ES2584038T3 - Sulfato de condroitina similar al de tiburón, y procedimiento para la preparación del mismo - Google Patents

Abstract

Sulfato de condroitina similar al de tiburón, libre de disacáridos tri-, tetra- y 2,4-di- sulfatados, que consiste en 60- 99% de 6-sulfato, 0,5-30% de 2,6-disulfato, 0,1-5% de 4,6-disulfato, 0,1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4-sulfato, expresándose todos los porcentajes con respecto al contenido de disacárido total del sulfato de condroitina similar al de tiburón, presentando este último un peso molecular medio en número (Mn) de 40-85 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-95 kDa.

Description

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DESCRIPCION

Sulfato de condroitina similar al de tiburon, y procedimiento para la preparacion del mismo.

La presente invencion se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburon, y un procedimiento para la preparacion del mismo. En particular, la presente invencion se refiere a un sulfato de condroitina similar al de tiburon, que muestra una cantidad muy baja de 4-sulfato, una alta densidad de carga y una actividad biologica comparable a los sulfatos de condroitina naturales; la invencion se refiere asimismo a un procedimiento para la preparacion del sulfato de condroitina similar al de tiburon.

El sulfato de condroitina (de aquf en adelante CS), que pertenece a la clase de polisacaridos complejos naturales llamados glucosaminoglucanos (GAGs), esta compuesto de secuencias disacaridas alternadas de restos diferentemente sulfatados de acido D-glucuronico (GlcA) y de N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) enlazados por enlaces beta (1->3).

Dependiendo de la naturaleza del disacarido, se conocen CS con diferentes cadenas principales de carbohidratos. De hecho, incluso si tanto los CS naturales como sinteticos conocidos estan principalmente compuestos por diversos porcentajes de dos tipos de unidades disacaridas, es decir, sulfatadas en la posicion 4 o 6 de GalNAc, los disacaridos con un numero y posicion diferentes de grupos sulfato pueden estar localizados, en diversos porcentajes, dentro de las cadenas polisacaridas. Por ejemplo, el disacarido no sulfatado esta presente, en general en bajas cantidades, en la cadena principal de CS, mientras que los disacaridos disulfatados que tienen dos grupos sulfato enlazados mediante O en diversas posiciones, tales como 2 de GlcA y 6 de GalNAc (disacarido D), o en la posicion 4 y 6 de GalNAc (disacarido E), pueden estar presentes en la cadena principal de CS en diversos porcentajes con relacion a las fuentes animales especfficas [Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007].

El CS muestra una unidad repetida disacarida que presenta la siguiente formula estructural:

imagen1

A continuacion se da a conocer el significado de algunos de los acronimos mas recurrentes, actualmente utilizados para identificar brevemente los restos diferentemente sulfatados de las secuencias disacaridas alternadas que constituyen los CS.

Di-0S Di-6S (C) Di-4S (A) Di-4,6diS (E) Di-2,6diS (D) Di-2,4diS (B) Di-2,4,6triS

(R2=H; R4=H; R6=H)

(R2=H; R4=H; R6=SO3‘)

(R2=H; R4=SO3‘; R6=H)

(R2=H; R=SO3- ; R6=SO3‘)

(R2= SO3-; R4=H; R6=SO3-)

(R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)

(R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)

Las muestras de CS tanto naturales como sinteticas pueden ser caracterizadas y diferenciadas por medio de enfoques analfticos sensibles, especfficos, validados y publicados, capaces de dar la caracterizacion estructural y los parametros de CS (por ejemplo, grupos sulfatados especfficos, densidad de carga, masa molecular, y pureza) asf como las actividades biologicas.

Las muestras de CS extractivas naturales pueden ser caracterizadas en busca de la estructura y las propiedades [Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007; Mucci A. et al., Carbohydr Polymers 41, 37, 2000; Volpi N., Analyt Biochem 277, 19, 2000].

Respecto a las formas tri- y tetrasulfatadas de CS (“triS” y “tetraS”, respectivamente), se puede observar que estas son inusualmente detectadas en muestras de CS extractivas naturales, mientras que tfpicamente caracterizan el CS sintetico; Di-2,4,6-triS es tomado como un estandar con el fin de evaluar la presencia de triS CS en productos de CS sinteticos ya que las otras formas de triS teoricamente posibles no estan presentes en los productos derivados naturalmente.

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La tabla 1 siguiente ilustra los principales disacaridos identificados en las muestras naturales de CS extrafdas y purificadas de diversos organos y tejidos, principalmente cartflagos.

Tabla 1

CS bovino CS porcino CS de pollo CS de tiburon CS de raya CS de calamar

Mn (kDa)

12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80

Mp (kDa)

20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120

indice de Polidispersidad

1,8-2,2 1,4-1,8 1,6-2,0 1,0-2,0 1,2-2,5 0,8-1,3

Di-0S

6 6 8 3 3 13

Di-6S (C)

33 14 20 44 39 15

Di-4S (A)

61 80 72 32 43 50

Di-2,6diS (D)

ND ND ND 18 13 0

Di-4,6diS (E)

ND ND ND 2 1 22

Di-2,4diS (B)

ND ND ND 1 1 0

triS

ND ND ND ND ND ND

tetraS

ND ND ND ND ND ND

Densidad de carga

0,90-0,96 0,92-0,96 0,90-0,94 1,15-1,25 1,08-1,20 1,00-1,20

Relacion 4S/6S

1,50-2,00 4,50-7,00 3,00-4,00 0,45-0,90 1,00-1,40 2,50-4,00

Mn = peso molecular medio numerico; Mp = peso molecular medio en peso; Indice de Polidispersidad = Mp/Mn; la densidad de carga es el numero de grupos sulfato por unidades disacaridas); ND = No Detectado______________

La tabla 1 ilustra los parametros estructurales principales para la caracterizacion de las muestras de CS naturales principales purificadas de diversas fuentes.

En particular, los parametros de masa molecular son muy similares para las muestras de CS terrestres (muestras bovinas, porcinas y de pollo) pero bastante diferentes de las muestras de peces (muestras de tiburon, raya y calamar), teniendo las ultimas valores de masas moleculares mayores que las primeras.

