CN105924544B - 一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用。所述高硫酸化硫酸软骨素，分子量为100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖组成为：O‑unit，C‑unit，A‑unit，E‑unit。该高硫酸化硫酸软骨素是由美洲大赤鱿的软骨中提取出的富含E‑unit的硫酸软骨素，其具有特异二糖组成、糖链排列、分子量的DG‑CS。通过实验证明该高硫酸化硫酸软骨素具有很好的抗肿瘤转移活性。

Description

一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用，特别涉及一种巨型鱿鱼软骨来源天然新型高硫酸化硫酸软骨素的制备及其在抗肿瘤方面的应用，属于生物技术技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(简称CS)是一种酸性黏多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、鲨鱼骨、鱿鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子。其基本组成单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖通过β-1,3糖苷键连结而成的二糖(→4GlcUaβ1→3GalNAcβ1→)[1]。自然界中大多数的CS是以N-乙酰-D-氨基半乳糖的4位或6位发生硫酸化的形式存在的，我们分别称之为CS-A、CS-C。除了CS-A、CS-C外，根据D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸化模式不同还存在包括CS-O、CS-E、CS-D、CS-K等在内的多种异构体[2]。CS-A、CS-C、CS-O、CS-E的结构式如下所示：
值得一提的是CS-E是硫酸软骨素中的重要一员，其富含N-乙酰-D-氨基半乳糖C-4位和C-6位发生硫酸化的高硫酸化二糖单位(E-unit)，使其带有大量负电荷，形成特定的分子结构。这种特性更利于其与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞粘附分子、脂蛋白特异性结合，进而调节神经生长、生长因子信号转导、创伤愈合、感染、肿瘤细胞迁移以及肿瘤细胞增值等生理或病理过程[3]。从而在抗肿瘤细胞转移、促进神经突触生长、刺激软骨细胞合成II型胶原中发挥关键作用，对癌症、关节炎、神经痛等疾病有很好的预防、辅助治疗作用[4]。
癌症是导致全球死亡率的一个重要原因。癌症之所以是人类久攻不下的难题，与其自身的病症特性有很大的关系，其中最为棘手的是癌细胞可不断迁移并侵入正常组织形成新的转移灶。研究发现在这一过程中肿瘤细胞硫酸软骨素的含量、组成、分子大小及分子结构与相应的正常组织有明显差异。而这种差异是肿瘤细胞迁移、侵入正常组织的先决条件。所以根据肿瘤细胞的这一特性，硫酸软骨素的抗肿瘤研究已经成为国内外研究的热点。深入研究发现硫酸软骨素抗肿瘤活性对硫酸软骨素硫酸化模式、分子量等都有严格要求，其中E-unit的含量最为关键。商品化的CS-E的E-unit含量在60％左右，硫酸化度约1.5，分子量范围为50～140kDa，但是其价格昂贵，且生产工艺主要集中于日本。国内关于提取富含E-unit的硫酸软骨素的研究文献寥寥无几，仅有的报道中制备出的CS硫酸化度仅有0.5左右[5-7]。最重要的是制备这种CS-E的原料来自一种名为太平洋褶皱鱼(TodarodesPacificus)的小型鱿鱼，但是Todarodes Pacificus软骨含量很少无法形成大量生产，并且近年来随着海洋污染加剧Todarodes Pacificus渔获量逐年递减，价格上升。
中国专利文献CN1563098A(申请号200410006223.5)公开了一种制备硫酸软骨素的方法，该方法包括以下步骤：A.将卡拉胶分解为分子量为1-4万，优选2-3万的卡拉胶寡糖；B.将鱿鱼骨用15％到饱和的强碱液处理，然后用酸中和，收集胶体；C.将步骤A制得的卡拉胶寡糖、步骤B制得的胶体和氨基葡萄糖在酸性条件下反应，再纯化，获得硫酸软骨素。该方法采用强碱处理，从而导致获得的硫酸软骨素的硫酸化程度较低，而且引入的卡拉胶，不利于硫酸软骨素的纯化，导致硫酸软骨素纯度低，相关应用价值大幅下降。
因此寻找富含E-unit硫酸软骨素的新原料，不仅可以缓解太平洋褶皱鱼的生存压力更能拓宽富含E-unit硫酸软骨素原料来源。研究发现不同种属动物体内所存在的硫酸软骨素亚型的含量、种类各不相同，同一动物因年龄、组织部位的不同硫酸软骨素的种类、含量也在不断变化。这一发现为制备不同种类的硫酸软骨素提供了很好的理论基础。一般来说，在牛的喉骨、鸡软骨、鲸鱼软骨中CS-A含量最高，可达76.2-90％；鲨鱼翅软骨中CS-D的含量最为丰富，而在其它鲨鱼软骨中CS-C含量最高，可达72.9％；鱿鱼软骨来源CS中E-unit含量最高，可达60％。
美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)生长周期短、产量大、价格便宜，而软骨骨质硬无法食用，一般作为废料丢弃。对美洲大赤鱿的软骨进行研究利用，目前还未有相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用。该高硫酸化硫酸软骨素是由美洲大赤鱿的软骨中提取出的富含E-unit的硫酸软骨素，其具有特异二糖组成、糖链排列、分子量的DG-CS。通过实验证明该高硫酸化硫酸软骨素具有很好的抗肿瘤转移活性。
术语说明
O-unit是指：不发生硫酸化的硫酸软骨素(CS)二糖单位。
C-unit是指：N-乙酰-D-氨基半乳糖C-6位发生硫酸化的硫酸软骨素(CS)二糖单位。
