JP3991240B2 - スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーおよびその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はセリン誘導体の配糖体モノマー、該モノマーから製造されるスフィンゴ糖脂質製造に有用な高分子プライマーおよびこれらの製造法、ならびにスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーを使用したスフィンゴ糖脂質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖は核酸や蛋白質と並んで生体を構成する主要な成分であるが、核酸や蛋白質と比べ、その構造あるいは機能はあまりよく理解されていない。糖は通常、糖鎖と呼ばれる重合体を形成し、さらに、それらが蛋白質や脂質と結合して糖蛋白質、糖脂質あるいはプロテオグリカンと総称される極めて複雑な複合分子を形成している。さらに、核酸あるいは蛋白質がその構成単位であるヌクレオチドあるいはアミノ酸が直線的に結合した高分子であるのに対して、糖鎖は分子内に複数の分岐点があるばかりでなく、その構成単位である単糖の結合様式も多様であるため、その構造は核酸や蛋白質と比較にならないほど複雑である。これら構造の複雑さが研究の遅れの大きな原因の一つである。
【０００３】
しかし、細胞認識、免疫、分化、受精、老化、ガン化などに関与することが最近、徐々にわかってくるにつれて、非常に注目される研究分野となってきた。このような現状より、天然の構造を有する糖鎖や新規な糖鎖を合成する試みが盛んになされている。核酸や蛋白質については自動合成技術が確立されており、このことによりこの分野の研究が著しく進歩したことは誰もが認めるところであり、糖鎖についてもその自動合成技術の確立は切望されている。
【０００４】
これまでに自動合成を試みたいくつかの報告があり、その手法は大きく分けて２つある。１つは化学合成によるものであるが、糖残基と糖残基を立体選択的に結合させる方法が十分確立されておらず、さらに保護基を結合させたり、あるいは脱離させたりと工程が煩雑であるという問題がある。もう１つは酵素合成によるものであり、保護基を必要とせず、また糖残基と糖残基を立体選択的に結合させることができるので化学合成に比べ、非常に有利である。C.-H. Wongらはアミノ化シリカに下記式１５の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用い、糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用し、伸長させた糖鎖を切り出す方法を報告しているが(J. Am. Chem. Soc., 116, 1136 (1994)) 、得られるオリゴ糖鎖は糖ペプチドであり、スフィンゴ糖脂質を得ることはできない。
【０００５】
【化１５】
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を示す）
【０００６】
これ以外にもU. Zehavi ら(Reactive Polymers, 22, 171 (1994)) あるいはM. Meldal(J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1849 (1994))らも糖転移酵素を利用した方法を報告しているが、いずれも得られるのはオリゴ糖あるいは糖ペプチドであり、スフィンゴ糖脂質を得ることはできない。スフィンゴ糖脂質合成用のプライマーやプライマーを利用したスフィンゴ糖脂質の製造方法は未だ知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、スフィンゴ糖脂質合成に利用できるプライマーおよび該プライマーを利用したスフィンゴ糖脂質の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、新規なスフィンゴ糖脂質合成用プライマーを合成し、これに適当な糖ヌクレオチド類の共存下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチド類より該プライマーに糖残基を転移させ、適当な回数この糖転移反応を繰り返した後、必要に応じて副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類などを除去し、セラミド共存下、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素と反応させ、糖鎖の伸長した該プライマーよりオリゴ糖残基をセラミドに転移させることにより、前記問題点を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は高分子担体上に一般式（Ｉ）で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーである。
【００１０】
【化１６】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。）
【００１１】
また、本発明は高分子担体上に、一般式(II)で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーである。
【００１２】
【化１７】
（式中、Ｒ1 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基、Ｒ2 は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。）
【００１３】
また、本発明はアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(III) で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(III) で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーである。
【００１４】
【化１８】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 はＨまたはメチル基を示す。）
【００１５】
また、本発明はアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(IV)で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(IV)で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーである。
【００１６】
【化１９】
（式中、Ｒ1 、炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 はＨまたはメチル基を示す。）
【００１７】
また、本発明は一般式(V)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーである。
【００１８】
【化２０】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００１９】
また、本発明は一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーである。
【００２０】
【化２１】
（式中、Ｒ1 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００２１】
また、本発明は一般式(VII) で表される活性化オリゴ糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにオリゴ糖部分の保護基を除去することにより、一般式(V) で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーを製造方法である。
【００２２】
【化２２】
（式中、Ｒ5 およびＲ6 はそれぞれ独立してアシル型保護基、エーテル型保護基または水酸基を前記保護基で保護した単糖残基あるいは水酸基を前記保護基で保護したオリゴ糖残基を示し、Ｒ7 、Ｒ8 、Ｒ9 、Ｒ10およびＲ11はそれぞれ独立してアシル型保護基またはエーテル型保護基を示し、Ｘは活性化基を示す。）
【００２３】
【化２３】
（式中、Ｒ12は保護基を示し、Ｒ13は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示す。）
【００２４】
【化２４】
（式中、Ｒ14はＨまたはメチル基を示し、Ｙは水酸基、臭素原子または塩素原子を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００２５】
【化２５】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００２６】
また、本発明は一般式(X) で表される活性化糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらに活性化糖部分の保護基を除去することにより、一般式(VI)で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーを製造方法である。
【００２７】
【化２６】
（式中、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17およびＲ18はそれぞれ独立して、アシル型保護基またはエーテル型保護基を示し、Ｘは活性化基を示す。）
【００２８】
【化２７】
（式中、Ｒ12は保護基を示し、Ｒ13は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示す。）
【００２９】
【化２８】
（式中、Ｒ14はＨまたはメチル基を示し、Ｙは水酸基、臭素原子または塩素原子を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００３０】
【化２９】
（式中、Ｒ1 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００３１】
また、本発明は上記セリン誘導体の配糖体モノマーとアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドとを適当な触媒存在下、共重合させることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーの製造方法である。
【００３２】
本発明はスフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
および
（２）工程（１）で得た糖残基が転移したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、オリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程
を含むことをと特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法である。
【００３３】
さらに、本発明はスフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
（２）工程（１）を１回または２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、
（３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除
去する工程、
および
（４）工程（１）〜工程（３）を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含むことを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【００３４】
【発明の実施態様】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、高分子担体上に一般式(I) で表される基が結合しているものであり、式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。
【００３５】
Ｒ1 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基またはα−シアル酸残基などが例示され、Ｒ2 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などが例示される。ここでいうシアル酸はノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸などが含まれる。
【００３６】
Ｒ1 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→などが例示される。
【００３７】
Ｒ2 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→などが例示される。
式中、Ｆｕｃはフコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｓｉａはシアル酸残基を示す。
【００３８】
Ｒ3 の炭素数６〜２０のアルキル基としては、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基などが例示され、アルケニル基としては、シス−９−オクタデセニル基などが例示される。
【００３９】
Ｒ4 の炭素数５〜１９のアルキレン基としては、ペンチレン基、ヘプチレン基、ノニレン基、ヘプタデシレン基などが例示される。
【００４０】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用プライマー高分子としては、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は任意に組み合わせることができる。
一般式(I) で表される基は、例えば、以下の式で表される基などが挙げられる。
【００４１】
【化３０】
【００４２】
【化３１】
【００４３】
【化３２】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【００４４】
【化３３】
【００４５】
本発明の高分子担体上に一般式(II)で表される基が結合しているスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、式中、Ｒ1 は一般式（Ｉ）のＲ3 と同じ基であり、炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 は一般式（Ｉ）のＲ4 と同じ基であり、炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。
