a continuación, se añadió IPTG al cultivo a una concentración final de 1,0 mM. El cultivo resultante se cultivó a 37°C durante 5 horas adicionales para inducir la expresión de las proteínas recombinantes.
Se recogieron las células bacterianas de 900 pl del cultivo mediante centrifugación. Las células obtenidas se suspendieron en 90 pl de tampón de Laemmli (x1). Después de calentar en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, se sometieron 10 pl del sobrenadante a SDS-PAGE en un gel de gradiente 5/20% y se transfirieron a una membrana de PVDF, seguido por análisis de Western para detectar la expresión de proteínas recombinantes. Se utilizó anti-Penta-His-HRP (QIAGEN) diluido a 1/2.000 para la detección de proteínas de fusión con histidina recombinantes. Como resultado, se confirmaron las expresiones de las proteínas recombinantes KfoA y kfoC (figura 2).
Ejemplo 3
Preparación de polisacárido y su detección mediante análisis de disacárido <Preparación de células bacterianas>
Se cultivó una cepa de K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli en medio LB complementado con 100 ppm de ampicilina como cultivo de siembra. El cultivo de siembra (750 pl) se transfirió a medio CYG complementado con 100 ppm de ampicilina (15 ml) y, a continuación, se cultivó a 37°C durante 3 horas. Al cultivo se le añadió IPTG (concentración final: 1 mM), y se realizó el cultivo durante 5 horas adicionales. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación.
<Preparación del sobrenadante de cultivo>
El cultivo de siembra (1 ml) se transfirió a medio CYG complementado con 100 ppm de ampicilina (20 ml) y, a continuación, se cultivó a 37°C durante 3 horas. Al cultivo se le añadió IPTG (concentración final: 0,1 mM) y se realizó el cultivo durante 5 horas adicionales. El sobrenadante de cultivo se recogió por centrifugación.
<Preparación de la fracción de polisacárido>
Los polisacáridos se prepararon a partir de las células recombinantes y el sobrenadante de cultivo mediante los tres procedimientos siguientes.
Preparación 1) Las células bacterianas obtenidas descritas anteriormente se resuspendieron en PBS y se trataron con lisozima y ADNasa I a 37°C durante 1 hora, seguido de tratamiento con proteinasa K a 37°C durante 1 hora. A continuación, las enzimas se sometieron a inactivación por calor y las proteínas se extrajeron mediante precipitación con sulfato amónico al 70%. La fracción sobrenadante resultante se dializó contra Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) para producir la muestra L.
Preparación 2) Las células bacterianas obtenidas descritas anteriormente se trataron con los agentes para purificar
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Preparación 3) El sobrenadante de cultivo (20 ml) se evaporó a sequedad. Los materiales secados se disolvieron en 2 ml de agua destilada. La solución se dializó contra T ris-HCl 10 mM (pH 8,0) para producir la muestra S.
<Detección de condroitina mediante análisis de disacáridos>
Las muestras L, E y S (100 |j.l cada una) fueron tratadas con cABC (condroitinasa ABC; fabricada por Seikagaku Corporation) en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaOAc 50 mM a 37°C durante toda la noche.
Como controles, se prepararon muestras L, E y S tratadas sin cABC y muestras L, E y S tratadas con cABC inactivada por calor. Se realizó ultrafiltración para extraer las macromoléculas con tamaño igual o superior a 10.000 y las muestras se analizaron mediante análisis de la composición de disacáridos utilizando un sistema de HPLC fluorescente (J Biol Chem. Julio 2000 21; 275 (29): 2269 a 2275) (figuras 3, 4 y 5). Se utilizó Senshu Pak Decosil C22 (D.I. 4,6 x 150 mm) como una columna de separación en el sistema HPLC y las longitudes de onda de excitación y emisión del detector de fluorescencia se fijaron a 346 nm y 410 nm, respectivamente.
Como resultado, sólo en los casos de las muestras tratadas con cABC, se detectaron picos específicos. El perfil de la composición de disacáridos de cada muestra se correspondió estrechamente con el perfil de la muestra obtenida mediante el tratamiento de la condroitina patrón con cABC, tal como se muestra en la figura 6(A). Paralelamente, en el caso en el que la condroitina patrón tratada con cABC se mezcló con la muestra L tratada con cABC, sólo se detectó un pico y, de este modo, se confirmó que la muestra L contenía condroitina (figura 6(B)). En el caso de la muestra E y S, se obtuvieron los mismos resultados (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Preparación del vector de coexpresión Kfo ZlC/KfoA <Amplificación del KfoZ] c>
Según el procedimiento descrito en el documento WO2007/145197, se clonó un ADN que codificaba KfoC truncada en N-terminal que comprendía la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 (gen kfoZlC). El gen kfo AC se insertó en pTrcHis para obtener pTrcHis-kfoZ] C.
