JP7495061B2

JP7495061B2 - 抗炎症作用を有する硫酸化オリゴ糖

Info

Publication number: JP7495061B2
Application number: JP2020544568A
Authority: JP
Inventors: アーノルド，ケイトリン; シー，ディン; シー，ヨンメイ; パブリンスキ，ラファウ; リウ，ジエン
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Research Foundation of State University of New York
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Research Foundation of State University of New York
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: WO2019090203A1; CN111601603A; EP3691653A1; EP3691653A4; US11865137B2; US20240216419A1; JP2021502470A; US20210169923A1; JP2024056723A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月３日出願の米国仮特許出願第６２／５８１，４４３号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本明細書において、いくつかの実施形態では、抗炎症作用を有する新しい硫酸化ヘパラン硫酸オリゴ糖化合物を開示する。例えば、いくつかの実施形態では、化合物が薬物誘発性肝障害に対して保護効果を示すことが観察される。特定の操作理論に拘束されることは所望されないが、化合物はおそらく、無菌的炎症性損傷に関与する重要なシグナル伝達相互作用であるＨＭＧＢ１／ＲＡＧＥの相互作用を阻害する。本発見は、炎症反応の過剰反応によって引き起こされる広範囲の疾患に適用することができる。

発明の背景
無菌的炎症は、細胞の障害に対応して組織の修復を開始する自然プロセスである。しかし、最初の発作後の過剰な炎症は、周囲の健康な組織に障害を与えることが多く、多くの疾患プロセスの主要な原因である。高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）は、転写を調節し、壊死性細胞死中に核から放出されるＤＮＡ結合タンパク質である（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ、２０１０年；Ｃｈｅｎ、２０１０年）。細胞外では、ＨＭＧＢ１は炎症誘発性分子として作用する障害関連分子パターン（ＤＡＭＰ）タンパク質であり、炎症細胞の損傷部位への遊走および活性化を調整する（Ｂｉａｎｃｈｉ、２０１７年）。ＨＭＧＢ１依存性炎症は、虚血再灌流および薬物誘発性肝損傷と関連している（Ｈｕｅｂｅｎｅｒ、２０１５年）。

アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は、パラセタモールとしても知られており、広く使用されている鎮痛剤であり、Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標）の医薬品有効成分である。治療用量を大幅に超える用量の摂取により急性肝不全（ＡＬＦ）が引き起こされる（Ｈｅａｒｄ、２００８年）。オピオイドとＡＰＡＰとの合剤であるＶｉｃｏｄｉｎ（登録商標）またはＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標）の誤用によっても、ＡＬＦが引き起こされる可能性がある。米国では、薬物誘発性肝損傷のほぼ５０％がＡＰＡＰ毒性（Ｌｅｅ、２００７年）に起因しており、これは毎年約８０，０００の救急外来受診にあたる（Ｂｌｉｅｄｅｎ、２０１４年）。ＡＰＡＰ毒性の機序は、肝細胞の壊死を引き起こす反応性化学種、Ｎ－アセチル－ｐ－ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）への代謝変換から始まる。（Ｔａｃｋｅ、２０１５年）。壊死性肝細胞は、終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）を介して好中球の走化性を促進するＨＭＧＢ１を放出し、無菌的炎症を活性化し、肝損傷を増幅する（Ｈｕｅｂｅｎｅｒ、２０１５年）。

しかし、それを必要とする対象における炎症を処置するための追加の組成物および方法が、当技術分野において依然として必要である。

概要
本概要は、本明細書にて開示する主題のいくつかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形および変更を列挙する。本概要は、膨大かつ多様な実施形態の単なる例示である。所与の実施形態の１つまたは複数の代表的な特徴についての言及も、同様に例示である。そのような実施形態は、典型的には、言及された特徴の有無にかかわらず存在することができ、同様に、これらの特徴は、この概要に列挙されているかどうかにかかわらず、本明細書にて開示する主題の他の実施形態に適用することができる。過度の繰り返しを避けるために、この概要では、そのような特徴のすべての可能な組合せを列挙しておらず、提案もしていない。

