WO2007058252A1

WO2007058252A1 - コンドロイチンの製造方法

Info

Publication number: WO2007058252A1
Application number: PCT/JP2006/322847
Authority: WO
Inventors: Nobuo Sugiura; Satoshi Shimokata; Koji Kimata
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2006-11-16
Publication date: 2007-05-24
Also published as: EP1950308A1; US20090233336A1; EP1950308A4; JPWO2007058252A1

Abstract

　所望の糖鎖長からなるＣＨの製造方法や、実質的に単一の糖鎖長からなるＣＨを含有する画分の製造方法等を提供する。　下記の工程、（ａ）グルクロン酸残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ｂ）の後に本工程を行う場合には、工程（ｂ）によって得られた糖鎖）、Ｎ－アセチルガラクトサミン供与体及びＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、および（ｂ）Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程（ａ）の後に本工程を行う場合には、工程（ａ）によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びグルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程を含み、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなるコンドロイチンの製造方法。

Description

コンドロイチンの製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、所望の糖鎖長力もなるコンドロイチンの新規な製造方法等に関する。

背景技術

[0002] まず、本出願書類において用いる略号を説明する。

CH:コンドロイチン

CS :コンドロイチン硫酸

HA:ヒアノレロン酸

GlcUA:グルクロン酸

GalNAc： N—ァセチルガラタトサミン

GPC：ゲル浸透クロマトグラフィー

HPLC：高速液体クロマトグラフィー

K4CP：大腸菌 K4株由来のコンドロイチンポリメラーゼ

D241K:K4CP (配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であつて、配列番号 2におけるアミノ酸番号 241のァスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素は GalNAcの転移活性を実質的に有さず、 GlcUAの転移活 '性を有している。

D521K:K4CP (配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するもの）の点変異体であつて、配列番号 2におけるアミノ酸番号 521のァスパラギン酸残基がリジン残基に置換しているもの。この酵素は GlcUAの転移活性を実質的に有さず、 GalNAcの転移活 '性を有している。

MALDI-TOF-MS:

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization—飛行時間型一質量分析

UDP :ゥリジン 5，ージリン酸

PA:アミノビリジン

CHは、 GlcUA及び GalNAcがそれぞれ j8 1— 3結合及び j8 1— 4結合で交互に直線上に結合したグリコサミノダリカンの一種である。 CHは、動物生体内において軟骨や多くの結合組織に CSプロテオダリカンとして存在しており、細胞接着、発生、分ィ匕、神経細胞伸展、軟骨'骨形成、組織再生などにおいて重要な役割を担っている

[0003] 動物由来の CHポリメラーゼがクローニングされてはいる力この酵素のみでは CH を合成することができず、また有している酵素活性も弱いため、工業的に CH糖鎖を効率よく製造するためには十分とはいえない。一方、 K4CPもクローユングされており、この酵素は単独で CHを合成する活性を有することが知られている。（特許文献 1、非特許文献 1)

K4CPは 2つの糖転移活性部位を持つ酵素であり、 UDP GlcUA及び UDP— G alNAcをそれぞれ供与体として、糖鎖を伸長させていくポリメラーゼである。反応時間や基質の添加量を変化させることによって、合成された CHのサイズ (糖鎖長)をある程度調整することもできるが、得られる画分は様々な分子量の糖鎖を含有する混合物であり、所望の糖鎖長の CHのみ力構成される画分を得ることはできない。

[0004] また、 K4CPにおける 2力所の糖転移活性部位は、それぞれ UDP— GlcUAと UD P— GalNAcの一方の糖転移活性を担ってヽる。そして一方の糖転移活性部位におけるアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体は、他方の糖転移活性し力示さな、ことが知られている。（特許文献 2)

また、動物感染性病原菌であるパストレアマルトシダ由来の HA合成酵素の点変異体を利用して、 HAオリゴ糖を製造できることが知られているが、 CHオリゴ等の製造に関しての開示はない。（非特許文献 2)

特許文献 1 :特開 2003— 199583号公報

特許文献 2：特開 2005— 65565号公報

非特許文献 1 :ニノミヤ、 T(Ninomiya, T.)ら、 2002年、ジャーナルォブノィォロジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 277卷、第 24号、 p. 21567 - 21575

非特許文献 2 :ポール、 L.デアンジェリス（Paul, L. DeAngelis)ら、 2003年、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 278卷、第 37号、 p. 35199- 35203

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、所望の糖鎖長からなる CHの製造方法や、実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分の製造方法等を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の糖転移酵素等を用い、特定の複数の工程を交互に行うことによって、所望の糖鎖長からなる C

Hの製造方法及び実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分の製造方法等を提供するに至り、本発明を完成した。

[0007] すなわち本発明は、下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなる CHの製造方法 (以下、「本発明方法 1」という。）を提供する；

工程 (a)： GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質 (工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 GalNAc供与体及び GalNAc転移酵素を反応系中に共存させる工程、

工程 (b)： GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、 GlcUA供与体及び GlcUA転移酵素を反応系中に共存させる工程。

[0008] また本発明は、下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分の製造方法 (以下、「本発明方法 2」という。）を提供する；