A-unit是指：N-乙酰-D-氨基半乳糖C-4位发生硫酸化的硫酸软骨素(CS)二糖单位。
E-unit是指：N-乙酰-D-氨基半乳糖C-4位和C-6位发生硫酸化的硫酸软骨素(CS)二糖单位。
本发明的技术方案如下：
一种高硫酸化硫酸软骨素，分子量为100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：
根据本发明优选的，所述高硫酸化硫酸软骨素分子量为623.2KDa，硫酸化度在1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：
上述高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入有机溶剂进行脱水脱脂，干燥，制得脱脂软骨；
(2)向步骤(1)制得的脱脂软骨中加水浸没处理，固液分离，向沉淀中加入酶反应缓冲液，混合均匀，调pH 5.0～9.0，加入蛋白酶在40～70℃酶解反应24～96h，灭活酶，固液分离，取液体，制得酶解粗液；
所述蛋白酶黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶与其他蛋白酶的混合；蛋白酶的加入量为脱脂软骨干重的1‰～5‰，黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的质量百分含量为20～100％；
(3)将步骤(2)制得的酶解粗液经除蛋白后，调pH至7.0～10.0，然后加入酶解粗液质量百分比1～10％的NaAC固体，溶解，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到50％～85％，固液分离，取沉淀，制得初级多糖；
(4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，经阴离子交换树脂纯化，以0～2.5M氯化钠溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱峰，醇沉，固液分离，超滤，干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，有机溶剂为丙酮或无水乙醇，有机溶剂的加入量为沉淀体积的2～4倍；脱水脱脂的时间为4～24h，次数为2～4次。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，处理条件为：在60～100℃处理10～30min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，酶反应缓冲液为氯化钙硼酸缓冲液，氯化钙浓度为5～10mM，硼酸浓度为50～100mM，pH7.0～9.0。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，其他蛋白酶为链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶和/或胰蛋白酶混合酶；链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶为普通市售产品，如可购自Sigma公司。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，黑曲霉蛋白酶为普通市售产品，如可购自TCI公司。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，酶解反应过程中，还包括两次蛋白酶补加步骤，每次不加量均为上次加酶量的0.4～0.6倍，第一次补加时间为酶解反应6～24h，第二次补加时间为酶解反应12～48h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，灭活酶条件为沸水浴中静置5～20min。
根据本发明优选的，所述固液分离均为离心，条件为5000～10000rpm/min离心5～20min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，除蛋白的具体步骤如下：
按步骤(2)制得的酶解粗液体积的2～10％加入三氯乙酸(TCA)，离心，取上清液，加入乙醚抽提三氯乙酸，去除乙醚。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，阴离子交换树脂纯化的具体条件为初级多糖溶解于水中，浓度为10mg/ml，加入硫酸软骨素重量40～80％的阴离子交换树脂室温孵育0.5～2h，以0～2.5M氯化钠溶液浓度梯度洗脱分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，醇沉的乙醇体积浓度为50％～85％；超滤膜的截留分子量为10kDa以上；干燥温度为不超过80℃。
上述高硫酸化硫酸软骨素在制备抗肿瘤药物中的应用。
有益效果
1、本发明首次公开了美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)可以作为富含E-unit硫酸软骨素的原料来源制备高硫酸化硫酸软骨素。由于美洲大赤鱿生长周期短、产量大、价格便宜，而软骨骨质硬无法食用，一般作为废料丢弃，因此不仅可以极大的扩大硫酸软骨素的原料来源，而且可以变废为宝，减少环境污染；
2、本发明从美洲大赤鱿软骨中提取的高硫酸化硫酸软骨素，在二糖组成、分子量等方面与已知的CS-E显著不同。抗肿瘤实验表明，本发明所制备获得的美洲大赤鱿硫酸软骨素(简称DG-CS)，在体内其具有很强的抗肿瘤转移活性，在体外可以与多种生长因子相互作用，为研发新型抗肿瘤糖类药物提供了原料和理论基础；
3、本发明所述的高硫酸化硫酸软骨素的制备方法较传统制备方法，不需要碱处理步骤，反应条件温和、酶用量少、易形成工业化生产，制得的高硫酸化硫酸软骨素成本低，市场价值高，而且抗凝血活性低不会引发体内溶血等副作用，可用于医药研发、疾病治疗、科学研究等领域；