いくつかの実施形態では、抗炎症特性を有する小分子化合物であって、この小分子化合物は、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子を含み、任意に、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用に十分に影響を与えるように、ＨＭＧＢ１タンパク質と相互作用するように構成されている、小分子化合物を本明細書において提供する。オリゴ糖分子は、約１０～約２０の糖単位、または約１２～約１８の糖単位を含むことができる。オリゴ糖分子は、約１８の糖単位を含むことができる。

いくつかの実施形態では、

（式中、Ｒ＝－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである）
で示される二糖構造単位を含む小分子化合物を、本明細書において提供する。二糖構造単位は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、およびＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで肝損傷に対して保護する。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで好中球浸潤を減少させる。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで炎症を低下させる。

本明細書では、対象を処置する方法であって、処置を受ける対象を用意することであって、対象が炎症を患っていること、および抗炎症特性を有する非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子を対象に投与することを含み、任意に、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用に十分に影響を与えるように、ＨＭＧＢ１タンパク質と相互作用するように構成されている、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、炎症の増加をもたらす任意の損傷を患っている。いくつかの実施形態では、対象は肝損傷を患っている。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象は、パラセタモール（ＡＰＡＰ）の過量投与を患っている対象である。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、小分子化合物は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、およびＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）からなる群から選択される二糖構造単位を含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、約１０～約２０の糖単位、または約１２～約１８の糖単位を含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、約１８の糖単位を含む。オリゴ糖分子の投与は、対象における好中球浸潤を減少させることができる。オリゴ糖分子の投与は、対象における炎症を低下させることができる。オリゴ糖分子の投与は、対象における肝障害および多臓器系不全に対して保護することができる。いくつかの態様では、処置を受ける対象は、薬物誘発性炎症を患っている。

いくつかの態様では、本明細書では、対象におけるパラセタモール（ＡＰＡＰ）の過量投与を処置する方法であって、ＡＰＡＰ過量投与の処置を必要とする対象を用意すること、抗炎症特性を有する非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子を対象に投与することを含み、任意に、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用に十分に影響を与えるように、ＨＭＧＢ１タンパク質と相互作用するように構成されており、対象におけるＡＰＡＰの過量投与による障害が軽減する、方法を提供する。対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、いくつかの実施形態では、過量投与後０時間～２４時間の間、または過量投与後少なくとも１２時間以内に有効であり得る。対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、肝損傷および／または多臓器系不全に対する保護を含むことができる。対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、対象における好中球浸潤の減少を含むことができる。対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、ＨＭＧＢ１タンパク質とＲＡＧＥとの間の相互作用を遮断することを含むことができる。いくつかの態様では、本小分子化合物は、

（式中、Ｒ＝－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである）
で示される二糖構造単位を含む。小分子化合物は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、およびＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）からなる群から選択される二糖構造単位を含むことができる。オリゴ糖分子は、約１０～約２０の糖単位、または約１２～約１８の糖単位を含む。いくつかの態様では、オリゴ糖分子は、約１８の糖単位を含む。

したがって、本明細書にて開示する主題の目的は、抗炎症作用を有する硫酸化ヘパラン硫酸オリゴ糖化合物、ならびにその製造方法および使用方法を提供することである。

この目的および他の目的は、本明細書にて開示する主題によって、全体的にまたは部分的に達成される。さらに、上述した本明細書にて開示する主題の目的、本明細書にて開示する主題の他の目的および利点は、以下の説明、図面および実施例を検討した後、当業者に明らかになるであろう。

本明細書にて開示する主題は、以下の図を参照することにより、よりよく理解することができる。図中の構成要素は必ずしも正確な縮尺ではなく、代わりに、本明細書にて開示する主題の原理を（多くの場合、概略的に）示すことに重点が置かれている。図において、同様の参照番号は、異なる図を通じて対応する部分を示す。本明細書にて開示する主題のさらなる理解は、添付の図面の図に示された実施形態を参照することによって得ることができる。図示の実施形態は、本明細書にて開示する主題を実行するためのシステムの単なる例示であるが、本明細書にて開示する主題の構成および操作方法の両方は、一般に、そのさらなる目的および利点とともに、図面および以下の説明を参照することによってより容易に理解され得る。図面は、添付されたまたは後に修正される特許請求の範囲に詳細に示されている本明細書にて開示する主題の範囲を限定することを意図しているのではなく、単に本明細書にて開示する主題を明確にし、例示することを意図している。