【００４６】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーとしては、Ｒ1 およびＲ2 は任意に組み合わせることができる。
【００４７】
本発明で利用できる高分子担体は、一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基を結合させることができ、かつ、結合後、以下で述べるような糖転移酵素の作用により一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基の糖残基、例えばグルコース残基またはオリゴ糖残基に糖残基を転移させることができるものであれば、特に制限はなく、例えばアルキルアミノ化ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、アクリルアミドとメタクリルアミドの共重合体またはアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと他のビニル系モノマーとの共重合体、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の重合体あるいは共重合体、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの重合体あるいは共重合体などが挙げられ、また、これらポリマーは適当な架橋剤で架橋されていてもよい。他のビニル系モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼン、ビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸などが例示される。
ここでいう高分子担体は必ずしも水不溶性である必要はなく、水溶性であってもよい。一般的な分子量は約10,000〜約5,000,000 である。その形態は、水不溶性担体の場合、ビーズ状、繊維状、膜状、フィルム状などが挙げられる。
【００４８】
本発明の高分子担体上に一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基が結合しているスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基を有する重合性モノマーを重合させたり、または他の重合性モノマーと共重合させることにより得ることができる。
【００４９】
また、高分子担体の側鎖官能基と一般式(XI)あるいは(XII) で表されるセリン誘導体の配糖体を反応させることによっても得ることができる。また、ポリマーの側鎖官能基と一般式(XI)あるいは(XII) との結合に際しては、必要に応じて適当なリンカーを用いてもよい。
【００５０】
側鎖官能基を有する高分子担体としては、アルキルアミノ化ガラス、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの重合体あるいは共重合体、アクリル酸の重合体あるいは重合体あるいは共重合体、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の共重合体などが挙げられる。
【００５１】
【化３４】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。Ｘはアミノ基、チオール基、カルボキシル基またはそれらの塩などの官能基を示す。）
【００５２】
【化３５】
（式中、Ｒ1 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。Ｘはアミノ基、チオール基、カルボキシル基またはそれらの塩などの官能基を示す。）
前者の方法をアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(III) で表される残基から構成されるビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーを例に、詳しく説明する。ここで、一般式(III) で表される残基は全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％である。
【００５３】
【化３６】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 はＨまたはメチル基を示す。）
【００５４】
一般式(III) で表される残基を含むビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、通常、一般式(V)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーとアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウムなどのラジカル開始剤を触媒とし、共重合させることにより得られる。
【００５５】
【化３７】
（式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９を整数示す。）
【００５６】
一般式(V) で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーは、一般式(VII) で表される活性化オリゴ糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを適当な触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにオリゴ糖部分の保護基を除去することにより得られる。
【００５７】
【化３８】
（式中、Ｒ5 およびＲ6 はそれぞれ独立して、アシル型保護基、エーテル型保護基または水酸基を前記保護基で保護した単糖残基あるいは水酸基を前記保護基で保護したオリゴ糖残基を示し、Ｒ7 、Ｒ8 、Ｒ9 、Ｒ10およびＲ11はそれぞれ独立して、アシル型保護基またはエーテル型保護基を示し、Ｘは活性化基を示す。）
【００５８】
【化３９】
（式中、Ｒ12は保護基を示し、Ｒ13は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示す。）
【００５９】
【化４０】
（式中、Ｒ14はＨまたはメチル基を示し、Ｙは水酸基、臭素原子または塩素原子を示し、ｎは５〜１９を整数を示す。）
【００６０】
一般式(VII) において、アシル型保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基などが例示される。エーテル型保護基としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基などが例示される。
【００６１】
一般式(VII) において、水酸基を前記保護基で保護した単糖残基とは、下記Ｒ1 およびＲ2 の単糖残基またはオリゴ糖残基の水酸基に上記保護基が結合したものである。
【００６２】
Ｒ1 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、α−シアル酸残基などが例示され、Ｒ2 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などが例示される。
【００６３】
Ｒ1 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→などが例示される。
【００６４】
Ｒ2 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→などが例示される。
式中、Ｆｕｃはフコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｓｉａはシアル酸残基を示す。
【００６５】
Ｘの活性化基としては、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、トリクロロアセトイミデート基などが挙げられる。
【００６６】
一般式(VII)で表される活性化オリゴ糖は、従来より行われている化学的な合成で得たものを利用することができる。例えば、２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド（下記式４１）、２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルトリクロロアセトイミデート（下記式４２）などが挙げられる。
【００６７】
【化４１】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【００６８】
【化４２】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【００６９】
一般式(VIII)で表されるセリン誘導体は、式中、Ｒ12は保護基を示し、Ｒ13は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示す。保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基などの基がある。
【００７０】
このようなセリン誘導体としては、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド（下記式４３、参考例１）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンラウリルアミド、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンステアリルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンオクチルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンラウリルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンステアリルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンオクチルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンラウリルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンステアリルアミドなどが例示される。
【００７１】
【化４３】
【００７２】
活性化オリゴ糖とセリン誘導体の縮合に用いることのできる触媒は、活性化基Ｘに応じて適宜選択すればよく、例えば活性化基が臭素（Ｂｒ）の場合は、通常、銀、水銀などの重金属塩、第４級アンモニウム塩などを用いることができ、フッ素（Ｆ）の場合は塩化スズ(II)と銀塩の組合せ、ジルコノセン錯体やハフノセン錯体、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルなどを、トリクロロアセトイミデート基の場合はＢＦ3 ＯＥｔ2 、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルなどを用いることができる。
【００７３】
また、この縮合反応は通常、無水条件下で行い、モレキュラシーブや無水硫酸カルシウム存在下で反応させることが多い。
【００７４】
溶媒としては、用いる基質（活性化オリゴ糖およびセリン誘導体）に応じて適宜選択すればよく、例えばジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、トルエン、ベンゼンなどの芳香族炭化水素、ジエチルエーテルなどがよく用いられる。
【００７５】
反応温度は活性化オリゴ糖の反応性により、通常、−７０℃〜１００℃前後であるが、反応に差し障りのない限り低温で行うのが望ましい。
【００７６】
セリン残基部分のアミノ基の保護基の除去方法は、保護基の種類により適宜選択され、例えばベンジルオキシカルボニル基の場合は水素化分解、ｔ−ブトキシカルボニル基の場合はＨＢｒ／酢酸やＨＦ処理で、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合はジエチルアミンなどの塩基処理で除去することができる。
【００７７】
一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体との縮合は、通常カルボジイミド類やＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの縮合試薬を用いることにより行うことができる。
【００７８】
【化４４】
（式中、Ｒ14はＨまたはメチル基を示し、Ｙは水酸基、臭素原子または塩素原子を示し、ｎは５〜１９の整数を示す。）
【００７９】
次に、オリゴ糖部分の保護基の除去も、除去したい保護基の種類に応じて、適宜、その脱離条件を選択すればよく、例えばアセチル基やベンゾイル基はメタノール中ナトリウムメトキシドで処理することにより、ベンジル基は水素化分解により、ｐ−メトキシベンジル基は水素化分解や２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノンあるいは硝酸セリウムアンモニウムなどの酸化剤で処理することにより、アリル基はカリウムｔ−ブトキシドまたはWilkinson 錯体でプロペニル基へ異性化させた後、酸、水銀塩もしくはヨウ素で処理することにより除去することができる。
【００８０】
得られたモノマーは通常、カラムクロマトグラフィーなどの精製方法により精製することができる。
【００８１】
一般式(IV)で表される残基を含むビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用プライマー高分子も上記方法と同様の方法により得ることができる。すなわち、上記方法で一般式(V) で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーの代わりに、一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーを用いることにより得ることができ、一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーは一般式(VIII)で表される活性化オリゴ糖の代わりに、一般式(X)で表される活性化糖を用いることにより得ることができる。
【００８２】
【化４５】
（式中、Ｒ1 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 はＨまたはメチル基を示し、ｎは５〜１９の整数である。）
【００８３】
【化４６】
（式中、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17およびＲ18はそれぞれ独立して、アシル型保護基またはエーテル型保護基を示し、Ｘは活性化基を示す。）
【００８４】
