ES2254645T3 - Derivados del polisacarido k5 altamente sulfatados y su preparacion. - Google Patents
Derivados del polisacarido k5 altamente sulfatados y su preparacion.Info
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Abstract
Un proceso para la preparación de K5 N,O- sobresulfatados que poseen un grado de sulfatación mayor que 3,2, que comprende: (a) tratar un K5 de la fermentación con isopropanol en una solución acuosa altamente salina; (b) someter el K5 purificado de este modo a una N- desacetilación seguida de una N-sulfatación posterior por tratamiento con un agente N-sulfatante; (c) tratar una sal de amonio del K5 N-sulfato que obtenido de este modo con un agente O-sulfatante bajo condiciones de O-sobresulfatación; y (d) si es necesario, someter el producto que obtenido deeste modo a una N-sulfatación y aislar el K5 N,O- sobresulfatado.
Description
Derivados del polisacárido K5 altamente
sulfatados y su preparación.
Se describe la purificación del polisacárido K5
de E. coli mediante el tratamiento con alcohol isopropílico y
eliminación de sustancias lipofílicas. Se puede usar el producto
purificado para preparar, después de la N-desacetilación,
nuevos polisacáridos N,O-sulfatados con un grado de
sulfatación elevado.
Se conoce que el polisacárido capsular K5, que se
aisló a partir de una cepa de E. coli (aquí denominado
simplemente "K5") descrito por W.F. Wann y col. (1981)
en Eur. J. Biochem. 116, 359-364, muestra la
misma secuencia que el precursor biosintético de la heparina y el
sulfato de heparán (N-acetilheparosán) y está constituido
químicamente por unidades repetitivas de disacárido formadas por
ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina
enlazada \alpha1-4), mientras que las unidades de
disacárido de
d-glucuronil-N-acetilglucosamina están
enlazadas \beta(1-4). La única diferencia,
que no es importante para las actividades biológicas del K5 y sus
derivados, entre el N-acetilheparosán, precursor de heparina,
y el polisacárido K5, es la presencia de un doble enlace en la
posición 4(5) en el extremo no reductor de algunas cadenas
del polímero, tal como se describió por ejemplo en EP 489647 y EP
544592 que se menciona aquí abajo.
Después de esta primera publicación, otros
artículos y otras solicitudes de patente describieron la preparación
del polisacárido K5 de E. coli que poseía rangos de peso
molecular desde unos pocos miles hasta varios cientos de miles de
Daltons. Por ejemplo, se indican EP 333243, IT 1230785, EP 489647,
EP 544592, WO 92/17507, WO 102597, y el artículo de M. Manzoni y
col. (1996), Journal Bioactive Compatible Polymers, 11,
301-311.
De acuerdo con la literatura, se purificó el K5
de la fermentación de las cepas de E. coli para eliminar por
ejemplo los ácidos nucleicos, las endotoxinas, los pirógenos o en
general las proteínas mediante varias metodologías.
De este modo, por ejemplo, W.F. Vann y
col. (1981) purificaron el K5, que se aisló por primera vez,
después de la precipitación con sales de amonio cuaternarias, usando
tres precipitaciones con etanol al 80%. En EP 333243, se realiza la
purificación mediante la precipitación con una sal de amonio
cuaternaria, extracción y aislamiento del K5. En EP 489647 y EP
544598, se purifica el K5 mediante la precipitación con etanol y la
cromatografía de exclusión y/o de intercambio iónico. De acuerdo con
WO 92/17507, se realiza la purificación mediante la precipitación
con etanol, diálisis y, después de la centrifugación de la solución
dializada y de la eliminación del sólido, la liofilización de la
solución resultante. De acuerdo con M. Manzoni y col. (1996)
y WO 01/02597, que describe un procedimiento para la preparación de
K5 mediante la fermentación en un medio de cultivo que contiene soja
desgrasada, sales y glucosa, se realiza la purificación de K5 usando
una solución de NaCl 1 M, ultrafiltración y cromatografía de
intercambio iónico de una solución que contiene el K5 que se obtuvo
mediante precipitación en etanol.
Además, se modificó químicamente el K5 de la
fermentación para obtener productos similares a la heparina. Así,
entre los documentos que se han mencionado arriba, WO 92/17507, EP
489647 y EP 544592 describen K5 N,O-sulfatados con peso
molecular bajo y elevado que poseen actividades anticoagulantes y
antitrombóticas, IT 1230785 y WO 92/17507 describen derivados
N-desacetilados-N,O-sulfatados de K5 que poseen un
cierto número de unidades de glucurónico epimerizadas a unidades de
idurónico, y WO 98/09636 describe un K5
N-desacetilados-N,O-sulfatados que poseen actividad
antimetastática.
Finalmente, para la O-sulfatación
del K5 N-sulfato, la literatura enseña como modular el número
de grupos sulfato que se pueden introducir en los grupos hidroxilo
de la unidad disacárido. Particularmente, Casu y col. (1994)
Carbohydrate Research, 263, 271-284 describe la
N-desacetilación de K5, la N-sulfatación y tres
métodos de O-sulfatación que se indican como B, C y AC. De
acuerdo con el método C, en el que se realiza la sulfatación del K5
N-sulfato usando 10 equivalentes molares de agente sulfatante
por grupo hidroxilo libre a una temperatura de
25-55ºC durante un período de tiempo que está en el
rango desde 1 hasta 24 horas, se obtienen los compuestos
polisulfatados después de una N-sulfatación mayor que posee
una proporción máxima de sulfato/carboxilo de 3,1 que se indicará
aquí abajo como K5 N,O-sobresulfatado.
