TW201309305A - 用於製造生物工程肝素之單一步驟肝素前體之ｎ－去乙醯化作用及解聚合作用 - Google Patents

用於製造生物工程肝素之單一步驟肝素前體之ｎ－去乙醯化作用及解聚合作用 Download PDF

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Abstract

在化學上與醫藥肝素相同之生物工程肝素的生產仍未明瞭。現已顯示，可在單一步驟鹼催化之反應中處理肝素前體，該反應產生最佳程度之N-去乙醯化作用及解聚合作用，而獲得可處理成與醫藥肝素實質上相同之生物工程肝素的產物。本發明者亦已識別用於調整反應條件之相關因子及演算法，以自可變化之肝素前體源獲得用於進一步處理成生物工程肝素之期望N-去乙醯化N-磺化產物。

Description

用於製造生物工程肝素之單一步驟肝素前體之N-去乙醯化作用及解聚合作用
本申請案主張於2011年2月22日提出申請之美國臨時專利申請案第61/463,713號及於2011年7月13日提出申請之美國臨時專利申請案第61/572,229號之優先權。
政府許可權
本發明係根據由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之許可HL096972在美國聯邦政府支持下作出的。美國聯邦政府對本發明擁有一定的權利。
肝素及硫酸乙醯肝素係參與抗凝血、病毒及細菌感染、血管發生、發炎、癌症及發育之生物上重要之分子。當前，肝素係自動物組織以約100公噸/年之量製備，但該肝素可受其他生物產品污染。豬腸肝素通常在單一肝素鏈中含有10至15個三硫酸化二糖及每條鏈1至2個雙硫酸化二糖(Loganathan等人(1990)，「Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources.」Biochemistry 29：4362-80)。儘管廣泛使用豬腸肝素，但始終存在污染及供應問題。
肝素前體係具有重複二糖單元[GlcAα-(1-4)GlcNAcR(1-4)]n之多糖，其係由埃希氏大腸桿菌(E.coli)K5天然產生。實驗室規模之研究已顯示，自埃希氏大腸桿菌K5菌株獲得之重量平均分子量(Mw)>10,000之肝素前體可以酶方式轉化為與肝素類似之抗凝血劑多糖。Lindahl等人(2005) 「Generation of「Neoheparin」from E coli K5 capsular polysaccharide」J Med Chem 48(2)：349-352；Zhang等人(2008)「Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors」Journal of the American Chemical Society 130(39)：12998-13007。
同時，由先前技術之方法產生之分子在結構及生物上並不與豬腸肝素相當。舉例而言，Zhang(2008)之肝素類似物幾乎完全不含N-乙醯基。本發明者已克服自與豬腸肝素相當之肝素的肝素前體合成中的關鍵障礙。
本發明者已識別肝素前體與NaOH間之單一步驟反應，其給出最佳程度之最佳程度之N-去乙醯化作用及解聚合作用而而獲得可處理成(圖1)與醫藥肝素實質上相同之生物工程肝素的產物。本發明者亦已識別用於調整反應條件之相關因子及演算法，以自可變肝素前體源獲得用於進一步處理成生物工程肝素之期望N-去乙醯化N-磺化產物。
與醫藥肝素化學上相同之生物工程肝素的生產仍未明瞭。現已顯示，可在單一步驟鹼催化之反應中處理肝素前體，該反應給出最佳程度之N-去乙醯化作用及解聚合作用而獲得可處理成與醫藥肝素實質上相同之生物工程肝素的產物。本發明者亦已識別用於調整反應條件之相關因子及演算法，以自可變肝素前體源獲得用於進一步處理成生物工程肝素之期望N-去乙醯化N-磺化產物。
因此，在一個態樣中，本發明係自肝素前體製造生物工 程肝素之方法，其包含在NaOH中在足以獲得以下之時間及條件下培育肝素前體：(a)部分N-去乙醯化作用至N-乙醯基含量介於11.5%與18%之間，及(b)部分解聚合作用，以獲得9 kDa至12.5 kDa之分子數量平均分子量(MN)，之後進行進一步反應。舉例而言，可藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或藉由尺寸排除層析(SEC)量測MN。
適宜反應條件包含在以下條件下培育肝素前體：(i)在1.0 M至3.0 M NaOH中，(ii)持續2 h至4 h，(iv)在50℃至70℃下。舉例而言，反應條件可包含在以下條件下培育肝素前體：(i)在1.0 M至2.0 M NaOH中，(ii)持續2.5 h至4 h，(iii)在55℃至65℃下。申請者已發現，可使用高濃度之肝素前體，例如約10 g/L，但亦可使用較低濃度之肝素前體。
在其他實施例中，使用方程式(7)計算用以獲得期望N-乙醯基含量之反應條件：Y1(%)=15.02-23.793X1-8.083X2-17.575X3+10.527X1 2+4.579X2 2+5.973X3 2+3.472X1X2+6.941X1X3+3.433X2X3 (7)。
其中Y1係N-乙醯基含量，X1係NaOH莫耳濃度，X2係反應時間(以小時表示)，且X3係反應溫度(攝氏溫度)。
在其他實施例中，使用以下方程式計算用以獲得期望解聚合作用因子之反應條件：Y2=0.72963-0.03175X1-0.09502X2-0.2227X3+0.01088X1 2+0.02028X2 2+ 0.01632X3 2-0.0257X1X2-0.02684X1X3-0.04509X2X3 (8)其中Y2係解聚合作用因子，X1係NaOH莫耳濃度，X2係反應時間(以小時表示)，且X3係反應溫度(攝氏溫度)。
在一些實施例中，針對Y1及Y2一起求解方程式(7)及(8)，以獲得對N-乙醯基含量及解聚合作用因子最佳之條件。
在一些實施例中，進一步處理前述部分N-去乙醯化作用及解聚合作用之產物。在一些實施例中，此包括利用三甲胺-三氧化硫複合物之選擇性N-磺化，例如以獲得與醫藥肝素相當之N-乙醯基葡糖胺與N-磺基葡糖胺之比率。在其他實施例中，如下進一步處理N-磺化產物：(1)利用C5-差向異構酶及2-O-磺基轉移酶之等單位混合物的C5-差向異構化/2-O-磺化；(2)利用6-O-磺基轉移酶-1及6-O-磺基轉移酶-3之等單位混合物的6-O-磺化；及(3)在PAP再生系統存在下利用3-O-磺基轉移酶-1之3-O-磺化。
此方法產生關於以下方面實質上等同醫藥肝素之生物工程肝素：(i)N-乙醯基葡糖胺及N-磺基葡糖胺含量及(ii)數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)。在其他實施例中，生物工程肝素具有實質上等同醫藥肝素之凝血時間。
在一些態樣中，其中用於製造生物工程肝素之起始材料係Mn介於12.6 kDa與24.6 kDa間之肝素前體。