次に、後者の方法について、高分子担体がアルキルアミノ化ガラスの場合を例にとり説明する。上記の方法と同様にして、一般式(VIII)で表される活性化オリゴ糖あるいは一般式(X) で表される活性化糖と一般式(IX)で表されるセリン誘導体とを適当な触媒存在下、縮合させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去した後、一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体の代わりに一般式(XIII)で表される二塩基酸を同様の方法で縮合させる。
【００８５】
【化４７】
（式中、Ｒは炭素数４〜１８のアルキレン基を示す。）
【００８６】
縮合反応させた後、同様にオリゴ糖部分の保護基を除去し、水溶液中で化学量論的に等量の炭酸セシウムなどのセシウム塩と接触させ、遊離のカルボキシル基をセシウム塩とする。一方、アルキルアミノ化ガラスはモノヨード酢酸とカルボジイミド類やＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの縮合試薬を用いヨードアセトアミド化する。上記セシウム塩とヨードアセトアミド化したアルキルアミノ化ガラスとをジメチルホルムアミドなどの溶媒中で接触させることにより縮合させ、目的とする高分子プライマーを得ることができる。
【００８７】
本発明のスフィンゴ糖脂質を製造する方法は、（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程および（２）工程（１）で得た、糖残基が転移したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、オリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含む。
【００８８】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を製造する方法は、（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、（２）工程（１）を１回または２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、（３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類または未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および（４）工程（１）〜工程（３）を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含む。
【００８９】
糖ヌクレオチドより高分子プライマーへの糖の転移は、通常、高分子プライマーと糖ヌクレオチドとを含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜７２時間好ましくは２〜２４時間、糖転移酵素と接触させることにより行われる。
【００９０】
本発明で用いる糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として利用できるものであればよく、特に限定されない。このような酵素としてＬｅｌｏｉｒ経路の糖転移酵素類が挙げられ、例えばガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素などが挙げられる。本発明で用いる糖ヌクレオチド類は上記酵素が利用できるものであれば、特に限定されず、例えばウリジン−５’−ジリン酸−ガラクトース、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、グアノシン−５’−ジリン酸−フコース、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらのナトリウム塩などが挙げられる。
【００９１】
また、反応液中には必要に応じて金属塩を添加してもよい。添加できる金属イオンとしては、例えばマグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛などがあり、通常、塩化物などの形で添加することができる。
【００９２】
必要に応じて副生したヌクレオチド類または未反応の糖ヌクレオチド類を除去する方法は、高分子プライマーとヌクレオチドおよび糖ヌクレオチドとを分離できる方法であれば、特に限定されず、例えばゲルろ過クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００９３】
複数の糖酸基を転移させ、伸長させるには、例えば水不溶性担体の場合、まず上記のような糖転移酵素を作用させ、糖残基を１つ伸長させる。次いで、高分子プライマーを洗浄することにより、ヌクレオチドおよび糖ヌクレオチドを除く。これを繰り返すことにより、複数の糖残基を転移させ、伸長させることができる。
【００９４】
糖鎖が伸長した高分子プライマーから、オリゴ糖残基のセラミドへの転移は、通常、該高分子プライマーとセラミドとを界面活性剤を含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜７２時間、好ましくは２〜２４時間、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素と接触させることにより行われる。
【００９５】
本発明において用いるセラミドとしては、スフィンゴシンあるいはその誘導体に脂肪酸が酸アミド結合しているものであれば、特に制限はなく、製造するスフィンゴ糖脂質の目的にあったものを適宜選択すればよい。例えば、スフィンゴシン誘導体としてはジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシンなどが挙げられ、脂肪酸としては炭素数８〜２４の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、α−ヒドロキシ酸などが挙げられる。
【００９６】
例えば、Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン（下記化４８）、Ｎ−パルミトイルスフィンゴシン（下記化４９）、Ｎ−リグノセロイルスフィンゴシン、Ｎ−オレオイルスフィンゴシン、Ｎ−リノレオイルスフィンゴシン、Ｎ−アラキノイルスフィンゴシン、Ｎ−ステアロイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−パルミトイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−リグノセロイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−オレオイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−リノレオイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−アラキノイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン、Ｎ−パルミトイルフィトスフィンゴシンなどが挙げられる。
【００９７】
【化４８】
【００９８】
【化４９】
【００９９】
本発明において用いるスフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素とは、該作用を有するものであれば、特に制限はなく、「セラミドグリカナーゼ」あるいは「エンドグリコセラミダーゼ」として市販しているものを用いることができる。例えば、ヒル由来のセラミドグリカナーゼやロドコッカス属菌由来のエンドグリコセラミダーゼなどが挙げられる。
【０１００】
本発明において用いる界面活性剤としては、特に制限はないが、トリトンＣＦ−５４、トリトンＸ−１００などを挙げることができる。
【０１０１】
得られたスフィンゴ糖脂質は、各種カラムクラマトグラフィーなどの一般的な精製方法により分離精製することができる。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の糖脂質合成用高分子プライマーを利用することにより容易に任意のスフィンゴ糖脂質を得ることができ、スフィンゴ糖脂質の生理機能の解明に利用することができる。
【０１０３】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
参考例１
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリン１２ｇ（５０．２ｍｍｏｌｅ）をエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒１２０ｍｌに溶解させた後、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（以下、ＥＥＤＱと略する）１３．６ｇ（５５．０ｍｍｏｌｅ）およびオクチルアミン１１．１ｍｌ（５５．０ｍｍｏｌｅ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、トルエンから目的物を再結晶した。得られた結晶を乾燥し、目的物１２．６４ｇを得た。
【０１０５】
参考例２
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
よく乾燥させた参考例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇ（１１．４ｍｍｏｌｅ）をジクロロエタン８０ｍｌに溶解させ、活性化させたモレキュラーシーブ４Ａ８．０ｇと２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド１２．０ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホン酸銀４．４０ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を加え、徐々に室温に戻しながら、窒素気流下で一晩撹拌した。反応液をセライトでろ過し、ろ液を飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相、トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固し、目的物５．３２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１０６】
【化５０】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１０７】
参考例３
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドの合成
参考例２で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇをメタノール６０ｍｌに溶解させ、５％パラジウム−炭素を触媒とし、室温下常圧で接触水素化還元を行なった。反応後触媒をろ別し、反応液を減圧乾固し、目的物３．４２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１０８】
【化５１】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１０９】
参考例４
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
６−アクリロイルアミノカプロン酸２７８ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）とＥＥＤＱ３７１ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）をエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒４０ｍｌに加え、十分溶解させ、参考例３で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミド１．１４ｇ（１．３７ｍｍｏｌｅ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（移動相、クロロホルム：メタノール＝１００：１）により目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固し、目的物１．０６ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１１０】
【化５２】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１１１】
実施例１（セリン誘導体の配糖体モノマー）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
参考例４で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）をテトラヒドロフラン：メタノール＝１：１の混合溶媒に溶解させ、ナトリウムメトキシド８．４９ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌｅ）を加え、室温で２時間撹拌した。Ｈ+型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（ダウケミカル社製）を加えていき、中和した。ろ過によりイオン交換樹脂を除き、ろ液を減圧濃縮し、エタノールで再結晶し、目的物２７０ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１１２】
【化５３】
【０１１３】
実施例２（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体の合成
実施例１で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１５０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）とアクリルアミド６０．２５ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌｅ）をジメチルスルホキシド：水＝１：１の混合溶媒に溶解し、テトラエチレンジアミン１２．ｕｌ（８４ｕｍｏｌｅ）と過硫酸アンモニウム７．６７ｍｇ（３３．６ｕｍｏｌｅ）を加え、５０℃で一晩重合させた。目的物を蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーで精製した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物（分子量約500,000 ）２００ｍｇを得た。得られたポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を含有する。その含有量は２０モル％である。
【０１１４】
【化５４】
