JP2003026725A - 新規なマルトース結合蛋白質リガンドとその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】マルトース結合蛋白質と酵素との融合蛋白質の
容易で、効率よい精製方法および酵素脱離の起こりにく
い該融合蛋白質の固定化方法を提供する。 【解決手段】高分子担体上に一般式（Ｉ）（式中、Ｒ¹
はＯＨまたはＮＲ³Ｒ⁴、Ｒ²はメチレン基１〜２０個分
の長さを有するリンカー、Ｒ³およびＲ⁴は独立してＨま
たは炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは０〜５まで
の整数を示す）で表される基が結合したマルトース結合
蛋白質リガンド。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なマルトオリゴ
糖誘導体および該マルトオリゴ糖誘導体の構造を部分構
造として有する高分子に関する。また、本発明は該マル
トオリゴ糖誘導体構造を部分構造として有する高分子を
利用した固定化酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年遺伝子組換え技術が進歩し、種々の
酵素が大腸菌をはじめとする細菌類で生産されるように
なった。しかし、ヒトなどの高等動物由来の酵素を発現
させようとしたとき、発現蛋白質が不溶性のインクルー
ジョンボディを形成し、酵素活性を発現できないことが
しばしばあり、このようなときの有効な解決手段とし
て、目的とする酵素を他の蛋白質、例えばマルトース結
合蛋白質（以下、ＭＢＰと示す）、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼなどとの融合蛋白質として発現させ
るという方法が用いられる。例えば、ＭＢＰとの融合蛋
白質として発現させる方法は特許第２７０３７７０号公
報に開示されている。その中で、可溶性蛋白質として発
現できる他に、ＭＢＰのマルトース結合性を利用して、
融合蛋白質を精製できるという利点がある。精製には架
橋アミロースを担体とするアフィニティクロマトグラフ
ィーが用いられており、アミロースレジンという商品名
でその担体は市販されている。しかし、架橋アミロース
とＭＢＰの結合は必ずしも強いものではなく、場合によ
っては酵素が吸着しなかったり、吸着が弱く溶出前の洗
浄の時点で酵素が溶出してしまい十分に精製できないこ
とがある。これは、ＭＢＰの基質特異性に起因してお
り、より親和性の高い担体を用いることにより克服でき
る。

【０００３】また、架橋アミロースに吸着した酵素は固
定化酵素としても利用でき、担体との親和性が十分でな
いときには酵素を結合できなかったり、一旦固定化され
た酵素が脱離してくる。固定化酵素を調製すると言う点
からもより親和性の高い担体が望まれる。

【０００４】マルトオリゴ糖鎖を側鎖に有する高分子と
しては、エピクロロヒドリンを用いてアガロースなどに
マルトオリゴ糖を結合させたものがあるが、マルトオリ
ゴ糖鎖の密度をコントロールできないため、オリゴ糖鎖
がＭＢＰと酵素の融合蛋白質との結合に必ずしも有効に
利用されているとはいえない。この他には、マルトオリ
ゴ糖と分子内にアミノ基と重合性ビニル基を有する化合
物とを還元アミノ化により結合させ、重合性ビニル基を
重合させることによりマルトオリゴ糖鎖を側鎖にもつ高
分子を得る方法がある。しかし、この方法ではオリゴ糖
鎖の還元末端にある糖が開環してしまうため、貴重な糖
鎖の糖残基が１つ減ってしまうという欠点がある。ま
た、還元アミノ化ではシアノ水素化ホウ素ナトリウムの
ような有毒な物質を用いるため危険であるという欠点も
ある。

【０００５】特開２００１−４００４６号では、簡便に
調製でき、架橋アミロースより親和性の高い担体として
がマルトオリゴ糖を担持させた高分子が開示されてい
る。しかし、ＭＢＰとの親和性はマルトオリゴ糖残基が
担っており、マルトオリゴ糖残基部分を化学修飾するこ
とにより、まだまだ親和性を向上させる余地がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＭＢ
Ｐとより親和性の高い高分子担体を用い、ＭＢＰと酵素
との融合蛋白質を容易に、効率よく、分離精製する方法
および容易に、効率よく、しかも酵素脱離の起こりにく
い固定化方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するために鋭意検討した結果、新規なマルトオリ
ゴ糖誘導体を合成し、該マルトオリゴ糖誘導体が担持さ
れた高分子を得ることにより、上記問題点を解決できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）一般式（Ｉ）（式中、Ｒ¹はＯＨまたはＮＲ
³Ｒ⁴、Ｒ²はメチレン基１〜２０個分の長さを有するリ
ンカー、Ｒ³およびＲ⁴は独立してＨまたは炭素数１〜４
のアルキル基を示し、ｎは０〜５までの整数を示す）で
表される基が結合していることを特徴とするマルトース
結合蛋白質リガンド。

【０００９】

【化４】

【００１０】（２）Ｒ²が式（II）（式中、Ｒ⁵は炭素数
１〜１９のアルキレン基、Ｒ⁶はＯ、ＳあるいはＮＨを
示し、Ｒ⁶を介して高分子担体と結合している）で表さ
れる基である（１）のマルトース結合蛋白質リガンド。

【００１１】

【化５】

【００１２】（３）高分子担体がアクリルアミド類、メ
タクリルアミド類、アクリル酸類、メタクリル酸類、ス
チレン類、脂肪酸ビニルエステル類よりなる群から選択
されるビニル化合物の重合体または共重合体あるいは多
糖である（１）または（２）のマルトース結合蛋白質リ
ガンド。 （４）一般式（III）（式中、Ｒ⁷はＯＨまたはＮＲ¹⁰Ｒ
¹¹、Ｒ⁸はメチレン基１〜１９個分の長さを有するリン
カー、Ｒ⁹はＮＨ₂、ＳＨ、ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ₂、ＯＣＯ
Ｃ(ＣＨ₃)＝ＣＨ₂、ＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ₂またはＮＨＣ
ＯＣ(ＣＨ₃)＝ＣＨ ₂、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は独立してＨまた
は炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは０〜５までの
整数を示す）で表されることを特徴とするマルトオリゴ
糖誘導体。