También se designan los otros derivados de K5 que
se describen aquí abajo como sigue: "K5 N-desacetilado"
el polisacárido K5 N-desacetilado, "K5 N-sulfato"
el polisacárido K5 N-desacetilado-N-sulfatado, "K5
N,O-sulfato" el polisacárido K5
N-desacetilado-N,O-sulfatado y "K5
N,O-sobresulfatado" el polisacárido K5
N-desacetilado-N,O-sulfatado con un grado de
sulfatación elevado, que se obtuvo, por ejemplo, de acuerdo con el
Método C que se mencionó arriba descrito por Casu y col.
(1994).
Realizando la O-sulfatación del K5
N-sulfato de acuerdo con el Método C se observó que mientras
que en el caso de los compuestos similares a la heparina (es
decir, que poseen un cierto porcentaje de unidades de urónico
como ácido idurónico) y en el caso de K5 es posible lograr un grado
de sulfatación elevado, en el caso del K5 N-sulfato el K5
N,O-sobresulfatado obtenido mostró un grado de sulfatación
que no alcanzaba los 3,2 grupos sulfato por unidad de disacárido.
Esta evidencia explica la falta de referencias en la literatura a K5
N,O-sobresulfatados que posean más de 3,2 grupos sulfato por
unidad de disacárido, productos potencialmente interesantes por su
grado aniónico elevado.
Se ha encontrado ahora que purificando el K5 que
se obtuvo por fermentación mediante el tratamiento con isopropanol
en una solución altamente salina, se obtiene un polisacárido K5
puro, prácticamente libre de sustancias lipofílicas.
Además se encontró que sometiendo el K5 libre de
sustancias lipofílicas que se obtuvo de este modo a una
N-desacetilación, a una N-sulfatación, a una
O-sulfatación de acuerdo con el Método C y, opcionalmente, a
otra N-sulfatación, se obtienen nuevos compuestos de K5
N,O-sobresulfatados que poseen un grado de sulfatación mayor
que 3,2 y en general igual o mayor que 3,5.
La Figura 1 muestra el espectro de
RMN-^{1}H de K5 que se obtuvo a partir de la
fermentación con un 80% de pureza.
La Figura 2 muestra el espectro de
RMN-^{1}H de K5 que se obtuvo a partir de la
fermentación libre de sustancias lipofílicas con una pureza >
99%.
De este modo, de acuerdo con uno de sus aspectos,
la presente invención proporciona un proceso para la preparación de
nuevos K5 N,O-sobresulfatados que poseen un grado de
sulfatación mayor que 3,2, que comprende
- (a)
- tratar un K5 que se obtuvo a partir de la fermentación con isopropanol en una solución acuosa altamente salina;
- (b)
- someter el K5 que se purificó de este modo a una N-desacetilación mediante hidrólisis alcalina y a una N-sulfatación posterior por tratamiento con un agente N-sulfatante;
- (c)
- tratar la sal de amonio del K5 N-sulfato que se obtuvo de este modo con un agente O-sulfatante bajo las condiciones de O-sobresulfatación; y
- (d)
- si se quiere, someter el compuesto que se obtuvo de este modo a una N-resulfatación y aislar el K5 N,O-sobresulfatado como la sal sódica, que se convierte opcionalmente en otra sal.
El término "grado de sulfatación" designa el
número de grupos sulfato por unidad de disacárido, expresado como
proporción de sulfato/carboxilo.
El término O-sobresulfatación significa la
sobresulfatación del K5 N-sulfato, que se obtuvo por ejemplo
usando el Método C.
En el paso (a), el K5 que se usó como material de
partida puede ser uno de los productos que se obtuvieron por la
fermentación de cepas de Escherichia Coli naturales o
clonadas que producen K5. En particular se puede usar el K5 descrito
en la literatura como aquéllos que se citaron arriba, ventajosamente
aquéllos descritos por M. Manzoni y col. Journal Bioactive
Compatible Polymers 1996, 11,
301-311 y aquél ilustrado en la Preparación 1 de
aquí abajo.
Más ventajosamente, el material de partida de K5
posee un peso molecular bajo, en particular con una distribución de
desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 15.000,
preferiblemente desde aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente
9.000, con un peso molecular promedio de aproximadamente 5.000 o un
peso molecular mayor, en particular con una distribución de 10.000
hasta aproximadamente 50.000, preferiblemente desde aproximadamente
20.000 hasta aproximadamente 40.000 y un peso molecular promedio de
aproximadamente 30.000. Preferiblemente el material de partida de K5
posee una distribución de pesos moleculares de desde aproximadamente
1.500 hasta aproximadamente 50.000, con un peso molecular promedio
de 20.000-25.000.
Se pretende calcular el peso molecular de K5 y de
sus derivados, que se describe aquí, usando fracciones de heparina
con un peso molecular conocido como estándares; se expresan todos
los pesos moleculares en la presente invención en Daltons.
El material de partida puede ser un K5 que se
purificó previamente a partir del que, por ejemplo, se han eliminado
las endotoxinas, los pirógenos u otras impurezas con metodologías
conocidas.
Similarmente, si se usa el K5 que se obtuvo al
final del pasaje (a) con propósitos farmacéuticos o para la
preparación del K5 N,O-sulfato para uso farmacéutico, se
puede purificar de pirógenos y endotoxinas.
De hecho, se disuelve el material de partida de
K5 en una solución 2-5 M, preferiblemente de cloruro
de sodio, a una concentración desde un 0,5 hasta un 10% y se trata
con 1-3 volúmenes de isopropanol a una temperatura
de 0-8ºC y se lleva la solución que se obtuvo de
este modo hasta 2-4 M mediante una mayor adición de
sal, preferiblemente cloruro de sodio.