Ademas, las muestras de CS de peces presentan unos valores de densidad de carga peculiares, superiores a aproximadamente 1,0, debido a la presencia de disacaridos disulfatados, y diferentes de las muestras terrestres, que presentan unos valores de densidad de carga inferiores a aproximadamente 1,0, debido a la ausencia de los disacaridos disulfatados.

Una peculiaridad adicional de todos los CS naturales es que cuando son digeridos con condroitinasa ABC, una enzima hidrolftica especffica para disacaridos sulfatados 4S o 6S, asf como para disacaridos no sulfatados, la cadena polisacarida es completamente digerida en unidades disacaridas. Esto puede ser observado facilmente con el analisis de electroforesis de carbohidratos asistida por fluroforo (FACE). La digestion completa de CS natural es debida a la ausencia de estructuras tri- y tetra-sulfatadas en la cadena polisacarida. Los disacaridos tri- y tetra- sulfatados, si estan presentes, no son reconocidos por la condroitinasa ABC, no permitiendo una digestion completa del polisacarido, esto produce parcialmente cadenas oligosacaridas no digeridas facilmente determinadas en el analisis FACE.

Finalmente, debido las rutas biosinteticas, todos los CS naturales conocidos muestran la presencia contemporanea de disacaridos monosulfatados en la posicion 4 y posicion 6 de GalNAc (con el disacarido 4-sulfatado nunca menor de 30%), incluso si su relacion cambia dependiendo de la fuente.

Como se ilustro anteriormente, CS es una macromolecula heterogenea muy compleja que tiene estructura y propiedades variables, dependiendo de la fuente de extraccion. Ademas, como resultado de los procesos biosinteticos relacionados con los tejidos y especies especfficos, se pueden biosintetizar CS con diferentes grados de polimerizacion, produciendo macromoleculas que tienen diversas masas moleculares y polidispersidad. Debido a estas variaciones estructurales, y ademas de la posible presencia de secuencias oligosacaridas especfficas, y la pureza de las preparaciones para aplicaciones en terapia o en productos nutraceuticos, los CS pueden tener diferentes propiedades y capacidades.

De hecho, han sido dado a conocer actividades diferentes y peculiares dependiendo de la estructura de CS [Volpi N., Biomaterials 23, 3015, 2002; Volpi N. et al., Biochimie 81, 955, 1999; Volpi N., Biomaterials 20, 1359, 1999; Suzuki S. et al., J Biol Chem 243, 7, 1968].

El CS extractivo natural es actualmente recomendado por la European League Against Rheumatism (EULAR) como farmaco de accion lenta sintomatico para la osteoartritis (SYSADOA) en Europa en el tratamiento de OA de rodilla

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[Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1 145, 2003], cadera [Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1 145, 2003], y mano [Zhang W. et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007] sobre la base de las pruebas de investigacion y el metaanalisis de numerosos estudios clfnicos.

Ademas, CS solo o en combinacion con otros ingredientes, es ampliamente utilizado como un producto nutraceutico, principalmente en Europa y en los Estados Unidos de America [McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N. et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N. et al., Separation Sc 1, 22, 2009].

La efectividad de CS esta estrictamente relacionada con su actividad antiinflamatoria, tal como su habilidad para inhibir la actividad de las enzimas degradantes como elastasa leucocitaria humana (HLE) [Ronca F. et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998. Egea J. et al., Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 1, S24, 2010].

El CS utilizado mundialmente en aplicaciones farmaceuticas o nutraceuticas es obtenido por la extraccion de tejidos de diversos animales tales como bovidos y porcinos [Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998], aves [Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002], peces cartilaginosos [Sugahara K. et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003], etc.

Incluso, el origen animal de estos productos plantea problemas potenciales de seguridad a los consumidores, asociados con la posible presencia de agentes infecciosos transmisibles, tales como los que provocan las encefalopatfas espongiformes en bovinos, o un uso restringido relacionado con asuntos religiosos.

Ademas, la naturaleza extractiva de estos productos convierte su suministro en potencialmente no fiable a partir de una demanda creciente y volumenes del mercado cada vez mayores.

Tales consideraciones han promovido la investigacion de fuentes de CS alternativas, mas dependientes, un ejemplo de lo cual es la produccion biotecnologica partiendo del polisacarido capsular K4 de E. coli como se describe en la bibliograffa cientffica y de patentes.

En este contexto, la expresion produccion biotecnologica se refiere a un metodo de produccion en el que una porcion sustancial del producto final es producida por un microorganismo, o por celulas aisladas de un organismo superior, o un sistema de cultivo artificial, habitual y variadamente denominado como fermentacion.

Basicamente, se han utilizado tres enfoques principales hasta el momento en la tecnica.

El primero puede ser identificado con la produccion de productos similares a CS utilizando como material de partida el polisacarido capsular K4 de E. coli O5:K4:H4, el cual se somete despues a transformacion qufmica, mientras que el segundo enfoque puede ser visto como la biosfntesis directa de compuestos similares a CS por microorganismos, y el tercero se reconoce que es la produccion biosintetica de condroitina no sulfatada, seguida de la sulfatacion qufmica o bioqufmica.

El documento EP-A-1304338, que pertenece al primer enfoque mencionado anteriormente, describe la produccion de CS partiendo del polisacarido K4 producido en cultivos lfquidos, que es inicialmente extrafdo y purificado, y a continuacion redisuelto y sometido a hidrolisis acida, cuyo efecto principal es la eliminacion de los restos de fructosa enlazados a los restos de GlcA presentes en el polfmero lineal. Un efecto secundario es la hidrolisis parcial de la cadena polisacarida, que conduce a productos de menor masa molecular. A continuacion, el polfmero desfructosilado, que es identico a la condroitina no sulfatada, es sulfatado de manera diversa en las posiciones C-4 o en las posiciones C-6 de los restos de GalNAc por medios qufmicos utilizando grupos protectores apropiados en las posiciones 4 o 6. Tambien, se describe en este documento un CS, consistiendo al menos 70% de su contenido en mono- y/o di-sulfatado en las posiciones 4 y 6 del resto de galactosamina, estando no sulfatada la posicion 2 del resto glucuronico, que tiene un Mp de 6-25 kDa y una relacion de grupo carboxilo/sulfato (es decir, densidad de carga) de 0,7-2,0.