本明細書にて開示する主題のより完全な理解のために、ここで以下の図面を参照する、すなわち、

１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。１８量体オリゴ糖の合成のための化学酵素的合成経路の略図である。本明細書に開示された１８量体オリゴ糖の化学構造の概略図である。ＡＰＡＰ過量投与後の肝損傷に対する１８量体オリゴ糖の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与後の肝損傷に対する１８量体オリゴ糖の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与後の肝損傷に対する１８量体オリゴ糖の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与後の肝損傷に対する１８量体オリゴ糖の効果を示すデータのグラフ図である。炎症を低下させるためにＨＭＧＢ１を標的とする１８量体オリゴ糖を示すデータのグラフ図である。炎症を低下させるためにＨＭＧＢ１を標的とする１８量体オリゴ糖を示すデータのグラフ図である。炎症を低下させるためにＨＭＧＢ１を標的とする１８量体オリゴ糖を示すデータのグラフ図である。炎症を低下させるためにＨＭＧＢ１を標的とする１８量体オリゴ糖を示すデータのグラフ図である。ＨＳオリゴ糖のシンボル構造を示す。図４Ｅの凡例である。ＡＰＡＰ過量投与に対する遅れた１８量体オリゴ糖処置の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与に対する遅れた１８量体オリゴ糖処置の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与に対する遅れた１８量体オリゴ糖処置の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与に対する遅れた１８量体オリゴ糖処置の効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与マウスの生物学的パラメーターを示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与マウスの生物学的パラメーターを示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与マウスの生物学的パラメーターを示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与マウスの生物学的パラメーターを示すデータのグラフ図である。ビオチン化および非ビオチン化オリゴ糖の化学構造、６量体、１２量体、１８量体および１８量体ＡＸａの略図である。６量体、１２量体、１８量体および１８量体ＡＸａオリゴ糖の保護効果を示すデータのグラフ図である。６量体、１２量体、１８量体および１８量体ＡＸａオリゴ糖の保護効果を示すデータのグラフ図である。６量体、１２量体、１８量体および１８量体ＡＸａオリゴ糖の保護効果を示すデータのグラフ図である。６量体、１２量体、１８量体および１８量体ＡＸａオリゴ糖の保護効果を示すデータのグラフ図である。ＡＰＡＰ過量投与がＡＬＴのレベルの増加を示すデータのグラフ図である。好中球の遊走およびシンデカン－１の切断をもたらすことを示すデータのグラフ図である；ＡＬＦ患者からのシンデカン－１の分析に基づくデータのグラフ表示である。ＡＬＦ患者におけるＡＬＴの血漿濃度に基づくデータのグラフ表示である。ＡＬＦ患者におけるＨＭＧＢ１の血漿濃度に基づくデータのグラフ表示である。

詳細な説明
ここで、本明細書にて開示する主題について以下でより完全に説明し、本明細書にて開示する主題のすべてではないがいくつかの実施形態について説明する。実際、本明細書にて開示する主題は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、この開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。

ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、細胞表面および細胞外マトリックスに豊富に存在する硫酸化多糖である。ＨＭＧＢ１を含む多くのＤＡＭＰはＨＳ結合タンパク質である（Ｘｕ、２０１１年）。ＨＳは、ケモカインの提示および好中球の経内皮遊走を含む、炎症のさまざまな側面に関与している（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、２００３年；Ｗａｎｇ、２００５年；Ａｘｅｌｓｓｏｎ、２０１３年；およびＳａｒｒｉｓ、２０１２年）。ＨＳは、スルホ基を有するグルコサミン残基に連結したグルクロン酸（ＧｌｃＡ）またはイズロン酸（ＩｄｏＡ）の二糖繰り返し単位からなる。ＨＳの鎖長および硫酸化パターンがその生物学的機能を決定する（Ｇａｍａ、２００６年）。本明細書にて開示する主題の態様によれば、抗炎症効果を活用するために特別に設計されたＨＳ１８糖（１８量体）の合成が提供される。この１８量体は、マウスモデルにおいてＨＭＧＢ１の炎症誘発性活性を中和することにより、ＡＰＡＰ誘発性急性肝不全を保護する。提示された結果は、ＨＭＧＢ１媒介炎症性疾患を抑制するための新しい化合物の余地を提供する。