4、本发明所述制备方法制得的高硫酸化硫酸软骨素收率可以达18～20％，纯度可以达到95％以上。
附图说明
图1为质量浓度为1％的DG-CS经Nanodrop K5600分析200-800nm全波长扫描图。
图2为DG-CS经Chondroteinase B(Sigma)、Chondroteinase ABC(Sigma)、rHCLase、Hyaluronidase生物酶降解后经HPLC分析图谱。
图3为本发明制备的DG-CS分子量检测图谱。
图4为本发明制备的DG-CS经CSase ABC降解后二糖组成图谱。
图5为本发明制备的DG-CS素抗凝血、抗血栓活性的检测图谱。
图中：A为本发明制备的DG-CS与精品肝素(Hp)的抗FII活性，B为本发明制备的DG-CS与精品肝素(Hp)的抗FⅩa活性。
图6为本发明制备的硫酸软骨素抗肿瘤转移活性统计分析柱状图。
图7为本发明制备的硫酸软骨素与肿瘤相关生物大分子生长因子相互作用图谱。
图中：A：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),B：肝细胞生长因子(HGF)，C：选择素-L(SELL)，D：选择素-E(SELE)，E：选择素-P(SELP)。
具体实施方式
下面结合实施例进一步全面公开本发明如何实施的技术方案，这些实施例不能理解为是为了限制发明的应用范围。发明人已尽力保证实验中各种数据的准确性，但实验上的一些偏差在所难免。常规方法不再特殊说明。
生物原料来源
美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨购置于山东济南维尔康水产品批发市场；
实施例1
一种高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1kg美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入3倍体积无水乙醇脱水、脱脂24h，过滤，重复脱水、脱脂步骤3次，然后50℃烘干称重，制得脱脂软骨；
(2)向步骤(1)制得的脱脂软骨中加水浸没，100℃水浴处理30min，冷却到室温过滤，向沉淀中加入20倍体积氯化钙硼酸缓冲液(0.1M硼酸，10mM氯化钙，pH8.0)混匀，加入原料干重2‰的黑曲霉蛋白酶(购自TCI公司)，于60℃反应72h，每隔24h补加1次酶，加酶量依次递减为上次加酶量的0.5倍，共加2次，100℃灭酶活10min，8000rpm/min离心10min，取液体，制得酶解粗液；
(3)向步骤(2)制得的酶解粗液中按质量百分比为5％的比例加入TCA(三氯乙酸)，8000rpm/min离心10min去沉淀得上清，所得到的上清中加入等体积乙醚抽提残余TCA，搅拌吹气除去乙醚，加入NaOH调节pH至8.0；然后加入酶解粗液质量5％的NaAC固体，混匀，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到80％，8000rpm/min离心10min取沉淀，制得初级多糖；
(4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，浓度为10mg/ml，加入硫酸软骨素溶液重量60％的A98阴离子交换树脂(购自德国朗盛公司)室温孵育0.5h，以0.5M，1M，2M氯化钠溶液分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰，2M氯化钠洗脱液合并醇沉，用孔径为10kDa超滤膜超滤脱盐，35℃干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
实施例2、DG-CS的纯度分析
2.1蛋白和糖胺聚糖含量分析
利用咔唑反应、BCA蛋白测定试剂盒、全波长扫描等技术手段检测制备得到的DG-CS纯度，发现样品中蛋白含量低于2％，在280nm附近蛋白吸收峰极小，如图1所示；由咔唑反应测得糖胺聚糖含量在97％以上，回收率为20％。
2.2其它糖胺聚糖含量分析
众所周知，利用生物酶底物专一性等性质可以确定多糖样品种类。硫酸软骨素裂解酶Chondroteinase ABC主要降解硫酸软骨素，硫酸皮肤素裂解酶Chondroteinase B可专一性降解硫酸皮肤素(DS)，由中国专利文献CN103923899A(专利号201410160095.3)公开的糖胺聚糖裂解酶rHCLase可降解硫酸软骨素(CS)和透明质酸(HA)，Hyaluronidase来源于Streptomyces Hyalurolyticus专一降解HA。为了进一步确定所制备的美洲大赤鱿硫酸软骨素的纯度，我们利用Chondroteinase B(购自Sigma公司)、Chondroteinase ABC(购自Sigma公司)、Hyaluronidase(购自Sigma公司)、rHCLase等酶在各自最适反应条件下处理样品，然后进行HPLC分析。HPLC分析条件为凝胶柱：SuperdexTM peptide 10/300GL；流动相：0.2M NH4HCO3；流速：0.4mL/min；检测条件：岛津紫外检测器(SPD-20A)检测结果如图2所示。
分析发现所制备样品不能被Chondroteinase B、Hyaluronidase降解，但可被Chondroteinase ABC、rHCLase降解而产物无显著差异，证明样品为CS且不含DS、HA等糖胺聚糖。
实施例3DG-CS的分子量分析
平均分子量分别为11.6KD、48.6KD、147KD、273KD、409.8KD的葡聚糖标准和实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS(质量浓度1％)，分别取100μl进行HPLC分析。