Después de 1-18 horas a la misma
temperatura, el producto del paso (a) precipita completamente y se
aisla por filtración o centrifugación. Si la pureza del producto no
es satisfactoria, se repite el procedimiento del paso (a). Se
redisuelve en agua el producto sólido que se ha obtenido de este
modo y se recupera por ultrafiltración con una membrana.
Al final del paso (a) se obtiene un K5 que posee
las mismas características que aquéllas del material de partida,
pero está sustancialmente libre de sustancias lipofílicas.
De hecho, el K5 libre de sustancias lipofílicas
es obtenible mediante un proceso que comprende (a1) tratar un K5 de
fermentación, disuelto en una solución 4 M de cloruro de sodio a 4ºC
con 1 volumen de isopropanol, (a2) llevar la solución salina hasta 3
M añadiendo la cantidad calculada de una solución saturada de
cloruro de sodio, (a3) mantener la solución a 4ºC durante la noche y
(a4) aislar el producto por centrifugación y eliminar las sales por
ultrafiltración.
Mediante la purificación con isopropanol es
posible de este modo obtener un K5 libre de sustancias lipofílicas
que posea una pureza mayor que el 99%. Este K5 permite obtener una
O-sulfatación elevada en el paso (c) siguiente.
En el paso (b), se realiza la
N-desacetilación de acuerdo con los métodos de hidrólisis
alcalina conocidos, por ejemplo con sulfato de hidracina en
hidracina o con una base tal como un hidróxido alcalino, por ejemplo
hidróxido de sodio o de potasio, en agua. Preferiblemente se lleva a
cabo la reacción en una solución acuosa de hidróxido de sodio a una
temperatura de 40-80ºC, controlando el curso de la
reacción. En general, después de 30 horas como máximo, pero
prácticamente después de 12-24 horas la
N-desacetilación es completa y se neutraliza la alcalinidad
del medio por tratamiento con un ácido, preferiblemente ácido
clorhídrico.
Se trata posteriormente la solución que contiene
el K5 y las sales con un agente N-sulfatante tal como el
aducto de una base orgánica terciaria con anhídrido sulfúrico
(trióxido de azufre), tal como la piridina\cdottrióxido de azufre
(C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3}) o una trialquilamina\cdottrióxido
de azufre tal como la trimetilamina\cdottrióxido de azufre en
presencia de un carbonato alcalino tal como el carbonato de sodio.
Se puede realizar la reacción a temperatura ambiente
(20-30ºC), pero también es posible trabajar a
temperaturas mayores (hasta aproximadamente 65ºC) para reducir el
tiempo de reacción. Se puede llevar a cabo la adición del carbonato
alcalino y del agente sulfatante simultáneamente o se introduce el
carbonato alcalino a granel y se añade el agente sulfatante
seguidamente, paso a paso, durante un período de tiempo que puede
durar desde 5 minutos hasta 12 horas. Al final de la reacción se
lleva la mezcla, a temperatura ambiente, hasta pH
7,5-8 con un ácido, preferiblemente ácido
clorhídrico y se eliminan las sales por ejemplo mediante
diafiltración. Se puede pasar la solución que se ha obtenido de este
modo, que contiene el K5 N-sulfato como una sal alcalina, al
paso siguiente (c), o se puede concentrar y se puede aislar el K5
N-sulfato como una sal de sodio por métodos convencionales.
El K5 N-sulfato que se obtuvo de este modo está sulfatado un
90-100%.
En el paso (c) se neutraliza una solución que
contiene el K5 N-sulfato alcalino que se obtuvo en el paso
(b) por ejemplo mediante el paso por una resina de intercambio
catiónico, como la IR 120 H^{+} hasta pH ácido. Se trata la
solución acídica que se ha obtenido de este modo con una base
orgánica terciaria o cuaternaria, por ejemplo con una trialquilamina
como la tributilamina, o con el hidróxido de un tetraalquilamonio,
preferiblemente el hidróxido de tetrabutilamonio, se reduce hasta el
volumen mínimo y se liofilizó. Se suspende la sal de amonio del K5
N-sulfato que se ha aislado de este modo en un disolvente
aprótico polar tal como la dimetilformamida o el dimetilsulfóxido y
se trata con un agente O-sulfatante, por ejemplo con el
aducto C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3}. Se puede usar el aducto
C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3} en estado sólido o en solución en el
mismo disolvente aprótico polar. Se lleva a cabo la sulfatación a
una temperatura que puede variar desde temperatura ambiente
(20-30ºC) hasta 70ºC, preferiblemente desde 40
hasta 60ºC, durante un período de tiempo desde 2 hasta 24 horas.
Al final de la reacción, se trata la solución a
temperatura ambiente con acetona saturada con cloruro de sodio hasta
la precipitación completa. Se separa el precipitado del disolvente
por filtración, se disuelve en la cantidad mínima de agua
desionizada, por ejemplo 100 ml, y se añade cloruro de sodio a la
solución hasta una concentración 0,2 M. Se lleva la solución hasta
pH 7,5-8 con hidróxido de sodio 2 N y se trata con
acetona hasta la precipitación completa. Después de la filtración se
disuelve el sólido en 100 ml de agua desionizada y se purifica de
las sales residuales por ultrafiltración tal como se describió en el
paso (b).
Si a partir del análisis por
RMN-^{13}C de una muestra liofilizada del producto
que se ha obtenido de este modo ocurrió una N-desulfatación
parcial durante la sobresulfatación, se somete el producto al paso
(d).