本發明亦係關於組合物及使用方法。因此，本發明包括包含由前述方法製造之生物工程肝素的醫藥組合物。本發 明亦包括生物工程肝素之該醫藥組合物的用途，其用於治療疾病，並用於製造用於治療疾病之產品。
定義
肝素前體係具有重複二糖單元[GlcAα-(1-4)GlcNAcR(1-4)]n之多糖。
本文所用「醫藥肝素」係指符合美國藥典之肝素要求的豬腸肝素。
本文所用「生物工程肝素」係指自肝素前體(例如自微生物發酵獲得之肝素前體)產生之肝素。
在生物工程肝素「實質上等同醫藥肝素」時，意指對於考慮中之給定性質而言，在相同條件下量測時，生物工程肝素屬於該性質之標準可變性範圍內，或在統計上並不與該性質不同。因此，關於N-乙醯基葡糖胺及N-磺基葡糖胺含量及數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)實質上等同醫藥肝素之生物工程肝素屬於關於N-乙醯基葡糖胺含量、N-磺基葡糖胺含量、MN、MW及PDI之醫藥肝素的標準範圍。類似地，具有實質上等同醫藥肝素之凝血時間的生物工程肝素意指生物工程肝素之凝血時間在相同情況下屬於醫藥肝素之標準範圍，或在相同情況下在統計上並不與醫藥肝素不同。
一系列值係適當的，此乃因USP肝素專論對MN、MW、PDI、N-乙醯化、N-磺化或糖含量無具體要求，而係由諸如凝血時間及不存在污染物等特徵界定。類似定義用於歐 洲藥典。USP提供作為市售肝素之摻合物之物理試樣(USP標準)，該等肝素符合USP要求之所有態樣。為推斷MN、MW、N-乙醯化或N-磺化之範圍，來自不同製造商之7種市售肝素活性醫藥成份及一種市售低分子量係利用可視描繪其物理化學性質來表徵。所有肝素均具有類似分子量性質，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳(Mn，10-11 kDa；Mw，13-14 kDa；多分散性(PDI)，1.3-1.4)及藉由尺寸排除層析(Mn，14-16 kDa；Mw，21-25 kDa；PDI，1.4-1.6)測定。在正進行研究過程中檢驗之超過十二種USP肝素中，葡糖胺殘基中之N-磺基與N-乙醯基之比率的範圍為4.4至6.9。此研究提供一般生物工程肝素之適當設計及合成所需的USP肝素之物理化學表徵。參見Zhang等人，「Structural characterization of heparins from different commercial sources,」，Analytical and Bioanalytical Chemistry,401,2793-2803,(2011)。
本文中使用具體公噸數表徵生物分子。「N-乙醯基含量」係N-乙醯基葡糖胺殘基之含量%。「解聚合作用因子」係最終期望產物之MN與初始產品之MN的比率。在本發明中，解聚合作用因子並非針對N-乙醯基之損失調整，此乃因N-乙醯基之損失並不顯著影響MN。
聚合物之分子量的量度經常表示為數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)。數量平均分子量(MN)係藉由量測n個聚合物分子之分子量、將該等重量相加並除以n測定。
重量平均分子量(MW)係藉由以下計算： 其中N i 係分子量M i 之分子數量。
MN及MW各自可藉由不同方式量測。在比較USP肝素與生物工程肝素間之MN及MW及其他值時，USP及生物工程試樣二者使用相同方法以避免因量測方法造成之量測值變化。
多分散性指數(PDI)量測混合物中之異質性程度。PDI計算為：PDI=MW/MN
如本文所用，(1)利用C5-差向異構酶及2-O-磺基轉移酶之等單位混合物的C5-差向異構化/2-O-磺化；(2)利用6-O-磺基轉移酶-1及6-O-磺基轉移酶-3之等單位混合物的6-O-磺化；及(3)在PAP再生系統存在下利用3-O-磺基轉移酶-1之3-O-磺化係根據Zhang(2008)。
如本文所用「一」(「a」或「an」)除非明確指明意指僅一個，否則均意指一或多個。
術語「約」在「約」修飾所述術語之上下文中係如熟習此項技術者所瞭解使用。對於數值，「約」可視為涵蓋所述值附近10%之變化。
如本文所用「實質上純淨」意指分子基本上不含其他物質至對其預期用途實際且適當之程度。實質上純淨之肝素 前體係至少90%純淨。較佳地，材料係大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至大於99%不含污染物。可藉由業內已知之方式評定純淨程度。
用於產生肝素前體之埃希氏大腸桿菌K5的發酵
埃希氏大腸桿菌K5係產生K5胞外多糖之埃希氏大腸桿菌的變體。適宜埃希氏大腸桿菌K5菌株可自公共收藏機構(例如ATCC(American Type Culture Collection,USA))獲得，例如埃希氏大腸桿菌菌株ATCC23506。埃希氏大腸桿菌K5菌株亦可自臨床來源分離及/或經遺傳改造。
一般而言，埃希氏大腸桿菌可在許多種介質及多個pH、溫度、O2及其他條件中生長。如WO 2011/028668中所報告，生長條件之變化可影響(a)細菌生長之速率，(b)最大細胞密度，(c)K5胞外多糖莢膜之產生，(d)K5莢膜經埃希氏大腸桿菌K5、駐存於埃希氏大腸桿菌K5中之噬菌體之修飾程度、及其他因子，(e)K5胞外多糖莢膜至介質中之釋放，(f)所產生肝素前體多糖是否屬於適於處理成肝素之大小範圍，及(g)污染物之量及類型。舉例而言，促進細胞裂解之條件可增加培養上清液中之K5胞外多糖的產率，但亦可增加K5胞外多糖莢膜之降解及上清液中之污染物之數目及量。
任一種污染物之重要性涉及可藉由後續純化及處理步驟去除污染物之容易程度、污染物是否干擾肝素前體後續處理成肝素、及污染物是否對人類或動物具有危險。呈多糖形式之肝素前體可與污染物(例如脂多糖(LPS)、核酸、非 肝素前體多糖、及肝素前體之衍生物)共純化。
舉例而言，WO 2011/028668闡述自不同介質中生長之相同埃希氏大腸桿菌K5獲得的肝素前體。端視針對介質之方法而定，肝素前體之數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)有所變化，如表1中所示。
WO 2011/028668亦闡述自埃希氏大腸桿菌K5可規模化生產高純度肝素前體的方法。經由較大規模發酵產生之肝素前體的數量平均分子量為約58,000 Da，重量平均分子量為約84,000 Da，且多分散性指數(PDI)為約1.4。估計純度為95%或以上。將溫度保持於約37℃下，且在pH下降時藉由添加NH4OH將pH保持在6與8之間。
WO 2011/028668亦闡述肝素前體純化，其可包含：(a)製備培養培養上清液或濾液之步驟，(b)將肝素前體結合至固體相(例如樹脂)及自其洗脫肝素前體，(c)用醇沈澱及(d)去致熱原。可增加額外結合、沈澱及去致熱原步驟。該等步驟通常經選擇以限制其對肝素前體之影響。
隨後可進一步處理最終高度純化之肝素前體。然而，即使其高度純淨，但鏈長度之分佈(如數量平均分子量 (MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)中所見)可有所變化。因此，產生模擬USP豬肝素之生物工程肝素的任一方法必須亦慮及起始材料之變化。