【００１３】

【化６】

【００１４】（５）Ｒ⁸が炭素数１〜１９のアルキレン
基である（４）のマルトオリゴ糖誘導体。 （６）Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨであるものを除く（４）あ
るいは（５）のマルトオリゴ糖誘導体および少なくとも
１種類のビニル系単量体とを含むことを特徴とする共重
合体からなるマルトース結合蛋白質リガンド。 （７）ビニル系単量体がアクリルアミド類、メタクリル
アミド類、アクリル酸類、メタクリル酸類、スチレン
類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群より選ばれる
（６）のマルトース結合蛋白質リガンド。 （８）架橋剤として少なくとも１種類の分子内に重合性
ビニル基を２個以上有するビニル系単量体を含む共重合
体からなる（６）または（７）のマルトース結合蛋白質
リガンド。 （９）架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド、メタクリル酸ビニル、ジメタクリル酸エチレングリ
コール、ジビニルベンゼンからなる群より選ばれる
（８）のマルトース結合蛋白質リガンド。 （１０）Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨであるものを除く（４）
あるいは（５）のマルトオリゴ糖誘導体と少なくとも１
種類のビニル系単量体の共重合比が１：１０〜１０００
００である共重合体からなる（６）〜（９）のいずれか
のマルトース結合蛋白質リガンド。 （１１）架橋剤の割合が０．１〜２０％である共重合体
からなる（８）〜（１０）のいずれかのマルトース結合
蛋白質リガンド。 （１２）（１）〜（３）または（６）〜（１１）のいず
れかのマルトース結合蛋白質リガンドにマルトース結合
蛋白質と酵素との融合蛋白質が結合されていることを特
徴とする固定化酵素。 （１３）酵素が糖転移酵素である（１２）の固定化酵
素。 （１４）糖転移酵素がβ１，４−ガラクトース転移酵素
である（１３）の固定化酵素。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を挙げ
て詳細に説明する。本発明のマルトース結合蛋白質リガ
ンドは高分子担体上に上記一般式（I）で表される基が
結合している。式中、Ｒ¹はＯＨまたはＮＲ³Ｒ⁴、Ｒ²は
メチレン基１〜２０個分の長さを有するリンカー、Ｒ³
およびＲ⁴は独立してＨまたは炭素数１〜４のアルキル
基を示し、ｎは０〜５までの整数を示す。Ｒ²のメチレ
ン基１〜２０個分の長さを有するリンカーとしては、例
えば上記式（II）で表される基（式中、Ｒ⁵は炭素数１
〜１９のアルキレン基、Ｒ⁶はＯ、ＳあるいはＮＨを示
す）が例示され、Ｒ⁵の炭素数１〜１９のアルキレン基
としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブ
チレン基、ヘキシレン基、オクチレン基、ドデシレン
基、オクタドデシレン基などが、Ｒ³およびＲ⁴の炭素数
１〜４のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロ
ピル基、イソプロピル基、ブチル基などが挙げられる。

【００１６】本発明のマルトース結合蛋白質リガンドと
しては、Ｒ¹、Ｒ²およびｎは任意に組み合わせることが
できる。

【００１７】本発明で用いることのできる高分子担体
は、一般式（Ｉ）で表される基が結合できるものであれ
ば特に制限はなく、例えばアクリルアミド類、メタクリ
ルアミド類、アクリル酸類、メタクリル酸類、スチレン
類、脂肪酸ビニルエステル類よりなる群から選択される
ビニル化合物の重合体または共重合体あるいは多糖など
が挙げられる。アクリルアミド類としてはアクリルアミ
ドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルア
ミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アル
キルアクリルアミド類などが例示される。メタクリルア
ミド類としてはメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリ
ルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ
−アルキルメタクリルアミド類などが例示される。アク
リル酸エステル類としてはアクリル酸メチル、アクリル
酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジ
メチルアミノエチルなどが例示される。メタクリル酸エ
ステル類としてはメタクリル酸メチル、メタクリル酸エ
チル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジ
メチルアミノエチルなどが例示される。。スチレン類と
してはスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが例示さ
れる。脂肪酸ビニルエステル類としては酢酸ビニル、酪
酸ビニルなどが例示される。多糖としてはセルロース、
キチン、キトサンや架橋アガロース、架橋デキストラン
などの架橋された多糖などが例示される。また、ここに
挙げた高分子担体は、一般式（III）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体を結合させるため適当な方法で活性化さ
れたものも含まれる。さらに、本発明中の脂肪酸ビニル
エステルの重合体あるいは共重合体には、重合反応後ア
ルカリなどによりエステル結合を全部あるいは一部加水
分解したものも含まれる。

【００１８】本発明の高分子担体上に一般式（Ｉ）で表
される基が結合しているマルトース結合蛋白質リガンド
は、Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨであるものを除く一般式（II
I）で表されるマルトオリゴ糖誘導体とビニル系単量体
とを共重合あるいは高分子担体上にグラフト共重合させ
ること、あるいはＲ⁹がＮＨ₂またはＳＨである一般式
（III）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を上記高分子
担体上の適当な官能基と結合させることにより得ること
ができる。共重合はラジカル重合、カチオン重合、アニ
オン重合などの手法を用いることにより行うことがで
き、通常ペルオキソ二硫酸アンモニウムなどを触媒とす
るラジカル重合により行うことができる。共重合させる
とき架橋剤を共存させてもかまわない。利用できる架橋
剤としては、分子内に重合性ビニル基を２個以上有する
ビニル系単量体であれば特に制限はなく、Ｎ，Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド、メタクリル酸ビニル、ジメ
タクリル酸エチレングリコール、ジビニルベンゼンなど
が開示される。また、上記マルトオリゴ糖誘導体とビニ
ル系単量体との共重合比は１：５〜１００００００が好
ましく、特に１：１０〜１０００００が好ましい。さら
に、架橋剤を用いるときは、上記マルトオリゴ糖誘導体
と上記ビニル系単量体の合計量に対してその割合が、
０．０５〜３０％が好ましく、０．１〜２０％が特に好
ましい。Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨである一般式（III）で
表されるマルトオリゴ糖誘導体を高分子担体に結合させ
る方法としては特に制限はないが、高分子担体上の官能
基を適当な方法で活性化させておくのが好ましい。例え
ば、高分子担体上の官能基がカルボキシル基の場合はＮ
−ヒドロキシコハク酸イミド基などに、チオール基の場
合は２−ピリジルジスルフィド基などに活性化させてお
くのが好ましい。