HPLC分析条件为凝胶柱：UltrahydrogelTM 100 7.8×300mm(Water)；流动相：0.02M Na2HPO4，0.02M NaH2PO4，0.02％NaN3，pH 7.0；流速：0.6mL/min；检测条件：岛津示差检测器(RID-10A)。
结果如图3所示，根据图3可以计算出制备DG-CS平均分子量在623.2KD左右。
实施例4DG-CS的二糖组成分析
(1)多糖降解
将质量浓度为1％的实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS样品，与CSaseABC、5倍缓冲液(250mM Tris-HCl，250mM NaAC，PH 8.0)以及水按1：2：7(体积比)的比例混合后，共20μl，在最适温度和最适pH下反应2h条件下反应，离心浓缩仪上干燥。
(2)HPLC分析
二甲亚砜，冰醋酸，氰基硼氢化钠和2-氨基苯甲酰胺按质量比14：6：1：1混合，取5μl加入到以上的降解体系中，65℃反应2h，反应物用三氯甲烷抽提6次，干燥处理，用水溶解，取50μl进行HPLC分析。
检测器：岛津荧光检测器RF-20A，柱子：YMC-Pack polyamin II column(250×4.6mm ID)，流动相：1M NaH2PO4,16mM NaH2PO4，流速：1ml/min。
洗脱梯度如表1所示：
表1
结果如图4所示，由图4可以看出，经本发明制备的DG-CS主要由基本组成单位O-unit(GlcA-GalNAc)、C-unit(GlcA-GalNAc(6S))、A-unit(GlcA-GalNAc(4S))、E-unit(GlcA-GalNAc(4S,6S))组成。
以图4的结果，利用HPLC积分计算出DG-CS中各种基本组成单元所占的含量所示。以此为根据，进而计算出DG-CS硫酸化度在1.43以上，具有高硫酸化度的特点。实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与商品化CS-E二糖组成、硫酸化度、分子量比较如表2所示。
表2
由上述结果可以看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与商品化CS-E二糖组成、硫酸化度、分子量存在显著差异，是一种新型富含E-unit的高硫酸化CS。
实施例5、DG-CS抗凝血活性检测
根据药典，检测实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与标准肝素Hp抗FXa、抗FIIa活性，结果如表3所示。
表3
由表3可以看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS具有很低的抗FXa、抗FIIa活性，分别为0.9U/mg、20U/mg，远远低于精品肝素(东营天东制药有限公司货号KH1411048A)221U/mg、226U/mg可有效避免体内溶血等副作用。
实施例6、DG-CS抗肿瘤活性的检测
(1)培养肿瘤细胞：乳腺癌细胞株4T1在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素双抗，2mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养液于37℃，5％CO2培养箱传代培养；
(2)收集细胞：待培养足够量的细胞后，用PBS清洗4T1肿瘤细胞，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃消化5-10min，加入细胞培养液10ml，悬浮洗涤细胞，1000rpm/min离心5min弃上清液，重复2次，离心收集细胞用适量PBS重悬；
(3)取10μl单细胞悬浮液，用PBS 10倍稀释，用细胞计数板在倒置显微镜下计数；
(4)用PBS重悬4T1肿瘤细胞到终浓度2×106个/ml待用；
(5)对小鼠分别尾部侧静脉注射PBS、50μg实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS、100μg实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS、200μg实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS、100μg精品肝素，10-60min后经尾静脉注射肿瘤细胞200μl/小鼠，4周后解剖小鼠统计小鼠体内实体瘤个数，检验抗肿瘤效果，结果如图6所示。
与已有的抗肿瘤药物精品肝素相比DG-CS具有相当的抗肿瘤效果，最佳用药剂量为100μg/只。计算抗肿瘤迁移活性：
(对照组平均每肺肿瘤个数－100μg实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS实验组平均每肺肿瘤个数)/对照组平均每肺肿瘤个数×100％
经计算，高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性为77％。
实施例8、新型CS与生长素、生长因子相互作用
利用Biacore-T200系统将生物素化的DG-CS固定在亲和素修饰的CM5芯片上，选择素(P-选择素、L-选择素、E-选择素)(来自于北京义翘神州生物技术有限公司)、生长因子(碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、生长因子(HGF)、等)(来自于北京义翘神州生物技术有限公司)经HBS-EP，pH 7.4缓冲液与高硫酸化硫酸软骨素DG-CS相互作用，结果如图7所示，通过Biacore-T200分析软件得出各蛋白分子与高硫酸化硫酸软骨素DG-CS作用的一些参数如表4所示。
表4DG-CS与蛋白分子相互作用
由表4可以看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与HGF、bFGF有很好的结合作用，说明可能在CS抑制肿瘤转移过程中是通过与HGF、bFGF等相互作用进而调节细胞信号转导来实现的。