いくつかの実施形態では、抗炎症特性を有する小分子化合物が開示される。いくつかの実施形態では、小分子化合物は、抗炎症特性を有する非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子を含む。いくつかの実施形態では、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用に十分に影響を与えるように、ＨＭＧＢ１タンパク質と相互作用するように構成されている。

いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する主題による小分子化合物は、

（式中、Ｒ＝－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである）
で示される二糖構造単位を含むか、またはそれを含む組成物の一部であり得る。限定ではなく例として、この二糖組成物は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、およびＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）中に見出すことができる。本明細書にて開示する主題による組成物は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリンまたはＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、約１０～約２０の糖単位、または約１２～約１８の糖単位を含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、約１８の糖単位を含む。いくつかの実施形態では、抗炎症効果を示すヘパラン硫酸オリゴ糖の一般的な構造は、

（式中、Ｒ^３はＨまたは検出可能なタグである）
を含む。いくつかの実施形態では、検出可能なタグはパラニトロフェニルを含む。

いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、以下の構造

のうちの１つを含む。

本明細書にて開示する主題の組成物は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。任意の好適な医薬製剤を使用して、対象への投与のための組成物を調製することができる。いくつかの実施形態では、組成物および／または担体は、ヒトにおいて薬学的に許容され得る。

例えば、好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、および製剤を対象の体液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与または複数回投与の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を加えるだけでよい凍結またはフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。いくつかの例示的な成分は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、一例では０．１～１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、別の例では約２．０ｍｇ／ｍｌであり；および／またはマンニトールもしくは別の糖であり、例えば１０～１００ｍｇ／ｍｌの範囲、別の例では約３０ｍｇ／ｍｌであり；および／またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

特に前述の成分に加えて、本明細書にて開示する主題の製剤は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野における従来の他の薬剤を含むことができることを理解すべきである。例えば、発熱物質を含まない滅菌水溶液および非水溶液を使用することができる。

対象を処置する方法はまた、炎症を含む状態を処置する方法を含むがこれに限定されない、本明細書にて開示する主題に従って提供される。本明細書にて開示する主題の治療方法は、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用に十分に影響を与えるように、ＨＭＧＢ１タンパク質と相互作用するように構成されている。

いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで肝損傷に対して保護する。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで好中球浸潤を減少させる。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで炎症を低下させる。

いくつかの実施形態では、対象は炎症を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、炎症の増加をもたらす任意の損傷を患っている。いくつかの実施形態では、対象は肝損傷を患っている。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象は、パラセタモール（アセトアミノフェンまたはＡＰＡＰ）の過量投与を患っている対象である。

いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する主題において処置を受ける対象は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載の方法は、「対象」という用語に含まれることが意図されているすべての脊椎動物種（例えば、哺乳類、鳥など）に対して有効であると理解されるべきである。

より詳細には、ヒトなどの哺乳動物、ならびに絶滅の危機にあるために重要な哺乳動物（例えば、シベリアトラなど）、経済的に重要な哺乳動物（ヒトが消費するために農場で飼育された動物）、および／またはヒトにとって社会的に重要な哺乳動物（ペットとしてまたは動物園で飼育されている動物）、例えば、ヒト以外の肉食動物（例えば、ネコおよびイヌなど）、ブタ（ピッグ、ホッグ、およびイノシシ）、反芻動物（例えば、ウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダなど）、およびウマの処置が、本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載の方法は、家畜化されたブタ（ピッグおよびホッグ）、反芻動物、ウマ、および類似のものを含むがこれらに限定されない家畜の処置を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、対象における好中球浸潤を減少させる。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子の投与は、対象における炎症を低下させる。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子の投与は、対象における肝障害および多臓器系不全に対して保護する。いくつかの実施形態では、処置を受ける対象は、薬物誘発性炎症を患っている。いくつかの実施形態では、対象におけるＡＰＡＰ過量投与による障害が軽減する。