【００１９】本発明の一般式（III）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体は、通常用いられている各種有機合成化
学的な手法により合成することができる。例えば、Ｒ⁷
がＯＨ、Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨの場合、マルトオリゴ糖
をアンモニウム塩と反応させてグリコシルアミンとし、
カルボジイミドに代表される縮合剤存在下にＮ−保護−
ω−アミノ脂肪酸あるいはＳ−保護−ω−メルカプト脂
肪酸と反応させた後、Ｎ−保護基あるいはＳ−保護基を
脱保護することにより得ることができる。また、Ｒ⁷が
ＮＨ₂、Ｒ⁹がＳＨの場合、上記と同様の方法でＳ−保護
−ω−メルカプト脂肪酸と縮合させるところまで行い、
その後非還元末端のグルコース残基の４，６位をベンザ
ルブロミドなどを用いて選択的にベンジリデン化し、さ
らに残存するＯＨ基を無水酢酸などを用いてアセチル化
する。アセチル化した後、Ｎ−ブロモコハク酸イミドな
どにより６位を選択的に開裂し、次いでアジ化ナトリウ
ムで処理することにより６位をアジド化する。接触還元
によりアジド基をアミノ基に還元すると同時に４位のベ
ンゾイル基を脱保護し、さらにナトリウムメチラートな
どを用いて脱アセチル化、Ｓ−保護基を脱保護すること
により得ることができる。さらに、Ｒ⁷がＮＨ₂、Ｒ⁹が
ＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ₂の場合、まずマルトオリゴ糖をベ
ンジルアルコールで１位をベンジル化する。次いでベン
ザルブロミドなどを用いてマルトオリゴ糖の非還元末端
グルコース残基の４，６位を選択的にベンジリデン化し
た後、同様に残存するＯＨ基を無水酢酸などによるアセ
チル化、Ｎ−ブロモコハク酸イミドなどによる６位の選
択的開裂、アジ化ナトリウムによる６位のアジド化、ナ
トリウムメチラートによる脱アセチル化、接触還元によ
るアジド基のアミノ基への還元と４位ベンゾイル基の脱
保護を行う。さらに、アミノ基を適当な保護基で保護す
ることにより、還元末端のグルコース残基の６位ＯＨ基
が保護されたアミノ基で置換されたマルトオリゴ糖が得
られる。得られたマルトオリゴ糖を上記と同様の方法で
グリコシルアミンとし、Ｎ−保護−ω−アミノ脂肪酸と
縮合させた後、ω−アミノ基の保護基を脱保護する。さ
らに、塩化アクリロイルなどによりアクリロイル化した
後、残るアミノ基の保護基を脱保護することにより目的
のマルトオリゴ糖誘導体を得ることができる。Ｎ−保護
−ω−アミノ脂肪酸の保護基と非還元末端グルコース残
基の６位アミノ基の保護基はそれぞれ異なる条件で脱保
護される必要があり、その組み合わせとしては、例えば
Ｎ−保護−ω−アミノ脂肪酸の保護基としてベンジルオ
キシカルボニル基、非還元末端グルコース残基の６位ア
ミノ基の保護基としてｔ−ブトキシカルボニル基の組み
合わせなどが挙げられる。

【００２０】本発明の固定化酵素に用いることのできる
マルトース結合蛋白質と酵素との融合蛋白質は、マルト
ース結合性を有しているマルトース結合蛋白質と酵素と
の融合蛋白質であれば、特に制限はなく、一般的には遺
伝子組換え手法を利用して得ることができる。また、酵
素は目的とする酵素活性を有していれば必ずしも酵素蛋
白質全体である必要はなく、その断片であっても構わな
い。利用できる酵素としては特に制限はないが、糖転移
酵素が好ましい。糖転移酵素としては、ガラクトース転
移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、フコース
転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、Ｎ
−アセチルガラクトサミン転移酵素、キシロース転移酵
素、グルクロン酸転移酵素などが挙げられる。

【００２１】本発明の固定化酵素は、上記マルトオリゴ
糖誘導体が結合した高分子担体あるいは上記マルトオリ
ゴ糖誘導体とビニル系単量体との共重合体と上記融合蛋
白質とを適当な溶液中で接触させることにより調製する
ことができる。用いることのできる溶液としては、融合
蛋白質の酵素活性が失活しないものであれば特に制限は
ないが、通常ｐＨ７付近の緩衝液が用いられる。必要に
応じて、融合蛋白質を安定化させるような添加剤、例え
ば、２−メルカプトエタノールなどのような還元剤やカ
ルシウム、マグネシウム、マンガンなどの金属塩を添加
しても構わない。共重合体あるいはグラフト共重合体と
融合蛋白質とは上記緩衝液中で、通常０〜４０℃で５分
〜２４時間接触させる。このとき穏やかに振とうさせて
もよい。

【００２２】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はかかる実施例により限定されるも
のではない。

【００２３】参考例１ ［６−（Ｎ’−ベンジルオキシ
カルボニル）−アミノヘキサノイル］−β−マルトシル
アミンの合成 マルトース５ｇと炭酸水素アンモニウム３９．８ｇを蒸
留水５０ｍｌに溶かし、室温で５日間攪拌した。反応
後、反応溶液を減圧下で濃縮し、炭酸水素アンモニウム
の匂いが消えるまでトルエンで共沸を繰り返した。その
残渣と６−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ
ヘキサン酸４ｇを乾燥ジメチルホルムアミド１００ｍｌ
に溶かし、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド４．０ｇと１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール一水和物３．２ｇを加え、室温で２４
時間攪拌した。 反応後、反応溶液をクロロホルムで洗
浄し、水で抽出を行ない、減圧下で濃縮した。この残渣
をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフ
ィー（溶出液 ９５％エタノール）を用いて精製し、目
的物３．５ｇを得た。［６−（Ｎ’−ベンジルオキシカ
ルボニル）−アミノヘキサノイル］−β−マルトシルア
ミンは下記構造式（式中、Ｚはベンジルオキシカルボニ
ル基を示す）を有する。

【００２４】

【化７】

【００２５】実施例１ ６−アミノヘキサノイル−β−
マルトシルアミン 参考例１で得た［６−（Ｎ’−ベンジルオキシカルボニ
ル）−アミノヘキサノイル］−β−マルトシルアミン１
００ｍｇをメタノール３０ｍｌに溶かし、１０％パラジ
ウム炭素３０ｍｇを加え、水素雰囲気下で室温で２４時
間攪拌した。反応溶液をセライトろ過した後、ろ液を減
圧下で濃縮し、目的物７２ｍｇを得た。６−アミノヘキ
サノイル−β−マルトシルアミンは下記構造式を有す
る。

【００２６】

【化８】

【００２７】参考例２ ベンジルマルトシドの合成 マルトース１７．１ｇとベンジルアルコール５４ｇをと
り、これにＨ⁺型にした陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５
０ＷＸ−８（ダウケミカル製）３ｇを加え、５時間還流
した。反応後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（アマシ
ャムファルマシア製）カラムクロマトグラフィー（溶出
液 ９５％エタノール）を用いて精製し、目的物４．３
ｇを得た。

【００２８】参考例３ ベンジル２，３，６，２’，
３’−ペンタ−Ｏ−アセチル−４’，６’−Ｏ−ベンジ
リデン−マルトシドの合成 参考例２で得たベンジルマルトシド４．３ｇをピリジン
５０ｍｌに溶かし、ベンザルブロミド２．７５ｇを加え
て６５℃にて１時間攪拌した。その反応溶液を室温に戻
した後に無水酢酸１２０ｍｌを加え、室温で２４時間攪
拌した。反応溶液をクロロホルムで抽出した後、飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、セライトろ過で
硫酸ナトリウムを除いた後、ろ液を減圧下で濃縮した。
その残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液 ト
ルエン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、目的物２．５
ｇを得た。ベンジル２，３，６，２’，３’−ペンタ−
Ｏ−アセチル−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−マルト
シドは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｎはベ
ンジル基を示す）を有する。