<Preparación de pTrcHis-kfoZI CA>
El plásmido pTrcHis-kfoCA preparado en el ejemplo 1 se escindió utilizando las enzimas de restricción SphI y SmaI. Se obtuvo un fragmento de aDn (2,9 kDa) mediante digestión del plásmido pTrcHis-kfo ^C utilizando las mismas enzimas de restricción. Según el procedimiento convencional, el fragmento de ADN se insertó en el sitio SphI-SmaI del plásmido escindido y, a continuación, el plásmido resultante se denominó pTrcHis-kfo/]CA.
Ejemplo 5
Preparación de anticuerpos contra KfoA y KfoC <Preparación de anticuerpos contra KfoA>
Se sintetizó el oligopéptido que comprendía la secuencia peptídica de la SEQ ID No: 15 (CIVSR RDGDI AESWS SPEKA NK, pureza: >70%) y 4 mg del oligopéptido se conjugaron con KLH (hemocianina de lapa californiana) mediante el procedimiento convencional. Después de preparar la solución de antígeno mediante la mezcla con adyuvante completo, se llevó a cabo la inmunización 5 veces en el intervalo de 2 semanas. Se recogió la sangre completa, después de confirmar el título de anticuerpos. A partir de la sangre de cada conejo, se obtuvieron 48 ml (muestra A) y 60 ml (muestra B) de suero contra KfoA, respectivamente. Después de la purificación utilizando columna de Proteína A, se obtuvieron 32 ml de la fracción EK-A de IgG (concentración de IgG: 5,30 mg/ml) a partir de la muestra A.
<Preparación de anticuerpos contra KfoC>
Se sintetizó el oligopéptido que comprendía la secuencia de péptido de la SEQ ID No: 16 (CQEPP GKENE TDRAA GK, pureza: >70%) y 4 mg del oligopéptido se conjugaron con KLH (hemocianina de lapa californiana) mediante el
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procedimiento convencional. Después de preparar la solución de antígeno mediante la mezcla con adyuvante completo, se llevó a cabo la inmunización 5 veces en el intervalo de 2 semanas. Se recogió la sangre completa, después de confirmar el título de anticuerpos. A partir de la sangre de cada conejo, se obtuvieron 65 ml (muestra A) y 39 ml (muestra B) de suero contra KfoA, respectivamente. Después de la purificación utilizando columna de Proteína A, se obtuvieron 39 ml de la fracción EK-A de IgG (concentración de IgG: 4,41 mg/ml) a partir de la muestra A.
Ejemplo 6
De la misma manera que en el ejemplo 2, se introdujo el plásmido pTrcHis-kfo-^CA en la cepa K5 de E. coli para obtener la cepa K5/pTrcHis-kfoZ]CA de E. coli y la cepa recombinante se cultivó para evaluar la expresión de las proteínas recombinantes. El cultivo de siembra desarrollado en medio LB complementado con 100 ppm de ampicilina (0,5 ml) se transfirió a medio CYG complementado con 100 ppm de ampicilina (10 ml) y, a continuación, el cultivo se llevó a cabo a 37°C durante 1,5 horas. Después de la adición de IPTG (concentración final: 1 mM), se continuó el cultivo durante 4 horas más. Las células bacterianas se recogieron a partir de 900 pl del cultivo y se suspendieron en 90 pl de tampón de Laemmli (x1). Después de calentar en un baño de agua hirviendo durante 10 min, se sometieron 10 pl del sobrenadante a SDS-PAGE en un gel al 7,5% y se transfirieron a una membrana de PVDF, seguido por análisis de Western para detectar la expresión de proteínas recombinantes. Se utilizaron anticuerpos contra KfoA (EK-A) y anticuerpos contra KfoC (EK-C) diluidos a 1/1.000 como primer anticuerpo para la detección de las proteínas recombinantes KfoA, KfoC y Kfo Z] C. Se utilizaron inmunoglobulinas HRP contra conejo (DAKO, # p0448) como segundo anticuerpo. Además, se llevaron a cabo los mismos exámenes utilizando el cultivo de K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli y K5/pTrcHis-kfoA de E. coli para comparar el nivel de expresión de proteínas recombinantes. Como resultado, no hubo una gran diferencia en el nivel de expresión de KfoA y KfoC (KfoZC) entre K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli y K5/pTrcHis-kfoA de E. coli (figura 7).