El documento WO 2009/149155, que ejemplifica el segundo enfoque anteriormente mencionado, describe la produccion directa de compuestos similares a CS por diversos microorganismos, tanto bacterias como hongos. Tambien se describe en este documento un compuesto similar a CS terrestre, estando sulfatadas ambas posiciones 4 y 6 del resto de galactosamina; se da a conocer que el compuesto muestra un peso molecular (Mp) de aproximadamente 300 Da hasta 35 kDa y una relacion de sulfato 4S/6S comprendida entre menos de 1 y mas de 1.

El tercero de los enfoques anteriores incluye varias estrategias diferentes para la produccion de la condroitina no sulfatada, la principal de las cuales es la sfntesis enzimatica del polfmero en sistemas libres de celulas, como la descrita por ejemplo en los documentos EP-A-1950308 y EP-A-1964924, y la biosfntesis en celulas recombinantes obtenidas que se expresan en hospedantes capaces de producir, a partir de UDP-GIcA, los genes kfoA y kfoC extrafdos de E. coli K4, descrita, por ejemplo, en el documento WO 2008/133350.

Otro ejemplo mas de la produccion biosintetica de condroitina no sulfatada se describe mediante la solicitud de patente italiana n° MI2010A001300, la cual, entre otros, se refiere a un metodo para la produccion biotecnologica de

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condroitina, que comprende cultivar en un medio adecuado un microorganismo recombinante, preferentemente Escherichia coli DSM23644, recuperar y purificar la condroitina no sulfatada presente en el cultivo microbiano, y despues sulfatar qufmicamente esta ultima. Una caracterfstica comun para los procedimientos para la produccion de CS descritos hasta el momento es una reduccion sustancial de la masa molecular del material original tanto durante la eliminacion catalizada por acido de los restos de fructosa como durante las etapas de sfntesis qufmica requeridas para la sulfatacion de los restos de GalNAc.

Como un ejemplo, el documento EP-A-1304338 describe un CS de 6-25 kDa de masa molecular, mientras que se describe que la masa molecular del polisacarido K4, utilizado como el material de partida, es de 150-400 kDa.

Kenji Uchimura et al.: “Mouse chondroitin 6-sulfotransferase: molecular cloning, characterization and chromosomal mapping”, Glycobiology, 1 de enero de 1998, paginas 489-496, describen la caracterizacion de una 6- sulfotransferasa capaz potencialmente de producir de manera especffica 6-sulfato de condroitina, no habiendose caracterizado todavfa de este ultimo la estructura primaria, es decir, la composicion disacarida, y las propiedades fisico-qufmicas, es decir, parametros de densidad de carga y masa molecular. Uchimura et al. tambien describen condroitina qufmicamente desulfatada mediante un ensayo no especffico, y no distinguen entre condroitina y los oligomeros que tienen un peso molecular bajo y ninguna actividad biologica.

H. Kitagawa: “Molecular cloning and expression of a novel chondroitin 6-O-sulfotransferase”, J. of Biol. Chem., vol. 275, n° 28, 25 de abril de 2000, paginas 21075-21080, describen a utilizacion de condroitina qufmicamente desulfatada, resulfatada despues mediante un procedimiento enzimatico, pero sin describir si la desulfatacion es total o si existe cualquier residuo de la sulfatacion en la posicion 6 (u otras). Ademas, no existe ninguna mencion ni ninguna estimacion de disacaridos no sulfatados, ya que la composicion disacarida se evalua separando solamente los disacaridos sulfatados.

Tsutsumi et al.: “Functional expression and genomic structure of human chondroitin 6-sulfotransferase”, Febs Letters, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 441, n° 2, 18 de diciembre de 1998, paginas 235-241 y Fukuta et al.: “Molecular cloning and expression of chick chondrocyte chondroitin 6-sulfotransferase”, J. of Biol. Chem., The American Society Of Biological Chemists, Inc., US, vol. 270, n° 31, 4 de agosto de 1995, paginas 18575-18580, describen la caracterizacion de 6-sulfotransferasa humana capaz de producir 6-sulfato de condroitina (y otros derivados de condroitina) de manera especffica y aun sin ninguna caracterizacion de sulfato de condroitina.

El documento WO 2010/136435 describe la produccion de concentraciones elevadas de condroitina no sulfatada por medio de bacterias recombinantes, geneticamente mutadas insertando en ellas secuencias geneticas especfficas; los Ejemplos nos 10 y 11 describen la produccion de sal sodica de condroitina. El procedimiento se ilustra y explica adicionalmente por Chiara Schiraldi et al. “Purification of chondroitin precursor from Escherichia coli K4 fermentation broth using membrane processing”, Biotechnology Journal, vol. 6, n° 4, 7 de marzo 2011, paginas 410-419.

El documento WO 98/34958 describe un procedimiento para la preparacion de los polisacaridos K4, K5 y K40 O- sulfatados utiles para el tratamiento de patologfas tumorales, por VIH-1 y de coagulacion y en preparaciones cosmeticas.

Chiara Schiraldi et al. “Production of chondroitin sulphate and chondroitin”, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 87, n° 4, 3 de junio 2010, paginas 1209-1220, describen un repaso de las diversas aplicaciones y procedimientos de condroitina a fin de proporcionar alternativas de sulfato de condroitina a productos extrafdos de fuentes naturales.

Un primer aspecto de la presente invencion es un sulfato de condroitina similar al de tiburon, libre de los disacaridos tri-, tetra- y 2,4-di- sulfatados, que consiste en 60-99% de 6-sulfato, 0,5-30% de 2,6-disulfato, 0,1-5% de 4,6- disulfato, 0,1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4-sulfato, expresandose todos los porcentajes con respecto al contenido total de disacarido del sulfato de condroitina similar al de tiburon, mostrando este ultimo un peso molecular medio en numero (Mn) de 40-85 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-95 kDa.