【００２９】

【化９】

【００３０】参考例４ ベンジル２，３，６，２’，
３’−ペンタ−Ｏ−アセチル−６’−アジド−４’−Ｏ
−ベンゾイル−６’−デオキシ−マルトシドの合成 参考例３で得たベンジル２，３，６，２’，３’−ペン
タ−Ｏ−アセチル−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−マ
ルトシド１．５ｇを乾燥ジクロロエタン５０ｍｌと四塩
化炭素１００ｍｌからなる混合溶媒に溶かし、 Ｎ−ブ
ロモコハク酸イミド１．１ｇと炭酸バリウム２３０ｍｇ
を加えて、６５℃で３時間攪拌した。その後、反応溶液
にジメチルホルムアミド１００ｍｌとアジ化ナトリウム
２ｇを加え、１２０℃にて２４時間攪拌した。反応溶液
をクロロホルムで抽出した後、水で洗浄し、減圧下で濃
縮した。その残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶
出液 トルエン：酢酸エチル＝２：１）にて精製し、目
的物４００ｍｇを得た。ベンジル２，３，６，２’，
３’−ペンタ−Ｏ−アセチル−６’−アジド−４’−Ｏ
−ベンゾイル−６’−デオキシ−マルトシドは下記構造
式（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｎはベンジル基を示
す）を有する。

【００３１】

【化１０】

【００３２】参考例５ ベンジル６’−アジド−６’−
デオキシ−マルトシドの合成 参考例４で得たベンジル２，３，６，２’，３’−ペン
タ−Ｏ−アセチル−６’−アジド−４’−Ｏ−ベンゾイ
ル−６’−デオキシ−マルトシド３１０ｍｇを乾燥メタ
ノール５０ｍｌに溶かし、１．６６Ｍナトリウムメチラ
ート−メタノール溶液２．９ｍｌを加え、室温で２４時
間撹拌した。反応溶液をＨ⁺型にした陽イオン交換樹脂
Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル製）を用いて、
ｐＨ７に中和した後、樹脂をろ別した。ろ液を減圧濃縮
して、目的物１７４ｍｇを得た。ベンジル６’−アジド
−６’−デオキシ−マルトシドは下記構造式（式中、Ｂ
ｎはベンジル基を示す）を有する。

【００３３】

【化１１】

【００３４】参考例６ ６’−アミノ−６’−デオキシ
−マルトース 参考例５で得た。ベンジル６’−アジド−６’−デオキ
シ−マルトシド１３７ｍｇをメタノール３０ｍｌに溶か
し、１０％パラジウム炭素３０ｍｇを加え、水素雰囲気
下で２４時間撹拌した。反応液をセライトろ過した後、
ろ液を減圧濃縮し、目的物９７ｍｇを得た。６’−アミ
ノ−６’−デオキシ−マルトースは下記構造式を有す
る。

【００３５】

【化１２】

【００３６】参考例７ ６’−ｔ−ブトキシカルボニル
アミノ−６’−デオキシ−マルトースの合成 参考例６で得た６’−アミノ−６’−デオキシ−マルト
ース６８ｍｇをジオキサン−水（２：１）１０ｍｌに溶
かし、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．２ｍｌとジ−ｔ
−ブチルジカーボネート４８ｍｇを加えた。室温で１時
間撹拌した後、減圧濃縮した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１０（アマシャムファルマシア製）カラムクロマトグラ
フィー（溶出液 蒸留水）を用いて精製し、目的物７９
ｍｇを得た。６’−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−
６’−デオキシ−マルトースは下記構造式（式中、Ｂｏ
ｃはｔ−ブトキシカルボニル基を示す）を有する。

【００３７】

【化１３】

【００３８】参考例８ ６−（Ｎ’−ベンジルオキシカ
ルボニル）−アミノヘキサノイル６’−ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ−６’−デオキシ−β−マルトシルアミ
ンの合成 参考例７で得た６’−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−
６’−デオキシ−マルトース６６ｍｇと炭酸水素ナトリ
ウム０．４ｇを蒸留水５ｍｌに溶かし、室温で５日間攪
拌した。反応後、反応溶液を減圧下で濃縮し、炭酸水素
アンモニウムの匂いが消えるまでトルエンで共沸を繰り
返した。その残渣と６−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニ
ル）−アミノヘキサン酸４４ｍｇを乾燥ジメチルホルム
アミド５ｍｌに溶かし、塩酸１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド４５ｍｇと１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物３６ｍｇを加
え、室温で２４時間攪拌した。 反応後、反応溶液をク
ロロホルムで洗浄し、水で抽出を行ない、減圧下で濃縮
した。この残渣をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム
クロマトグラフィー（溶出液 ９５％エタノール）を用
いて精製し、目的物４４ｍｇを得た。６−（Ｎ’−ベン
ジルオキシカルボニル）−アミノヘキサノイル６’−ｔ
−ブトキシカルボニルアミノ−６’−デオキシ−β−マ
ルトシルアミンは下記構造式（式中、Ｂｏｃはｔ−ブト
キシカルボニル基、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を
示す）を有する。

【００３９】

【化１４】

【００４０】参考例９ ６−アミノヘキサノイル６’−
ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６’−デオキシ−β−
マルトシルアミンの合成 参考例８で得た６−（Ｎ’−ベンジルオキシカルボニ
ル）−アミノヘキサノイル６’−ｔ−ブトキシカルボニ
ルアミノ−６’−デオキシ−β−マルトシルアミン３５
ｍｇをメタノール５ｍｌに溶かし、１０％パラジウム炭
素１５ｍｇを加え、水素雰囲気下で室温で２４時間攪拌
した。反応溶液をセライトろ過した後、ろ液を減圧下で
濃縮し、目的物２７ｍｇを得た。６−アミノヘキサノイ
ル６’−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６’−デオキ
シ−β−マルトシルアミンは下記構造式（式中、Ｂｏｃ
はｔ−ブトキシカルボニル基を示す）を有する。

【００４１】

【化１５】

【００４２】参考例１０ ６−アクリロイルアミノヘキ
サノイル６’−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６’−
デオキシ−β−マルトシルアミンの合成 参考例９で得た６−アミノヘキサノイル６’−ｔ−ブト
キシカルボニルアミノ−６’−デオキシ−β−マルトシ
ルアミン２７ｍｇを蒸留水５ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液を０．０６ｍｌ加えた。さらに、塩化
アクリロイル６ｍｇを含むテトラヒドロフラン０．５ｍ
ｌを氷冷下撹拌しながら滴下した。このとき、ｐＨ８．
５を保つように適宜０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を
加えてｐＨを調整した。約２時間撹拌後、１Ｎ塩酸で反
応液を中和し、凍結乾燥した。残渣を７０％エタノール
で溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（アマシャム
ファルマシア製）カラムクロマトグラフィー（溶出液
７０％エタノール）を用いて精製し、目的物１２ｍｇを
得た。６−アクリロイルアミノヘキサノイル６’−ｔ−
ブトキシカルボニルアミノ−６’−デオキシ−β−マル
トシルアミンは下記構造式（式中、Ｂｏｃはｔ−ブトキ
シカルボニル基を示す）を有する。