Ejemplo 7
Preparación de polisacárido y su detección mediante análisis de disacáridos <Preparación de célula bacteriana>
De la misma manera que en el ejemplo 3, se prepararon células bacterianas y sobrenadante del cultivo de las cepas de K5/pTrcHis-kfo Z]CA de E. coli, K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli y K5/pTrcHis-kfoA de E. coli después de tratamiento en autoclave a 121°C durante 5 minutos.
<Preparación de la fracción de polisacáridos>
El sobrenadante (1 ml) se dializó frente a agua corriente durante una noche y, a continuación, la solución dializada se liofilizó. Los materiales liofilizados se disolvieron en 100 pl de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) para utilización como una fracción de polisacáridos.
<Detección de condroitina mediante análisis de disacáridos>
De la misma manera que en el ejemplo 3, se analizó la fracción obtenida mediante el análisis de la composición de disacáridos. Se analizó la solución patrón de condroitina (200 pg/ml y 100 pg/ml) mediante HPLC fluorescente para elaborar la curva de calibración de condroitina. La relación entre la concentración de condroitina y el área de pico de azúcar doble insaturado,Z]Di-0S, se mostró en la ecuación-1.
[Condroitina; pg/ml de sobrenadante] = (0,000591 x [área del pico] + 1,219)/[índice de concentración] (r2 = 0,9984) (Ecuación-1)
El pico de acuerdo con el disacárido insaturado ( Z] Di-0S) se detectó en las muestras preparadas a partir de K5/pTrcHis-kfoZl CA de E. coli y K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli (datos no mostrados). La tabla 1 muestra el resultado de la concentración de condroitina calcula utilizando la ecuación-1 en los cultivos recombinantes.
Tabla 1 Comparación del contenido de condroitina en el cultivo de las cepas recombinantes
K5 de E. coli
Concentración Área de pico Condroitina [pg/ml]
K5/pTrcHis-kfoA
10 10.187,4 0,7
K5/pTrcHis-kfoCA
10 505.032,3 30,0
K5/pT rcH is-kfo Zl CA
10 888.677,6 52,6
Mediante la comparación de la productividad de condroitina entre K5/pTrcHis-kfoZlCA de E. coli y K5/pTrcHis-kfoCA de E. coli, la cepa recombinante K5/pTrcHis-kfoZ]CA de E. coli es más adecuada para la producción de condroitina

Claims (7)

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    REIVINDICACIONES
    1. Bacteria productora de ácido glucurónico-UDP, en la que se introducen un gen kfoA de la cepa K4 de Escherichia coli y un gen kfoC de la cepa K4 de Escherichia coli, en la que dicha bacteria tiene la capacidad de producir condroitina como un polisacárido capsular,
    y en la que el gen kfoA codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (A) y (B)
    (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y
    (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa; y
    en la que el gen kfoC codifica una proteína seleccionada del grupo que comprende (C) a (F);
    (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
    (D) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de condroitina sintasa;
    (E) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y
    (f) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, que incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de 1 a 20 aminoácidos y que tiene actividad de condroitina sintasa.
  2. 2. Bacteria, según la reivindicación 1, en la que el gen kfoA es un ADN seleccionado del grupo que comprende (a) y
    (b) :
    (a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; y
    (b) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene actividad de UDP-glucosa-4-epimerasa.
  3. 3. Bacteria, según la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen kfoC es un ADN seleccionado del grupo que comprende
    (c) y (d):
    (c) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; y
    (d) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa.
  4. 4. Bacteria, según la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen kfoC es un ADN seleccionado del grupo que comprende
    (e) y (f):
    (e) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5; y
    (f) un ADN que hibrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina sintasa.
  5. 5. Bacteria, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha bacteria es la cepa K5 de Escherichia coli.
  6. 6. Procedimiento de producción de condroitina que comprende, como mínimo, las siguientes etapas (1) y (2):
    (1) cultivar la bacteria, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
    (2) recoger la condroitina del cultivo.
  7. 7. Procedimiento de producción de sulfato de condroitina que comprende: producir condroitina mediante el procedimiento, según la reivindicación 6; y sulfatar la condroitina para producir sulfato de condroitina.
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