实施例9黑曲霉蛋白酶，木瓜蛋白酶质量比1:1混合酶制备高硫酸化硫酸软骨素
(1)将1kg美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入加入3倍体积丙酮或无水乙醇脱水、脱脂24h，3次后50℃烘干称重，制得脱脂软骨；
(2)向步骤(1)制得的脱脂软骨中加水浸没，100℃水浴处理30min，冷却到室温过滤，过滤分离，向沉淀中加入20倍体积氯化钙硼酸缓冲液(0.1M硼酸，10mM氯化钙pH8.0)混匀，加入原料干重2‰的混合酶(黑曲霉蛋白酶与木瓜蛋白酶按质量比1:1混合，均为普通市售产品)，于60℃反应72h，每隔24h补加1次酶，加酶量依次递减为上次加酶量的0.5倍，共加2次，100℃灭酶活10min，8000rpm/min离心10min，取上清，制得酶解粗液；
(3)向步骤(2)制得的酶解粗液中按质量百分比为5％的比例加入TCA(三氯乙酸)，，离心去沉淀得上清，所得到的上清中加入等体积乙醚抽提残余TCA，加入NaOH调节pH至8.0；然后加入酶解粗液质量5％的NaAC固体，混匀，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到80％，8000rpm/min离心10min，取沉淀，制得初级多糖；
(4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，浓度为10mg/ml，加入硫酸软骨素溶液重量60％的A98阴离子交换树脂室温孵育0.5h，以0.5M，1M，2M氯化钠溶液分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰，2M氯化钠洗脱液合并醇沉，8000rpm/min离心10min收集沉淀，蒸馏水溶解后用孔径为10kDa超滤膜超滤，35℃干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行纯度、回收率检测，方法同实施例2，实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS纯度、回收率分别为95％、17％。
对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行分子量检测，方法同实施例3，实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS分子量为467.2kDa。
对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行二糖组成分析，方法同实施例4，实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素二糖组成为：
硫酸化度为1.23。
对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗凝血检测方法同实施例5，实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素抗FXa、抗FIIa活性，分别为0.3U/mg、12U/mg；
对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗肿瘤实验方法同实施例6，实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性为65％。
对比例1用传统制备方法利用美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨制备硫酸软骨素
按照传统制备方法用美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨制备硫酸软骨素，具体方法参见(方旭波,陈小娥,余辉,宋茹(2009).鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的分离纯化和鉴定.中国食品学报.09(4):103-108.)。
对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行纯度、回收率检测，方法同实施例2，对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS纯度、回收率分别为90％、18％。
对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行分子量检测，方法同实施例3，对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS分子量为90.8kDa。
对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行二糖组成分析，方法同实施例4，对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素二糖组成为：
硫酸化度为0.52。
对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗肿瘤实验，方法同实施例6，对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性不显著。
说明书中涉及的参考文献
1.Fuchuan Li,Gerdy B.ten Dam,Sengottuvelan Murugan.(2008)Involvementof Highly Sulfated Chondroitin Sulfate in the Metastasis of the Lewis LungCarcinoma Cells.J.Biol.Chem.283:34294-34304.