自肝素前體之肝素之產生
K5肝素前體在側基之數量及分佈、及聚合物鏈之長度方面不同於USP豬肝素。挑戰係識別可獲得側基之正確平衡、及正確大小分佈之條件。
生物工程肝素過程中之下一步驟係化學N-去乙醯化及N-磺化步驟(圖1)。為使得最終生物工程肝素能夠類似於USP豬肝素之結構，N-乙醯基葡糖胺與N-磺基-葡糖胺之比率必須與豬肝素中之比率匹配。此需要精細控制N-去乙醯化反應以保存適當比例之N-乙醯基。此係關鍵步驟，此乃因N-去乙醯化反應直接影響所產生生物工程肝素之N-乙醯基含量。甚至更重要的是，N-磺化後獲得之N-磺基/N-乙醯基肝素前體用作後續酶修飾之新主鏈，且N-磺基及N-乙醯基之定位直接影響獲得肝素之期望最終結構之酶活性。
同時，鹼催化之去乙醯化作用亦可經由限制解聚合反應降低肝素前體之分子量，該解聚合反應之化學尚未充分瞭解。肝素解聚合作用(如其他多糖)通常經由酸催化之機制(例如利用亞硝酸)達成。
令人驚奇地，申請者已發現，利用NaOH之某些反應條件可在單一步驟中達成製備在MN、MW及PDI方面實質上等同醫藥肝素之生物工程肝素所需的以下之期望程度：(1)N-乙醯化，(2)分子大小及(3)多分散性。甚至更令人驚奇 地，生物工程肝素在N-乙醯基葡糖胺及N-磺基葡糖胺含量、凝血抑制方面實質上等同醫藥肝素，且在若干方面接近醫藥肝素之糖組合物。
藉由參照以下實例可進一步瞭解本發明，該等實例係提供用於闡釋本發明之某些實施例，但並不意欲具有限制性。熟習此項技術者應瞭解可作出改變，此並不背離本發明之精神。
實例
實例1證實單一步驟中之鹼催化之部分去乙醯化作用及解聚合作用允許產生與USP豬肝素生物相當之生物工程肝素。
I.材料及方法
A.埃希氏大腸桿菌K5肝素前體之製備
埃希氏大腸桿菌K5肝素前體係藉由埃希氏大腸桿菌K5菌株發酵產生且純化自培養上清液，如WO 2011/028668中先前所述。
B. K5肝素前體之N-去乙醯化作用/N-磺化作用
將K5多糖(100 mg)溶解於25 ml 2 M NaOH中，於60℃下培育5 h，每小時移出5 ml等份試樣，冷卻至室溫，並用HCl調整至pH 7。隨後在每一時間點升溫至45℃至50℃，在單一步驟中添加碳酸鈉(60 mg)及三甲胺-三氧化硫複合物(60 mg)，且將混合物培育12 h。12 h之後再次添加相等部分之碳酸鈉及三甲胺-三氧化硫且於50℃下再繼續選擇性N-磺化作用12 h。隨後使溶液達到室溫，使用3500 Da截 留分子量(molecular weight cut-off,MWCO)纖維素膜對蒸餾水透析過夜。凍乾透析液以獲得不含鹽之N-磺基，N-乙醯基肝素前體多糖。參見Kuberan等人(2003a)「Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides」J Biol Chem 278：52613-21。
C.硫酸乙醯肝素生物合成酶及肝素裂解酶之表現
使人類C5-差向異構酶、倉鼠2-O-磺基轉移酶、倉鼠6-O-磺基轉移酶-1、小鼠6-O-磺基轉移酶-3及小鼠3-O-磺基轉移酶-1之催化結構域在埃希氏大腸桿菌中重組表現並進行純化，如先前所述(Zhang等人(2008)「Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors」Journal of the American Chemical Society 130(39)：12998-13007.Chen等人(2005)「Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate」J Biol Chem 280：42817-25)。自肝黃黃桿菌(Flavobacterium heparinum)之基因組DNA選殖肝素裂解酶I、II及III。亦針對埃希氏大腸桿菌實施重組肝素裂解酶之表現(Zhang(2008))。
D.藉由酶修飾自N-乙醯基、N-磺基肝素前體之生物工程肝素的製備
該等酶修飾步驟用於將N-乙醯基、N-磺基肝素前體轉化為生物工程抗凝血劑肝素：(1)C5-差向異構化/2-O-磺化(利用C5-差向異構酶及2-O-磺基轉移酶之等單位混合物)；(2)6-O-磺化(利用6-O-磺基轉移酶-1及6-O-磺基轉移酶-3 之等單位混合物)；及(3)3-O-磺化(利用3-O-磺基轉移酶-1)。每一步驟均係在PAP再生系統存在下在緩衝液中實施。(Chen(2005),Zhang(2008))。
E. N-乙醯基、N-磺基肝素前體之NMR分析
所有1H-NMR均係在Brüker® 600 MHz NMR分光光度計上執行。在5 mm標準NMR管中製備試樣。使用TOPSPIN® 2.0軟體獲得譜。所有譜均係在298 K之溫度下獲得。使用10 s之再循環延遲時間。利用Mnova NMR軟體處理獲得之1H-NMR譜用於相位及基線校正。利用Mnova NMR軟體之「人工積分」或「線擬合」功能計算峰面積。
F.醫藥肝素及生物工程肝素之聚丙烯醯胺凝膠電泳分子量測定
在肝素分子量分析中使用尺寸為0.75 mm x 6.8 cm x 8.6 cm之12%聚丙烯醯胺凝膠。將肝素試樣(5 μg)裝載於凝膠上且隨後使其經受電泳(200 V，25 min)並用艾爾遜藍(Alcian blue)染色0.5 h，且隨後在水中褪色。對凝膠進行掃描且使用UN-SCANIT電腦軟體根據製造商之用戶指南分析所得數位影像。計算數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)。牛肺肝素寡糖梯用作分子量之計算之標準。
G.用於分子量測定之K5肝素前體及N-去乙醯化肝素前體的尺寸排除層析
使用TSK-GEL® G3000PWx1尺寸排除管柱在包括Shimadzu® LC-10Ai幫浦、Shimadzu® CBM-20A控制器及 Shimadzu® RID-10A折射率檢測器之設備上實施尺寸排除層析，試樣注射體積為20 μL且流速為0.8 ml/min。緩衝液由0.2 M Na2SO4組成。在層析期間利用Eppendorf®管柱加熱器將管柱維持於60℃下。利用LCsolution® 1.25版軟體記錄尺寸排除層析圖並利用其「GPC Postrun」功能來計算MN、MW及PDI進行分析。使用不同分子量之右旋糖作為校準物。
H.使用液相層析-質譜之二糖組合物分析
向肝素試樣中添加肝素酶II並於37℃下培育24 h。利用YM-10 10K MWCO離心管藉由離心過濾回收產物。冷凍乾燥濾液並準備進行液相層析-質譜。
在配備有離子陷阱及UV檢測器之Agilent® 1200 LC/MSD儀器(Agilent Technologies公司，Wilmington,DE)上實施液相層析-質譜。所用管柱係Acquity超性能液相層析® BEH C18管柱(1.7 μm,2.1X100 mm)(Waters公司)。洗脫劑A係水/乙腈(85/15,v/v)，且洗脫劑B係水/乙腈(35/65,v/v)。兩種洗脫劑均含有12 mM三丁胺及38 mM乙酸銨，用乙酸將pH調整至6.5。管柱流出物進入電噴霧離子化-質譜之來源用於連續檢測。自根據每一二糖之標準曲線校準之提取離子層析圖之峰面積計算二糖之含量。