Preferentemente, el sulfato de condroitina similar al de tiburon de la presente invencion consiste en 70-90% de 6- sulfato, 8,5-20% de 2,6-disulfato, 0,1-5% de 4,6-disulfato, 0,1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4-sulfato, expresandose todos los porcentajes con respecto al contenido total de disacarido del sulfato de condroitina similar al de tiburon, mostrando este ultimo un peso molecular medio en numero (Mn) de 40-65 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-70 kDa.

El CS objeto de la presente invencion se caracteriza por una masa molecular elevada y por grupos sulfatados peculiares, principalmente en la posicion 6, asf como por una cantidad muy pequena de disacarido 4-sulfatado.

Examinando las caracterfsticas del CS de la presente invencion y comparandolas con las mostradas en la tabla 1 anterior que se refieren a las muestras de CS extractivas naturales, se puede observar que el CS de la presente invencion se asemeja aproximadamente al CS de tiburon.

Tambien, el CS objeto de la presente invencion no muestra polisacaridos polisulfatados, en particular no muestra ni

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disacaridos tri- ni tetra-sulfatados que caracterizan tfpicamente el CS obtenido por los metodos sinteticos descritos en la tecnica anterior y detectables, despues de la digestion con condroitinasa ABC, como un producto no degradado.

Ademas, el CS objeto de la presente invencion resulta estar altamente purificado (sobre la base de la cantidad de producto no degradado despues de la digestion con condroitinasa aBc), y se distingue evidentemente del CS descrito en el documento EP-A-1304338 que tiene una masa molecular de 6-25 kDa y una cantidad elevada de condroitina no sulfatada (> 10%) y amplio intervalo de densidad de carga (0,7-2), mientras que los intervalos de la densidad de carga del CS de la invencion son mas estrechos y ascienden preferentemente hasta 1,05-1,30.

Tanto Mn como Mp pueden ser calculados de acuerdo con los metodos habituales conocidos por los expertos en la materia; por ejemplo la Cromatograffa de Exclusion de Tamanos de Altas Prestaciones (HPSEc); preferentemente, Mn y Mp pueden ser determinados por HPSEC, equipado con software especializado integrado para la Cromatograffa de Permeacion en Gel (GPC).

Preferentemente, la suma de 2,6-disulfato y 4,6-disulfato en el CS de la presente invencion asciende hasta 10-25% del contenido total de disacarido.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende el sulfato de condroitina similar al de tiburon de la presente invencion y un vehfculo farmaceutica o nutraceuticamente aceptable tal como, por ejemplo, celulosa microcristalina, deXtrina, maltodextrina, ciclodextrina, sulfobutileter beta- ciclodextrina, lecitina de soja, acido palmitoleico, liposomas, esteres de sacarosa, y similares.

Como apreciara el experto en la materia, la composicion de la invencion puede ser formulada en diversas formas, ya sea solida (es decir, comprimidos, capsulas duras, capsulas de gel blandas) o lfquida (por ejemplo, disoluciones o mezclas para beber en polvo), preferentemente en forma de una preparacion farmaceutica y/o nutraceutica parenteral y/u oral, y puede comprender ademas otros principios inactivos y/o activos.

Entre tales ingredientes adicionales, la composicion de la invencion puede comprender tambien y preferentemente al menos una de las siguientes sustancias: hidrocloruro de glucosamina, sulfato de glucosamina, N-acetil- glucosamina, acido hialuronico, heparina, queratina, dermatina, metilsulfonilmetano, folatos o folatos reducidos, vitaminas del grupo B, S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o ascorbato de manganeso, y pueden ser administradas en una cantidad efectiva a un sujeto que lo necesite, dependiendo de las necesidades y las circunstancias que el caso pueda requerir. Unicamente a tftulo de ejemplo, el CS similar al de tiburon y/o la composicion de la presente invencion pueden ser administrados en una cantidad de 100-3000 mg/dfa, preferentemente en una cantidad de 1000-2000 mg/dfa, mas preferentemente en una cantidad de 1200-1800 mg/dfa, en general dividida en dos/tres dosis por dfa.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invencion se refiere al sulfato de condroitina similar al de tiburon o a la composicion de la presente invencion, para uso en la prevencion o tratamiento de osteoartritis, o para el mantenimiento de la salud musculoesqueletica, por ejemplo como un principio activo en un farmaco o en un aditivo alimentario o un suplemento nutricional.

Unicamente a tftulo de ejemplo, el CS similar al de tiburon o la composicion de la presente invencion, como se definio anteriormente, puede ser utilizado para la preparacion de un medicamento, un aditivo alimentario o un suplemento nutricional, para la prevencion y/o el tratamiento de osteoartritis (OA) de cadera, mano y rodilla y sus sfntomas principales, tales como dolor, hinchazon de las articulaciones, inflamacion, enfermedad de Alzheimer, infecciones microbianas, arterioesclerosis, osteoporosis y como un adyuvante en la terapia contra el cancer y la regeneracion de tejidos, incluyendo la regeneracion del tejido nervioso.

De acuerdo con todavfa otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar la condroitina similar al de tiburon anteriormente definida, que comprende:

a) salificar condroitina no sulfatada, como acido libre, previamente disuelta en un ambiente acuoso, con una sal seleccionada del grupo que consiste de tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-amonio o piridinio;

b) secar la condroitina no sulfatada salificada que resulta de la etapa a) hasta 5-15% de contenido de agua;

c) secar la condroitina no sulfatada salificada que resulta de la etapa b), a una temperatura de 100°C-170°C, hasta un contenido de agua de 0,1-3%;

d) sulfatar selectivamente la posicion 6 de la condroitina no sulfatada salificada resultante de la etapa c), solubilizada en N-metil-pirrolidona o dimetilformamida, a una temperatura de 0°C-30°C, anadiendo 1-2 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o el complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida, a intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que se anade un total de 2-15 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o del complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida; dejando la disolucion

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resultante bajo agitacion durante 2-24 horas;

e) interrumpir ("quenching") la reaccion llevada a cabo en la etapa d) con una disolucion acuosa de bicarbonato o carbonato de sodio, filtrando y concentrando hasta sequedad la disolucion resultante para obtener un solido seco;

f) disolver el solido seco en una disolucion acuosa de cloruro de sodio, ultrafiltrando y dializando la disolucion resultante;

g) recuperar el producto de la disolucion resultante de la etapa f);

h) purificar el producto resultante de la etapa g), y obtener este ultimo ya sea en forma acida o como la sal de sodio del mismo;

i) recuperar el producto resultante de la etapa h).