いくつかの実施形態では、対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、過量投与後０時間～２４時間の間、またはいくつかの実施形態では、過量投与後少なくとも１２時間以内、およびいくつかの実施形態では、過量投与後６時間以内に有効である。いくつかの実施形態では、対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、肝損傷および／または多臓器系不全に対する保護を含む。いくつかの実施形態では、対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、対象における好中球浸潤の減少を含む。いくつかの実施形態では、対象におけるＡＰＡＰ過量投与の処置は、ＨＭＧＢ１タンパク質とＲＡＧＥとの間の相互作用を遮断することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する主題に従う小分子化合物は、

（式中、Ｒ＝－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである）
で示される二糖構造単位を含む。限定ではなく例として、この二糖構造単位は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、またはＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）中に見出すことができる。本明細書にて開示する方法に従い用いられる組成物は、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリンまたはＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、インビボで肝損傷に対して保護し、例えば、インビボで肝保護を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、インビボで好中球浸潤を減少させる。いくつかの実施形態では、対象は肝損傷を患っている。いくつかの実施形態では、処置を必要とする対象は、パラセタモール（アセトアミノフェンまたはＡＰＡＰ）の過量投与を患っている対象である。

いくつかの実施形態では、オリゴ糖分子は、以下の構造

のうちの１つを含む。

定義
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本明細書にて開示する主題を限定することを意図するものではない。

以下の用語は当業者によってよく理解されていると考えられるが、本明細書にて開示する主題の説明を容易にするために以下の定義を示す。

本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、以下で特に定義されない限り、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有することが意図されている。本明細書で使用される技法への言及は、当業者に明らかであろうそれらの技法の変形または同等の技法の置換を含む、当技術分野で一般に理解されている技法を指すことが意図されている。以下の用語は当業者によってよく理解されていると考えられるが、本明細書にて開示する主題の説明を容易にするために以下の定義を示す。

本出願で使用される「非抗凝固性」という用語および「抗凝固性なし」という句は、抗凝固活性が第Ｘａ因子および／または第ＩＩａ因子の阻害に起因する、約５０単位／ｍｇ以下の抗凝固活性を有する本明細書にて開示する主題を説明する。

本明細書にて開示する主題を説明する際に、いくつかの技法および工程が開示されることが理解されるであろう。これらのそれぞれには個別の利益があり、それぞれは他の開示された技法の１つもしくは複数、または場合によってはすべてと組み合わせて使用することもできる。

したがって、明確にするために、本明細書では、個々の工程の可能なすべての組合せを不必要に繰り返すことを差し控える。それにもかかわらず、明細書および特許請求の範囲は、そのような組合せが本発明および特許請求の範囲の範囲内に完全に含まれるという理解を前提として読まれるべきである。

長年にわたる特許法の慣例に従い、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含め、本出願にて使用される場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「単位セル」への言及は、複数のそのような単位セルを含む、などである。

他に示されている場合を除き、明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、特に異議を唱えない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメーターは、本明細書にて開示する主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、組成物、質量、重量、温度、時間、体積、濃度、百分率などの値または量に関する場合、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、いくつかの実施形態では±０．１％の、特定された量からの変動を包含することを意味し、したがって変動は、開示された方法を実施するため、または開示された組成物を使用するために適切である。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「を特徴とする」と同義語である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素または方法工程を除外するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、クレームの記載に使用される専門用語であって、指名された要素が必須であることを意味するが、別の要素を付加することができ、それでもなおクレームの範囲内の構成物を形成することができる。

本明細書で使用される場合、「からなる」という句は、クレームで明記されていない、いかなる要素、工程、または成分をも除外する。「からなる」という句が前段の直後ではなく、クレーム本文の文節に出現する場合、それはその文節に記載されている要素を限定するにすぎず、他の要素は全体としてクレームから除外されない。