I.生物工程及醫藥肝素之活體外抗凝血活性
在鹽水中製備兩種肝素試樣之儲備溶液並將其添加至貧血小板之彙集人類血漿中，該血漿已收集於檸檬酸鈉上。在利用氯化鈣鈣化並添加Platelin®試劑(BioMeriux, Durham,NC)之後，利用AMAX®凝血分析儀(Sigma)測定凝血時間。
II.結果
A. N-去乙醯化及N-磺化步驟中之N-磺基/N-乙醯基比率的控制
N-去乙醯化反應取決於NaOH處理且每小時取樣，持續5 h。隨後用三甲胺-三氧化硫N-磺化N-去乙醯化葡糖胺殘基。使所得N-磺基，N-乙醯基肝素前體經受1H-NMR研究以測定產物之N-磺基/N-乙醯基比率(N-磺基/N-乙醯基比率=[1-N-乙醯基葡糖胺%]/N-乙醯基葡糖胺%，其中N-乙醯基葡糖胺%=N-乙醯基含量)。使用葡糖胺之H1質子量化N-磺基/N-乙醯基比率，如在N-乙醯基葡糖胺中顯示峰大約在5.31 ppm處且當用N-磺基替代N-乙醯基時峰移位至約5.55 ppm處(圖2A)。N-磺化之後獲得之多糖用於1H-NMR研究，此乃因發現其比N-去乙醯化肝素前體更穩定且具有更好溶解度，且H1質子化學位移之變化在1H-NMR中更明顯。
N-乙醯基含量隨著反應時間延長而降低。在60℃下利用2 M NaOH之處理中，一式三份地實施3 h之N-去乙醯化反應產生12.3%至16.6%之N-乙醯基含量，如自NMR譜測定。N-乙醯基含量之平均值係14.8%，其中12.2%至17.3%之置信界限為95%(圖2B)。該等值緊密地匹配針對醫藥肝素報告之11.9-17.6%的N-乙醯基含量。Guerrini等人(2001)「Combined quantitative(1)H and(13)C nuclear magnetic resonance spectroscopy for characterization of heparin preparations」，Semin Thromb Hemost 27：473-82。
B. N-去乙醯化步驟對多糖之分子量的影響
自發酵及純化獲得之K5肝素前體顯示數量平均分子量為49 KDa，其遠大於市售肝素之分子量(圖3)。在3 h N-去乙醯化反應時間後，產物N-去乙醯化肝素前體之數量平均分子量降低至9.7 KDa，如由尺寸排除層析測定(圖3A)。
自此N-去乙醯化肝素前體證實，產生具有與針對豬腸肝素報告之分子量性質類似之分子量性質的生物工程肝素，如圖3B進一步顯示，且下文進一步證實。
生物工程肝素及醫藥肝素之分子量通常由聚丙烯醯胺凝膠電泳表徵，已報告尺寸排除層析受標準緩衝液中之肝素與管柱填充材料間之靜電排斥影響。界定肝素寡糖分子量標準物之可用性提供使用聚丙烯醯胺凝膠電泳測定肝素分子量之可靠方式。藉由此聚丙烯醯胺凝膠電泳方法測定之醫藥肝素之分子量對於MN及MW值分別在9 KDa至12 KDa及13 KDa至20 KDa範圍內。此研究中針對醫藥肝素及生物工程肝素獲得之值分別係MN 13 KDa及14 KDa且MW 18 KDa(圖3B)。由於化學N-磺化及酶O-磺化步驟係在輕微條件下，故推論出，不應發生進一步解聚合作用，以便生物工程肝素之分子量應為N-去乙醯化肝素前體加上所添加磺基之分子量。由磺化後之分子量自N-去乙醯化肝素前體之9.7 KDa增加至生物工程肝素之13 KDa來確認此假設。
因此，N-去乙醯化肝素前體之約10 KDa的分子量(9 kDa至12 kDa，如由聚丙烯醯胺凝膠電泳所測定)代表用於製 備與極接近豬腸肝素分子量之生物工程肝素的最佳起始材料。
藉由小心選擇適當N-去乙醯化反應條件，令人驚奇地同時獲得期望分子量性質(圖3)及最佳N-磺基/N-乙醯基比率(圖2B及圖4)二者。肝素與抗凝血酶及凝血酶二者形成三元複合物之結合性係依賴鏈之大小，且因此控制肝素分子量對生物工程肝素具有接近醫藥肝素之抗凝血劑活性至關重要。
C.生物工程肝素與醫藥肝素之結構比較
生物工程肝素之1H-NMR譜類似於自豬腸製備之醫藥肝素的1H-NMR(圖4)。醫藥肝素譜中不存在之自3.4 ppm至3.8 ppm之尖峰對應於生物工程肝素中之甘油雜質，甘油係自其用作低溫保存劑之O-磺基轉移酶所帶入。生物工程肝素具有與醫藥肝素相當之N-磺基葡糖胺及N-乙醯基葡糖胺含量(表2)。
表2中呈現之生物工程肝素之N-乙醯基葡糖胺及N-磺基葡糖胺值與由吾人之實驗室報告之許多USP肝素之值相當(Zhang等人，「Structural characterization of heparins from different commercial sources」，Analytical and Bioanalytical Chemistry,401,2793-2803(2011))及其他(Guerrini等人，「Combined quantitative(1)H and(13)C nuclear magnetic resonance spectroscopy for characterization of heparin preparations」，Semin Thromb Hemost 27：473-82(2001))。生物工程肝素中之3-O-磺基葡糖胺、2-O-磺基艾杜糖醛 酸、艾杜糖醛酸、葡糖醛酸之值並不類似於吾人之實驗室及其他所觀察USP肝素之值(參見表2)。
與市售肝素相比，生物工程肝素顯示較低艾杜糖醛酸含量及較高葡糖醛酸含量，且兩個數量均在先前所報告之不同USP肝素之標準艾杜糖醛酸及葡糖醛酸含量可變性範圍外。
肝素酶II消化後利用高效液相層析-質譜之二糖分析提供生物工程肝素及市售肝素之二糖組合物(圖4及表3)。除△UA2S-GlcNAc6S外，亦可在生物工程肝素中發現醫藥肝素中存在之所有主要二糖組份(表4)。
D.生物工程及醫藥肝素之抗凝血劑活性
使用活化之部分促凝血酶原激酶時間分析評定肝素試樣之整體活體外抗凝血劑活性。於三種肝素濃度下獲得之凝血時間顯示統計上相同之值(圖6)。
III.討論
肝素前體之控制N-去乙醯化(化學酶修飾肝素前體鏈以提供抗凝血劑肝素中之第一化學步驟)尤為重要，不僅係由於其影響所產生之最終肝素之N-乙醯基含量及分子量，且其亦對後續酶步驟具有顯著影響。藉由先前化學酶修飾步驟產生之前體多糖序列可影響接下來之酶步驟中產生的多糖的序列。為了構建緊密地類似於豬腸肝素之生物工程肝素，肝素前體之N-去乙醯化/N-磺化之化學步驟的控制至關重要。已顯示，利用NaOH之N-去乙醯化作用在適當控制時可在所得多糖產物中提供最佳N-乙醯基/N-磺基比率以及產生期望分子量之部分解聚合產物。