La salificacion de la condroitina no sulfatada en la etapa a) se lleva a cabo preferentemente con una sal seleccionada de entre el grupo que consiste en tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-amonio, todavfa mas preferentemente con tetrabutil-amonio, mientras que el secado de la condroitina no sulfatada en la etapa b) se puede llevar a cabo mediante liofilizacion o secado por rocfo.

El secado de la sal de condroitina no sulfatada en la etapa c) se lleva a cabo preferentemente hasta 0,5-2% agua, mientras que la solubilizacion de la sal de condroitina no sulfatada que resulta de dicha etapa se lleva a cabo preferentemente en dimetilformamida.

La sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo preferentemente anadiendo un total de 6-12, mas preferentemente 6-9, equivalentes de complejo de trioxido de azufre-piridina. Alternativamente, cuando la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo por el complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida, se anade un total de 1-9, preferentemente 2-4, equivalentes.

Ademas, la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de 10°C-20, mientras que, al final de la etapa d), la disolucion resultante se deja preferentemente bajo agitacion durante 2-6 horas.

De acuerdo con todavfa otra forma de realizacion preferida del procedimiento de la invencion, el producto de la disolucion resultante de la etapa f) es recuperado mediante liofilizacion, secado por pulverizacion o precipitacion en un ambiente alcoholico.

El procedimiento de la invencion permite el mantenimiento sin cambio del peso molecular del polisacarido nativo.

Sorprendentemente, el procedimiento de la invencion permite evitar llevar a cabo cualquier etapa dirigida a proteger cualquiera de los grupos hidroxilo secundarios, probablemente debido a que la reactivad de los grupos hidroxilo primarios en la posicion 6 del GalNAc que garantiza la selectividad de la reaccion.

Ademas, el procedimiento de la invencion permite obtener una productividad sustancialmente mas alta y una mejor reproducibilidad de la calidad del producto en comparacion con la tecnica anterior; por ejemplo, con respecto al documento EP-A-1304388, en el que las etapas de sulfatacion dan como resultado un intervalo mas amplio de relacion de grupos carboxilo/sulfato, que asciende a 0,7-2,0.

Tambien, el procedimiento de la invencion permite obtener un producto que muestra cantidades muy bajas de disacarido 4-sulfatado y sustancialmente libre de disacaridos polisulfatados; en particular, permite obtener un producto libre ya sea de sacaridos triS o tetraS.

Tfpicamente, el procedimiento de la invencion puede ser llevado a cabo mediante disolviendo condroitina no sulfatada, como acido libre o la sal de sodio, preparada por ejemplo desfructosilando el polfmero capsular K4 obtenido mediante fermentacion, como se describe por Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) y Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1988), en un ambiente acuoso.

En el caso en que la condroitina no sulfatada este bajo la forma de su sal de sodio, despues de su disolucion completa, la disolucion resultante es eluida, convenientemente a una temperatura de 0°C-30°C, en una columna que contiene una resina de intercambio cationico (tal como, por ejemplo, Amberjet 1200 H, Rohm and Haas y similar) recolectando las porciones eluidas convenientemente a un pH de 1,5-4,0, preferentemente 1,5-3,0, y recuperando las porciones acidas acuosas.

Alternativamente, esta etapa puede ser llevada a cabo en lotes: despues de la disolucion de la sal de sodio de condroitina no sulfatada, en agua, la cual es preferentemente obtenida agitando 20-60 minutos a 0°C-30°C, se le

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anade la resina cationica (Amberjet 1200 H, Rohm and Haas y similar), el pH de la disolucion despues de la adicion de la resina resulta que esta entre 1,5 y 3,0. Despues, la disolucion se filtra, y se recoge el filtrado acido resultante.

La disolucion acida de la condroitina no sulfatada, obtenida ya sea directamente disolviendo la condroitina no sulfatada como acido libre o purificando su disolucion de sal de sodio como se describio anteriormente, ya sea en forma continua o en lotes, se anade despues con una disolucion acuosa de un ion seleccionado del grupo que consiste en tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-, amonio o piridinio, convenientemente hasta un pH de 6,0-8,0, preferentemente 6,0-7,0, la disolucion es evaporada hasta sequedad, por ejemplo mediante liofilizacion o secado por pulverizacion, hasta un contenido de agua de 5-15%, para recuperar asf la sal de condroitina correspondiente.

La sal de condroitina resultante se somete despues a una segunda etapa de secado, a una temperatura de 100°C- 170°C, hasta un contenido de agua de 0,1-3%, para recuperar asf finalmente la sal de condroitina no sulfatada correspondiente.

La sal de condroitina no sulfatada correspondiente, obtenida como se describio anteriormente, se sulfata despues selectivamente en la posicion 6, sin la necesidad de proteger ninguna de los restos funcionales, al solubilizarla en un disolvente seleccionado de N-metilpirrolidona o dimetilformamida, a una temperatura de 0°C-30°C, preferentemente 10°C-20°C, eluyendo convenientemente la sal de condroitina no sulfatada completamente disuelta en una columna que contiene una resina de intercambio cationico (tal como, por ejemplo, Amberjet 1200 H, Rohm and Haas y similar), anadiendo 1-2 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o del complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida, a intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que se anade un total de 2-15 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o dimetilformamida, dejando la disolucion resultante bajo agitacion durante 2-24 h, preferentemente 2-6 h.