En el paso (d) se trata el producto que se obtuvo
al final del paso (c) con un agente N-sulfatante operando
bajo las condiciones del paso (b) hasta la N-sulfatación
completa, repitiendo el procedimiento si la N-sulfatación no
es completa.
Se aísla el K5 N,O-sobresulfatado que se
obtuvo de este modo como la sal sódica, que se puede transformar en
otra sal, como las sales de potasio, calcio, magnesio, aluminio,
zinc o las sales complejas usando métodos conocidos, por ejemplo
mediante intercambio iónico con una resina adecuada, por
precipitación con disolventes o por ultrafiltración con
membranas.
Se puede analizar la pureza mediante un espectro
de RMN-^{1}H, por un espectro UV, por reacción de
un carbazol o mediante un kit para la determinación de proteínas.
Mediante estos ensayos se demostró que el K5 que se obtuvo al final
del paso (a) tiene, como característica esencial, un espectro de
RMN-^{1}H en el que las señales en el campo por
debajo de 1,5 ppm están ausentes. Además los ácidos nucleicos no son
detectables, (absorbancia 0 a 260 nm con un espectrofotómetro
estándar UV) y las proteínas no son mayores que un 0,5%,
ventajosamente por debajo de un 0,25%, más ventajosamente por debajo
de un 0,1%, preferiblemente por debajo de un 0,03% de acuerdo con el
kit BioRad.
De hecho, el K5 puro que se obtuvo al final del
paso (a) está libre de sustancias lipofílicas y ácidos nucleicos. El
uso de "sustancialmente", referido a la ausencia de sustancias
lipofílicas y de "no detectable" referido a los ácidos
nucleicos tiene en cuenta la sensibilidad de los instrumentos que se
han usado que no han revelado la presencia de las impurezas que se
mencionaron arriba.
De este modo se estableció que el espectro de
RMN-^{1}H del polisacárido K5 puro que se obtuvo
de este modo carecía de las señales a <1,5 ppm características
del grupo metilo de las sustancias lipofílicas.
Los nuevos compuestos de K5 purificados de este
modo, que permiten la preparación de K5 N,O-sobresulfatados
con un grado elevado de sulfatación poseen preferiblemente un peso
molecular bajo, en particular con una distribución desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 15.000, preferiblemente
desde aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente 9.000, con un
peso molecular promedio de aproximadamente 5.000, o un peso
molecular mayor, en particular con una distribución desde
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 50.000, preferiblemente
desde aproximadamente 20.000 hasta aproximadamente 40.000 con un
peso molecular promedio de aproximadamente 30.000. Preferiblemente
el material de partida de K5 posee una distribución de peso
molecular desde aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 50.000
con un peso molecular promedio de 20.000-25.000.
De este modo, de acuerdo con otro de sus
aspectos, la presente invención proporciona nuevos compuestos de K5
N,O-sobresulfatados que poseen un grado de sulfatación mayor
que 3,2 y sus sales. Ventajosamente los nuevos polisacáridos de K5
N,O-sobresulfatados poseen un grado de sulfatación desde 3,2
hasta 4, más ventajosamente desde 3,5 hasta 4, preferiblemente desde
3,7 hasta 4. Preferiblemente las sales de los nuevos K5
N,O-sobresulfatados son farmacéuticamente aceptables.
Ventajosamente dichos K5
N,O-sobresulfatados poseen un peso molecular bajo, en
particular con una distribución desde aproximadamente 2.000 hasta
aproximadamente 16.000, preferiblemente desde aproximadamente 2.500
hasta aproximadamente 10.000 con un peso molecular promedio de
aproximadamente 6.500, o un peso molecular algo mayor, en
particular con una distribución desde aproximadamente 13.000 hasta
aproximadamente 65.000, preferiblemente desde aproximadamente 25.000
hasta aproximadamente 50.000 con un peso molecular promedio de
aproximadamente 40.000. Preferiblemente el K5
N,O-sobresulfatado de la presente invención posee una
distribución de pesos moleculares de desde aproximadamente 2000
hasta aproximadamente 65.000, con un peso molecular promedio de
25.000-30.000. También los compuestos de K5
N,O-sobresulfatados que poseen un peso molecular promedio muy
bajo, por ejemplo desde aproximadamente 2.000 hasta 5.000, que se
obtuvieron por despolimerización, constituyen productos muy
interesantes.
Se puede llevar a cabo la despolimerización que
permite la preparación de los K5 N,O-sobresulfatados de un
peso molecular promedio desde 2.000 hasta 5.000 al final de uno de
los pasos (b)-(d) del proceso que se ilustró arriba, preferiblemente
al final del paso (b) o sobre el K5 N,O-sobresulfatado
final.
Se puede realizar la despolimerización de acuerdo
con uno de los métodos conocidos para la despolimerización de la
heparina, por ejemplo con ácido nitroso y una reducción posterior
con borohidruro de sodio (EP 37319), con peryodato (EP 287477), con
radicales libres (EP 121067) o con una
\beta-eliminación (EP 40144). De acuerdo con una
realización preferida, se realiza la despolimerización sobre un K5
N-sulfato que se ha obtenido al final del paso (b) con ácido
nitroso y posterior reducción con borohidruro de sodio tal como se
detalla en EP 544592. Al final de la despolimerización y la
reducción, se somete el producto de peso molecular bajo que se
obtuvo de este modo a los pasos (c) y, opcionalmente, (d) y se aísla
el K5 N,O-sobresulfatado.
Alternativamente, se puede aplicar el mismo
proceso de despolimerización y reducción sobre el K5
N,O-sobresul-
fatado con peso molecular elevado y se obtiene el producto de peso molecular bajo correspondiente directamente.
fatado con peso molecular elevado y se obtiene el producto de peso molecular bajo correspondiente directamente.