小心地控制NaOH水溶液與肝素前體之反應條件以獲 得：(1)與醫藥肝素匹配之N-乙醯基/N-磺基比率所需之去乙醯化作用的適當程度，及同時(2)類似地控制多糖之分子量以獲得期望範圍。與由Kuberan等人，(2003a)「Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides」，J Biol Chem 278：52613-21；Chen(2005)J Biol Chem 280：42817-25；Chen等人，(2007)，「Using an enzymatic combinatorial approach to identify anticoagulant heparan sulfate structures」，Chem Biol 14：986-93；及Zhang(2008)Journal of the American Chemical Society 130(39)：12998-13007報告之生物工程肝素的先前形式相比，此生物工程肝素之結構、分子量及抗凝血劑活性更好地匹配豬腸肝素。
於2003年由Kuberan報告之抗凝血劑多糖經完全N-去乙醯化且無N-乙醯基葡糖胺殘基，未報告分子量數據，且未量測抗凝血劑活性程度以與市售肝素比較，但凝膠遷移率變動分析指示與抗凝血酶結合。
於2007年由Chen及於2008年由Zhang報告之化學酶合成之多糖亦使用全-N-磺化肝素前體作為起始材料且因此由於多糖鏈中無N-乙醯基葡糖胺殘基而不類似於市售肝素。
於2005年由Chen報告之抗凝血劑多糖係藉由首先使市售肝素化學去磺化合成，且因此與生物工程肝素之產生無關。
相反，此處呈現之生物工程肝素具有與醫藥肝素相當之 N-磺基葡糖胺及N-乙醯基葡糖胺含量且其分子量及抗凝血劑活性緊密地匹配醫藥肝素。儘管本發明者已識別N-去乙醯化、N-磺化及解聚合作用之最佳條件，但觀察到生物工程肝素與醫藥USP肝素間存在差別。吾人之分析係該等與精細化學結構相關之差別係由於N-去乙醯化及N-磺化後之酶步驟且將需要進一步研究以製造在所有方面與醫藥肝素相當之生物工程肝素。
實例2：肝素前體之去乙醯化作用的反應面最佳化 I.肝素前體至肝素之轉化需要多個輸入及輸出變量之最佳化
利用氫氧化鈉水溶液之肝素前體的化學N-去乙醯化作用對肝素前體鏈前體具有兩個主要作用。第一，部分(或完全)去除N-乙醯基葡糖胺殘基之N-乙醯基以給出未經取代之胺基。第二，使肝素前體多糖鏈部分解聚合，從而降低其分子量。必須控制該兩個作用以獲得N-乙醯基取代、分子量及分佈(MW、MN及PDI)之期望程度。此外，商業生產需要高回收率。
存在可在N-去乙醯化/解聚合步驟中變化之四個主要因子，其可影響產物之N-乙醯基含量、平均分子量及回收產率。該等因子係肝素前體之初始濃度、NaOH濃度、反應時間及反應溫度。必須控制該四個因子以獲得具有期望N-乙醯基含量、平均分子量及高回收產率之產物。
必須加以考慮之額外因子係肝素前體反應物之變化。自埃希氏大腸桿菌K5發酵產生之肝素前體的MN由於介質組 成及培養條件變化而所有變化。甚至在充分控制之發酵操作下，由於生物過程之複雜性及使肝素前體鏈解聚合之K5裂解酶的表現，肝素前體之MN可在批與批之間有所不同。
基於不同起始肝素前體MN，需要不同解聚合作用程度以產生具有類似於USP肝素之MN的生物工程肝素。此可藉由改變N-去乙醯化反應條件達成。然而，反應產物必須亦滿足另一標準(即適當N-乙醯基含量)及第三目標(即最大產物產率)。因此，肝素前體之N-去乙醯化作用的目的變為多目標最佳化問題，其中靶向三個目標：N-乙醯基含量、MN及產物產率。
吾人研發用以解決此複雜問題之模型。該模型精確地預測利用不同數量平均分子量肝素前體試樣之N-去乙醯化作用及解聚合作用所需的反應條件。
I.材料及方法
A.埃希氏大腸桿菌K5肝素前體之製備
埃希氏大腸桿菌K5肝素前體係藉由埃希氏大腸桿菌K5菌株(ATCC號23506)發酵產生且純化自培養上清液，如先前所述。更具體而言，MN為14.9 KDa及14.0 KDa之K5肝素前體係由兩個不同批次之指數進料分批進料培養物產生(WO 2011/028668)且MN為18.4 KDa之K5肝素前體係自恒pH分批進料培養物產生(Wang等人(2011a)，「Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering」，Bioengineered Bugs 2,63-67)。所有肝素前 體批料均係利用來自GE Healthcare(Piscataway,NJ)WO 2011/028668之DEAE Sepharose®快速流動陰離子交換樹脂純化。
B. K5肝素前體之N-去乙醯化/N-磺化
將K5多糖溶解於不同濃度之1 ml NaOH溶液中並於不同溫度下培育不同時間長度。隨後將反應混合物稀釋至5 ml，在冰上冷卻，並用HCl調整至pH 7。在單一步驟中添加碳酸鈉(60 mg)及三甲胺-三氧化硫複合物(60 mg)，且將混合物培育12 h。12 h之後再次添加相等部分之碳酸鈉及三甲胺-三氧化硫且於50℃下再繼續化學選擇性N-磺化12 h。隨後使溶液達到室溫，使用3500 Da截留分子量(MWCO)纖維素膜對蒸餾水透析過夜。市售肝素通常具有約15 KDa之MN，極少鏈低於3500 Da，因此，使用3500 Da MWCO纖維素膜可自試樣有效地去除鹽且應不會影響在靶標範圍內之產物鏈。凍乾透析液以獲得不含鹽之N-磺基，N-乙醯基肝素前體多糖。用於因子設計及Box-Behnken設計之起始肝素前體材料具有14.9 KDa之MN。
C. N-磺基，N-乙醯基肝素前體之NMR分析
在Brüker® 600 MHz NMR分光光度計上執行1H-NMR。在D2O中凍乾後在5 mm標準NMR管中製備試樣。使用TOPSPIN® 2.0軟體獲得譜。所有譜均係在298 K之溫度下獲得。使用10 s之再循環延遲時間。利用Mnova NMR軟體處理獲得之1H-NMR譜用於相位及基線校正。使用葡糖胺之H1質子量化N-乙醯基含量，在N-乙醯基葡糖胺時顯示峰 大約在5.31 ppm處且在N-磺基葡糖胺時移位至約5.55 ppm處。圖2中顯示所產生N-磺基，N-乙醯基肝素前體之典型1H-NMR譜，指定該等峰。N-乙醯基含量計算為N-乙醯基葡糖胺H1質子之峰面積除以N-乙醯基葡糖胺H1質子與N-磺基葡糖胺H1質子之峰面積的和。使用Mnova NMR軟體之「人工積分」或「線擬合」功能計算峰面積。
D.用於分子量測定之K5肝素前體及N-磺基，N-乙醯基肝素前體之尺寸排除層析(SEC)
SEC係測定肝素之分子量性質的有用方法。使用TSK-GEL® G3000PWx1或G4000PWx1尺寸排除管柱在包括Shimadzu® LC-10Ai幫浦、Shimadzu® CBM-20A控制器及Shimadzu® RID-10A折射率檢測器之設備上實施SEC，試樣注射體積為20 μL且流速為0.6 ml/min。流動相由0.1 M NaNO3組成。在層析期間利用Eppendorf®管柱加熱器將管柱維持於40℃下。利用LCsolution® 1.25版軟體記錄SEC層析圖並利用其「GPC Postrun」功能進行分析。對於K5肝素前體之分子量測定，使用TSK-GEL® G4000PWx1尺寸排除管柱，且使用不同分子量(30.6 kDa、54 kDa、125 kDa及250 kDa)之透明質酸標準物(購自Hyalose L.L.C.(Oklahoma City,Oklahoma))作為標準曲線之校準物。對於N-磺基，N-乙醯基肝素前體之分子量測定，使用TSK-GEL® G3000PWx1尺寸排除管柱，且使用不同分子量(dp 6、dp 10、dp 16及dp 20)之肝素寡糖(購自Iduron(Manchester,UK))作為標準曲線之校準物。