工程 (a)： GlcUA残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長力もなる受容体基質 (工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 G alNAc供与体及び GalNAc転移酵素を反応系中に共存させる工程、

工程 (b) : GalNAc残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質 (工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、 G1 cUA供与体及び GlcUA転移酵素を反応系中に共存させる工程。 [0009] また本発明は、本発明方法 1に記載の（a)又は (b)のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加した CHの製造方法 (以下、「本発明方法 3」という。）を提供する。

以下、本発明方法 1〜3をまとめて単に「本発明方法」 t 、う。

[0010] 本発明方法の工程（a)における GalNAc転移酵素及び工程 (b)における GlcUA 転移酵素は、いずれも下記 (A)に示す酵素であることが好ましい。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素。

また、本発明方法の工程 (a)における GalNAc転移酵素が下記 (B)に示す酵素であり、かつ、工程 (b)における GlcUA転移酵素が下記 (C)に示す酵素であるものも好ましい。

(B)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号 2におけるアミノ酸番号 435〜539で示される領域内の 1〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換して、ることを特徴とするもの。

(C)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号 2におけるアミノ酸番号 153〜258で示される領域内の 1〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換して、ることを特徴とするもの。

[0011] その中でも、「アミノ酸番号 435〜539の領域」が「アミノ酸番号 519〜521の領域」であり、「アミノ酸番号 153〜258の領域」が「アミノ酸番号 239〜241の領域」であり、かつ「1〜数個」が「1〜3個」であるものが好ましい。またその中でも、アミノ酸番号 52 1のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつ、アミノ酸番号 241のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されて、るものが好まし!/、。

[0012] また本発明方法における工程 (a)及び (b)の直後に、それぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことが好ましい。この場合、転移酵素のみを除去することが好ましい。

また、本発明方法において用いる GalNAc供与体が UDP— GalNAcであり、かつ、 GlcUA供与体が UDP - GlcUAである態様も好まし!/ヽ。

[0013] また、本発明方法における「共存」は、 10°C〜50°Cの条件下で 10分間〜 24時間行われることが好ましぐ 20°C〜40°Cの条件下で 30分間〜 5時間行われることがより好ましぐ 25°C〜37°Cの条件下で 1時間〜 4時間行われることがさらに好ましい。また、本発明方法における工程 (a)及び (b)の各工程にぉヽて共存させる転移酵素は、担体に固定ィ匕されていることが好ましい。

また、本発明方法において用いる受容体基質は、 CH又はその誘導体であることが好ましい。この CHの誘導体は、 PAが共有結合した CHであることが好ましい。

発明の効果

[0014] 本発明方法は、副生成物をほとんど出すことなぐ所望の糖鎖長力なる CHや、実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分等を簡便かつ安価に工業的スケールで製造できることから極めて有用である。

また、本発明方法により製造した所望の糖鎖長力なる CHや実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分等は、今まで未開拓であった糖鎖の変化による生理活性の探求等に極めて有用な物質であり、医薬品、飲食品、化粧品等の素材としても有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。

< 1 >本発明方法1

本発明方法 1は、下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長からなる CHの製造方法である；

工程 (a)： GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質 (工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 GalNAc供与体及び GalNAc転移酵素を共存させる工程、

工程 (b)： GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、 GlcUA供与体及び GlcUA転移酵素を共存させる工程。

[0016] 本発明方法 1によれば、糖鎖長の増加をコントロールしつつ CHを製造することができるため、所望の糖鎖長からなる CHを容易に製造することができる。したがって、本発明方法 1には、 CHの糖鎖長の増加のコントロール (調整)方法などの概念も包含される。なお、本発明方法 1による製造の目的物 (糖鎖長の増加のコントロール対象)たる「CH」は、 GlcUA— GalNAcの繰返単位のみからなる本来の CHのみならず、 CH オリゴ糖および CHの誘導体などを含む概念である。

[0017] 工程 (a)は、 GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 GalNAc供与体及び GalNAc転移酵素を共存させる工程である。すなわち、 GalNAc転移酵素を反応触媒として、 G1 cUA残基を非還元末端に持つ受容体基質の GlcUA残基に、 GalNAc供与体の Ga INAc残基を転移させ、 GlcUA— GalNAcを非還元末端として有し、受容体基質よりも 1残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる工程である。

[0018] また工程 (b)は、 GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質（工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、 GlcUA供与体及び GlcU A転移酵素を共存させる工程である。すなわち、 GlcUA転移酵素を反応触媒として、 GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質の GalNAc残基に、 GlcUA供与体の GlcU A残基を転移させ、 GalNAc— GlcUAを非還元末端として有し、受容体基質よりも 1残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる工程である。

[0019] ここにヽぅ「GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、 GlcUA残基を非還元末端に有して、る糖鎖 (その誘導体も含む)である限りにお、て特に限定されなヽ。また、ここにいう「GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、 GalNAc残基を非還元末端に有して、る糖鎖 (その誘導体も含む)である限りにお、て特に限定されない。

[0020] これらの受容体基質としては、例えば下記一般式（1)及び（2)で示される糖鎖を例示することができる。

GlcUA- GalNAc -R¹ · · · · (1)