本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」という句は、クレームの範囲を、明記された材料または工程および特許請求された主題の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる」、および「本質的に～からなる」という用語に関して、これらの３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本明細書にて開示され、特許請求された主題は、他の２つの用語のいずれの使用をも含むことができる。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、実体の列挙との関係で使用される場合、実体が単独でまたは組合せで存在することを指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤ」という句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを個別に含むが、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのあらゆる組合せおよび副組合せも含む。

以下の実施例は、本明細書にて開示する主題の種々の実施形態をさらに説明するために含まれる。しかし、当業者であれば、本開示の見地から、本明細書にて開示する主題の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更がなされ、依然として同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。

実施例１
アセトアミノフェン／パラセタモール（ＡＰＡＰ）の過量投与は、米国およびヨーロッパでの薬物誘発性急性肝不全（ＡＬＦ）の主な原因である。疾患の進行は、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出によって誘発される無菌的炎症に起因する。ＨＭＧＢ１の炎症誘発性活性を中和するための、特定の効果的かつ安全なアプローチが非常に望ましい。ＨＭＧＢ１を標的とすることにより強力な肝保護を示すＨＳ１８糖（１８量体）を、本明細書にて、いくつかの実施形態において開示する。ＡＰＡＰの過量投与に対応した内因性シンデカン－１の役割を調査することにより、１８量体の保護機序が実証された。本明細書にて開示するデータは、１８量体により、シンデカン－１によって媒介される宿主の抗炎症効果が増強することを示唆している。最後に、ＡＰＡＰの過量投与から６時間後に投与された１８量体は、依然として保護的であり、したがって、遅発性の患者にＮ－アセチルシステインを上回る治療上の利点を提供することが実証されている。合成ＨＳによって、ＡＬＦおよび他のＨＭＧＢ１関与炎症性疾患の処置のための新しいアプローチが開かれる。

一連の新規硫酸化ヘパラン硫酸オリゴ糖化合物を合成した。特に、化学酵素合成を使用して、抗凝固活性のない純粋なＨＳ／ヘパリン様オリゴ糖を得た。１８量体ＮＳ２Ｓと呼ばれる１つの例示的な化合物を、マウスにおける詳細なインビボ試験に使用した。１８量体ＮＳ２Ｓにより、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性急性肝不全との関係において、損傷が大幅に低下した。特定の操作理論に拘束されることは所望されないが、１８量体ＮＳ２Ｓの作用機序には、おそらくＨＭＧＢ１／ＲＡＧＥが関与している。１８量体ＮＳ２Ｓ処置は、マウスにおけるＡＰＡＰ過量投与の６時間後に依然として有効であるが、臨床的に使用された解毒剤ＮＡＣは、この時点では有効性を失っている。これらの観察の追加の説明は、以下の実施例に見出すことができる。

化学酵素合成を使用して、抗凝固活性のない、新規で純粋なオリゴ糖化合物を生成した。代表的な合成経路は、以下の実施例に開示されている。一連の１８量体化合物および１つの１２量体、および１つの６量体化合物を、インビボで使用した。１つの例示的な１８量体ＮＳ２Ｓは、インビボで肝損傷に対して保護的であることが示された。本実施例では、１８量体ＮＳ２Ｓにより、インビボでの生存率が大幅に増加する。１８量体ＮＳ２Ｓにより好中球浸潤が減少する。ＲＡＧＥノックアウトマウスは、１８量体ＮＳ２Ｓの保護効果に感受性がないことが観察された。この観察は、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）の過量投与後の遅れた処置が可能であることを裏付けている。