II.實驗設計
A.全因子設計
利用Minitab®軟體自標籤「Stat->DOE->Factorial->Create Factorial Design」產生四因子、兩水準全因子設計且利用四個因子執行，該四個因子係肝素前體濃度、NaOH濃度、反應時間及反應溫度。該等因子中之每一者具有兩個編碼值且相應未編碼值闡釋於表5a中。全因子設計係基於一階模型：Y=β0+ΣβiXi (1)其中Y係反應，β0係模型截距且βi係線性係數，且Xi係獨立變量之值。全因子設計之目的係識別在N-乙醯基含量、MN及產量方面顯著影響產物性質之因子，且進一步定量研究其效應以預測後續反應面設計中之反應條件。全因子設計之另一價值係識別不顯著因子且將其自實驗設計之下一階段排除，由此減少下一反應面設計所需之運行次數。可將該等不顯著因子設定至有利於過程經濟以有益於真實生產過程的程度。
在統計上可靠地一式兩份地實施全因子設計。利用軟體Minitab® 15遵循標籤「Stat->DOE->Factorial->Analyze Factorial Design」分析實驗數據。
B. Box-Behnken設計
利用Minitab®軟體自標籤「Stat->DOE->Response Surface->Create Response Surface Design」產生沿Box-Behnken設計(Box,G.E.,Behnken,D.W(1960)「Some new three level designs for the study of quantitative variables」，Technometrics 2,455-475)之因子分析且加以實施以定量地模擬變量對N-乙醯基、N-磺基肝素前體產物之N-乙醯基含量、MN及產量之效應。將三個重要因子之水準重新定義(表6a)至中心點及實際操作區附近。Box-Behnken設計具有15次實驗運行，其中三次運行係在中心點處(表6b)以研發反應面模型，該等模型闡述反應變量與產物之各別地N-乙醯基含量、MN及產量的關係。
在1 ml離心管中執行15次N-去乙醯化實驗運行，且利用溫度可調之水浴控制反應溫度。利用MiniTab® 15遵循「Stat->DOE->Response Surface->Analyze Response Surface Design」分析實驗數據並擬合至二階方程式中。 二次方程式模型係如下：Y=β0+ΣβiXi+ΣβiiXi 2+ΣβijXiXj (2)其中Y係預測反應；β0係偏移項；βi係線性效應；βii係平方效應；βij係相互作用效應，且Xi及Xj係變量xi及xj之無量綱之編碼值。
對於統計計算而言，編碼值與實際值間之關係係由以下方程式闡述： 其中Xi係獨立變量xi之無量綱之編碼值；xi係該獨立變量之實際值；x0係中心點處之獨立變量xi之真實值且△xi係階躍變化。
III.結果
A.全因子設計
表5b代表用於運行四因子、兩水準全因子設計及反應之條件。根據先前報告條件針對多糖之N-去乙醯化作用選擇因子之高水準及低水準。利用Minitab®軟體分析設計反應。表5c顯示每一因子之一階回歸結果及顯著性水準。使用0.05之P值水準確定因子是否對反應具有顯著效應。對於N-乙醯基含量而言，因子X2(NaOH濃度)、X3(反應時間)及X4(反應溫度)均具有小於0.05之P值，此指示於測試水準下其顯著影響產物N-乙醯基含量。X1(肝素前體濃度)給出0.946之P值，大於0.05，此指示其對產物N-乙醯基含量無顯著影響。類似地，X2(NaOH濃度)、X3(反應時間)及X4(反應溫度)均對解聚合作用因子及產物回收率具有顯著影響，而X1之P值(肝素前體濃度)指示肝素前體濃度並非影響產物解聚合作用及回收率之重要因子。
驚奇地發現，肝素前體濃度並不顯著影響產物性質。此係有益的，此乃因其允許將肝素前體設定至高值(10 g/L)以增加過程生產能力，以便可在單一間歇反應中處理更多材料用於前瞻性商業生產。利用Minitab之回歸分析將全因子設計數據擬合至以下一階方程式中：N-乙醯基含量Y1(%)=3.392-0.039 X1-1.336 X2-3.392 X3-1.322 X4 (4)解聚合作用因子Y2=0.23+0.0137 X1-0.0919 X2-0.0484 X3-0.1415 X4 (5)產物回收率Y3(%)=39.75+0.47 X1-8.5 X2-4.01 X3-31.54 X4 (6)
所有三種反應之X2、X3及X4之負係數指示其對產物N-乙 醯基含量、解聚合作用因子及產物回收率具有負效應。
B. Box-Behnken設計實驗及反應面分析
利用Box-Behnken設計進一步分析三個重要變量NaOH濃度、反應時間及反應溫度之效應，目的係構建二次反應面模型，其闡述該三個變量對產物性質之效應且可用於自用於因子設計及Box-Behnken設計之肝素前體預測具有不同MN之肝素前體的反應條件。
市售肝素通常具有11.9%至17.6%之N-乙醯基含量，其中平均N-乙醯基含量為14.8%(Guerrini等人(2001)「Combined quantitative(1)H and(13)C nuclear magnetic resonance spectroscopy for characterization of heparin preparations」，Semin Thromb Hemost 27：473-82)。已發現，市售肝素具有14.3 KDa至15.9 KDa範圍內之MN，其中平均MN為15.1 KDa。藉由肝素前體之N-去乙醯化及N-磺化產生之N-磺基，N-乙醯基肝素前體需要經歷酶C5差向異構化及O-磺化以變為生物工程肝素(圖1)。根據C5差向異構化及O-磺化圖案，靶標N-磺基，N-乙醯基肝素前體之N-乙醯基含量應理想地為14.8%，或在11.9%至17.6%範圍內；且N-磺基，N-乙醯基肝素前體之靶標MN應理想地為11.7 KDa，或在11.0 KDa至12.3 KDa範圍內。根據全因子設計之結果，2 M NaOH、3 h反應時間及60℃反應溫度之反應條件給出具有與靶標極為接近之性質的產物。因此，2 M NaOH、3 h反應時間及60℃反應溫度之反應條件選擇為Box-Behnkeh設計之中心點。按經驗選擇每一因子之高水準及低水準(表 6a)且以10 mg/ml肝素前體濃度水準執行所有反應，此時肝素前體濃度並不顯著且高水準可增加過程通量。Box-Behnken設計及反應闡釋於表6b中。
