JP5622346B2 - 神経細胞の細胞死抑制剤等 - Google Patents
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Description
NMDA:N−メチル−D−アスパラギン酸
AMPA:α−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソオキサゾールプロピオン酸
KA:カイニン酸
従来より、グルタミン酸及びアスパラギン酸等の興奮性アミノ酸によって、神経細胞のの細胞死が引き起こされることが知られており、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが興奮性アミノ酸による神経細胞の細胞死を抑制することについても知られている(非特許文献1等)。しかしながら、コンドロイチン硫酸Eが神経細胞の細胞死を抑制する効果については知られていない。
(1)二糖分析によって決定されるΔDi−diSEの含有率が30〜100%であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤。
(2)コンドロイチン硫酸Eを有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤。
(3)細胞死が、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死である、上記(1)又は(2)に記載の細胞死抑制剤。
(4)興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死が、下記群から選択される1又は2以上の物質によって惹起される細胞死である、上記(3)に記載の細胞死抑制剤;
NMDA、KA、AMPA、グルタミン酸、アスパラギン酸。
(5)細胞死がアポトーシスである、上記(1)〜(4)のいずれか1つに記載の細胞死抑制剤。
(6)神経細胞に上記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の細胞死抑制方法(以下、「本発明細胞死抑制方法」という)。
(7)神経細胞に上記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、細胞死耐性を獲得した神経細胞の製造方法(以下、「本発明神経細胞製造方法」という)。
(8)上記(7)に記載の製造方法によって製造される、細胞死耐性を獲得した神経細胞(以下、「本発明神経細胞」という)。
(9)神経細胞と、上記(1)〜(5)のいずれか1つに記載の細胞死抑制剤とを有効成分として少なくとも含む組成物(以下、「本発明組成物1」という)。
(10)二糖分析によって決定されるΔDi−diSEの含有率が30〜100%であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の保護剤。
(11)コンドロイチン硫酸Eを有効成分とする、神経細胞の保護剤。
(以下、上記(10)及び(11)をまとめて「本発明保護剤」ということがある。)
(12)神経細胞に上記(10)又は(11)に記載の保護剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の保護方法(以下、「本発明保護方法」という)。
(13)神経細胞と、上記(10)又は(11)に記載の保護剤とを有効成分として少なくとも含む組成物(以下、「本発明組成物2」という)。
<1> 本発明細胞死抑制剤
本発明細胞死抑制剤は、二糖分析によって決定されるΔDi−diSEの含有率が30〜100%であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の細胞死抑制剤を提供する。
上述のコンドロイチン硫酸E及び半合成コンドロイチン硫酸の調製方法/入手方法は例示のためのものであり、最終的に本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸が得られる限り、調製方法は特に限定されない。
製造例1:マイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eの製造
マイカより採取した軟骨240gを細断し、20分間煮沸した後、水240mlとアクチナーゼ(科研製薬株式会社製)2.4gで、pH7.5、55℃の条件下で一晩抽出した。この抽出液に炭酸ナトリウム1.2gを添加して、pH10.5、50℃の条件下で1時間攪拌した後、ろ過し、ろ液を200mlまでに濃縮した。この濃縮溶液を0.5N NaOH水溶液及び0.2%NaHSO3 水溶液により35℃で2時間アルカリ処理した後、エタノール200ml、エタノール+3%酢酸ナトリウム(pH4.8)200ml、エタノール+3%酢酸ナトリウム(pH4.8)240mlで3回分画し、その溶液を、レジンHPA−11M(三菱化成株式会社(現三菱化学株式会社)製)に吸着させた。塩化ナトリウム濃度を3.7M にしたときの溶出液を濃縮、ろ過し、純水に対して透析したものを200mlまで濃縮した。この濃縮溶液に活性炭0.5gを加え、pH4.8、50℃条件下で1時間攪拌した。その後、ろ過、精密ろ過を行い、4倍量のエタノールを加えて得た沈殿物を乾燥し、コンドロイチン硫酸Eロット1(マイカ軟骨由来)を得た。
製造例2:アカイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eの製造
製造例1と同様の方法で、アカイカより採取した軟骨から、コンドロイチン硫酸E(アカイカ軟骨由来)を調製した。
製造例3:アカイカ軟骨由来のガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸Eの製造
製造例2で調製したアカイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eのガラクトサミン残基の6位の特異的硫酸化を、後述する製造例4と同様に行い、ガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸E(アカイカ軟骨由来)を得た。
製造例4:チョウザメ脊索由来のガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸Aの製造
チョウザメ脊索由来のコンドロイチン硫酸A(平均分子量:1万、生化学工業株式会製)3gを水150mlに溶解し、6℃でDowex 50〔H+ 〕カラム(ダウケミカル製)でイオン交換した後、10%トリ−n−ブチルアミン/エタノールでpH5.0に調整し、ジエチルエーテル300mlで2回洗浄した。20℃で減圧下でエーテルを留去した後、水層を凍結乾燥し、さらに五酸化リン存在下に減圧乾燥してコンドロイチン硫酸Aのトリ−n−ブチルアミン塩を調製した。この塩をDMF300mlに溶解した後に、0℃でピリジン−SO3 複合体(アルドリッチ社製)7.5g/DMF100mlをゆっくり滴下し、1時間攪拌して硫酸化した。水100mlを添加して反応を止め、0.1N NaOH水溶液でpH9.0に調整した後、流水で透析し、40℃下、エバポレーターで濃縮し、イオン交換(SA−12A(三菱化学株式会社製):150ml及びPK−220(三菱化学株式会社製):150ml)に付した。1N NaOH水溶液で中和した後、40℃下、エバポレーターで濃縮し、5%になるように酢酸ナトリウムを加え、5倍量のエタノールを加えて得た沈殿物を乾燥し、ガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸A(チョウザメ脊索由来)を得た。
製造例5:クジラ軟骨由来のガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸Aの製造
クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸A(平均分子量:2万5千〜5万、生化学工業株式会社製)を上記製造例4と同様に処理し、ガラクトサミン6位硫酸化コンドロイチン硫酸Aロット1(クジラ軟骨由来)を得た。
以上に説明した様に、本発明細胞死抑制剤は、神経細胞に細胞死耐性を獲得させるために用いられる「耐性付与剤」、及び神経細胞の「細胞死予防剤」の概念をも包含する。
本発明細胞死抑制剤を当該神経細胞に接触させる方法は、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸の分子と神経細胞とが接触する条件である限りにおいて限定されない。接触を行う時間としては、好ましくは1〜48時間が例示され、より好ましくは3〜24時間が例示される。また接触を行う際の温度についても特に限定されないが、20℃〜40℃であることが好ましく、37℃であることがより好ましい。
当該試薬をインビトロで用いる場合、例えば神経細胞に細胞死耐性を獲得させる目的で、細胞死が誘発される前の神経細胞に接触させることにより用いることができる。この様にして得られる細胞死耐性を獲得した細胞は、神経細胞の細胞死が関連する疾患又は障害、好ましくは神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした移植のために用いられる神経細胞として、好適に用いることができる。このような疾患又は障害の具体例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳性麻痺等の周生期脳障害、脳梗塞、仮死、脳出血及び脳の物理的損傷に伴う疾患又は障害等が挙げられる。当該神経細胞及びその製造方法等については、後述する<3>本発明神経細胞製造方法及び<4>本発明神経細胞における説明を参照されたい。
本発明細胞死抑制剤は、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤型も特に限定されず、例えば注射剤(溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等)、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、坐剤等から広く選択することができる。
上述の「細胞死抑制作用を有する他の物質」は、本発明細胞死抑制剤の有効成分のコンドロイチン硫酸との組合せ配合又は組合せ投与により、重篤な副作用が惹起されない限りにおいて、また、一方の物質が他方の物質の本来有する細胞死抑制作用を阻害する物質ではない限りにおいて、特に限定されない。
<2> 本発明細胞死抑制方法
本発明細胞死抑制方法は、神経細胞に本発明細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の細胞死抑制方法である。
<3> 本発明神経細胞製造方法
本発明神経細胞製造方法は、神経細胞に本発明細胞死抑制剤を接触させるステップを少なくとも含む、細胞死耐性を獲得した神経細胞の製造方法である。
<4>本発明神経細胞
本発明神経細胞は、本発明神経細胞製造方法によって製造される、細胞死耐性を獲得した神経細胞である。
本発明神経細胞は、細胞死耐性を獲得した神経細胞であることから、例えば神経細胞の過剰な細胞死によって引き起こされる疾患又は障害の治療、改善、緩和又は予防等を目的とした移植用の細胞等として好適に用いることができる。
<5>本発明組成物1
本発明組成物1は、神経細胞と、本発明細胞死抑制剤とを有効成分として少なくとも含む組成物である。
<6>本発明保護剤
本発明は、二糖分析によって決定されるΔDi−diSEの含有率が30〜100%であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞の保護剤を提供する。
<7>本発明保護方法
本発明保護方法は、神経細胞に本発明保護剤を接触させるステップを少なくとも含む、神経細胞の保護方法である。
<8>本発明組成物2
本発明組成物2は、神経細胞と、本発明保護剤とを有効成分として少なくとも含む組成物である。
CS−A:コンドロイチン硫酸A
CS−B:コンドロイチン硫酸B
CS−C:コンドロイチン硫酸C
CS−D:コンドロイチン硫酸D
CS−E:コンドロイチン硫酸E
CS−A(クジラ軟骨由来、約25〜50kDa、生化学工業株式会社製):CS−A(25〜50kDa)
CS−B(ブタ皮由来、11〜25kDa、生化学工業株式会社製):CS−B(11〜25kDa)
CS−C(サメ軟骨由来、約40〜80kDa、生化学工業株式会社製):CS−C(40〜80kDa)
CS−D(サメヒレ由来、約30kDa、生化学工業株式会社製):CS−D(30kDa)
CS−E(イカ軟骨由来、約75kDa、生化学工業株式会社製):CS−E(75kDa)
CS−E(イカ軟骨由来、2糖、生化学工業株式会社製):CS−E(2糖)
CS−E(イカ軟骨由来、約3kDa、生化学工業株式会社製):CS−E(3kDa)
CS−E(イカ軟骨由来、約5kDa、生化学工業株式会社製):CS−E(5kDa)