【００４３】

【化１６】

【００４４】実施例２ ６−アクリロイルアミノヘキサ
ノイル６’−アミノ−６’−デオキシ−β−マルトシル
アミンの合成 参考例１０で得た６−アクリロイルアミノヘキサノイル
６’−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６’−デオキシ
−β−マルトシルアミン１２ｍｇをとり、これに３０％
トリフロロ酢酸水溶液５ｍｌを加え、室温で３０分間撹
拌した。反応後、反応液にジエチルエーテルを加え、生
成物を沈殿させた。沈殿をジエチルエーテルで数回洗浄
した後、これを乾燥させ、目的物９ｍｇを得た。６−ア
クリロイルアミノヘキサノイル６’−アミノ−６’−デ
オキシ−β−マルトシルアミンは下記構造式を有する。

【００４５】

【化１７】

【００４６】参考例１１ ３−Ｓ−アセチルチオプロピ
オイルβ−マルトトリオシルアミンの合成 マルトトリオース１５．５ｇと炭酸水素アンモニウム９
４ｇを蒸留水１００ｍｌに溶かし、室温で５日間攪拌し
た。反応後、反応溶液を減圧下で濃縮し、炭酸水素アン
モニウムの匂いが消えるまでトルエンで共沸を繰り返し
た。その残渣と３−Ｓ−アセチルメルカプトプロピオン
酸５．３ｇを乾燥ジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶
かし、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド５．７ｇと１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール一水和物４．６ｇを加え、室温で２４時間
攪拌した。 反応後、反応溶液をクロロホルムで洗浄
し、水で抽出を行ない、減圧下で濃縮した。この残渣を
Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィ
ー（溶出液 ９５％エタノール）を用いて精製し、目的
物８．４ｇを得た。３−Ｓ−アセチルチオプロピオイル
β−マルトトリオシルアミンは下記構造式（式中、Ａｃ
はアセチル基を示す）を有する。

【００４７】

【化１８】

【００４８】参考例１２ ３−Ｓ−アセチルチオプロピ
オイル２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オ
クタ−Ｏ−アセチル−４”，６”−Ｏ−ベンジリデン−
β−マルトトリオシルアミンの合成 参考例１１で得た３−Ｓ−アセチルチオプロピオイルβ
−マルトトリオシルアミン６．４ｇをピリジン１００ｍ
ｌに溶かし、ベンザルブロミド２．８ｇを加えて６５℃
にて１時間攪拌した。その反応溶液を室温に戻した後に
無水酢酸１５０ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌した。
反応溶液をクロロホルムで抽出した後、飽和炭酸水素ナ
トリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムを用いて乾燥させ、セライトろ過で硫酸ナト
リウムを除いた後、ろ液を減圧下で濃縮した。その残渣
をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液 トルエン：
酢酸エチル＝２：１）で精製し、目的物２．２ｇを得
た。３−Ｓ−アセチルチオプロピオイル２，３，６，
２’，３’，６’，２”，３”−オクタ−Ｏ−アセチル
−４”，６”−Ｏ−ベンジリデン−β−マルトトリオシ
ルアミンは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示
す）を有する。

【００４９】

【化１９】

【００５０】参考例１３ ３−Ｓ−アセチルチオプロピ
オイル２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オ
クタ−Ｏ−アセチル−６”−アジド−４”−Ｏ−ベンゾ
イル−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミンの
合成 参考例１２で得た３−Ｓ−アセチルチオプロピオイル
２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オクタ−
Ｏ−アセチル−４”，６”−Ｏ−ベンジリデン−β−マ
ルトトリオシルアミン２．１ｇを乾燥ジクロロエタン５
０ｍｌと四塩化炭素１００ｍｌからなる混合溶媒に溶か
し、 Ｎ−ブロモコハク酸イミド１．１ｇと炭酸バリウ
ム２３０ｍｇを加えて、６５℃で３時間攪拌した。その
後、反応溶液にジメチルホルムアミド１００ｍｌとアジ
化ナトリウム２ｇを加え、１２０℃にて２４時間攪拌し
た。反応溶液をクロロホルムで抽出した後、水で洗浄
し、減圧下で濃縮した。その残渣をシリカゲルクロマト
グラフィー（溶出液 トルエン：酢酸エチル＝２：１）
にて精製し、目的物５８９ｍｇを得た。３−Ｓ−アセチ
ルチオプロピオイル２，３，６，２’，３’，６’，
２”，３”−オクタ−Ｏ−アセチル−６”−アジド−
４”−Ｏ−ベンゾイル−６”−デオキシ−β−マルトト
リオシルアミンは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基
を示す）を有する。

【００５１】

【化２０】

【００５２】参考例１４ ３−Ｓ−アセチルチオプロピ
オイル２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オ
クタ−Ｏ−アセチル−６”−アミノ−４”−ベンゾイル
−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミンの合成 参考例１３で得た３−Ｓ−アセチルチオプロピオイル
２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オクタ−
Ｏ−アセチル−６”−アジド−４”−Ｏ−ベンゾイル−
６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン５５０ｍ
ｇをメタノール５０ｍｌに溶かし、１０％パラジウム炭
素３０ｍｇを加え、水素雰囲気下で２４時間撹拌した。
反応液をセライトろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、目的
物５１０ｍｇを得た。３−Ｓ−アセチルチオプロピオイ
ル２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オクタ
−Ｏ−アセチル−６”−アミノ−４”−ベンゾイル−
６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミンは下記構
造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。

【００５３】

【化２１】

【００５４】実施例３ ３−メルカプトプロピオイル
６”−アミノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシル
アミンの合成 参考例１４で得た３−Ｓ−アセチルチオプロピオイル
２，３，６，２’，３’，６’，２”，３”−オクタ−
Ｏ−アセチル−６”−アミノ−４”−ベンゾイル−６”
−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン１０７ｍｇを
乾燥メタノール２０ｍｌに溶かし、１．６６Ｍナトリウ
ムメチラート−メタノール溶液１．１ｍｌを加え、室温
で２４時間撹拌した。反応溶液をＨ⁺型にした陽イオン
交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル製）を
用いて、ｐＨ７に中和した後、樹脂をろ別した。ろ液を
減圧濃縮して、目的物５５ｍｇを得た。３−メルカプト
プロピオイル６”−アミノ−６”−デオキシ−β−マル
トトリオシルアミンは下記構造式を有する。