GalNAc - GlcUA— R² · · · · (2)

(各式中、—はグリコシド結合を、 R¹及び R²は、同一でも異なっていてもよい任意の基をそれぞれ示す。 )

[0021] 「尺¹」や「R²」としては、例えば、 CH骨格を有する糖鎖の残基や、 HA骨格を有する糖鎖の残基等が例示される。例えばここにヽぅ「CH骨格を有する糖鎖の残基」としては CH残基や CS残基等が例示される。このような糖鎖残基には、さらに他の化学物質などが結合して、ても良、。

なお本発明方法における「GlcUA」及び「GalNAc」は、それぞれ D— GlcUA及び D— GalNAcであることが好ましい。また、 GlcUAと GalNAcとの間のグリコシド結合 (GlcUA- GalNAc)は j8 1—3結合であることが好ましぐ GalNAcと GlcUAとの間のグリコシド結合（GalNAc— GlcUA)は j8 1—4結合であることが好まし!/、。

[0022] また、受容体基質の糖鎖のサイズも特に限定されず、高分子の糖鎖から 1〜20糖程度のオリゴ糖であってもよヽ。「GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質」として具体的には、例えば、式（1)の糖鎖としての CHの 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの CHオリゴ糖および高分子の CH、 R¹として CSの 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの CSオリゴ糖および高分子の CS、 HA の 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの HAオリゴ糖および高分子の HAを有する一般式（1)の糖鎖が挙げられる。また「GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質」として具体的には、式（2)の糖鎖としての CHの 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの CHオリゴ糖および高分子の CH、 R²として C Sの 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの CSオリゴ糖および高分子の CS、 HAの 2糖、 3糖、 4糖、 5糖、 6糖、 7糖、 8糖、 9糖、 10糖などの HAオリゴ糖および高分子の HAを有する一般式 (2)の糖鎖が挙げられる。

[0023] このような受容体基質は、公知の方法で製造することもでき、また市販のものなどを用いることもできる。また、これらの糖鎖の誘導体としては、これらの糖鎖に他の化学物質などが結合して、るものを例示することができる。これらの糖鎖に結合する他の化学物質の種類等も特に限定されない。このような化学物質としては、例えば PAなどが例示される。またその化学物質と糖鎖との間の結合様式も限定されない。結合様式としては、共有結合などが例示される。なかでも、 PAが糖鎖に共有結合しているものが好ましぐ PAが糖鎖の還元末端に共有結合しているものがより好ましい。最も好ましいのは、 CH (CHのオリゴ糖を含む）の還元末端に PAが共有結合しているものである。 PAが共有結合した糖鎖は、糖鎖の還元末端に還元剤を使って PAをァミノアルキルィ匕する方法で調製することができる。還元剤としては、シァノポロハイドライドゃジメチルァミノボラン、トリメチルァミノボラン複合体等を用いることが好ましぐ特にトリメチルァミノボラン複合体を使用する方法が好ましい。

[0024] 本発明方法 1にお、ては、このような受容体基質として一種類の化合物力なる受容体基質を使用して、所望の糖鎖長カゝらなる一種類の糖鎖を製造してもよい。また、複数種類 (好ましくは 2〜5種類、より好ましくは 2〜3種類)の受容体基質を使用して、それぞれの基質に由来する所望の糖鎖長からなる複数の糖鎖を製造してもよい。例えば、 CHオリゴ 10糖 (糖鎖長： 10糖)のみの製造を所望する場合には、 10糖よりも鎖長が短い一種類の CHオリゴ糖を受容体基質として用いることができる。また例えば、 CHオリゴ 8糖 (糖鎖長： 8糖)と CHオリゴ 12糖 (糖鎖長： 12糖)の混合物を同時に製造する場合には、それぞれ (8— n)糖及び（12— n)糖 (nは 1以上の整数)の鎖長力なる CHオリゴ糖を受容体基質として用いることができる。

[0025] 本発明方法 1は、前記の工程 (a)と (b)を交互に行うことを特徴とする。したがって、工程 (a)における「GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、工程 (b)の後に本工程を行う際には「工程 (b)によって得られた糖鎖」を意味することとなる。同様に、工程 (b)における「GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質」は、工程 (a) の後に本工程を行う際には「工程 (a)によって得られた糖鎖」を意味することとなる。本発明方法 1で用いる「GlcUA供与体」は、ある糖鎖分子に対して GlcUA残基を供与する能力を有する分子である限りにお、て限定されな、が、 GlcUAヌクレオチドが好ましい。 GlcUAヌクレオチドとしては、 UDP-GlcUAや、 dTDP (デォキシチミジン 5，ージリン酸） GlcUA等が例示されるが、 UDP— GlcUAが好ましい。

[0026] また本発明方法 1で用いる「GalNAc供与体」は、ある糖鎖分子に対して GalNAc 残基を供与する能力を有する分子である限りにおヽて限定されなヽが、 GalNAcヌクレオチドが好ましい。 GalNAcヌクレオチドとしては、 UDP— GalNAcや、 dTDP (デォキシチミジン 5'—ジリン酸） GalNAc等が例示される力 UDP— GalNAcが好ましい。