Entre las sales de los compuestos de K5
N,O-sobresulfatados que se mencionaron arriba, se prefieren
las sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y zinc.
De acuerdo con otro aspecto más, la presente
invención proporciona nuevos polisacáridos de K5
N,O-sobresulfata-
dos que poseen un grado de sulfatación mayor que 3,2, en particular desde 3,2 hasta 4, ventajosamente desde 3,5 hasta 4, preferiblemente desde 3,7 hasta 4, obtenibles mediante un proceso que comprende
dos que poseen un grado de sulfatación mayor que 3,2, en particular desde 3,2 hasta 4, ventajosamente desde 3,5 hasta 4, preferiblemente desde 3,7 hasta 4, obtenibles mediante un proceso que comprende
- (a)
- tratar un K5 de la fermetación con isopropanol en una solución altamente salina;
- (b)
- someter el K5 que se ha purificado de este modo a una N-desacetilación por hidrólisis alcalina y una N-sulfatación posterior por tratamiento con un agente N-sulfatante;
- (c)
- tratar una sal de amonio del K5 N-sulfato que se obtuvo de este modo con un agente O-sulfatante en las condiciones de O-sobresulfatación;
- (d)
- si se quiere, someter el producto que se obtuvo de este modo a una N-sulfatación y aislar el K5 N,O-sobresulfatado como una sal sódica que, si es necesario, se convierte en otra sal.
Los K5 N,O-sobresulfatados obtenibles
mediante el proceso que se mencionó arriba poseen un grado de
sulfatación desde 3,2 hasta 4, ventajosamente desde 3,5 hasta 4,
preferiblemente desde 3,7 hasta 4. Los nuevos compuestos de K5
N,O-sobresulfatados que se obtuvieron de acuerdo con el
proceso de la presente invención, especialmente como sales de ello,
son productos altamente aniónicos útiles en la industria cosmética
como un co-adyuvante frente a la pérdida del cabello
y en la industria farmacéutica como productos capaces de atrapar los
radicales libres.
Dichos compuestos de K5
N,O-sobresulfatados están completamente sulfatados en las
posiciones 6-O- y 2-NH- de las unidades de glucosamina
mientras que en las unidades de glucurónico están
2,3-O-disulfatados o (2-O- o
3-O-)monosulfatados, dependiendo el porcentaje de los grupos
sulfato en las unidades de glucurónico del grado de
sulfatación.
De este modo, es otro objeto de la invención
proporcionar nuevos K5 N,O-sobresulfatados constituidos por
una mezcla de cadenas en las que como mínimo un 90% de dichas
cadenas están representadas por la siguiente fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde n es desde 3 hasta 100 y R y
R' son hidrógenos o un grupo SO_{3}^{-}, siendo como mínimo uno
de R y R' diferentes a hidrógeno, con la condición de
que
- -
- R y R' son ambos SO_{3}^{-} en desde un 60 hasta un 100% de las unidades n;
- -
- uno de R y R' es hidrógeno y el otro es SO_{3}^{-} en desde 0 hasta un 40% de las unidades n; siendo el grado de sulfatación desde 3,2 hasta 4 y
siendo el catión correspondiente
uno química o farmacéuticamente
aceptable.
En este contexto, se refiere la expresión
"químicamente aceptable" a un catión que es útil para otras
síntesis posibles, tales como el ión amonio o el ión
(C_{1}-C_{4})trialquilamonio, o para la
purificación del producto, siendo los cationes preferidos los iones
de sodio, potasio, magnesio, aluminio y zinc que se mencionaron
arriba. En lo restante hasta un 10% de las cadenas en dicha mezcla
de cadenas, para un grado de sulfatación dado, se puede haber
separado una cierta cantidad de grupos SO_{3}^{-} de unidades de
glucosamina de la posición 2 y se puede haber transferido en el
grupo 3-OH de dichas unidades de glucosamina.
Su contenido elevado en aniones le confiere a los
polisacáridos de K5 N,O-sobresulfatados de la presente
invención una buena actividad frente a los radicales libres. Debido
a su baja toxicidad son ingredientes activos útiles para la
preparación de composiciones farmacéuticas y cosméticas.
De este modo, la presente invención también
proporciona composiciones farmacéuticas que contienen, como
ingrediente activo de ello, una cantidad farmacológicamente activa
de un K5 N,O-sobresulfatado que posee un grado de sulfatación
mayor que 3,2, ventajosamente desde 3,2 hasta 4, más ventajosamente
desde 3,5 hasta 4, preferiblemente desde 3,7 hasta 4 o una de sus
sales farmacéuticamente aceptables en mezcla con un excipiente
farmacéutico.
En las composiciones farmacéuticas de la presente
invención para la administración oral, subcutánea, intravenosa,
intramuscular, transdérmica o tópica, se administran los
ingredientes activos preferiblemente en unidades de dosificación, en
mezcla con los portadores o vehículos farmacéuticos clásicos.
La dosificación puede variar en función de la
edad, el peso, y las condiciones de salud del paciente. Esta
dosificación incluye la administración de una dosis desde 1 hasta
1.000 mg, ventajosamente desde 10 hasta 750 mg, preferiblemente
desde 250 hasta 500 mg, desde una hasta tres veces por día mediante
una ruta intravenosa, subcutánea, oral, intramuscular, transdérmica
o tópica.