利用Minitab®軟體分析Box-Behnken反應，且回歸結果闡釋於表6c中。對於反應「產物回收率」，大多數變量及其二次項之P值大於0.05，此指示在實驗設計範圍內其並不顯著影響產物回收率；僅X1 2及截距項具有小於0.05之P值。然而，R2值相對較低(0.823)，此指示僅反應可變性中之82.3%可由模型解釋；此外，利用F測試針對反應「產物回收率」之方差分析給出2.59之F值及0.154之P值，此指示在95%顯著性水準下回歸模型並不顯著。因此，認為反應「產物回收率」之可變性係在實驗設計範圍下由隨機誤差引起且並不選擇為最佳化目標。
N-乙醯基含量之回歸模型的R2係0.995，且F值及P值分別係119.87及0，此指示回歸模型之良好擬合及顯著性。類似地，解聚合作用因子之回歸模型給出0.960之R2、13.47之F值及0.005之P值，此驗證回歸模型之擬合及顯著性。可利用以下二階多項方程式解釋NaOH濃度、反應時間及反應溫度對產物N-乙醯基含量及解聚合作用因子之效應：N-乙醯基含量Y1(%)=15.02-23.793X1-8.083X2-17.575X3+10.527X1 2+4.579X2 2+5.973X3 2+3.472X1X2+6.941X1X3+3.433X2X3 (7)解聚合作用因子Y2=0.72963-0.03175X1-0.09502X2-0.2227X3+ 0.01088X1 2+0.02028X2 2+0.01632X3 2-0.0257X1X2-0.02684X1X3-0.04509X2X3 (8)
利用圖7a、b及c中之三維反應面及輪廓繪圖闡釋NaOH濃度、反應時間及反應溫度對產物N-乙醯基含量之效應。利用圖8a、b及c中之三維反應面及輪廓繪圖闡釋NaOH濃度、反應時間及反應溫度對產物解聚合作用因子之效應。在利用方程式7及8闡述之反應面模型下，可解決根據起始肝素前體材料之MN產生具有恰當N-乙醯基含量及具體解聚合作用因子之產物的反應條件。
首先針對MN為14.0 KDa之K5肝素前體批料測試模型，該K5肝素前體批料小於用於構建反應表面模型之K5材料且將需要0.83之解聚合作用因子以產生期望分子量為約11.7 KDa之N-磺基，N-乙醯基肝素前體。在由方程式7及8闡述之反應面模型下，NaOH濃度之編碼值為0.535、反應時間為-1且反應溫度為0.0777之反應條件應提供N-乙醯基含量為約14.8%且MN為約11.7 KDa之N-磺基，N-乙醯基肝素前體。反應條件對應於2.54 M NaOH濃度、2 h反應時間及60.8℃反應溫度。在該等條件下實施反應且經分析N-磺基，N-乙醯基肝素前體產物具有15.6%之N-乙醯基含量及11.3 KDa之MN，其接近靶標且在市售肝素之可變性範圍內。隨後使用模型預測另一K5肝素前體批料之反應條件，其大於用於構建MN為18.4 KDa之模型的肝素前體。反應面模型預測NaOH濃度之編碼反應值為-0.238，反應時間為1且反應溫度為0.143，以產生具有期望N-乙醯基含量及MN 之N-磺基，N-乙醯基產物。反應條件對應於1.76 M NaOH濃度、4 h反應時間及61.4℃反應溫度。利用上述條件實施反應且獲得具有13.5% N-乙醯基含量及11.5 KDa MN之N-磺基，N-乙醯基肝素前體產物。N-乙醯基含量及MN接近靶標且在市售肝素之可變性範圍內。
IV.討論
已發現，與NaOH之反應可用於單一步驟過程中以使肝素前體部分解聚並N-去乙醯化以獲得具有用於製造生物工程肝素所需之N-乙醯化程度、MN、MW及PDI的產物。然而，每一反應程度取決於時間、溫度及反應物之濃度。此外，端視培養條件而定，自埃希氏大腸桿菌K5發酵獲得之肝素前體的鏈長度及分佈有所變化。
藉由全因子設計及Box-Behnken設計實驗確立反應面模型。此模型提供選擇反應條件以獲得具有期望性質之N-磺基，N-乙醯基肝素前體的指南。此外，該模型係在針對生物工程肝素生產製造理想N-磺基，N-乙醯基肝素前體中解決多目標最佳化問題之基礎。滿足產物之恰當N-乙醯基含量及MN的單一反應條件可自模型方程式獲得。
研發模型方程式7以控制N-磺基，N-乙醯基肝素前體產物之N-乙醯基含量的性質。起始肝素前體材料經100% N-乙醯化，N-去乙醯化步驟將N-乙醯基轉化為N-胺基，且N-磺化步驟完全磺化N-胺基成為N-磺基。藉由改變利用方程式7闡述之反應條件，可在N-去乙醯化及N-磺化反應中獲得不同剩餘N-乙醯基含量。為製備N-磺基，N-乙醯基肝素前 體以生成生物工程肝素，靶向14.8% N-乙醯基含量，其係市售肝素之報告平均N-乙醯基含量。
研發模型方程式8以控制產物MN。術語「解聚合作用因子」用於闡述反應期間發生之解聚合作用程度。預計肝素前體之N-去乙醯化作用期間的解聚合作用係隨機的且不依賴於起始材料鏈長度。預計解聚合作用程度依賴於反應條件且因此，可藉由改變反應條件加以改變以針對具有不同MN之起始肝素前體材料獲得不同解聚合作用程度。該等預計理論上可靠且利用吾人之模型以實驗方式加以驗證。因此，該模型可藉由改變解聚合作用因子用於控制產物MN。
產物回收率最初包括於利用全因子設計之研究中，其中發現其可顯著受NaOH濃度、反應時間及反應溫度之影響。然而，在Box-Behnken設計中反應條件因子之變化範圍降低時，驚奇地發現產物回收率在彼等參數內有效地恆定。因此，由於具體輸入因子，可以已知回收率獲得已知產物，由此大大簡化對商業生產之施加之反應。
該模型將肝素前體之N-去乙醯化條件之最佳化轉化為解決兩個方程式7及8之數學問題，其可利用Minitab®及Matlab®軟體容易地達成。該設計可利用相對較少之實驗運行次數有效地估計一階及二階係數。在預測點屬於自中心點(0,0,0)之半徑內時，三因子Box-Behnken設計具有其最好預測能力。Myers等人，(2002)「Response surface methodology-process and product optimization using designed experiments」，第2版，John Wiley & Sons,New York,NY。
此範圍涵蓋Mn下限為12.6 KDa且上限為24.6 KDa之肝素前體起始材料。若肝素前體起始材料之Mn在此範圍外，則預測之變方差可能較大。
為獲得此範圍內之肝素前體起始材料，可能需要利用K5裂解酶或酸之部分解聚合作用。
V.結論
在化學上與醫藥肝素相同之生物工程肝素的生產仍未明瞭。作為合成法之起始材料之肝素前體係藉由細菌發酵產生。為處理成肝素，必須使肝素前體部分去乙醯化至適當含量之N-乙醯基葡糖胺殘基。其必須亦經磺化至N-磺基葡糖胺之正確含量。最終，必須降低自發酵產生之通常較大分子的MN、MW及PDI，該問題會因肝素前體中批次與批次間大的變化而放大。令人驚奇地，現已顯示，可在單一步驟鹼催化之反應中處理肝素前體，該反應產生最佳程度之N-去乙醯化作用及解聚合作用，而獲得可處理成在若干方面與醫藥肝素實質上相同之生物工程肝素的產物。本發明者亦已判別出用於調整反應條件之相關因子及演算法，以自可變化之肝素前體源獲得用於進一步處理成生物工程肝素之期望N-去乙醯化N-磺化產物。