【０１１５】
実施例３（高分子プライマーへの糖転移反応）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
実施例２にて合成したＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体２２ｍｇ、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸１５ｍｇ、ウシ血清アルブミン４ｍｇ、塩化マンガン０．６４ｍｇ、仔ウシ由来アルカリフォスファターゼ２０単位、トリトンＣＦ−５４を１０ｕｌ含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに、ブタ肝臓由来のα２，３シアル酸転移酵素０．３単位を添加し、３７℃で３日間反応させた。目的物を蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーで精製した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物であるＮ−アセチルノイラミン酸が転移したポリマー２２ｍｇを得た。得られたポリマー中の１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１１６】
【化５５】
（式中、Ａｃは、アセチル基を示す。）
【０１１７】
実施例４（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たＮ−アセチルノイラミン酸が転移したポリマー２２ｍｇ、Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン５０ｍｇ、トリトンＣＦ−５４を２０ｕｌ含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに、ヒル由来セラミドグリカナーゼ０．０１単位を添加し、３７℃で１７時間反応させた。反応後クロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：５で平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラムを用いて、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンを分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固して、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン１３ｍｇを得た。該化合物は下記構造式を有する。
【０１１８】
【化５６】
（式中、Ａｃは、アセチル基を示す。）
【０１１９】
参考例５
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの合成
６−アクリロイルアミノカプロン酸２７８ｍｇの代わりにアジピン酸２１９ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例４と同様の方法で合成し、目的物０．８５ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１２０】
【化５７】
（式中、Ａｃは、アセチル基を示す。）
【０１２１】
参考例６
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇの代わりに、参考例５で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミド３８５ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）を用い、実施例１と同様の方法で合成し、目的物２６０ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１２２】
【化５８】
【０１２３】
参考例７
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドセシウム塩の合成
参考例６で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミド２００ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）を蒸留水１０ｍｌに溶かし、１Ｍ炭酸セシウム水溶液で液が中性になるまで加えた。。反応液を凍結乾燥させ、目的物２２８ｍｇを得た。
【０１２４】
参考例８
アルキルアミノ化ガラスのヨードアセチル化
long chain alkylamine controlled pore glass （シグマ社）１ｇとモノヨード酢酸５０ｍｇを水１０ｍｌ中に加え、ここに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩５５ｍｇを加え、２４時間室温で振とうした。振とう後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄した。得られたガラスビーズをよく乾燥させた後、ピリジン１０ｍｌを加え、さらに無水酢酸１ｍｌを振とうしながら滴下し、４時間反応させることにより、未反応のアミノ基をアセチル化した。反応後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄し、目的物１ｇを得た。ヨードアセチル化されたアルキルアミノ化ガラスは、下記モデル構造式を有する。
【０１２５】
【化５９】
【０１２６】
実施例５（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
ヨードアセチル化したアルキルアミノ化ガラスへのＯ−ラクトシル−Ｎ−（ω−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの結合
参考例８で得たヨードアセチル化したガラスビーズ１００ｍｇと参考例７で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドセシウム塩３２ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍｌに加え、室温で４８時間振とうした。振とう後、ジメチルホルムアミド、水、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタンの順でガラスビーズを洗浄し、目的物１２８ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドが結合したアルキルアミノ化ガラスは、下記モデル構造式を有する。
【０１２７】
【化６０】
【０１２８】
実施例６（高分子プライマーへの糖転移反応）
アルキルアミノ化ガラスを担体とする高分子プライマーへのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体２２ｍｇの代わりに、実施例５で得た、Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドが結合したアルキルアミノ化ガラスビーズ６０ｍｇを用い、実施例３と同様の反応を行った。反応後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄し、目的物６７ｍｇを得た。該Ｎ−アセチルノイラミン酸の転移した生成物は、下記モデル構造式を有する。
【０１２９】
【化６１】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１３０】
実施例７（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例６で得たガラスビーズ６７ｍｇを用いて、実施例４と同様の反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。
【０１３１】
参考例９
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド１２．０ｇの代わりに、２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチルグルコシルブロミド７．０７ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例２と同様の反応を行い、目的物３．５６ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３２】
【化６２】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１３３】
参考例１０
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミドの合成
２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇの代わりに、参考例９で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド３．０ｇを用い、参考例３と同様の反応を行い、目的物２．２１ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３４】
【化６３】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１３５】
実施例８（セリン誘導体の配糖体のモノマーの前駆体）
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミド１．１４ｇの代わりに、参考例１０で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミド０．７５ｇ（１．３７ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例４と同様の反応を行い、目的物０．７３ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３６】
【化６４】
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。）
【０１３７】
実施例９（セリン誘導体の配糖体モノマー）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリルアミド）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇの代わりに、実施例８で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリルアミド）カプロイルセリンオクチルアミド２８５ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）を用い、実施例１と同様の反応を行ない、目的物２０５ｍｇを得た。Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３８】
【化６５】
【０１３９】
実施例１０（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体の合成
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリルロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１５０ｍｇの代わりに、実施例９で得たＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１１５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）を用いて、実施例２と同様の反応を行い、目的物１６５ｍｇを得た。得られたポリマー中のＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１４０】
【化６６】
【０１４１】
実施例１１（プライマー高分子への糖転移反応）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのβ１，４ガラクトース転移酵素によるガラクトースの転移
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体１７ｍｇ、ウリジン−ジリン酸−ガラクトース・２ナトリウム塩１６ｍｇ、α−ラクトアルブミン０．５ｍｇ、塩化マンガン０．６４ｍｇ、仔ウシ由来アルカリフォスファターゼ２０ｕｎｉｔ、トリトンＣＦ−５４を１０ｕｌ含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍｌに、牛乳由来のβ１，４ガラクトース転移酵素１．０ｕｎｉｔを添加し、３７℃で３日間反応させた。実施例３と同様の方法で精製し、目的物を１７ｍｇ得た。該ポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１４２】
【化６７】
【０１４３】
実施例１２（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１１で得たポリマー１７ｍｇを用い、実施例４と同様の反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンは、下記構造式を有する。
【０１４４】
【化６８】
【０１４５】
実施例１３（高分子プライマーへの糖転移反応）
ガラクトースが転移したＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
実施例２で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１１で得たポリマー１７ｍｇを用い、実施例３と同様な反応を行い、目的物１８ｍｇを得た。得られたポリマー中の１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基の含有量は２０モル％であった。
【０１４６】
実施例１４（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１３で得たポリマー１８ｍｇを用い、実施例４と同様な反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。
【発明の属する技術分野】