[0027] これらの糖ヌクレオチドは、公知の方法で製造しても良ぐ市販のものなどを用いても良い。

また本発明方法 1で用いる「GalNAc転移酵素」は、 GalNAcを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的に GlcUAを転移しないものが好ましい。また本発明方法 1で用いる「GlcUA転移酵素」は、 GlcUAを転移する酵素である限りにおいて限定されないが、実質的に GalNAcを転移しないものが好ましい。また両転移酵素は、同一種類の酵素であっても、異なる種類の酵素であっても良い。

両酵素として同一種類の酵素を用いる場合には、下記 (A)に示す酵素であることが好ましい。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素。

[0028] また両酵素として異なる種類の酵素を用いる場合には、本発明方法の工程 (a)における GalNAc転移酵素が下記（B)に示す酵素であり、かつ、工程 (b)における Glc UA転移酵素が下記 (C)に示す酵素であることが好ま、。

配列番号 1は、配列番号 2のアミノ酸配列をコードする大腸菌由来 DNA配列をアミノ酸配列と共に示す。

[0029] その中でも、「アミノ酸番号 435〜539の領域」が「アミノ酸番号 519〜521の領域」であり、「アミノ酸番号 153〜258の領域」が「アミノ酸番号 239〜241の領域」であり、かつ「1〜数個」が「1〜3個」であるものが好ましい。またその中でも、アミノ酸番号 52 1のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつアミノ酸番号 241のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されて、るものが好まし!/、。

上記領域において置換されるアミノ酸、置換されるアミノ酸の数、上記「他のアミノ酸」の種類などのアミノ酸の置換の態様は、置換後の酵素が所望の酵素活性を維持する限りにおいて特に限定されない。上記「他のアミノ酸」は、天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸の何れから選択してもよ、。

[0030] 遺伝子工学的に置換を導入する場合には、上記の「他のアミノ酸」は天然型ァミノ酸（グリシン、 L—ァラニン、 L—パリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—セリン、 L —スレオニン、 L—ァスパラギン酸、 L—グルタミン酸、 L—ァスパラギン、 L—グルタミン、 L—システィン、 L—メチォニン、 L—リジン、 L—アルギニン、 L—ヒスチジン、 L— フエ-ルァラニン、 L—チロシン、 L—トリプトファン、 L—プロリン）から選択することが好ましい。

[0031] 特に、配列番号 2におけるアミノ酸番号 521のアミノ酸 (Lーァスパラギン酸）のみを他のアミノ酸に置換する場合や、配列番号 2におけるアミノ酸番号 241のアミノ酸 (L ーァスパラギン酸)のみを他のアミノ酸に置換する場合における「他のアミノ酸」は、いずれも L—リジンであることが好ましい。以下、配列番号 2におけるアミノ酸番号 521 のアミノ酸 (L -ァスパラギン酸）のみを L -リジンに置換した酵素を「D521K」と、配列番号 2におけるアミノ酸番号 241のアミノ酸 (Lーァスパラギン酸）のみを L—リジンに置換した酵素を「D241K」とそれぞれ表記することもある。

[0032] 「D521K」及び「D241K」は、前記の非特許文献 2に記載された方法によって取得することができる。この「D241K」は、 GalNAc酸残基を非還元末端に持つ CHを受容体基質とし、 GlcUAヌクレオチド (UDP— GlcUA等)を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端に GlcUAを転移してグリコシド結合させる酵素であって、かつ実質的に GalNAcの転移活性を持たない酵素（変異体)である。また「D 521K」は、 GlcUA残基を非還元末端にもつ CHを受容体基質とし、 GalNAcヌクレォチド (UDP— GalNAc等)を供与体基質として反応させると、受容体基質の非還元末端に GalNAcを転移してグリコシド結合させる酵素であって、かつ実質的に GlcU Aの転移活性を持たな、酵素 (変異体)である。

これらの酵素は、遊離の状態で用いてもよぐ担体に固定化された状態（固定ィ匕酵素の状態)で用いてもよい。

[0033] 工程 (a)及び (b)におヽて、受容体基質、糖供与体及び糖転移酵素を共存させる方法及び条件は、これらの分子が相互に接触し、糖転移酵素が作用する条件である限りにおいて限定されない。また共存させる際のこれらの分子の量なども、目的等に応じて当業者が適宜設定することができる。

例えば、「共存」は中性 pH付近 (例えば pH6. 5〜8. 5程度)で行われることが好ましぐ当該 pH下で緩衝作用を有する緩衝溶液中で行われることがより好ましい、また「共存」させるの温度や時間としては、例えば 10°C〜50°Cの条件下で 10分間〜 24 時間や、 20°C〜40°Cの条件下で 30分間〜 5時間や、 25°C〜37°Cの条件下で 1時間〜 4時間などが例示される。一般に、所望の糖鎖長が長いほど、長い接触時間が必要となり、多少他のピークが見られることがある。し力しこの問題は、接触時間をさらに長くすることにより解消することができる。