De acuerdo con otro de sus aspectos, la presente
invención se refiere una composición cosmética que contiene, como
uno de sus ingredientes activos, un K5 N,O-sobresulfatado
que posee un grado de sulfatación mayor que 3,2, ventajosamente
desde 3,2 hasta 4, más ventajosamente desde 3,5 hasta 4,
preferiblemente desde 3,7 hasta 4, o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, en mezcla con un excipiente
cosmético.
Una sal que se ha escogido entre el grupo que
consiste en las sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio
y zinc constituye un ingrediente activo válido de las composiciones
de la presente invención.
Finalmente, de acuerdo con otro aspecto más, la
presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas y
cosméticas que comprenden el nuevo K5 purificado de la invención
como un ingrediente activo.
Preparación
I
Primero se realiza una fermentación en un
recipiente usando el siguiente medio:
| Soja desgrasada | 2 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 9,7 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 2 g/l |
| MgCl_{2} | 0,11 g/l |
| Citrato de sodio | 0,5 g/l |
| Sulfato de amonio | 1 g/l |
| Glucosa | 2 g/l |
| Agua | 1.000 ml |
| pH = 7,3 |
Se esteriliza el medio a 120ºC durante 20
minutos. Se prepara la glucosa separadamente como una solución que
se esteriliza a 120ºC durante 30 minutos y se añade al medio bajo
condiciones estériles. Se inocula el recipiente con una suspensión
de células de E. Coli Bi 8337/41 (O10:K5:H4) a partir de una
desviación que se mantuvo en agar de soja Tríptico, y se incuba a
37ºC durante 24 horas bajo agitación controlada (160 rpm, 6 cm de
recorrido). Se mide el crecimiento bacteriano contando las células
con un microscopio. En otro paso más, se inocula un fermentador
Chemap-Braun con un volumen de 14 litros que
contiene el mismo medio de arriba con el 0,1% del cultivo del
recipiente de arriba y se realiza la fermentación con aeración lvvm
(vvm = volumen de aire por volumen de líquido por minuto), 400 rpm
de agitación y una temperatura de 37ºC durante 18 horas. Durante la
fermentación se mide el pH, el oxígeno, la glucosa residual, el
polisacárido K5 que se ha producido y el crecimiento bacteriano. Al
final de la fermentación se incrementa la temperatura hasta 80ºC
durante 10 minutos. Se separan las células del medio por
centrifugación a 10.000 rpm y se ultrafiltra el sobrenadante a
través de un módulo SS316 (MST) equipado con membranas PES con un
punto de corte nominal de 800 y 10.000 D para reducir el volumen
hasta 1/5. Entonces se precipita el polisacárido K5 añadiendo 4
volúmenes de acetona a 4ºC y dejándolo sedimentar durante una noche
a 4ºC y finalmente se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 minutos o
se filtra. Entonces se realiza una desproteinización usando una
proteasa del tipo II de Aspergillus orizae en NaCl 0,1 M y
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,15 M a pH 8 que contiene un
0,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS) (10 mg/l de filtrado) a 37ºC
durante 90 minutos. Se ultrafiltra la solución sobre un módulo SS
316 con una membrana de punto de corte nominal de 10.000 D con 2
extracciones con NaCl 1 M y se lava con agua hasta que la
absorbancia desaparece en el ultrafiltrado. Entonces se precipita el
polisacárido K5 con acetona y se obtiene un rendimiento de 850 mg/ l
de fermentador. Se mide la pureza del polisacárido mediante la
determinación del ácido urónico (método del carbazol), RMN de protón
y carbono, UV y contenido de proteína. La pureza es mayor que un
80%. El polisacárido obtenido de este modo está compuesto por dos
fracciones con diferente peso molecular, 30.000 y 5.000 D
respectivamente tal como se obtuvo a partir de la determinación por
HPLC usando una columna 75 HR Pharmacia y una sola fracción única
con un tiempo de retención de aproximadamente 9 minutos usando dos
columnas de Bio-sil SEC 250 en serie (BioRad) y
Na_{2}SO_{4} como fase móvil a temperatura ambiente y a una
velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. Se realiza la determinación
frente a una curva que se obtuvo con fracciones de heparina con un
peso molecular conocido.
Se muestra en la Figura 1 el
RMN-^{1}H del K5 purificado que se obtuvo de este
modo.
Puesto que es posible indicarlo, en la región por
debajo de 1,5 ppm hay muchas señales presentes atribuibles a los
metilos de las sustancias lipofílicas.
Se disuelven en 100 ml de una solución acuosa que
contiene cloruro de sodio 4 M y que está termostatizada a 4ºC, 5 g
del K5 que se obtuvo al final de la Preparación I y se añade 1
volumen de isopropanol frío sobre la solución que se obtuvo de este
modo. Se lleva la concentración de sal de la solución hasta 3 M
añadiendo una cantidad controlada de una solución saturada de
cloruro de sodio y se mantiene la solución enfriada a temperatura
fría (aproximadamente 4ºC) durante una noche. Se separa el
precipitado formado por centrifugación a 10.000 rpm durante 20
minutos y se controla la pureza del producto por diálisis durante
una noche y posterior análisis por RMN-^{1}H en el
cual las señales en la región por debajo de 1,5 ppm deben estar
ausentes. Si es necesario, se repite el procedimiento de la
disolución en agua que contiene NaCl 4 M y la precipitación con
isopropanol. Se disuelve el precipitado en agua y se ultrafiltra
sobre una membrana Miniplate Millipore con 10.000 D de punto de
corte hasta la desaparición de las sales. Se obtiene un K5 que posee
una pureza de como mínimo un 99% y cuyo espectro de
RMN-^{1}H se muestra en la Figura 2.
Tal como se puede notar, en la región por debajo
de 1,5 ppm no hay trazas de impurezas lipofílicas.