La masa de reaccion resultante se interrumpe despues en una disolucion acuosa de bicarbonato o carbonato de sodio, y despues se recupera, por ejemplo mediante tratamiento con bicarbonato de sodio y filtracion de las sales insolubles resultantes, se evapora hasta sequedad y nuevamente se disuelve en una disolucion acuosa de cloruro de sodio, se recupera y finalmente se trata, por ejemplo mediante ultrafiltracion y dialisis, para eliminar asf las sales remanentes y las impurezas de bajo peso molecular, y finalmente recuperando el producto, por ejemplo, mediante liofilizacion, secado por pulverizacion o precipitacion en un ambiente alcoholico.

El 6-sulfato de condroitina resultante obtenido como se ilustro anteriormente se purifica despues; por ejemplo mediante cromatograffa en columna de resina de intercambio cationico, para obtenerlo asf en su forma acida, y - posiblemente - se obtiene a continuacion como la sal de sodio del mismo anadiendo, por ejemplo, hidroxido de sodio.

El 6-sulfato de condroitina asf obtenido se recupera finalmente, por ejemplo secandolo en un horno, a vacfo, a 50°C- 70°C, o se purifica cromatograficamente, obteniendo un sulfato de condroitina similar al de tiburon, libre de disacaridos tri-, tetra- y 2,4-di- sulfatados, que muestra un Mn de 40-85 kDa, un Mp de 50-95 kDa.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.

Ejemplo 1

Salificacion

Se disolvieron en agua desmineralizada (500 ml) 20 g de sal sodica de condroitina, preparada desfructosilando el polfmero capsular K4 obtenido mediante fermentacion como se describe por Manzoni (Biotechnology Letters 18, 383-6, 1996) y Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998). Tras la disolucion total, la disolucion resultante se eluyo a 5°C en una columna que contuene una resina de intercambio cationico (160 ml de Amberjet 1200 H, Rohm and Haas), previamente hidratada y preparada en forma acida. Las porciones eluidas se recuperaron a un pH de 1,9, recogiendo las porciones acidas acuosas y anadiendoles una disolucion acuosa al 16% de tetrabutilamonio, hasta un pH de 7,0; la disolucion se evaporo entonces hasta sequedad liofilizando para recuperar 20,8 g de condroitina como sal de tetrabutilamonio.

La sal resultante se sometio entonces a un segundo tratamiento termico en una secadora estatica a 105°C durante 4 h, a vacfo, hasta una humedad residual menor de 0,2%. Se obtuvieron asf 18,5 g de condroitina como sal de tetrabutilamonio.

Ejemplo 2

Salificacion

Se disolvieron en 20 ml de agua desmineralizada 12 g de condroitina no sulfatada preparada desfructosilando el polfmero capsular K4 obtenido mediante fermentacion como se describe por Manzoni (Biotechnology Letters 18,

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383-6, 1996) y Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998), y, tras acidificar hasta pH 2,5 mediante HCl 1M y anadir 80 ml de etanol, la condroitina no sulfatada precipito como acido libre.

Tras filtrar y lavar con etanol, se obtuvieron 10,3 g del producto como un solido blanco que, despues de haberlo secado a vacfo a 50°C, mostro un tftulo acido de 90%, calculado en el producto per se y que contenfa 8% de agua residual. El solido resultante se suspendio en 20 ml de agua y se anadio con una disolucion acuosa al 40% p/p de hidroxido de tetrabutilamonio hasta pH 8. La disolucion resultante se liofilizo entonces hasta 2,5% de agua residual, para obtener 15,9 g de condroitina solida como sal de tetrabutilamonio.

La sal resultante se sometio entonces a un segundo tratamiento termico en una secadora estatica a 105°C durante 4 h, a vacfo, hasta una humedad residual menor de 0,2%. Se obtuvieron asf 15,4 g de tetrabutilcondroitina.

Ejemplo 3

Sulfatacion

Se cargaron 1,4 g de tetrabutilcondroitina, obtenida como se ilustra en el ejemplo 1, y 84 ml de DMF en un matraz de cuatro bocas de 250 ml, en una atmosfera inerte (N2), agitando mecanicamente y en presencia de un sistema de enfriamiento de burbujeo, con trampa de cloruro de calcio y termometro.

La suspension resultante se dejo agitando hasta la disolucion total, ajustando a continuacion la temperatura a 23°C.

Una vez que se ajusto la temperatura, se anadio en porciones el complejo solido de trioxido de azufre-piridina (1,07 g, 3 eq.) a la disolucion, manteniendo la reaccion en agitacion durante 1 h y anadiendo despues mas complejo solido de trioxido de azufre-piridina (1,07 g; 3 eq.). Despues de agitar 1 h adicional a la misma temperatura, la mezcla de reaccion se transfirio a un matraz de 500 ml, que contiene una disolucion saturada de hidrogenocarbonato de sodio, y se enfrio a 10°C.

Despues de dejar que la temperatura se elevase hasta 20°C, se llevo a cabo la filtracion en un Buchner, recuperando el filtrado y evaporandolo hasta sequedad a vacfo.

El solido seco resultante (2,3 g) se molio finamente y se redisolvio en una disolucion 0,3M de NaCl (130 ml), sometiendo la disolucion asf obtenida a ultrafiltracion usando una membrana de 3 kDa de corte y manteniendo el pH del retenido a 7,0. La disolucion ultrafiltrada se dializo entonces para eliminar las sales, recuperando el producto mediante liofilizacion.

El producto resultante se seco finalmente a 50°C y 10 mbares, hasta que se obtuvo 1 g de sustancia, que muestra un tftulo (calculado determinando la deteccion amperometrica pulsada “PAD” de acido glucuronico) de 95%, un Mn de 60 kDa y un Mp de 67,3 kDa, determinado mediante cromatograffa de exclusion de tamanos de altas prestaciones (HPSEC) equipada con un software especializado integrado para GPC.

Ejemplo 4

Sulfatacion

Se cargaron 1,21 g de condroitina como sal de tetrabutilamonio, obtenida como se ilustra en el ejemplo 1, y 72 ml de DMF en un matraz de cuatro bocas de 250 ml mantenido en una atmosfera inerte (N2), agitando mecanicamente y en presencia de un sistema de enfriamiento de burbuja, con trampa de cloruro de calcio y termometro.

La disolucion resultante se dejo agitar hasta la disolucion total, ajustando a continuacion la temperatura a 10°C.