本発明はセリン誘導体の配糖体モノマー、該モノマーから製造されるスフィンゴ糖脂質製造に有用な高分子プライマーおよびこれらの製造法、ならびにスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーを使用したスフィンゴ糖脂質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖は核酸や蛋白質と並んで生体を構成する主要な成分であるが、核酸や蛋白質と比べ、その構造あるいは機能はあまりよく理解されていない。糖は通常、糖鎖と呼ばれる重合体を形成し、さらに、それらが蛋白質や脂質と結合して糖蛋白質、糖脂質あるいはプロテオグリカンと総称される極めて複雑な複合分子を形成している。さらに、核酸あるいは蛋白質がその構成単位であるヌクレオチドあるいはアミノ酸が直線的に結合した高分子であるのに対して、糖鎖は分子内に複数の分岐点があるばかりでなく、その構成単位である単糖の結合様式も多様であるため、その構造は核酸や蛋白質と比較にならないほど複雑である。これら構造の複雑さが研究の遅れの大きな原因の一つである。
【０００３】
しかし、細胞認識、免疫、分化、受精、老化、ガン化などに関与することが最近、徐々にわかってくるにつれて、非常に注目される研究分野となってきた。このような現状より、天然の構造を有する糖鎖や新規な糖鎖を合成する試みが盛んになされている。核酸や蛋白質については自動合成技術が確立されており、このことによりこの分野の研究が著しく進歩したことは誰もが認めるところであり、糖鎖についてもその自動合成技術の確立は切望されている。
【０００４】
これまでに自動合成を試みたいくつかの報告があり、その手法は大きく分けて２つある。１つは化学合成によるものであるが、糖残基と糖残基を立体選択的に結合させる方法が十分確立されておらず、さらに保護基を結合させたり、あるいは脱離させたりと工程が煩雑であるという問題がある。もう１つは酵素合成によるものであり、保護基を必要とせず、また糖残基と糖残基を立体選択的に結合させることができるので化学合成に比べ、非常に有利である。C.-H. Wongらはアミノ化シリカに下記式１５の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用い、糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用し、伸長させた糖鎖を切り出す方法を報告しているが(J. Am. Chem. Soc., 116, 1136 (1994)) 、得られるオリゴ糖鎖は糖ペプチドであり、スフィンゴ糖脂質を得ることはできない。
【０００５】
【化１５】
【０００６】
これ以外にもU. Zehavi ら(Reactive Polymers, 22, 171 (1994)) あるいはM. Meldal(J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1849 (1994))らも糖転移酵素を利用した方法を報告しているが、いずれも得られるのはオリゴ糖あるいは糖ペプチドであり、スフィンゴ糖脂質を得ることはできない。スフィンゴ糖脂質合成用のプライマーやプライマーを利用したスフィンゴ糖脂質の製造方法は未だ知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、スフィンゴ糖脂質合成に利用できるプライマーおよび該プライマーを利用したスフィンゴ糖脂質の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、新規なスフィンゴ糖脂質合成用プライマーを合成し、これに適当な糖ヌクレオチド類の共存下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチド類より該プライマーに糖残基を転移させ、適当な回数この糖転移反応を繰り返した後、必要に応じて副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類などを除去し、セラミド共存下、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素と反応させ、糖鎖の伸長した該プライマーよりオリゴ糖残基をセラミドに転移させることにより、前記問題点を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は高分子担体上に一般式（Ｉ）で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーである。
【００１０】
【化１６】
【００１１】
また、本発明は高分子担体上に、一般式(II)で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーである。
【００１２】
【化１７】
【００１３】
また、本発明はアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(III) で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(III) で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーである。
【００１４】
【化１８】
【００１５】
また、本発明はアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(IV)で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(IV)で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーである。
【００１６】
【化１９】
【００１７】
また、本発明は一般式(V)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーである。
【００１８】
【化２０】
【００１９】
また、本発明は一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーである。
【００２０】
【化２１】
【００２１】
また、本発明は一般式(VII) で表される活性化オリゴ糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにオリゴ糖部分の保護基を除去することにより、一般式(V) で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーを製造方法である。
【００２２】
【化２２】
【００２３】
【化２３】
【００２４】
【化２４】
【００２５】
【化２５】
【００２６】
また、本発明は一般式(X) で表される活性化糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらに活性化糖部分の保護基を除去することにより、一般式(VI)で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーを製造方法である。
【００２７】
【化２６】
【００２８】
【化２７】
【００２９】
【化２８】
【００３０】
【化２９】
【００３１】
また、本発明は上記セリン誘導体の配糖体モノマーとアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドとを適当な触媒存在下、共重合させることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーの製造方法である。
【００３２】
本発明はスフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
および
（２）工程（１）で得た糖残基が転移したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、オリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程
を含むことをと特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法である。
【００３３】
さらに、本発明はスフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
（２）工程（１）を１回または２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、
（３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除
去する工程、
および
（４）工程（１）〜工程（３）を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含むことを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【００３４】
【発明の実施態様】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、高分子担体上に一般式(I) で表される基が結合しているものであり、式中、Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ3 は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ4 は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。
【００３５】
Ｒ1 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基またはα−シアル酸残基などが例示され、Ｒ2 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などが例示される。ここでいうシアル酸はノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸などが含まれる。
【００３６】
Ｒ1 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→などが例示される。
【００３７】
Ｒ2 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→などが例示される。
式中、Ｆｕｃはフコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｓｉａはシアル酸残基を示す。
【００３８】
Ｒ3 の炭素数６〜２０のアルキル基としては、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基などが例示され、アルケニル基としては、シス−９−オクタデセニル基などが例示される。
【００３９】
Ｒ4 の炭素数５〜１９のアルキレン基としては、ペンチレン基、ヘプチレン基、ノニレン基、ヘプタデシレン基などが例示される。
【００４０】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用プライマー高分子としては、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は任意に組み合わせることができる。
一般式(I) で表される基は、例えば、以下の式で表される基などが挙げられる。
【００４１】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【００４４】
【化３３】
本発明の高分子担体上に一般式(II)で表される基が結合しているスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、式中、Ｒ1 は一般式（Ｉ）のＲ3 と同じ基であり、炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ2 は一般式（Ｉ）のＲ4 と同じ基であり、炭素数５〜１９のアルキレン基を示す。
【００４６】
本発明のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーとしては、Ｒ1 およびＲ2 は任意に組み合わせることができる。
【００４７】
本発明で利用できる高分子担体は、一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基を結合させることができ、かつ、結合後、以下で述べるような糖転移酵素の作用により一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基の糖残基、例えばグルコース残基またはオリゴ糖残基に糖残基を転移させることができるものであれば、特に制限はなく、例えばアルキルアミノ化ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、アクリルアミドとメタクリルアミドの共重合体またはアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと他のビニル系モノマーとの共重合体、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の重合体あるいは共重合体、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの重合体あるいは共重合体などが挙げられ、また、これらポリマーは適当な架橋剤で架橋されていてもよい。他のビニル系モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼン、ビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸などが例示される。
ここでいう高分子担体は必ずしも水不溶性である必要はなく、水溶性であってもよい。一般的な分子量は約10,000〜約5,000,000 である。その形態は、水不溶性担体の場合、ビーズ状、繊維状、膜状、フィルム状などが挙げられる。
【００４８】
本発明の高分子担体上に一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基が結合しているスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、一般式（Ｉ）あるいは(II)で表される基を有する重合性モノマーを重合させたり、または他の重合性モノマーと共重合させることにより得ることができる。
【００４９】
また、高分子担体の側鎖官能基と一般式(XI)あるいは(XII) で表されるセリン誘導体の配糖体を反応させることによっても得ることができる。また、ポリマーの側鎖官能基と一般式(XI)あるいは(XII) との結合に際しては、必要に応じて適当なリンカーを用いてもよい。
【００５０】
側鎖官能基を有する高分子担体としては、アルキルアミノ化ガラス、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドの重合体あるいは共重合体、アクリル酸の重合体あるいは重合体あるいは共重合体、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の共重合体などが挙げられる。
【００５１】
【化３４】
【００５２】
【化３５】