2.Fuchuan Li,Wen Shi,Mariana Capurro and Jorge Filmus.(2011)Glypican-5stimulates rhabdomyosarcoma cell proliferation by activating Hedgehogsignaling.J.Biol.Chem.192:691–704.
3.Takuo Nakano,Mirko Betti and Zeb Pietrasik.(2010)Extraction,Isolation and Analysis of Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycans.RecentPatents on Food,Nutrition&Agriculture,2:61-74.
4.Charalampos G.Panagos,DerekThomson,ClaireMoss.(2014)Characterisation of hyaluronicacid and chondroitin/dermatansulfate from thelumpsuckerfish,C.lumpus.Carbohydrate Polymers 106:25–33.
5.Ting Zhao,a Ye Zhou,b Guanghua Mao.(2013)Extraction,purificationand characterisation of chondroitin sulfate in Chinese sturgeon cartilage.JSci Food Agric.93:1633–1640.
6.陈小娥，方旭波，余辉.(2008)鱿鱼软骨中硫酸软骨素的提取工艺研究.食品科技.33(12):214-217.
7.刘坤，刘飒.(2004)孔鳐硫酸软骨素的制备.中国海洋药物杂志.99(3)：19-22.
8.方旭波,陈小娥,余辉,宋茹(2009).鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的分离纯化和鉴定.中国食品学报.09(4):103-108.
9.Bergefall K,Trybala E,Johansson M,Uyama T,Naito S,Yamada S et al.(2005；)Chondroitin Sulfate Characterized by the E-disaccharide Unit Is aPotent Inhibitor of Herpes Simplex Virus Infectivity and Provides the VirusBinding Sites on gro2C Cells.J.Biol.Chem.280:32193-32199.

Claims (14)

1.一种高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，分子量为100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：
O-unit 3.9～10%；
C-unit 11.8～35%；
A-unit 30～37.7%；
E-unit 19～46.6%。
2.如权利要求1所述的高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，所述高硫酸化硫酸软骨素分子量为623.2KDa，硫酸化度在1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：
O-unit 3.9%；
C-unit 11.8%；
A-unit 37.7%；
E-unit 46.6%。
3.权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将美洲大赤鱿（Dosidicus Gigas）软骨粉碎后加入有机溶剂进行脱水脱脂，干燥，制得脱脂软骨；
（2）向步骤（1）制得的脱脂软骨中加水浸没处理，固液分离，向沉淀中加入酶反应缓冲液，混合均匀，调pH 5.0～9.0，加入蛋白酶在40～70 ℃酶解反应24～96 h，灭活酶，固液分离，取液体，制得酶解粗液；
所述蛋白酶为黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶与其他蛋白酶的混合；蛋白酶的加入量为脱脂软骨干重的1‰～5‰，黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的质量百分含量为20～100%；
（3）将步骤（2）制得的酶解粗液经除蛋白后，调pH至7.0～10.0，然后加入酶解粗液质量百分比1～10%的NaAc 固体，溶解，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到50%～85%，固液分离，取沉淀，制得初级多糖；
（4）将步骤（3）制得的初级多糖溶解于水中，经阴离子交换树脂纯化，以0～2.5M 氯化钠溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱峰，醇沉，固液分离，超滤，干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，有机溶剂为丙酮或无水乙醇，有机溶剂的加入量为沉淀体积的2～4倍；脱水脱脂的时间为4～24 h，次数为2～4次。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，处理条件为：在60～100℃处理10～30 min。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酶反应缓冲液为氯化钙硼酸缓冲液，氯化钙浓度为5～10 mM，硼酸浓度为50～100 mM，pH7.0～9.0。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，其他蛋白酶为链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶和/或胰蛋白酶。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酶解反应过程中，还包括两次蛋白酶补加步骤，每次补加量均为上次加酶量的0.4～0.6倍，第一次补加时间为酶解反应6～24 h后，第二次补加时间为酶解反应12～48 h后。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，灭酶活条件为沸水浴中静置5～20 min。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述固液分离均为离心，条件为5000～10000 rpm离心5～20 min。