実施例２
材料および方法
試験設計
この試験は、ＨＳ１８糖（１８量体）を合成し、ＡＰＡＰ誘発性肝不全マウスモデルにおいてその抗炎症効果を評価するために設計された。１８量体ＮＳ２Ｓ（非抗凝固性化合物；１８量体と呼ばれる）および１８量体ＡＸａ（抗凝固性化合物）を含む２つのＨＳ１８量体の化学酵素合成を、本明細書にて実証する。２つの１８量体の構造を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）と高分解能質量分析（ＭＳ）の両方を使用して確認した。ＨＭＧＢ１とビオチン化１８量体および１８量体ＡＸａとの間の結合の実証は、アビジンアガロースカラムとそれに続くウエスタン分析を使用して達成した。ＨＭＧＢ１は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるナノモル範囲で１８量体および１８量体ＡＸａに結合する。合成された１８量体の肝保護効果を、良好に確立されたＡＰＡＰ誘発性肝不全マウスモデルにおいて評価した。肝障害は、血漿ＡＬＴレベルとヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色肝切片の検査とを含む２つの方法で評価した。ＡＰＡＰ過量投与後の炎症反応は、損傷部位への好中球遊走を測定することにより評価した。第Ｘａ因子（ＦＸａ）活性をサロゲートとして使用して、インビトロおよびインビボの両方の実験で１８量体、１２量体および６量体の抗凝固活性を評価した。試験群および対照群の動物の数、ならびに統計分析を、図の凡例にて示す。匿名の患者のＡＬＦ血漿サンプルを、（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＤｉａｂｅｔｅｓａｎｄＤｉｇｅｓｔｉｖｅａｎｄＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａの）ＡｃｕｔｅＬｉｖｅｒＦａｉｌｕｒｅＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ（ＡＬＦＳＧ）バイオリポジトリから入手し、切断されたシンデカン－１の血漿レベルを測定した。３１の患者サンプルを分析した後、健常対照群（ｎ＝１１）とＡＦＬ患者との間に明確な統計的差異が観察されたため、分析を中止した。

ＨＳ生合成酵素の発現
ＮＳＴ、Ｃ_５－ｅｐｉ、２－ＯＳＴ、６－ＯＳＴ－１、６－ＯＳＴ－３、３－ＯＳＴ－１、３－ＯＳＴ－５、およびｐｍＨＳ２を含む合計９つの酵素を、合成に使用した。Ｃ_５－ｅｐｉおよび２－ＯＳＴを除くすべての酵素を、以前記載されているように（Ｒｅｎｐｅｎｇら、２０１０年；Ｘｕら、２００８年）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて、適切なアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。組換えＣ_５－ｅｐｉおよび２－ＯＳＴを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現アプローチ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して昆虫細胞内で発現させ、高い発現レベルを得た（１９）。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）、ウリジン５’－ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰ－ＧｌｃＡ）、ウリジン５’－ジホスホＮ－トリフルオロアセチルグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＴＦＡ）を含む３つの酵素補因子すべてを、以前記載された酵素的アプローチ（Ｎａｍ、２０１７年）を使用して、社内で合成した。

非ビオチン化１８量体ＡＸａの合成
１８量体ＡＸａの合成は、１８量体から開始した。６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（６－ＯＳＴ）修飾と３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼアイソフォーム１（３－ＯＳＴ－１）修飾を含む２つの酵素修飾を追加した。６－Ｏ－硫酸化工程では、１８量体（０．５ｍＭ）を、ＭＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、６－ＯＳＴ－１（５０μｇｍｌ^－１）、６－ＯＳＴ－３（５０μｇｍｌ^－１）およびＰＡＰＳ（６ヒドロキシル基量１．５当量）を含有する緩衝液中で、６０ｍｌで３７℃にて一晩でインキュベートした。次に、生成物を、次の３－Ｏ－硫酸化工程のためにＱ－セファロースカラムにより精製した。

３－Ｏ－硫酸化工程を、３－ＯＳＴ－１酵素によって完了させた。６－Ｏ－硫酸化１８量体（０．５ｍＭ）を、ＭＥＳ（５０ｍＭ）緩衝液（ｐＨ７．０）、３－ＯＳＴ－１（２０μｇｍｌ^－１）およびＰＡＰＳ（０．６７５ｍＭ）を含有する溶液中で、２０ｍｌで３７℃にて２時間インキュベートした。生成物を、Ｑ－セファロースカラムにより精製した。合成中、生成物を、ＤＥＡＥ－ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ製）を使用してＨＰＬＣにより監視した。