【００５５】

【化２２】

【００５６】参考例１５ Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テト
ラカルボキシメチルジエチレントリアミノアセチル−β
−マルトシルアミン−ユウロピウム錯体の合成 マルトース５０ｍｇと炭酸水素アンモニウム１０ｇを蒸
留水５０ｍｌに溶かし、室温で５日間攪拌した。反応
後、反応溶液を減圧下で濃縮し、炭酸水素アンモニウム
の匂いが消えるまでトルエンで共沸を繰り返した。その
残渣に無水ジエチレントリアミン―Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ”，Ｎ”―五酢酸１４９ｍｇを加え、１０％炭酸水素
ナトリウム水溶液３ｍｌに溶かし、室温で２時間撹拌し
た。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（アマシャムファルマ
シア製）カラムクロマトグラフィー（溶出液 蒸留水）
を用いて精製した。生成物画分を凍結乾燥し、得られた
固形物１０ｍｇを蒸留水２ｍｌに溶解し、酢酸ユウロピ
ウム９ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応液をＳ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（アマシャムファルマシア
製）カラムクロマトグラフィー（溶出液 蒸留水）を２
回行い、精製し、目的物４５ｍｇを得た。Ｎ，Ｎ’，
Ｎ”，Ｎ”−テトラカルボキシメチルジエチレントリア
ミノアセチル−β−マルトシルアミン−ユウロピウム錯
体は下記構造式を有する。

【００５７】

【化２３】

【００５８】実施例４ ＤＥＬＦＩＡ（Dissociation E
nhanced Lanthanide Fluoro-immunoassay）による各種
マルトオリゴ糖誘導体とマルトース結合蛋白質との親和
性の評価 ９６穴マイクロプレートに２００ｎＭマルトース結合蛋
白質の２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９％Ｎ
ａＣｌ含有、以下ＰＢＳと略する）溶液０．１ｍｌを加
えて、４℃で２４時間インキュベートを行ない、マルト
ース結合蛋白質溶液を取り除いた後に３度、ＰＢＳ
（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）０．２ｍｌで洗浄
し、プレート上にマルトース結合蛋白質をコーティング
した。次に、様々な濃度のマルトオリゴ糖誘導体と参考
例１５で得たＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テトラカルボキシ
メチルジエチレントリアミノアセチル−β−マルトシル
アミン−ユウロピウム錯体を３μＭ含む混合溶液を調製
し、マルトース結合蛋白質をコーティングしたプレート
穴に５０μｌづつ加え、室温で３０分間静置した。その
後、混合溶液を取り除き、８度ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有）０．２ｍｌで洗浄した後に、エンハン
スメント溶液（５０μＭ酸化トリオクチルホンフィン、
１５μＭ４，４，４−トリフロロ−１−（２−ナフチ
ル）−１，３−ブタンジオン、０．１％トリトンＸ−１
００を含む０．１Ｍ酢酸−フタル酸水素カリウム緩衝液
（ｐＨ３．２））０．１５ｍｌを加え、１５分間振動さ
せた。そして、遊離したユウロピウムイオン濃度を蛍光
光度計で測定（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎ
ｍ）した。マルトオリゴ糖誘導体濃度に対して遊離した
ユウロピウムイオン濃度をプロットし、マルトース結合
蛋白質とＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テトラカルボキシメチ
ルジエチレントリアミノアセチル−β−マルトシルアミ
ン−ユウロピウム錯体との結合に対する阻害定数を求め
た。マルトオリゴ糖誘導体としては、マルトース、マル
トトリオース、実施例１〜３で得たマルトオリゴ糖誘導
体を用いた。各々対応するマルトオリゴ糖に比べ、マル
トオリゴ糖誘導体の方がマルトース結合蛋白質に対する
親和性が向上していた。

【００５９】

【表１】

【００６０】実施例５ ６−アミノヘキサノイル−β−
マルトシルアミン結合セファロースの調製 実施例１で得た６−アミノヘキサノイル−β−マルトシ
ルアミン２３ｍｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．０）５ｍｌに溶かし、予め１ｍＭ塩酸で洗浄したＮ
ＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（アマシャムフ
ァルマシア製）２ｍｌを加え、室温で４時間穏やかに振
とうした。樹脂をろ別し、これに５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を５ｍｌ加え、室温で４時間
穏やかに振とうすることにより樹脂上に残存する活性部
位をブロックした。５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
で交互に３回ずつ洗浄し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）の中で冷蔵保存した。

【００６１】実施例６ ６−アクリロイルアミノヘキサ
ノイル６’−アミノ−６’−デオキシ−β−マルトシル
アミンとアクリルアミドとの共重合体（１：１０００）
の調製 実施例２で得た６−アクリロイルアミノヘキサノイル
６’−アミノ−６’−デオキシ−β−マルトシルアミン
５ｍｇおよびアクリルアミド７１０ｍｇを蒸留水２５ｍ
ｌに溶解し、ここにＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミド５７ｍｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチ
レンジアミン１０μｌを加え、溶解した。溶液を４℃に
冷やし、ここに１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム水
溶液１２５μｌを添加し、１時間重合させた。重合後、
得られたゲルを凍結乾燥し、共重合体７５０ｍｇを得
た。共重合体はホモジザイズした後、２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の中で冷蔵保存した。

【００６２】実施例７ ３−メルカプトプロピオイル
６”−アミノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシル
アミン結合セファロースの調製 実施例３で得た３−メルカプトプロピオイル６”−アミ
ノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン２９
ｍｇを５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌ
に溶かし、活性化Ｔｈｉｏｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４
ＦＦ（アマシャムファルマシア製）２ｍｌを加え、室温
で１２時間穏やかに振とうした。樹脂をろ別し、０．１
％牛血清アルブミンを含む２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．４）で十分洗浄した後、２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の中で冷蔵保存した。

【００６３】参考例１５ β１，４−ガラクトース転移
酵素の活性測定法 適当な濃度の酵素液４０μｌを１９ｍＭＤ−グルコー
ス、０．３７ｍＭＵＤＰ−ガラクトース、０．１４ｍＭ
β−ＮＡＤＨ、１．３ｍＭホスホエノールピルビン酸、
１７．５Ｕピルビン酸キナーゼ、２５Ｕ乳酸脱水素酵
素、５．０ｍＭ塩化マンガン水溶液、０．０２％α−ラ
クトアルブミンを含む５２ｍＭグリシルグリシン緩衝液
（ｐＨ８．４）３．０２５ｍｌに加え、３０℃で約１０
ｍｉｎ反応させ、３４０ｎｍおける吸光度（以下、Ａ３
４０と示す）の減少を記録した。ブランクとして酵素液
の代わりに２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸・４Ｎａ、２ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含有）を用いた。テストおよ
びブランクの最大ΔＡ３４０／分を求め、以下の算出式
に従い活性を算出した。 Ｕ／ｍｌ＝（ΔＡ３４０／分（テスト）−ΔＡ４３０／
分（ブランク））×３．０６５÷６．０２２÷０．０４

【００６４】なお、α−ラクトアルブミン存在下、３０
℃、ｐＨ８．４で１分間にＵＤＰ−ガラクトースよりＤ
−グルコースへガラクトース１μｍｏｌ転移させる酵素
量を１Ｕと定義した。