[0034] また、例えば「共存」時の糖転移酵素及び受容体基質の量は、糖転移酵素 90 μ 1 に対して受容体基質 lnmol〜lmmol程度となるようにすることが好ましぐ lOOnmol程度とすることがより好ましい。また「共存」時、糖供与体は受容体基質に対して 1等量以上あればよいが、糖転移酵素の反応を完全に行うためにも受容体基質の 1. 5〜3 0等量存在させることが好ましく、 2〜 10等量存在させることがより好まし、。

また「共存」は、糖転移酵素を適当な担体 (ビーズ、限外濾過膜、透析膜等）に固定化させ、これに前記の糖供与体及び受容体基質を含有する溶液を連続的に接触させること〖こより行ってもよい。したがって、例えばカラム型のリアクターや、膜型リアクタ一等を採用することもできる。また、 PCT国際公開パンフレット WO00Z27437号に記載された方法と同様に、受容体基質を担体に固定化させて酵素反応させることもできる。さらに、糖供与体を再生 (合成)するバイオリアクター等を組み合わせてもよい

[0035] 本発明方法 1は、前記の工程 (a)及び (b)を少なくとも含んでいる限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明方法 1における工程 (a)及び (b) の直後に、それぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことが好ましい。この場合、転移酵素のみを除去することが好ましい。

[0036] 本発明方法 1における「除去」の語は、前記の共存系力もある分子の作用を取り除くことを意味する。したがって、分子自体を物理的に取り除くことはもちろん、分子を失活させることによって当該分子の作用を取り除く態様も包含される。

転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する方法は特に限定されないが、転移酵素を除去する場合は、該酵素を固相に固定ィ匕しておき、該固相を適当な方法により除去することにより酵素を除去することができる。供与体は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー又は限外濾過膜を用いることにより除去できる。

[0037] ただし、本発明方法 1における工程 (a)および (b)において受容体基質よりも 1残基多い糖残基数を有する糖鎖を生成させる反応は、後述の実施例にも記載するよう〖こ、反応条件 (反応時間など）により制御することができるので、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去して各反応を独立して行うことは必ずしも必須ではな、。

したがって、「除去」の程度も必ずしも 100%である必要はなぐその程度は目的等に応じて当業者が適宜設定することができる。

[0038] 例えば糖転移酵素を除去する場合には、熱により失活させてもよぐ糖転移酵素が担体に固定ィ匕されている場合には当該担体を物理的に除去することにより行ってもよい。担体の物理的除去は、例えば濾過フィルタ一等を用いたり、遠心分離等を行うことによって容易に行うことができる。

[0039] またさらに、本発明方法 1により得られた CH (所望の糖鎖長力なる)を精製するェ程や、品質チェック工程などを含んで、ても良、ことは言うまでもな、。

本発明方法 1は、前記の工程 (a)及び (b)を交互に行うことを特徴とする。したがつて、工程 (a)から出発して交互に行ってもよ工程 (a)、工程 (b)、工程 (a)、工程 (b ) · · ·のように）、工程 (b)から出発して交互に行ってもょ、（工程 (b)、工程 (a)、工程 (b)、工程 (a) ' "のように)。なお、本発明方法 1における「交互」の語には、 2工程のみで終了する場合 (例えば、工程 (a)と工程 (b)を行って終了する場合や、工程 (b)と工程 (a)を行って終了する場合)も包含される。

工程 (a)又は工程 (b)を 1回行うことにより、糖鎖長が単糖 1つ分だけ伸長する。したがって、前記の各工程を「交互」に行う回数を適宜設定することにより、所望の糖鎖長の CHを製造することができる。交互に行う回数等は、前記の各工程における各分子の共存の条件等に基づいて、当業者が適宜設定'コントロールすることができる。本発明方法 1により製造される物 (所望の糖鎖長からなる CH)は、溶液状態のままでよぐ固体状態 (粉末等や、溶液が凍結した状態等)としてもよい。

[0040] < 2 >本発明方法 2

本発明方法 2は、下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分の製造方法である；

工程 (a)： GlcUA残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長力もなる受容体基質 (工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 G alNAc供与体及び GalNAc転移酵素を共存させる工程、

工程 (b) : GalNAc残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質 (工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、 G1 cUA供与体及び GlcUA転移酵素を共存させる工程。

[0041] 本発明方法 2は、本発明方法 1における「受容体基質」を「一種類だけ使用」することにより、実質的に単一の糖鎖長からなる CHを含有する画分の製造方法としたものである。

したがって本発明方法 2は、製造の目的物が「実質的に単一の糖鎖長力もなる CH を含有する画分」である点、並びに GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質及び GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質が、いずれも「実質的に単一の糖鎖長からなるもの」である点を除き、本発明方法 1と同じである。したがって、各工程における反応、酵素など、および反応体である GlcUA残基を非還元末端に持つ受容体基質及び GalNAc残基を非還元末端に持つ受容体基質そのものについては本発明方法 1と同様である。

[0042] ここで「実質的に単一」とは、ある画分を MALDI—TOF— MSによって分析したときに、特定の糖鎖長の糖鎖に由来するピークの高さ力これを含む全体のピークの高さの総和の 7割以上を示すことをいう。 MALDI— TOF— MSの分析条件は、後述の実施例を参照されたい。