Una vez que se ajusto la temperatura, se anadio complejo solido de trioxido de azufre-DMF (0,88 g, 3 eq.) a la disolucion, manteniendo la reaccion bajo agitacion durante 1 h. Se anadio hidrogenocarbonato de sodio (0,97 g, 6 eq.), manteniendo la misma temperatura, y la agitacion se continuo durante 1 h dejando que la temperatura se elevase hasta 20°C. La suspension resultante se filtro en un Buchner, y el filtrado recuperado se evaporo hasta sequedad a vacfo.

El solido seco resultante (2,05 g) se molio finamente y se redisolvio en una disolucion 0,3M de NaCl (130 ml), sometiendo la disolucion asf obtenida a ultrafiltracion usando una membrana de 3 kDa de corte y manteniendo el pH del retenido a 7,0. La disolucion ultrafiltrada se dializo entonces para eliminar sales, recuperando el producto mediante liofilizacion.

El producto resultante se seco finalmente a 50°C y 10 mbares, hasta que se obtuvieron 0,95 g de sustancia, que muestra un tftulo (calculado determinando PAD de acido glucuronico) de 94%, un Mn de 62 kDa y un Mp de 68,3 kDa, determinado mediante cromatograffa de exclusion de tamanos de altas prestaciones (HPSEC) equipada con un software especializado integrado para GPC.

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Ejemplo 5

Analisis de 6-sulfato de condroitina

La composicion del CS obtenido de los ejemplos 3 y 4, se estudio mediante HPLC de sus productos de digestion tratando el CS obtenido como se describe anteriormente con condroitinasa ABC, de acuerdo con el metodo descrito por Joon-Soo Sim et al. (J. Chromatography B, 2005 vol. 818, paginas 133-139).

El analisis se llevo a cabo usando una columna HPLC-SAX, 250 x 4,6 mm 10 mm, eluyendo con gradiente, partiendo de 3,5 mM de HCl (pH = 3,5) (100%) de fase inicial hasta una concentracion igual a 1M de NaCl en HCl 3,5 mM (pH = 3,5) (100%). Los mismos productos que resultan de la digestion con condroitinasa ABC se analizaron en analisis de FACE (electroforesis de carbohidratos asistida por fluoroforo) a fin de senalar la presencia de polisacarido no digerido. Los resultados muestran una tasa de digestion de aproximadamente 95%. La tasa elevada de digestion indica la ausencia sustancial de disacaridos tri- y/o tetra-sulfatados en la estructura del CS obtenido.

La siguiente tabla 2 presenta los disacaridos principales identificados para los productos preparados en los ejemplos 3 y 4.

Tabla 2

CS (Ejemplo 3) CS (Ejemplo 4)

Masa molecular:

Mn (kDa)

55,2 62

Mp (kDa)

67,3 68,3

Polidispersidad

1,2 1,2

Diasacaridos:

Di-0S

3,5 2,8

Di-6S

72,1 83,1

Di-4S

0,1 0,2

Di-2,6diS

18,9 13,8

Di-4,6diS

3,5 0,1

Di-2,4diS

ND ND

triS

ND ND

tetraS

ND ND

Densidad de carga

1,21 1,10

Mn = peso molecular medio en numero; Mp = peso molecular medio en peso; fndice de polidispersidad = Mp/Mn; la densidad de carga es el numero de grupos sulfato por unidades disacaridas); ND = no detectado

Comparando la tabla anterior con la tabla 1, se puede apreciar que la composicion del CS objeto de la presente invencion muestra que se parece estrechamente a CS de tiburon, puesto que el primero muestra cantidades muy bajas de Di-4S y esta compuesto principalmente de Di-6S mientras que Di-0S, Di-2,6diS y Di-4,6diS resultaron ser aproximadamente superponibles con los valores dados a conocer para CS de tiburon; ademas, el CS de la presente invencion mostro una densidad de carga mayor que 1,0. Tambien, los productos obtenidos llevando a cabo tanto el ejemplo 3 como 4 no mostraron formas triS ni tetraS de CS.

Ademas, el CS objeto de la presente invencion muestra un contenido de sulfato peculiar cuando se compara con algunos de los productos descritos en la tecnica anterior, como se ilustra en la siguiente tabla 3.

Tabla 3

Di-0S Di-4S Di-6S Di-4,6diS Di-2,6diS

EP-A-1304388

SI SI SI SI NO

WO 2009/149155

NO Si Si NO NO

EP-A-1964924

Si NO NO NO NO

EP-A-1950308

Si NO NO NO NO

MI2010A001300

Si NO NO NO NO

CS similar al de tiburon (Ejemplo 3)

SI SI SI SI SI

CS similar al de tiburon (Ejemplo 4)

Si Si Si Si Si

Ejemplo 6

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Puesto que la eficacia de CS esta estrictamente relacionada con su actividad antiinflamatoria, tal como su capacidad para inhibir la actividad de enzimas degradantes como elastasa leucocitaria humana (HLE), el CS objeto de la presente invencion se ensayo in vitro para determinar su capacidad para inhibir tal actividad de HLE, y se comparo con CS bovino (1st European Pharmacopoeia CS Standard) y CS extrafdo de muestras de cartflago de tiburon.

Los resultados comparativos se muestran en la Figura 1.

Una muestra de CS similar al de tiburon, de acuerdo con la presente invencion, segun se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, se comparo con CS bovino (1st European Pharmacopoeia CS Standard) vendido por Bioiberica y con CS extrafdo de cartflagos de tiburon.

La actividad de elastasa se determino mediante ensayo espectrofotometrico utilizando un sustrato artificial cromogenico (N-Succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida) especffico para HLE. Tras la preincubacion de la enzima con cantidades crecientes de CS, la actividad se determino mediante incubacion con sustrato cromogenico (N-Succinil- Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida). Tras detener la reaccion, el producto resultante se determino cuantitativamente mediante evaluacion espectrofotometrica.