【００６５】参考例１６ ＭＢＰ−β１，４−ガラクト
ース転移酵素融合蛋白質の調製 ヒト胎盤より取得したβ１，４−ガラクトース転移酵素
遺伝子より膜結合部位をコードする部分を取り除いた遺
伝子をベクターｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ社製）のＥｃｏ
ＲＩおよびＳａｌＩサイトに挿入し、ＭＢＰ−β１，４
−ガラクトース転移酵素融合蛋白質発現ベクターｐＭＧ
−Ｐ２１を調製した。該発現ベクターｐＭＧ−Ｐ２１で
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を
形質転換し、ＭＢＰ−β１，４−ガラクトース転移酵素
融合蛋白質生産菌エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＭ
Ｇ−Ｐ２１）を得た。本菌を０．２％グルコースおよび
アンピシリン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５０ｍｌの入
った５００ｍｌ容坂口フラスコに植菌し、３７℃、１６
時間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。得られた培養液
を上記培地３Ｌの入った５Ｌ容ジャーファメンターに３
０ｍｌ植菌し、２５℃、通気量１．５Ｌ／分、６時間、
３００ｒｐｍで撹拌し培養した。その後、イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを０．３ｍＭになる
ように添加し、さらに１８時間培養を続けた。得られた
培養液を遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体を０．
１ＭＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸・２Ｎ
ａ、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４；以下、カラムバッファ
ー（ｐＨ７．４、０．１ＭＮａＣｌ）と示す）１５０ｍ
ｌで懸濁し、超音波破砕機により、菌体を破砕し、融合
蛋白質を抽出した。

【００６６】破砕液を遠心分離し、無細胞抽出液１５５
ｍｌを得た。無細胞抽出液のβ１，４−ガラクトース転
移酵素活性は１．４Ｕ／ｍｌであり、比活性は８０ｍＵ
／ｍｇ−蛋白質であった。得られた無細胞抽出液にポリ
エチレンイミンを０．７％になるまで撹拌しながら徐々
に加えた。このときｐＨが８を越えないようにＨＣｌで
ｐＨを調節した。添加後、さらに３０分間撹拌を続け
た。生じた沈殿を遠心分離で取り除き、上清１６０ｍｌ
を得た。ここに、硫酸アンモニウムを７５．５ｇ（７０
％飽和）４℃で撹拌しながら徐々に加えた。添加後、さ
らに１時間撹拌を続けた。生じた沈殿を遠心分離にて集
めた。得られた沈殿をカラムバッファー（ｐＨ８．０）
で再溶解し、３０ｍｌにした。これを透析（外液はカラ
ムバッファー（ｐＨ８．０））により、脱塩した。予め
カラムバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ（アマシャムファルマ
シア製）を５０ｍｌ充填したカラムに、脱塩した酵素液
を吸着させ、同バッファー１５０ｍｌで洗浄後、同バッ
ファー２５０ｍｌおよびカラムバッファー（ｐＨ８．
０、０．１ＭＮａＣｌ）２５０ｍｌを用いたリニアグラ
ジェントにより溶出させることにより、ＭＢＰ−β１，
４−ガラクトース転移酵素融合蛋白質画分１８ｍｌとし
て精製した。得られた精製酵素液は活性６．２Ｕ／ｍ
ｌ、比活性３．２Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。

【００６７】参考例１７ 固定化β１，４−ガラクトー
ス転移酵素の活性測定法 固定化１，４−ガラクトース転移酵素を適当量とり、１
００ｎＭ ＰＡ化オリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａ
ｎα１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６）Ｍ
ａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ
Ａ）、２００μＭＵＤＰ−Ｇａｌ、１０ｍＭ塩化マンガ
ン、α−ラクトアルブミン０．２６ｍｇ／ｍｌを含む２
５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ中、
２０℃で１時間振とう撹拌しながら反応させた。反応
後、生成物量をＨＰＬＣにより定量した。参考例１５の
活性測定法で予め活性を測定した酵素液を用いて、上記
活性測定反応を行い、生成物量からガラクトース転移量
を求め、検量線を作成し、その検量線より活性を算出し
た。

【００６８】実施例８ β１，４−ガラクトース転移酵
素の固定化（その１） 実施例５で得た６−アミノヘキサノイル−β−マルトシ
ルアミン結合セファロース５０μｌをとり、これに参考
例１６で得た精製酵素液５０μｌおよびカラムバッファ
ー（ｐＨ８．０）２００μｌを加え、４℃で穏やかに２
時間振とうした。遠心分離により上清を取り除き、カラ
ムバッファー（ｐＨ８．０）２００μｌで２回洗浄する
ことにより、固定化β１，４−ガラクトース転移酵素を
得た。洗浄液を上清とあわせて回収液とした。回収液お
よび固定化β１，４−ガラクトース転移酵素の酵素活性
を測定し、活性回収率を算出した。固定化酵素の活性は
４２０ｍＵ／ｍｌ−樹脂であり、活性回収率は２２％で
あった。

【００６９】実施例９ β１，４−ガラクトース転移酵
素の固定化（その２） 実施例５で得た６−アミノヘキサノイル−β−マルトシ
ルアミン結合セファロースの代わりに実施例６で得た６
−アクリロイルアミノヘキサノイル６’−アミノ−６’
−デオキシ−β−マルトシルアミンとアクリルアミドと
の共重合体を用いる以外は実施例８と同様にして固定化
β１，４−ガラクトース転移酵素を調製した。得られた
固定化酵素の活性は３３０ｍＵ／ｍｌ−樹脂であり、活
性回収率は２３％であった。

【００７０】実施例１０ β１，４−ガラクトース転移
酵素の固定化（その３） 実施例５で得た６−アミノヘキサノイル−β−マルトシ
ルアミン結合セファロースの代わりに実施例７で得た３
−メルカプトプロピオイル６”−アミノ−６”−デオキ
シ−β−マルトトリオシルアミン結合セファロースを用
いる以外は実施例８と同様にして固定化β１，４−ガラ
クトース転移酵素を調製した。得られた固定化酵素の活
性は４７０ｍＵ／ｍｌ−樹脂であり、活性回収率は２１
％であった。

【００７１】実施例１１ β１，４−ガラクトース転移
酵素の固定化（その４） 参考例１６で得た精製酵素液５０μｌおよびカラムバッ
ファー（ｐＨ８．０）２００μｌの代わりに参考例１６
で得た無細胞抽出液２５０μｌを用いる以外は実施例１
０と同様にして固定化β１，４−ガラクトース転移酵素
を調製した。得られた固定化酵素の活性は４００ｍＵ／
ｍｌ−樹脂であり、活性回収率は２０％であった。

【００７２】比較例１ アミロースレジン（ＮＥＢ社
製）へのβ１，４−ガラクトース転移酵素の固定化 実施例７で得た３−メルカプトプロピオイル６”−アミ
ノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン結合
セファロースの代わりにアミロースレジンを用いる以外
は実施例９と同様にして、固定化β１，４−ガラクトー
ス転移酵素を調製した。しかし、固定化酵素としての活
性は認められなかった。活性は全て回収液として回収さ
れており、アミロースレジンには酵素は結合していなか
った。