El contenido de proteína calculado usando el kit
BioRad es un 0,02% y los ácidos nucleicos no son detectables
(absorbancia 0 a 260 nm).
Se disuelven diez gramos de polisacárido K5 puro
que se preparó tal como se describe en el Ejemplo 1 con 1.000 ml de
hidróxido de sodio 2 M y se mantuvo la solución que se preparó de
este modo a 60ºC durante 24 horas. Se lleva la solución a
temperatura ambiente y entonces hasta pH neutro con ácido
clorhídrico 6 N.
Se añaden sobre la solución que contiene el K5
desacetilado, mantenido a 40ºC, 16 g de carbonato de sodio y
seguidamente, en 4 horas, 16 de piridina\cdottrióxido de azufre.
Al final de la reacción, después de 24 horas, se lleva la solución
hasta temperatura ambiente y entonces hasta pH 7,5-8
con una solución de ácido clorhídrico al 5%. Se purifica el producto
de las sales por diafiltración usando una membrana espiral de 1.000
D (Prepscale Cartridge-Millipore). Se finaliza el
proceso cuando la conductividad del permeato está por debajo de
1.000 \muS, preferiblemente por debajo de 100 \muS. Se reduce la
intradiálisis hasta una concentración de polisacárido del 10% usando
el mismo sistema de diálisis en la concentración. Se liofilizó la
solución concentrada. El análisis de RMN-^{13}C no
muestra grupos residuales N-acetilo o NH_{2}.
Se disuelve el producto liofilizado que se obtuvo
al final del paso (ii) en 100 ml de agua desionizada y se lleva la
solución hasta 10ºC con un baño refrigerante y entonces se pasa por
una resina de intercambio catiónico IR120H^{+} (100 ml). Se
mantiene tanto la columna como el recipiente a 10ºC. Después del
paso de la solución que contiene la muestra se lava la resina con
agua desionizada hasta que el pH del permeato es mayor que 6
(aproximadamente 3 volúmenes de agua desionizada). Se lleva la
solución acídica hasta la neutralidad (pH 7) con hidróxido de
tetrabutilamonio (solución acuosa al 15%), entonces se reduce hasta
el volumen mínimo y se liofilizó. Se disuelve la sal de
tetrabutilamonio en 400 ml de dimetilformamida y se añade con 35 g
de C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3} en forma sólida. Se mantiene la
solución a 50ºC durante 24 horas. Al final de la reacción se enfría
la solución hasta temperatura ambiente y se añade con 3 volúmenes de
acetona saturada con cloruro de sodio, se enfría hasta 4ºC hasta la
precipitación completa (12 horas). Se separa el precipitado del
disolvente por filtración, se solubiliza con la cantidad mínima de
agua desionizada (aproximadamente 100 ml) y se añade sobre la
solución cloruro de sodio hasta una concentración 0,2 M.
Se lleva la solución hasta pH
7,5-8 con hidróxido de sodio 2 M y se trata con 2
volúmenes de acetona hasta la precipitación completa. Se separa el
precipitado del disolvente por filtración. Se solubiliza el sólido
obtenido con 100 ml de agua desionizada y se purifica de las sales
residuales por ultrafiltración tal como se describió en el paso (ii)
usando una membrana espiral de 1.000 D (Prepscale Cartridge
Millipore).
Se trata la solución que se obtuvo de este modo,
que contenía el producto O-sulfatado, tal como se
describió previamente en el paso (ii) para la
N-sulfatación. El producto muestra un peso molecular
promedio de 15.000 D y una proporción de sulfato/carboxilo de 3,84.
La distribución de los grupos sulfato, determinada por
RMN-^{13}C es la siguiente: la unidad de
glucosamina del disacárido constitutivo está
N-sulfatada al 100% y
6-O-sulfatada, mientras que,
respecto a las unidades de glucurónico, un 30% están monosulfatadas
y un 70% disulfatadas.
Se usa como material de partida un K5 que se
obtuvo y se caracterizó tal como describieron M. Manzoni y col.
(1996). Se purifica el K5 que se preparó de este modo tal como se
describió en el Ejemplo 1 y se obtiene un K5 puro en el que las
señales por debajo de 1,5 ppm están ausentes, libre de ácidos
nucleicos y con un contenido de proteína de un 0,5%. Operando tal
como se describió en el Ejemplo 2 se obtiene un K5
N,O-sobresulfatado que posee un peso molecular promedio de
13.000 y una proporción de sulfato respecto a carboxilo de 3,54.
Claims (30)
1. Un proceso para la preparación de K5
N,O-sobresulfatados que poseen un grado de sulfatación mayor
que 3,2, que comprende
- (a)
- tratar un K5 de la fermentación con isopropanol en una solución acuosa altamente salina;
- (b)
- someter el K5 purificado de este modo a una N-desacetilación seguida de una N-sulfatación posterior por tratamiento con un agente N-sulfatante;
- (c)
- tratar una sal de amonio del K5 N-sulfato que obtenido de este modo con un agente O-sulfatante bajo condiciones de O-sobresulfatación; y
- (d)
- si es necesario, someter el producto que obtenido de este modo a una N-sulfatación y aislar el K5 N,O-sobresulfatado.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde el K5
de partida posee un peso molecular con una distribución desde
aproximadamente 1.500 hasta aproximadamente 15.000.
3. El proceso de la reivindicación 2, donde dicha
distribución de pesos moleculares va desde aproximadamente 2.000
hasta aproximadamente 9.000, con un peso molecular promedio de
aproximadamente 5.000.