Tabla 4

Inhibicion de HLE (%)

mg

CS bovino (comparativo) CS de tiburon (comparativo) CS similar al de tiburon (invencion)

1,0

0,0 0,0 0,0

2,5

0,0 10,5 6,7

5,0

12,8 33,7 21,9

7,5

24,9 51,4 36,1

10,0

40,6 68,0 50,3

La figura 1 ilustra los datos dados a conocer en la tabla 4, y muestra que el CS similar al de tiburon de la presente invencion puede inhibir significativamente la actividad de elastasa leucocitaria humana, de manera eficaz, comparable a la mostrada por las muestras de CS naturales.

La actividad biologica y las propiedades antiinflamatorias presentadas in vitro por el CS objeto de la presente invencion hacen a este ultimo comparable a los productos naturales, y por lo tanto potencialmente util como farmaco en preparaciones farmaceuticas y nutraceuticas.

Claims (20)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Sulfato de condroitina similar al de tiburon, libre de disacaridos tri-, tetra- y 2,4-di- sulfatados, que consiste en 6099% de 6-sulfato, 0,5-30% de 2,6-disulfato, 0,1-5% de 4,6-disulfato, 0,1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4-sulfato, expresandose todos los porcentajes con respecto al contenido de disacarido total del sulfato de condroitina similar al de tiburon, presentando este ultimo un peso molecular medio en numero (Mn) de 40-85 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-95 kDa.
2. 2. Sulfato de condroitina similar al de tiburon segun la reivindicacion 1, que consiste en 70-90% de 6-sulfato, 8,520% de 2,6-disulfato, 0,1-5% de 4,6-disulfato, 0,1-5% de condroitina no sulfatada y 0,1-1% de 4-sulfato, expresandose todos los porcentajes con respecto al contenido de disacarido total del sulfato de condroitina similar al de tiburon, presentando este ultimo un peso molecular medio en numero (Mn) de 40-65 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-70 kDa.
3. 3. Sulfato de condroitina similar al de tiburon segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la suma de 2,6-disulfato y 4,6- disulfato asciende a 10-25% del contenido de disacarido total.
4. 4. Sulfato de condroitina similar al de tiburon segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su utilizacion en la prevencion o el tratamiento de la osteoartritis, o para el mantenimiento de la salud musculoesqueletica.
5. 5. Composicion que comprende el sulfato de condroitina similar al de tiburon segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un vehfculo farmaceutica o nutraceuticamente aceptable.
6. 6. Composicion segun la reivindicacion anterior, para su utilizacion en la prevencion o el tratamiento de la osteoartritis, o para el mantenimiento de la salud musculoesqueletica.
7. 7. Procedimiento para preparar la condroitina similar a la de tiburon segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:

   a) salificar una condroitina no sulfatada, preparada desfructosilando el polfmero capsular de E. coli K4 obtenido mediante fermentacion, como acido libre, disuelta previamente en un ambiente acuoso, con una sal seleccionada de entre el grupo que consiste en tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-, amonio o piridinio;

   b) secar la condroitina no sulfatada salificada, como acido libre y/o sal de sodio, que resulta de la etapa a) hasta 5-15% de contenido de agua;

   c) secar la condroitina no sulfatada salificada resultante de la etapa b), a una temperatura de 100°C-170°C, hasta 0,1-3% de contenido de agua;

   d) sulfatar selectivamente la posicion 6 de la condroitina no sulfatada salificada resultante de la etapa c), solubilizada en N-metil-pirrolidona o dimetilformamida, a una temperatura de 0°C-30°C, anadiendo 1-2 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o el complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida, a unos intervalos de tiempo de 1-3 horas, hasta que se anade un total de 2-15 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina o del complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida; dejando la disolucion resultante bajo agitacion durante 2-24 horas;

   e) interrumpir la reaccion llevada a cabo en la etapa d) con una disolucion acuosa de bicarbonato o carbonato de sodio, filtrar y concentrar hasta sequedad la disolucion resultante para obtener un solido seco;

   f) disolver el solido seco en una disolucion acuosa de cloruro de sodio, ultrafiltrar y dializar la disolucion resultante;

   g) recuperar el producto de la disolucion resultante de la etapa f);

   h) purificar el producto resultante de la etapa g), y obtener este ultimo o en forma acida o como la sal de sodio del mismo;

   i) recuperar el producto resultante de la etapa h) que presenta un peso molecular medio en numero (Mn) de 4085 kDa y un peso molecular medio en peso (Mp) de 50-95 kDa.
8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion anterior, en el que la salificacion de la condroitina no sulfatada en la etapa a) se lleva a cabo con una sal seleccionada de entre el grupo que consiste en tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil- amonio.
9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, en el que la salificacion de la condroitina no sulfatada en la etapa a) se lleva a cabo con tetrabutilamonio.

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10. 10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el secado de la condroitina no sulfatada en la etapa b) se lleva a cabo mediante liofilizacion o secado por pulverizacion.
11. 11. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el secado de la sal de condroitina no sulfatada en la etapa c) se lleva a cabo hasta 0,5-2% de agua.
12. 12. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la solubilizacion de la sal de condroitina no sulfatada resultante de la etapa c) se lleva a cabo en dimetilformamida.
13. 13. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo anadiendo un total de 6-12 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina.
14. 14. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo anadiendo un total de 6-9 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-piridina.
15. 15. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo anadiendo un total de 1-9 equivalentes del complejo de trioxido de azufre-dimetilformamida.
16. 16. Procedimiento segun la reivindicacion anterior, en el que la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo anadiendo un total de 2-4 equivalentes del complejo de, trioxido de azufre-dimetilformamida.
17. 17. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sulfatacion selectiva en la etapa d) se lleva a cabo a una temperatura de 10°C-20°C.
18. 18. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al final de la etapa d), la disolucion resultante se deja en agitacion durante 2-6 h.
19. 19. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa g), el producto se recupera mediante liofilizacion, secado por pulverizacion o precipitacion en un ambiente alcoholico.
20. 20. CS o composicion segun las reivindicaciones 1 a 3 y 5, para su utilizacion en un metodo para el tratamiento o la prevencion de la osteoartritis, o para el mantenimiento de la salud musculoesqueletica, que comprende administrar a un paciente que la necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de un CS o de una composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5.