[0043] 本発明方法 2における工程 (a)および (b)で受容体基質よりも 1残基多!、糖残基数を有する糖鎖を生成させる反応においても、本発明方法 1と同様に各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去して各反応を独立して行うことは必ずしも必須ではな、が、転移酵素及び供与体の少なくとも、ずれか一方を実質的に 100%除去して各反応を行うことが好ましい。転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する方法については本発明方法 1と同様である。 [0044] ここで「実質的に 100%除去する」とは、 1残基だけ糖残基数の多い糖鎖を生成する工程を当該酵素または基質を除去して行った場合に、 1残基だけ糖残基数の多い糖鎖のピークが MALDI—TOF— MSにおいて実質的に検出されない（実質的に無視し得る）程度に除去することをいう。例えば、後述の実施例 3の（2)において D521 Kを使用しない条件、即ち PA—CH6 (100nmol)、 20mM塩化マンガン 1. 2mM及び 150mMNaClを含有する Tris - HC1緩衝液に溶解した後、 50mMUDP - GalN Acを 10 1添加した溶液を 30°Cで 2時間震盪した溶液を精製し、凍結乾燥した画分を MALDI— TOF— MSに付すと、 PA— CH7のピークは実質的に検出されず（実質的に無視し得る）、このような条件を「実質的に 100%除去」（この場合は酵素)された状態と考える。

[0045] < 3 >本発明方法 3

本発明方法 3は、本発明方法 1に記載の（a)又は (b)のいずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加した CHの製造方法である。

本発明方法 3は、本発明方法 1における工程 (a)及び (b)を交互に行うことなぐいずれか一方の工程のみを行うことによって、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加した CHの製造方法としたものである。

[0046] したがって本発明方法 3は、製造の目的物が「受容体基質よりも一つ糖鎖長が増加した CH」である点、並びに本発明方法 1における工程 (a)及び (b)の、ずれか一方の工程のみを行う点を除き、本発明方法 1と同じである。したがって、各工程における反応、酵素、反応体などについては本発明方法 1と同様である。

[0047] 以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。

(分析法）

以下の実施例で得られた CH及び CH誘導体は、 MALDI— TOF— MS (ブルカー社製 AutoFlex)によって構造解析した。分析には発生した陰イオンを検出するネガテイブモードを用い、リフレクションモードで解析した。

[0048] (ターゲットの調製）

得られた検体 1 1(20〜100 pmoleの CHを含有）と 10 mg/mlの DHB (2,5- dihy droxy- benzoic acid)—50%ァセトニトリル水溶液

1 μ 1とを混合し、その 1 1をターゲットプレートにスポットして、速やかに窒素ガスを吹き付け乾燥させた。

実施例 1

[0049] 酵素の固定ィ匕

NHS - activated Sepharose Beads (アマシャム社製、 0. 1ml)に、 D241K又は D5 21K (それぞれ特開 2005— 65565号公報の実施例にしたがって得られたもの） 0. 5mg及びグリセロール (終濃度 20%)を含有する生理的リン酸緩衝液 (pH7. 2) (以下、「PBS」という。） 1ml溶液を添カ卩し、 4°Cで 6時間震盪した。反応後、 1Mエタノールァミンを 4 1添加し、さらに 4°Cで 1時間震盪した。その後、 20 mMTris-HCl緩衝液（pH8. 0)で 3回、 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4. 0)で 3回、 20%グリセロールー PBSで 3回順次洗浄して、 D241K、 D521Kそれぞれの固定化酵素を作成した。得られた固定ィ匕酵素は 20%グリセロール—PBSで懸濁して、 4°Cで保存した。

[0050] また、得られた固定ィ匕酵素をそれぞれ 10 μ 1使用し、 CH6糖と UDP— [³H]GalN Acを基質として GalNAc転移活性を、 CH7糖と UDP— [14C]GlcUAを基質として GlcUA転移活性をそれぞれ測定した。その結果、 D241K固定ィ匕酵素（以下、 D24 1Kビーズという）は GlcUA転移活性のみ力 D521K固定化酵素（以下、 D521Kビ一ズと、う）は GalNAc転移活性のみが保持されて、ることを確認した。

実施例 2

[0051] PAが共有結合した (PAィ匕された) CHオリゴ糖の製造

(1) CH6 (CH6糖)及び CH7 (CH7糖）の製造

CSをィ匕学的に脱硫酸ィ匕した CH (生化学工業株式会社製）に、ヒッジ睾丸由来のヒアル口-ダーゼ (シグマ社)を加え、 NaClを含有する酢酸ナトリウム緩衝液中で限定分解することによって、非還元末端力 SGlcUA残基である偶数糖のオリゴ糖を得た。それらをゲル濾過及びイオン交換カラムにより精製して、 CH6に相当する画分を集めて、凍結乾燥した。この得られた画分についてゥロン酸含有量分析 (力ルバゾール法 )、 HPLC (GPC)、 MALDI— TOF— MS、コンドロイチナーゼ処理後の二糖分析等を行った結果、還元末端力 GalNAc残基で非還元末端力 SGlcUA残基である 6糖であることを確認した。