此方法令人驚奇之處在於其產生具有所期望N-乙醯基葡糖胺、N-磺基葡糖胺、MN、MW及PDI之分子。其進一步令人驚奇之處在於該方法高度適於商業生產。舉例而言， N-去乙醯化作用及解聚合作用可在單一步驟中進行，且適於在同一反應容器中磺化。此外，該等反應使用高濃度之肝素前體進行，並具有極高且穩定之產率。
儘管肝素前體起始材料具有高可變性，但藉由建立可最佳化3個關鍵條件之定製模型，預期可在高產率下以相對較少步驟獲得相當均一產物。該等結果即建立一種用於使生物工程肝素商業化之關鍵製造步驟。
圖1. 自埃希氏大腸桿菌K5肝素前體產生生物工程抗凝血劑肝素之方案。
圖2A-2B. 2A：來自3 h之N-去乙醯化K5肝素前體之N-磺基，N-乙醯基肝素前體的1H-NMR。2B：隨N-去乙醯化反應時間變化之剩餘N-乙醯基含量。誤差棒代表標準偏差。
圖3A-3B. 3A：K5肝素前體(頂部)及N-去乙醯化K5肝素前體(底部)之尺寸排除層析圖。在該圖上標注自每一試樣之層析圖計算之MN、MW及PDI。3B：牛肺肝素梯(泳道1)、生物工程肝素(泳道2)及藥用豬腸肝素(USP肝素)(泳道3)之聚丙烯醯胺凝膠電泳凝膠。在該圖上標注自每一試樣之凝膠計算之MN、MW及PDI。
圖4. 生物工程肝素(A)及市售USP肝素試樣(B)之1H-NMR。
圖5A-5B. 硫酸乙醯肝素/肝素中最常見之二糖的液相層析-質譜。5A：生物工程肝素之提取離子層析圖；5B：市售USP肝素之提取離子層析圖(0S：△UA-GlcNAc，NS：△UA-GlcNS，6S：△UA-GlcNAc6S，2S：△UA2S-GlcNAc，NS6S：△UA-GlcNS6S，NS2S：△UA2S-GlcNS，2S6S：△UA2S-GlcNAc6S，TriS：△UA2S-GlcNS6S)。
圖6. 生物工程肝素及藥用豬腸肝素(USP肝素)之活化之部分促凝血酶原激酶時間分析。基礎活化之部分促凝血酶原激酶時間係30.5±0.25秒，數據代表平均值±SD，n=3。
圖7A-7C. 7A. NaOH濃度及反應時間對產物N-乙醯基含量之效應的反應面及相應輪廓繪圖，反應溫度固定為編碼值0(實際值為60℃)。7B. NaOH濃度及反應溫度對產物N-乙醯基含量之效應的反應面及相應輪廓繪圖，反應時間固定為編碼值0(實際值為3 h)。7C. 反應時間及反應溫度對產物N-乙醯基含量之效應的反應面及相應輪廓繪圖，NaOH濃度固定為編碼值0(實際值為2 M)。
圖8A-8C. 8A. NaOH濃度及反應時間對產物解聚合作用因子之效應的反應面及相應輪廓繪圖，反應溫度固定為編碼值0(實際值為60℃)。8B. NaOH濃度及反應溫度對產物解聚合作用因子之效應的反應面及相應輪廓繪圖，反應時間固定為編碼值0(實際值為3 h)。8C. 反應時間及反應溫度對產物解聚合作用因子之效應的反應面及相應輪廓繪圖，NaOH濃度固定為編碼值0(實際值為2 M)。

Claims (17)

  1. 一種自肝素前體製造生物工程肝素之方法，其包括在NaOH中，在足以獲得以下結果之時間及條件下培育肝素前體：(a)部分N-去乙醯化作用至N-乙醯基含量介於11.5%與18%之間，及(b)部分解聚合作用，以獲得9 kDa至12.5 kDa之分子數量平均分子量(MN)，之後再進行進一步反應。
  2. 如請求項1之方法，其中該等反應條件包括在以下條件下培育(i)在1.0 M至3.0 M NaOH中，(ii)持續2 h至4 h，(iii)於50℃至70℃下。
  3. 如請求項2之方法，其中該等反應條件係：(i)在1.0 M至2.0 M NaOH中，(ii)持續2.5 h至4 h，(iii)於55℃至65℃下。
  4. 如請求項1之方法，其中肝素前體之初始濃度係約10 g/L。
  5. 如請求項1之方法，其中使用方程式(7)計算獲得該期望N-乙醯基含量之反應條件：Y1(%)=15.02-23.793X1-8.083X2-17.575X3+10.527X1 2+4.579X2 2+5.973X3 2+3.472X1X2+6.941X1X3+3.433X2X3 (7)其中Y1係N-乙醯基含量，X1係NaOH莫耳濃度，X2係反應時間(以小時表示)，且X3係反應溫度(攝氏溫度)。
  6. 如請求項1之方法，其中使用以下方程式計算獲得該期望解聚合作用因子之反應條件：Y2=0.72963-0.03175X1-0.09502X2-0.2227X3+0.01088X1 2+0.02028X2 2+0.01632X3 2-0.0257X1X2-0.02684X1X3-0.04509X2X3 (8)其中Y2係解聚合作用因子，X1係NaOH莫耳濃度，X2係反應時間(以小時表示)，且X3係反應溫度(攝氏溫度)。
  7. 如請求項1之方法，其中藉由組合方程式(7)與(8)來計算該等最佳反應條件Y1(%)=15.02-23.793X1-8.083X2-17.575X3+10.527X1 2+4.579X2 2+5.973X3 2+3.472X1X2+6.941X1X3+3.433X2X3 (7) Y2=0.72963-0.03175X1-0.09502X2-0.2227X3+0.01088X1 2+0.02028X2 2+0.01632X3 2-0.0257X1X2-0.02684X1X3-0.04509X2X3 (8)其中Y1係N-乙醯基含量，Y2係解聚合作用因子，X1係NaOH莫耳濃度，X2係反應時間(以小時表示)，且X3係反應溫度。
  8. 如請求項1之方法，其進一步包括選擇性N-磺化。
  9. 如請求項8之方法，其中利用三甲胺-三氧化硫複合物進行選擇性N-磺化。
  10. 如請求項8之方法，其中N-乙醯基葡糖胺與N-磺基葡糖胺之比率實質上與醫藥肝素相當。
  11. 如請求項8之方法，其進一步包括：(1)利用C5-差向異構酶及2-O-磺基轉移酶之等單位(equi-unit)混合物的C5-差向異構化/2-O-磺化；(2)利用6-O-磺基轉移酶-1及6-O-磺基轉移酶-3之等單位混合物的6-O-磺化；及(3)在PAP再 生系統之存在下利用3-O-磺基轉移酶-1之3-O-磺化。
  12. 如請求項11之方法，其中該產物係關於以下方面實質上等同醫藥肝素之生物工程肝素：(i)N-乙醯基葡糖胺及N-磺基葡糖胺含量及(ii)數量平均分子量(MN)、重量平均分子量(MW)及多分散性指數(PDI)。
  13. 如請求項12之方法，其中該生物工程肝素具有實質上等同醫藥肝素之凝血時間。
  14. 如請求項1之方法，其中該起始材料係具有介於12.6 kDa與24.6 kDa間之MN的肝素前體。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項12或13中任一項之生物工程肝素。
  16. 一種如請求項15之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療疾病之產品。
  17. 一種抗凝血劑，其含有如請求項12或13中任一項之生物工程肝素作為活性成份。
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