前者の方法をアクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(III) で表される残基から構成されるビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーを例に、詳しく説明する。ここで、一般式(III) で表される残基は全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％である。
【００５３】
【化３６】
【００５４】
一般式(III) で表される残基を含むビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーは、通常、一般式(V)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーとアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウムなどのラジカル開始剤を触媒とし、共重合させることにより得られる。
【００５５】
【化３７】
【００５６】
一般式(V) で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーは、一般式(VII) で表される活性化オリゴ糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを適当な触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにオリゴ糖部分の保護基を除去することにより得られる。
【００５７】
【化３８】
【００５８】
【化３９】
【００５９】
【化４０】
【００６０】
一般式(VII) において、アシル型保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基などが例示される。エーテル型保護基としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基などが例示される。
【００６１】
一般式(VII) において、水酸基を前記保護基で保護した単糖残基とは、下記Ｒ1 およびＲ2 の単糖残基またはオリゴ糖残基の水酸基に上記保護基が結合したものである。
【００６２】
Ｒ1 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルグルコサミン残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、α−シアル酸残基などが例示され、Ｒ2 の単糖残基としては、αおよびβ−ガラクトース残基、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などが例示される。
【００６３】
Ｒ1 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→６Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→などが例示される。
【００６４】
Ｒ2 のオリゴ糖残基としては、例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３Ｇａｌα１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、Ｓｉａα２→８Ｓｉａα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→、ＧａｌＮＡｃα１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→などが例示される。
式中、Ｆｕｃはフコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｓｉａはシアル酸残基を示す。
【００６５】
Ｘの活性化基としては、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、トリクロロアセトイミデート基などが挙げられる。
【００６６】
一般式(VII)で表される活性化オリゴ糖は、従来より行われている化学的な合成で得たものを利用することができる。例えば、２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド（下記式４１）、２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルトリクロロアセトイミデート（下記式４２）などが挙げられる。
【００６７】
【化４１】
【００６８】
【化４２】
【００６９】
一般式(VIII)で表されるセリン誘導体は、式中、Ｒ12は保護基を示し、Ｒ13は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示す。保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基などの基がある。
【００７０】
このようなセリン誘導体としては、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド（下記式４３、参考例１）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンラウリルアミド、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンステアリルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンオクチルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンラウリルアミド、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルセリンステアリルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンオクチルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンラウリルアミド、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）セリンステアリルアミドなどが例示される。
【００７１】
【化４３】
活性化オリゴ糖とセリン誘導体の縮合に用いることのできる触媒は、活性化基Ｘに応じて適宜選択すればよく、例えば活性化基が臭素（Ｂｒ）の場合は、通常、銀、水銀などの重金属塩、第４級アンモニウム塩などを用いることができ、フッ素（Ｆ）の場合は塩化スズ(II)と銀塩の組合せ、ジルコノセン錯体やハフノセン錯体、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルなどを、トリクロロアセトイミデート基の場合はＢＦ3 ＯＥｔ2 、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルなどを用いることができる。
【００７３】
また、この縮合反応は通常、無水条件下で行い、モレキュラシーブや無水硫酸カルシウム存在下で反応させることが多い。
【００７４】
溶媒としては、用いる基質（活性化オリゴ糖およびセリン誘導体）に応じて適宜選択すればよく、例えばジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、トルエン、ベンゼンなどの芳香族炭化水素、ジエチルエーテルなどがよく用いられる。
【００７５】
反応温度は活性化オリゴ糖の反応性により、通常、−７０℃〜１００℃前後であるが、反応に差し障りのない限り低温で行うのが望ましい。
【００７６】
セリン残基部分のアミノ基の保護基の除去方法は、保護基の種類により適宜選択され、例えばベンジルオキシカルボニル基の場合は水素化分解、ｔ−ブトキシカルボニル基の場合はＨＢｒ／酢酸やＨＦ処理で、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合はジエチルアミンなどの塩基処理で除去することができる。
【００７７】
一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体との縮合は、通常カルボジイミド類やＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの縮合試薬を用いることにより行うことができる。
【００７８】
【化４４】
【００７９】
次に、オリゴ糖部分の保護基の除去も、除去したい保護基の種類に応じて、適宜、その脱離条件を選択すればよく、例えばアセチル基やベンゾイル基はメタノール中ナトリウムメトキシドで処理することにより、ベンジル基は水素化分解により、ｐ−メトキシベンジル基は水素化分解や２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノンあるいは硝酸セリウムアンモニウムなどの酸化剤で処理することにより、アリル基はカリウムｔ−ブトキシドまたはWilkinson 錯体でプロペニル基へ異性化させた後、酸、水銀塩もしくはヨウ素で処理することにより除去することができる。
【００８０】
得られたモノマーは通常、カラムクロマトグラフィーなどの精製方法により精製することができる。
【００８１】
一般式(IV)で表される残基を含むビニル系共重合体であるスフィンゴ糖脂質合成用プライマー高分子も上記方法と同様の方法により得ることができる。すなわち、上記方法で一般式(V) で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーの代わりに、一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーを用いることにより得ることができ、一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマーは一般式(VIII)で表される活性化オリゴ糖の代わりに、一般式(X)で表される活性化糖を用いることにより得ることができる。
【００８２】
【化４５】
【００８３】
【化４６】
【００８４】
次に、後者の方法について、高分子担体がアルキルアミノ化ガラスの場合を例にとり説明する。上記の方法と同様にして、一般式(VIII)で表される活性化オリゴ糖あるいは一般式(X) で表される活性化糖と一般式(IX)で表されるセリン誘導体とを適当な触媒存在下、縮合させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去した後、一般式(IX)で表されるアクリルアミドあるいはメタクリルアミド誘導体の代わりに一般式(XIII)で表される二塩基酸を同様の方法で縮合させる。
【００８５】
【化４７】
【００８６】
縮合反応させた後、同様にオリゴ糖部分の保護基を除去し、水溶液中で化学量論的に等量の炭酸セシウムなどのセシウム塩と接触させ、遊離のカルボキシル基をセシウム塩とする。一方、アルキルアミノ化ガラスはモノヨード酢酸とカルボジイミド類やＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの縮合試薬を用いヨードアセトアミド化する。上記セシウム塩とヨードアセトアミド化したアルキルアミノ化ガラスとをジメチルホルムアミドなどの溶媒中で接触させることにより縮合させ、目的とする高分子プライマーを得ることができる。
【００８７】
本発明のスフィンゴ糖脂質を製造する方法は、（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程および（２）工程（１）で得た、糖残基が転移したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、オリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含む。
【００８８】
また、本発明のスフィンゴ糖脂質を製造する方法は、（１）上記スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下、糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、（２）工程（１）を１回または２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、（３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類または未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および（４）工程（１）〜工程（３）を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程を含む。
【００８９】
糖ヌクレオチドより高分子プライマーへの糖の転移は、通常、高分子プライマーと糖ヌクレオチドとを含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜７２時間好ましくは２〜２４時間、糖転移酵素と接触させることにより行われる。
【００９０】
本発明で用いる糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として利用できるものであればよく、特に限定されない。このような酵素としてＬｅｌｏｉｒ経路の糖転移酵素類が挙げられ、例えばガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素などが挙げられる。本発明で用いる糖ヌクレオチド類は上記酵素が利用できるものであれば、特に限定されず、例えばウリジン−５’−ジリン酸−ガラクトース、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、グアノシン−５’−ジリン酸−フコース、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらのナトリウム塩などが挙げられる。
【００９１】
また、反応液中には必要に応じて金属塩を添加してもよい。添加できる金属イオンとしては、例えばマグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛などがあり、通常、塩化物などの形で添加することができる。
【００９２】
必要に応じて副生したヌクレオチド類または未反応の糖ヌクレオチド類を除去する方法は、高分子プライマーとヌクレオチドおよび糖ヌクレオチドとを分離できる方法であれば、特に限定されず、例えばゲルろ過クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００９３】
複数の糖酸基を転移させ、伸長させるには、例えば水不溶性担体の場合、まず上記のような糖転移酵素を作用させ、糖残基を１つ伸長させる。次いで、高分子プライマーを洗浄することにより、ヌクレオチドおよび糖ヌクレオチドを除く。これを繰り返すことにより、複数の糖残基を転移させ、伸長させることができる。
【００９４】