[0052] また、上記と同様に CHをヒアル口-ダーゼ処理することによって得られた複数種類の偶数糖 CHオリゴ糖の混合物に、 β—ダルク口-ダーゼ (シグマ社)を添加し、 NaC 1を含有する酢酸ナトリウム緩衝溶液中で 37°C、 18時間静置した。その反応液を上記方法と同様の精製処理に付し、 CH7に相当する画分を集めて凍結乾燥した。この得られた画分につヽて前記と同様の分析を行った結果、還元末端が GalNAcで非還元末端も GalNAcである CH7であることを確認した。

(2) PAが共有結合した CH6 (PA-CH6)の製造

上記（1)で得られた CH6 (10 mg)を水 1 mlに溶解し、これに塩酸で pH5. 6に調整した PA水溶液 1 mlと、トリメチルァミノボラン複合体 (アルドリッチ社製)のメタノール溶液 lmlとを添加して密封し、 70°Cで 3日間反応させた。反応液を減圧濃縮し、ついで凍結乾燥した後、再度水 0. 1 mlに溶解した。その後 Dowex 50 WX8陽イオン交換榭脂 (ダウケミカル社製）に通した後、 0. 2 M酢酸アンモ-ゥムを展開緩衝液とする Superdex 30 HR 16/60カラム（アマシャム社製）でゲルろ過クロマトグラフィー（流速： 2 ml/分）を行った。検出液を蛍光検出器 (Ex: 310nm、 Em: 370nm)でモニタ一して PA—CH6を含有する画分を集めた。この画分をさらに、 SAX Magnum 9/25H PLCカラム（ワットマン社製）を用いた 30〜200mMの KH POリニアグラディエントに

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よるイオン交換クロマトグラフィーにより精製して、 PA— CH6を得た。 PA— CH6は、上記（1)と同様に分析し、構造及び純度を確認した (図 1)。

実施例 3

[0053] 所望の糖鎖長力なる PAィ匕オリゴ糖の製造

(1)反応時間の決定

実施例 2の（2)で得られた PA— CH6 (100nmol)を、 1. 2 mlの 20mM塩化マンガン及び 150 mM NaClを含有する 50 mM Tris- HC1緩衝液（pH7. 2)に溶解し、これを実施例 1で得られた D521Kビーズが入った容器に添カ卩した。これに 50mM U DP— GalNAcを 10 μ 1及び UDP— [³H] GalNAcを 5pmol(0. 1 μ Ci)添加した。 30°Cで震盪し、 1時間後に Superdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィ一により反応液を分離し、シンチレーシヨンカウンターで GalNAcの転移量を測定したところ、 1時間でほぼ完全に糖転移反応が完結することを確認した。この結果より反応時間を 2時間とした。

[0054] (2) PA— CH7の製造

実施例 3の（1)と同様〖こ、実施例 2の（2)で得られた PA—CH6を上記と同じ Tris-H C1緩衝液に溶解し、実施例 1で得られた D521Kビーズが入った容器に添加した。これに UDP— GalNAcを添カ卩して、 30°Cで 2時間震盪した。反応液（1. 2ml)をフィルター（ウルトラフリー CL、ミリポア社製、孔径 0. 45 m)で濾過して固定ィ匕酵素ビーズを除去し、 PA—CH7を含有する濾液を得た。次の糖転移反応にはこのままこの濾液を用いた。

PA—CH7を Superdex Peptide HR 10/30カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィ一により精製し、凍結乾燥した。精製された画分は、 MALDI— TOF— MS分析によつて高純度な PA— CH7であることを確認した（図 2)。

[0055] (3) PA— CH8 (PAィ匕 CH8糖）の製造

実施例 3の（2)で得られた PA—CH7溶液を、 D241Kビーズの入った容器に添カロし、さらに 50 mM UDP— GlcUAを 10 μ 1を添カ卩して、 30°Cで 2時間震盪した。反応液を上記（2)と同様に処理し、固定化酵素ビーズを除去して、 PA— CH8を含有する濾液を得た。下記 PA— CH9〜PA— CH16 (PAィ匕 CH9糖〜 PA化 CHI 6糖）の製造における PA—CH9の製造の糖転移反応にはこの濾液をそのまま用いた。 P A— CH8の精製及び分析は、上記と同様に行った（図 3)。

[0056] (4) PA—CH9〜PA—CH16の製造

上記 PA— CH8を含有する濾液を使用して、上記（2)と同様の操作を行うことにより PA—CH9が得られた。その PA—CH9を含有する濾液を使用して、上記（3)と同様の操作を行うことにより PA— CH10が得られた。同様にして、上記（2)および（3)の操作を交互に繰り返すことによって、 1糖ずつ糖鎖長が延長した PA化 CHオリゴ糖が得られた。このょぅにして得られた1³八ーじ119〜1³八ーじ1116の精製及び分析は上記と同様に行った（図 4〜図 11)。

実施例 4

[0057] 逐次糖鎖伸長オリゴ糖の合成実施例 2の（1)で得られた CH6を使用して、実施例 3と同様に所望の鎖長の糖鎖が得られるまで交互に反応を行い、 CH7〜CH16 (CH 7糖〜 CHI 6糖)をそれぞれ製造した。精製及び分析を上記と同様に行い、 CH7〜CH16がそれぞれ得られたことを確認した。