4. El proceso de la reivindicación 1, donde el K5
de partida posee un peso molecular con una distribución desde
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 50.000.
5. El proceso de la reivindicación 4, donde dicha
distribución de pesos moleculares va desde aproximadamente 20.000
hasta aproximadamente 40.000, con un peso molecular promedio de
aproximadamente 30.000.
6. El proceso de la reivindicación 1, donde el K5
de partida posee un peso molecular con una distribución desde
aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente 50.000, con un peso
molecular promedio de 20.000-25.000.
7. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde, en el paso (b), se
lleva a cabo la hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio.
8. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde se usa el aducto
piridina\cdottrióxido de azufre o el aducto trimetilamina.trióxido
de azufre como agente N-sulfatante.
9. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, donde, en el paso (c), se usa
la sal de tetrabutilamonio como una sal de amonio.
10. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde, en el paso (c), se usa
el aducto piridina\cdottrióxido de azufre como agente
sulfatante.
11. El proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, donde se aísla el K5
N,O-sobresulfatado como una sal de sodio.
12. El proceso de la reivindicación 11, donde se
convierte dicha sal de sodio en otra sal.
13. El proceso de la reivindicación 12, donde se
selecciona dicha otra sal a partir del grupo que consiste en sales
de potasio, calcio, magnesio, aluminio y zinc.
14. Un polisacárido K5 sustancialmente libre de
sustancias lipofilicas obtenible de acuerdo con un proceso donde
(al) se trata un K5 de la fermentación, disuelto en una solución de
cloruro de sodio 4 M a 4°C, con un volumen de isopropanol; (a2) se
lleva la solución de sal hasta una concentración 3 M mediante la
adición de la cantidad calculada de cloruro de sodio; (a3) se
mantiene la solución durante una noche a 4°C; y (a4) se aísla el
producto por centrifugación y se eliminan las sales por
ultrafiltración.
15. Un polisacárido de K5 N,
O-sobresulfatado que posee un grado de sulfatación
mayor que 3,2 obtenible de acuerdo con el proceso que consiste
en
- (a)
- tratar un K5 de la fermentación con isopropanol en una solución acuosa altamente salina;
- (b)
- someter el K5 purificado de este modo a una N-desacetilación seguida de una N-sulfatación posterior por tratamiento con un agente N-sulfatante;
- (c)
- tratar una sal de amonio del K5 N-sulfato que se obtuvo de este modo con un agente O-sulfatante bajo condiciones de O-sobresulfatación; y
- (d)
- si es necesario, someter el producto obtenido de este modo a una N-sulfatación y aislar el K5 N,O-sobresulfatado en forma de su sal sódica que, si es necesario, se convierte en otra sal.
16. Un polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado que posee un grado de sulfatación mayor
que 3,2, o una sal de ello.
17. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de la reivindicación 16 que posee un grado
de sulfatación desde 3,5 hasta 4.
18. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de la reivindicación 17 que posee un grado
de sulfatación desde 3,7 hasta 4.
19. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16-18, que posee un peso molecular
con una distribución desde aproximadamente 2.000 hasta
aproximadamente 16.000.
20. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de la reivindicación 19, donde dicha
distribución de pesos moleculares va desde aproximadamente 2.500
hasta aproximadamente 10.000, con un peso molecular promedio de
aproximadamente 6.500.
21. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16-18, que posee un peso molecular
con una distribución desde aproximadamente 13.000 hasta
aproximadamente 65.000.
22. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de la reivindicación 21, donde dicha
distribución de pesos moleculares va desde aproximadamente 25.000
hasta aproximadamente 50.000 con un peso molecular promedio de
aproximadamente 40.000.
23. El polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16-18, que posee un peso molecular
con una distribución desde aproximadamente 2.000 hasta
aproximadamente 65.000 con un peso molecular promedio de
25.000-30.000.
24. Un K5 N,O-sobresulfatado de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 16-18 que se
obtuvo por despolimerización que posee un peso molecular promedio
desde 2.000 hasta 5.000.
25. Una sal farmacéuticamente aceptable del K5
N,O-sobresulfatado de las reivindicaciones
16-24.
26. La sal de la reivindicación 25, que se
selecciona a partir del grupo que consiste en sales de sodio,
potasio, calcio, magnesio, aluminio y zinc.
27. K5 N,O-sobresulfatados constituidos
por una mezcla de cadenas en las que como mínimo un 90% de dichas
cadenas poseen la fórmula
donde n es desde 3 hasta 100 y R y
R' son hidrógeno o un grupo SO_{3}^{-}, siendo como mínimo uno
de R y R' diferentes al hidrógeno, con la condición de que R y R'
sean ambos SO_{3}^{-} en desde un 60 hasta un 100% de las
unidades n, uno de R y R' es hidrógeno y el otro es SO_{3}^{-}
en desde 0 hasta un 40% de las unidades n; siendo el grado de
sulfatación desde 3,2 hasta 4 y siendo el catión correspondiente uno
química o farmacéuticamente
aceptable.
28. El K5 N,O-sobresulfatado de la
reivindicación 27 donde se selecciona dicho catión a partir del
grupo que consiste en iones de sodio, potasio, calcio, magnesio,
aluminio y zinc.
29. Una composición farmacéutica que comprende,
como un ingrediente activo de ello, una cantidad farmacológicamente
activa de un K5 N,O-sobresulfatado de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 16-28, en mezcla con un
excipiente o un vehículo farmacéutico.
30. Una composición cosmética que comprende, como
un ingrediente activo de ello, una cantidad cosméticamente efectiva
de un K5 N,O-sobresulfatado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16-28 en mezcla con un excipiente o
un vehículo cosmético.
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