糖鎖が伸長した高分子プライマーから、オリゴ糖残基のセラミドへの転移は、通常、該高分子プライマーとセラミドとを界面活性剤を含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜７２時間、好ましくは２〜２４時間、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素と接触させることにより行われる。
【００９５】
本発明において用いるセラミドとしては、スフィンゴシンあるいはその誘導体に脂肪酸が酸アミド結合しているものであれば、特に制限はなく、製造するスフィンゴ糖脂質の目的にあったものを適宜選択すればよい。例えば、スフィンゴシン誘導体としてはジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシンなどが挙げられ、脂肪酸としては炭素数８〜２４の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、α−ヒドロキシ酸などが挙げられる。
【００９６】
例えば、Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン（下記化４８）、Ｎ−パルミトイルスフィンゴシン（下記化４９）、Ｎ−リグノセロイルスフィンゴシン、Ｎ−オレオイルスフィンゴシン、Ｎ−リノレオイルスフィンゴシン、Ｎ−アラキノイルスフィンゴシン、Ｎ−ステアロイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−パルミトイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−リグノセロイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−オレオイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−リノレオイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−アラキノイルジヒドロスフィンゴシン、Ｎ−ステアロイルフィトスフィンゴシン、Ｎ−パルミトイルフィトスフィンゴシンなどが挙げられる。
【００９７】
【化４８】
【化４９】
本発明において用いるスフィンゴ糖脂質のオリゴ糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する作用を有する酵素とは、該作用を有するものであれば、特に制限はなく、「セラミドグリカナーゼ」あるいは「エンドグリコセラミダーゼ」として市販しているものを用いることができる。例えば、ヒル由来のセラミドグリカナーゼやロドコッカス属菌由来のエンドグリコセラミダーゼなどが挙げられる。
【０１００】
本発明において用いる界面活性剤としては、特に制限はないが、トリトンＣＦ−５４、トリトンＸ−１００などを挙げることができる。
【０１０１】
得られたスフィンゴ糖脂質は、各種カラムクラマトグラフィーなどの一般的な精製方法により分離精製することができる。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の糖脂質合成用高分子プライマーを利用することにより容易に任意のスフィンゴ糖脂質を得ることができ、スフィンゴ糖脂質の生理機能の解明に利用することができる。
【０１０３】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
参考例１
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリン１２ｇ（５０．２ｍｍｏｌｅ）をエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒１２０ｍｌに溶解させた後、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（以下、ＥＥＤＱと略する）１３．６ｇ（５５．０ｍｍｏｌｅ）およびオクチルアミン１１．１ｍｌ（５５．０ｍｍｏｌｅ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、トルエンから目的物を再結晶した。得られた結晶を乾燥し、目的物１２．６４ｇを得た。
【０１０５】
参考例２
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
よく乾燥させた参考例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇ（１１．４ｍｍｏｌｅ）をジクロロエタン８０ｍｌに溶解させ、活性化させたモレキュラーシーブ４Ａ８．０ｇと２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド１２．０ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホン酸銀４．４０ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を加え、徐々に室温に戻しながら、窒素気流下で一晩撹拌した。反応液をセライトでろ過し、ろ液を飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相、トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固し、目的物５．３２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１０６】
【化５０】
【０１０７】
参考例３
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドの合成
参考例２で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇをメタノール６０ｍｌに溶解させ、５％パラジウム−炭素を触媒とし、室温下常圧で接触水素化還元を行なった。反応後触媒をろ別し、反応液を減圧乾固し、目的物３．４２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１０８】
【化５１】
【０１０９】
参考例４
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
６−アクリロイルアミノカプロン酸２７８ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）とＥＥＤＱ３７１ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）をエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒４０ｍｌに加え、十分溶解させ、参考例３で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミド１．１４ｇ（１．３７ｍｍｏｌｅ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（移動相、クロロホルム：メタノール＝１００：１）により目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固し、目的物１．０６ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１１０】
【化５２】
【０１１１】
実施例１（セリン誘導体の配糖体モノマー）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
参考例４で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）をテトラヒドロフラン：メタノール＝１：１の混合溶媒に溶解させ、ナトリウムメトキシド８．４９ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌｅ）を加え、室温で２時間撹拌した。Ｈ+型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（ダウケミカル社製）を加えていき、中和した。ろ過によりイオン交換樹脂を除き、ろ液を減圧濃縮し、エタノールで再結晶し、目的物２７０ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１１２】
【化５３】
実施例２（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体の合成
実施例１で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１５０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）とアクリルアミド６０．２５ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌｅ）をジメチルスルホキシド：水＝１：１の混合溶媒に溶解し、テトラエチレンジアミン１２．ｕｌ（８４ｕｍｏｌｅ）と過硫酸アンモニウム７．６７ｍｇ（３３．６ｕｍｏｌｅ）を加え、５０℃で一晩重合させた。目的物を蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーで精製した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物（分子量約500,000 ）２００ｍｇを得た。得られたポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を含有する。その含有量は２０モル％である。
【０１１４】
【化５４】
実施例３（高分子プライマーへの糖転移反応）
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
実施例２にて合成したＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体２２ｍｇ、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸１５ｍｇ、ウシ血清アルブミン４ｍｇ、塩化マンガン０．６４ｍｇ、仔ウシ由来アルカリフォスファターゼ２０単位、トリトンＣＦ−５４を１０ｕｌ含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに、ブタ肝臓由来のα２，３シアル酸転移酵素０．３単位を添加し、３７℃で３日間反応させた。目的物を蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーで精製した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物であるＮ−アセチルノイラミン酸が転移したポリマー２２ｍｇを得た。得られたポリマー中の１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１１６】
【化５５】
【０１１７】
実施例４（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たＮ−アセチルノイラミン酸が転移したポリマー２２ｍｇ、Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン５０ｍｇ、トリトンＣＦ−５４を２０ｕｌ含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに、ヒル由来セラミドグリカナーゼ０．０１単位を添加し、３７℃で１７時間反応させた。反応後クロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：５で平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラムを用いて、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンを分離した。目的物を含む溶出画分を減圧乾固して、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン１３ｍｇを得た。該化合物は下記構造式を有する。
【０１１８】
【化５６】
【０１１９】
参考例５
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの合成
６−アクリロイルアミノカプロン酸２７８ｍｇの代わりにアジピン酸２１９ｍｇ（１．５ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例４と同様の方法で合成し、目的物０．８５ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１２０】
【化５７】
【０１２１】
参考例６
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇの代わりに、参考例５で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミド３８５ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）を用い、実施例１と同様の方法で合成し、目的物２６０ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１２２】
【化５８】
参考例７
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドセシウム塩の合成
参考例６で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミド２００ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）を蒸留水１０ｍｌに溶かし、１Ｍ炭酸セシウム水溶液で液が中性になるまで加えた。。反応液を凍結乾燥させ、目的物２２８ｍｇを得た。
【０１２４】
参考例８
アルキルアミノ化ガラスのヨードアセチル化
long chain alkylamine controlled pore glass （シグマ社）１ｇとモノヨード酢酸５０ｍｇを水１０ｍｌ中に加え、ここに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩５５ｍｇを加え、２４時間室温で振とうした。振とう後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄した。得られたガラスビーズをよく乾燥させた後、ピリジン１０ｍｌを加え、さらに無水酢酸１ｍｌを振とうしながら滴下し、４時間反応させることにより、未反応のアミノ基をアセチル化した。反応後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄し、目的物１ｇを得た。ヨードアセチル化されたアルキルアミノ化ガラスは、下記モデル構造式を有する。