【００７３】実施例１２ ３−メルカプトプロピオイル
６”−アミノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシル
アミン結合セファロースを用いたＭＢＰ−β１，４−ガ
ラクトース転移酵素融合蛋白質の精製 実施例７で得た３−メルカプトプロピオイル６”−アミ
ノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン結合
セファロース１ｍｌをカラムに充填し、参考例１６で得
た無細胞抽出液０．５ｍｌを通液し、融合蛋白質を吸着
させた。吸着後カラムバッファー（ｐＨ７．４、０．１
ＭＮａＣｌ）５ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後、１０
ｍＭマルトースを含むカラムバッファー（ｐＨ７．４、
０．１ＭＮａＣｌ）３ｍｌで融合蛋白質を溶出させ、β
１，４−ガラクトース転移酵素活性画分を集めた。得ら
れた酵素液の比活性は１．１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であり、
約１３倍向上していた。

【００７４】比較例２ アミロースレジン（ＮＥＢ社
製）を用いたＭＢＰ−β１，４−ガラクトース転移酵素
融合蛋白質の精製 実施例７で得た３−メルカプトプロピオイル６”−アミ
ノ−６”−デオキシ−β−マルトトリオシルアミン結合
セファロースの代わりにアミロースレジン（ＮＥＢ社
製）を用いて、実施例１２と同様にして融合蛋白質を吸
着させようとしたが、融合蛋白質は吸着せず、洗浄液中
に活性が回収され、精製できなかった。

【００７５】

【発明の効果】上述したように、本発明の高分子担体上
にマルトオリゴ糖誘導体を結合させたマルトース結合蛋
白質リガンドを利用することにより、マルトース結合蛋
白質との融合蛋白質として発現させた酵素を効率よく、
しかも容易に精製したり、固定化することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西村 紳一郎 北海道札幌市中央区北９条西16丁目１番１ 号320 (72)発明者 黒河内 政樹 北海道札幌市北区北20条西５丁目20番地エ ルムハ イツ中島401号 (72)発明者 山田 久里子 北海道札幌市北区麻生町７丁目１番１号 311 (72)発明者 ユアン チュアン リー アメリカ合衆国メリーランド州21093、チ モニウム、サヴォコート 1824 Ｆターム(参考） 4B033 NA25 NA45 NB04 NB13 NB34 NB36 NB44 NC04 NC13 ND03 ND20 4C057 BB03 BB04 CC03 CC04 DD03 HH02 4H045 AA10 BA41 BA60 BA62 DA89 EA60 EA65 FA74 FA82 GA26 4J100 AB02P AB07P AG02P AG04P AJ02P AL03P AL08P AM15P BA02H BA03H BA03P BA28H BA33P BA34H BA51H BC53H CA01 CA04 CA31 HA19 HA33 HA55 HA61 JA50

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高分子担体上に一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ¹はＯＨまたはＮＲ³Ｒ⁴、Ｒ²はメチレン基１
   〜２０個分の長さを有するリンカー、Ｒ³およびＲ⁴は独
   立してＨまたは炭素数１〜４のアルキル基を示し、ｎは
   ０〜５までの整数を示す）で表される基が結合している
   ことを特徴とするマルトース結合蛋白質リガンド。
2. 【請求項２】 Ｒ²が式（II） 【化２】 （式中、Ｒ⁵は炭素数１〜１９のアルキレン基、Ｒ⁶は
   Ｏ、ＳあるいはＮＨを示し、Ｒ⁶を介して高分子担体と
   結合している）で表される基である請求項１に記載のマ
   ルトース結合蛋白質リガンド。
3. 【請求項３】 高分子担体がアクリルアミド類、メタク
   リルアミド類、アクリル酸類、メタクリル酸類、スチレ
   ン類、脂肪酸ビニルエステル類よりなる群から選択され
   るビニル化合物の重合体または共重合体あるいは多糖で
   ある請求項１または２に記載のマルトース結合蛋白質リ
   ガンド。
4. 【請求項４】 一般式（III） 【化３】 （式中、Ｒ⁷はＯＨまたはＮＲ¹⁰Ｒ¹¹、Ｒ⁸はメチレン基
   １〜１９個分の長さを有するリンカー、Ｒ⁹はＮＨ₂、Ｓ
   Ｈ、ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ₂、ＯＣＯＣ(ＣＨ₃)＝ＣＨ ₂、Ｎ
   ＨＣＯＣＨ＝ＣＨ₂またはＮＨＣＯＣ(ＣＨ₃)＝ＣＨ₂、
   Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は独立してＨまたは炭素数１〜４のアル
   キル基を示し、ｎは０〜５までの整数を示す）で表され
   ることを特徴とするマルトオリゴ糖誘導体。
5. 【請求項５】 Ｒ⁸が炭素数１〜１９のアルキレン基で
   ある請求項４に記載のマルトオリゴ糖誘導体。
6. 【請求項６】 Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨであるものを除く
   請求項４あるいは５に記載のマルトオリゴ糖誘導体およ
   び少なくとも１種類のビニル系単量体とを含むことを特
   徴とする共重合体からなるマルトース結合蛋白質リガン
   ド。
7. 【請求項７】 ビニル系単量体がアクリルアミド類、メ
   タクリルアミド類、アクリル酸類、メタクリル酸類、ス
   チレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群より選ば
   れる請求項６に記載のマルトース結合蛋白質リガンド。
8. 【請求項８】 架橋剤として少なくとも１種類の分子内
   に重合性ビニル基を２個以上有するビニル系単量体を含
   む共重合体からなる請求項６または７に記載のマルトー
   ス結合蛋白質リガンド。
9. 【請求項９】 架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリ
   ルアミド、メタクリル酸ビニル、ジメタクリル酸エチレ
   ングリコール、ジビニルベンゼンからなる群より選ばれ
   る請求項８に記載のマルトース結合蛋白質リガンド。
10. 【請求項１０】 Ｒ⁹がＮＨ₂またはＳＨであるものを除
    く請求項４あるいは５に記載のマルトオリゴ糖誘導体と
    少なくとも１種類のビニル系単量体の共重合比が１：１
    ０〜１０００００である共重合体からなる請求項６〜９
    のいずれかに記載のマルトース結合蛋白質リガンド。
11. 【請求項１１】 架橋剤の割合が０．１〜２０％である
    共重合体からなる請求項８〜１０のいずれかに記載のマ
    ルトース結合蛋白質リガンド。
12. 【請求項１２】 請求項１〜３または６〜１１のいずれ
    かに記載のマルトース結合蛋白質リガンドにマルトース
    結合蛋白質と酵素との融合蛋白質が結合されていること
    を特徴とする固定化酵素。
13. 【請求項１３】 酵素が糖転移酵素である請求項１２に
    記載の固定化酵素。
14. 【請求項１４】 糖転移酵素がβ１，４−ガラクトース
    転移酵素である請求項１３に記載の固定化酵素。