図面の簡単な説明

[図 1]PA - - CH6の MALDI- TOF- MSスペクトルを示す図である。

[図 2]PA - - CH7の MALDI- TOF- MSスペクトルを示す図である。

[図 3]PA - - CH8の MALDI- TOF- MSスペクトルを示す図である。

圆 4]PA- - CH9の MALDI- TOF- MSスペクトルを示す図である。

[図 5]PA - - CH10の MALDI -TOF一 MSスペクトルを示す図である。

圆 6]PA- - CH11の MALDI -TOF一 MSスペクトルを示す図である。

圆 7]PA- - CH12の MALDI -TOF一 MSスペクトルを示す図である。

[図 8]PA - -CH 13の MALDI -TOF一 MSスペクトルを示す図である。

圆 9]PA— -CH 14の MALDI -TOF一 MSスペクトルを示す図である。

[図 10]PA—CH15の MALDI—TOF— MSスペクトルを示す図である

[図 11]PA— CH 16の MALDI—TOF - MSスペクトルを示す図である

Claims

請求の範囲

[1] 下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、所望の糖鎖長力なるコンドロイチンの製造方法。

工程 (a)：グルクロン酸残基を非還元末端に持つ受容体基質 (工程 (b)の後に本ェ程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 N—ァセチルガラタトサミン供与体及び N—ァセチルガラタトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、工程 (b) :N-ァセチルガラタトサミン残基を非還元末端に持つ受容体基質 (工程 (a) の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びダルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程。

[2] 下記の工程 (a)及び (b)を含み、かつ、これらの工程を交互に行うことを特徴とする、実質的に単一の糖鎖長からなるコンドロイチンを含有する画分の製造方法。

工程 (a)：グルクロン酸残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長力なる受容体基質 (工程 (b)の後に本工程を行う場合には、工程 (b)によって得られた糖鎖）、 N—ァセチルガラタトサミン供与体及び N—ァセチルガラタトサミン転移酵素を反応系中に共存させる工程、

工程 (b) :N—ァセチルガラタトサミン残基を非還元末端に持つ実質的に単一の糖鎖長からなる受容体基質 (工程 (a)の後に本工程を行う場合には、工程 (a)によって得られた糖鎖）、グルクロン酸供与体及びダルクロン酸転移酵素を反応系中に共存させる工程。

[3] 請求項 1に記載の（a)又は (b)の、ずれか一方のみの工程を含むことを特徴とする、受容体基質よりも一つ糖鎖長が増力 tlしたコンドロイチンの製造方法。

[4] 工程 (a)における N—ァセチルガラタトサミン転移酵素及び工程 (b)におけるダルク口ン酸転移酵素が、いずれも下記 (A)に示す酵素である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造方法。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素。

[5] 工程 (a)における N—ァセチルガラタトサミン転移酵素が下記 (B)に示す酵素であり、かつ、工程 (b)におけるグルクロン酸転移酵素が下記 (C)に示す酵素である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の製造方法。 (B)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する酵素の変異体であって、配列番号 2におけるアミノ酸番号 435〜539で示される領域内の 1〜数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換して、ることを特徴とするもの。

[6] 「アミノ酸番号 435〜539の領域」が「アミノ酸番号 519〜521の領域」であり、「ァミノ酸番号 153〜258の領域」力^アミノ酸番号 239〜241の領域」であり、かつ「1〜数個」が「1〜3個」である、請求項 5に記載の製造方法。

[7] アミノ酸番号 521のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換され、かつ、アミノ酸番号 241 のアミノ酸のみが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項 6に記載の製造方法。

[8] 工程 (a)及び (b)の直後にそれぞれ、各工程において共存させた転移酵素及び供与体の少なくともいずれか一方を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の製造方法。

[9] 転移酵素のみを除去することを特徴とする、請求項 8に記載の製造方法。

[10] N—ァセチルガラタトサミン供与体が UDP— N—ァセチルガラタトサミンであり、かつ

、グルクロン酸供与体が UDP—グルクロン酸であることを特徴とする、請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の製造方法。

[11] 「共存」力 10°C〜50°Cの条件下で 10分間〜 24時間行われることを特徴とする、請求項 1〜： LOのいずれか 1項に記載の製造方法。

[12] 「共存」力 20°C〜40°Cの条件下で 30分間〜 5時間行われることを特徴とする、請求項 1〜： L 1のいずれか 1項に記載の製造方法。

[13] 「共存」力 25°C〜37°Cの条件下で 1時間〜 4時間行われることを特徴とする、請求項 1〜12のいずれか 1項に記載の製造方法。

[14] 工程 (a)及び (b)の各工程において反応系中に共存させる転移酵素力担体に固定化されているものであることを特徴とする、請求項 1〜13のいずれか 1項に記載の製造方法。

[15] 受容体基質が、コンドロイチン又はその誘導体である、請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の製造方法。

[16] コンドロイチンの誘導体力アミノビリジンが共有結合したコンドロイチンである、請求項 15に記載の製造方法。