CS−E(イカ軟骨由来、約12kDa、生化学工業株式会社製):CS−E(12kDa)
CS−E(イカ軟骨由来、約25kDa、生化学工業株式会社製):CS−E(25kDa)
なお、CS−E(2糖)、CS−E(3kDa)、CS−E(5kDa)、CS−E(12kDa)及びCS−E(25kDa)は、分子量が約75kDaのCS−Eを、羊睾丸ヒアルロニダーゼにより酵素分解することにより調製したものを使用した。
1 各種CSの神経細胞の細胞死抑制効果の検証
各種CSの、NMDAによって誘発される神経細胞の細胞死を抑制する効果について検証した。
1−1
ブルワー GJ(Brewer GJ)ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ、1993年、第35巻、第5号、p.567−576に記載の方法に従って、胎生16日齢ラット胎仔大脳皮質から単一細胞浮遊液を調製し、B−27添加物(インビトロジェン)を含むNeurobasal medium(神経細胞培養用基礎培地、インビトロジェン)を用いて37℃にて培養した。培養10〜14日目に各種CSを上記培地中で100μg/mlとなるように添加するか、又はコントロールとして上記培地を添加し、24時間後、上記の各培地にNMDAを加えて細胞死を誘発し、更に24時間培養した。細胞死の程度を、上記培養後の各培地中に存在するLDHの活性を、コー,J.Y.(Koh,J.Y.)ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・メソッズ、1987年、第20巻、第1号、p.83−90に記載の方法に従って測定し、評価した。また、生存細胞数を常法によって抗MAP2抗体を用いてMAP2の蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下200倍で観察した5視野分のMAP2陽性細胞をカウントすることにより測定した。
1−2 CS−E濃度の検討
CS−E(75kDa)の濃度を、それぞれ1、3、5、10、50、100 μg/mlと変化させることの他、上記1−1と同様の方法により、CS−Eで神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のLDH活性を測定した。
1−3 CS−Eを用いた処理を行うタイミングの検討
CS−E(75kDa)を用いた処理を行うタイミングを、培地にNMDAを添加する24時間前、3時間前、直前、又はNMDAを添加した直後と変化させることの他、上記1−1と同様の方法により、CS−Eによる神経細胞の処理、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のLDH活性を測定した。
1−4 CS−Eの分子量の検討
CS−E(75kDa)以外のCS−Eとして、CS−E(3kDa)、CS−E(5kDa)、CS−E(12kDa)、CS−E(25kDa)を用い、上記1−1と同様の方法により、CS−Eで神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のLDH活性を測定した。
2 カスパーゼ3活性の検証
CS−Eが有する神経細胞の細胞死の抑制効果とアポトーシスとの関連を、培地中のカスパーゼ3活性を測定することにより検証した。
3 KA又はAMPAによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
3−1 KAによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
細胞死の誘発に用いる興奮性アミノ酸を100、又は1000 μM/mlのKAに変え、さらに処理に用いるCS−Eの濃度をそれぞれ0、10、100 μg/mlと変化させることの他、上記実施例1と同様の方法により、CS−E(75kDa)で神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のLDH活性を測定した。
3−2 AMPAによって誘発される神経細胞の細胞死の抑制効果の検証
細胞死の誘発に用いる興奮性アミノ酸を100、500、又は1000 μM/mlのAMPAに変え、さらに処理に用いるCS−Eの濃度をそれぞれ0、10、100 μg/mlと変化させることの他、上記実施例1と同様の方法により、CS−E(75kDa)で神経細胞を処理した上で、細胞死の誘発、培養を行い、培地中のLDH活性を測定した。
4 NMDAcurrentに対する影響の検証
上記1−1と同様の方法により神経細胞を培養し、培養13日目にCS−E 100 μg/mlを投与し、24時間後(培養14日目)に神経細胞のNMDAに対する反応をパッチクランプ法で測定した。パッチ電極で細胞を-80mV〜+40mVに電位固定した後、NMDA 50μMを他のガラス管を用いて細胞近傍に微量投与し、細胞膜に流れる電流を測定した。結果を図10に示す。
Claims (5)
- 二糖分析によって決定されるΔDi−diSEの含有率が30〜100%であるコンドロイチン硫酸を有効成分とする、神経細胞のインビトロ用細胞死抑制試薬。
- コンドロイチン硫酸Eを有効成分とする、神経細胞のインビトロ用細胞死抑制試薬。
- 細胞死が、興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死である、請求項1又は2に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬。
- 興奮性アミノ酸受容体を介して惹起される細胞死が、下記群から選択される1又は2以上の物質によって惹起される細胞死である、請求項3に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬;
N−メチル−D−アスパラギン酸、カイニン酸、α−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソオキサゾールプロピオン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸。 - 細胞死がアポトーシスである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインビトロ用細胞死抑制試薬。
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