11.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，除蛋白的具体步骤如下：
按步骤（2）制得的酶解粗液体积的2～10%加入三氯乙酸（TCA），离心，取上清液，加入乙醚抽提三氯乙酸，去除乙醚。
12.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，阴离子交换树脂纯化的具体条件为初级多糖溶解于水中，浓度为10 mg/ml，加入硫酸软骨素溶液重量40～80%的阴离子交换树脂室温孵育0.5～2 h，以0～2.5M 氯化钠溶液浓度梯度洗脱分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰。
13.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，醇沉的乙醇体积浓度为50%～85%；超滤膜的截留分子量为10 kDa以上；干燥温度为不超过80℃。
14.权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107312765B (zh) * 2017-07-05 2020-01-21 山东大学 一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用
CN111662394B (zh) * 2019-03-05 2022-11-04 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用
CN110484495B (zh) * 2019-08-23 2021-03-09 江南大学 一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法
CN111647098B (zh) * 2020-06-17 2022-05-17 山东警察学院 一种鱼皮来源的硫酸软骨素/硫酸皮肤素及其应用
CN114617267A (zh) * 2022-03-22 2022-06-14 意润健康产业（广州）有限公司 一种强化型复合骨肽及其制备方法与应用
CN115353574B (zh) * 2022-09-06 2023-06-13 福建省深蓝生物科技有限公司 高硫酸化度的硫酸软骨素cs-e及其提取方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4567942B2 (ja) * 2002-12-27 2010-10-27 生化学工業株式会社 破骨細胞形成抑制剤
CN101883794A (zh) * 2007-10-01 2010-11-10 生化学工业株式会社 新型的低分子化硫酸软骨素及其用途
JP4636818B2 (ja) * 2004-06-07 2011-02-23 マルホ株式会社 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法
CN103342757A (zh) * 2013-06-25 2013-10-09 山东大学 一种两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用
CN103952384A (zh) * 2014-05-16 2014-07-30 山东大学 内切型硫酸软骨素/硫酸皮肤素4-o-硫酸酯酶及其编码基因与应用
JP5622346B2 (ja) * 2006-05-19 2014-11-12 愛知県 神経細胞の細胞死抑制剤等

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005082491A (ja) * 2003-09-04 2005-03-31 Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho 免疫制御剤
WO2013136871A1 (ja) * 2012-03-12 2013-09-19 研光通商株式会社 過硫酸化コンドロイチン組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4567942B2 (ja) * 2002-12-27 2010-10-27 生化学工業株式会社 破骨細胞形成抑制剤
JP4636818B2 (ja) * 2004-06-07 2011-02-23 マルホ株式会社 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法
JP5622346B2 (ja) * 2006-05-19 2014-11-12 愛知県 神経細胞の細胞死抑制剤等
CN101883794A (zh) * 2007-10-01 2010-11-10 生化学工业株式会社 新型的低分子化硫酸软骨素及其用途
CN103342757A (zh) * 2013-06-25 2013-10-09 山东大学 一种两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用
CN103952384A (zh) * 2014-05-16 2014-07-30 山东大学 内切型硫酸软骨素/硫酸皮肤素4-o-硫酸酯酶及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的分离纯化和鉴定";方旭波等;《中国食品学报》;20090830;第9卷(第4期);第103-109页 *

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