【０１２５】
【化５９】
実施例５（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
ヨードアセチル化したアルキルアミノ化ガラスへのＯ−ラクトシル−Ｎ−（ω−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドの結合
参考例８で得たヨードアセチル化したガラスビーズ１００ｍｇと参考例７で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドセシウム塩３２ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍｌに加え、室温で４８時間振とうした。振とう後、ジメチルホルムアミド、水、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタンの順でガラスビーズを洗浄し、目的物１２８ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドが結合したアルキルアミノ化ガラスは、下記モデル構造式を有する。
【０１２７】
【化６０】
実施例６（高分子プライマーへの糖転移反応）
アルキルアミノ化ガラスを担体とする高分子プライマーへのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体２２ｍｇの代わりに、実施例５で得た、Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（５−カルボキシ）ペンタノイルセリンオクチルアミドが結合したアルキルアミノ化ガラスビーズ６０ｍｇを用い、実施例３と同様の反応を行った。反応後、ガラスビーズを蒸留水でよく洗浄し、目的物６７ｍｇを得た。該Ｎ−アセチルノイラミン酸の転移した生成物は、下記モデル構造式を有する。
【０１２９】
【化６１】
【０１３０】
実施例７（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例６で得たガラスビーズ６７ｍｇを用いて、実施例４と同様の反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。
【０１３１】
参考例９
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシルブロミド１２．０ｇの代わりに、２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチルグルコシルブロミド７．０７ｇ（１７．２ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例２と同様の反応を行い、目的物３．５６ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３２】
【化６２】
【０１３３】
参考例１０
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミドの合成
２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチルラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇの代わりに、参考例９で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド３．０ｇを用い、参考例３と同様の反応を行い、目的物２．２１ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３４】
【化６３】
【０１３５】
実施例８（セリン誘導体の配糖体のモノマーの前駆体）
Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシルセリンオクチルアミド１．１４ｇの代わりに、参考例１０で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシルセリンオクチルアミド０．７５ｇ（１．３７ｍｍｏｌｅ）を用い、参考例４と同様の反応を行い、目的物０．７３ｇを得た。Ｏ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３６】
【化６４】
【０１３７】
実施例９（セリン誘導体の配糖体モノマー）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリルアミド）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−Ｏ−ヘプタアセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇの代わりに、実施例８で得たＯ−（２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル）グルコシル−Ｎ−（６−アクリルアミド）カプロイルセリンオクチルアミド２８５ｍｇ（０．４ｍｍｏｌｅ）を用い、実施例１と同様の反応を行ない、目的物２０５ｍｇを得た。Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
【０１３８】
【化６５】
実施例１０（スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体の合成
Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリルロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１５０ｍｇの代わりに、実施例９で得たＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド１１５ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌｅ）を用いて、実施例２と同様の反応を行い、目的物１６５ｍｇを得た。得られたポリマー中のＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１４０】
【化６６】
実施例１１（プライマー高分子への糖転移反応）
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのβ１，４ガラクトース転移酵素によるガラクトースの転移
Ｏ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体１７ｍｇ、ウリジン−ジリン酸−ガラクトース・２ナトリウム塩１６ｍｇ、α−ラクトアルブミン０．５ｍｇ、塩化マンガン０．６４ｍｇ、仔ウシ由来アルカリフォスファターゼ２０ｕｎｉｔ、トリトンＣＦ−５４を１０ｕｌ含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍｌに、牛乳由来のβ１，４ガラクトース転移酵素１．０ｕｎｉｔを添加し、３７℃で３日間反応させた。実施例３と同様の方法で精製し、目的物を１７ｍｇ得た。該ポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を有する。その含有量は２０モル％である。
【０１４２】
【化６７】
実施例１２（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１１で得たポリマー１７ｍｇを用い、実施例４と同様の反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。１−Ｏ−ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンは、下記構造式を有する。
【０１４４】
【化６８】
実施例１３（高分子プライマーへの糖転移反応）
ガラクトースが転移したＯ−グルコシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体へのα２，３シアル酸転移酵素によるＮ−アセチルノイラミン酸の転移
実施例２で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１１で得たポリマー１７ｍｇを用い、実施例３と同様な反応を行い、目的物１８ｍｇを得た。得られたポリマー中の１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基の含有量は２０モル％であった。
【０１４６】
実施例１４（スフィンゴ糖脂質）
１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンの合成
実施例３で得たポリマー２２ｍｇの代わりに、実施例１３で得たポリマー１８ｍｇを用い、実施例４と同様な反応を行った。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンが生成していることを確認した。
Claims (13)
- 高分子担体上に、一般式（Ｉ）で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー。
- 高分子担体が、アルキルアミノ化ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドまたはアクリルアミドとメタクリルアミドの共重合体またはアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと他のビニル系モノマーとの共重合体である請求項１記載のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー。
- 高分子担体上に、一般式(II)で表される基が結合していることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー。
- 高分子担体が、アルキルアミノ化ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドまたはアクリルアミドとメタクリルアミドの共重合体またはアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドと他のビニル系モノマーとの共重合体である請求項３記載のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマー。
- アクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(III) で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(III) で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマー。
- アクリルアミド残基および／またはメタクルアミド残基および一般式(IV)で表される残基から構成されるビニル系共重合体において、一般式(IV)で表される残基が全ビニル系共重合体中、５〜９５モル％であるスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマー。
- 一般式(V) で表されるセリン誘導体の配糖体モノマー。
- 一般式(VI)で表されるセリン誘導体の配糖体モノマー。
- 一般式(VII) で表される活性化オリゴ糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにオリゴ糖部分の保護基を除去することにより、一般式(V) で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーの製造方法。
- 一般式(X) で表される活性化糖と一般式(VIII)で表されるセリン誘導体とを触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式(IX)で表されるアクリルアミド誘導体あるいはメタクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらに糖部分の保護基を除去することにより、一般式(VI)で示されるセリン誘導体の配糖体モノマーを製造することを特徴とするセリン誘導体の配糖体モノマーの製造方法。
- 請求項７または請求項８記載のセリン誘導体の配糖体モノマーとアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドとを適当な触媒存在下、共重合させることを特徴とするスフィンゴ糖脂質合成用水溶性高分子プライマーの製造方法。
- スフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）請求項１〜６のいずれか１項記載のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
および
（２）工程（１）で得た糖残基が転移したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、オリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程
を含むことをと特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。 - スフィンゴ糖脂質を製造する方法であって
（１）請求項１〜６のいずれか１項記載のスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに糖ヌクレオチドの存在下に転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに転移させる工程、
（２）工程（１）を１回または２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、
（３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、
および
（４）工程（１）〜工程（３）を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長したスフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーに、セラミドの存在下、スフィンゴ糖脂質の糖とセラミドとの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を作用させ、該スフィンゴ糖脂質合成用高分子プライマーより、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程
を含むことを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。
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