非ビオチン化６量体および非ビオチン化１２量体の合成を、酵素的方法を使用して完了させ、この合成は、以前報告されていた（Ｘｕ、２０１７年）。

非ビオチン化オリゴ糖のビオチン化オリゴ糖への変換
４種類の非ビオチン化オリゴ糖、６量体、１２量体、１８量体、および１８量体ＡＸａを、ビオチン化対応物に変換させた。ｐＮＰタグ付き６量体、１２量体、１８量体、および１８量体ＡＸａ（５～１０ｍｇ）とＰｄ／Ｃ０．５ｍｇを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０中に合計体積４ｍｌで溶解させた。反応混合物を３回真空引きして、Ｈ_２を再充填した。次に反応物を室温で４時間インキュベートした。その後、ろ過して炭を除去した。ろ過した溶液を、５００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４を使用してｐＨ８．５に調整した。スクシンイミジル６－アジドヘキサノエート（出発オリゴ糖の２０モル当量）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。反応物をＤＥＡＥ－ＨＰＬＣカラムで精製して、アジドタグ付きオリゴ糖を生成した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液にＮ_２を５分間バブリングして、０．１ＭＣｕＳＯ_４、０．１Ｍトリス（３－ヒドロキシプロピル－トリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）、０．１５Ｍアスコルビン酸ナトリウム、０．０１Ｍアジドタグ付きオリゴ糖、および０．０２Ｍビオチン－ＰＥＧ_４－アルキン（Ｓｉｇｍａ）のサンプル溶液を調製した。ＴＨＰＴＡ４００μｌとＣｕＳＯ_４８０μｌとの混合物をボルテックスし、次にアスコルビン酸ナトリウム１６０μｌ、アジドタグ付きオリゴマー２００μｌ、およびビオチン－ＰＥＧ４－アルキン２００μｌを加え、Ｎ_２で２分間バブリングし、次に３７℃で一晩インキュベートした。反応物をＤＥＡＥ－ＨＰＬＣカラムで精製して、ビオチン化産物を生成した。反応物を、ＨＰＬＣおよびＭＳを使用して監視した。

ＨＰＬＣ分析
ＤＥＡＥ－ＮＰＲＨＰＬＣとポリアミン系アニオン交換（ＰＡＭＮ）－ＨＰＬＣの両方を使用して、生成物の純度を分析した。ＨＰＬＣ分析の溶出条件は他所に記載されていた（Ｒｅｎｐｅｎｇら、２０１０）。要約すると、ＤＥＡＥ－ＨＰＬＣ法の場合、カラムＴＳＫゲルＤＮＡ－ＮＰＲ（４．６×７５ｍｍ、ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に０～１ＭＮａＣｌの直線勾配をかけながら、０．４ｍｌｍｉｎ^－１の流速で６０分間溶出した。ＰＡＭＮ－ＨＰＬＣの場合、カラム（ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ－ＨＰＬＣ、４．６×２５０ｍｍ、ＹＭＣ製）を、０～１ＭＫＨ_２ＰＯ_４の直線勾配をかけながら、４０分間溶出し、次に１Ｍで０．５ｍｌｍｉｎ^－１の流速で３０分間保持した。

オリゴ糖のＭＳ分析
低分解能分析を、ＴｈｅｒｍｏＬＣＱ－Ｄｅｃａで実施した。オリゴ糖は、２００：ｌのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ混合物（９：１、体積／体積）で直接希釈した。シリンジポンプ（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、サンプルを直接注入（５０μｌｍｉｎ^－１）で導入した。実験は、陰イオン化モードで行った。エレクトロスプレー源を５ｋＶおよび２７５℃に設定し、合成非硫酸化オリゴ糖をＨ_２Ｏ２００μｌで希釈した。エレクトロスプレー源を３ｋＶおよび１５０℃に設定し、硫酸化オリゴ糖を１０ｍＭ重炭酸アンモニウム２００μｌで希釈した。フルスキャンＭＳの場合、自動ゲイン制御を１×１０^７に設定した。ＭＳデータを取得し、Ｘｃａｌｉｂｕｒ１．３を使用して処理した。

高分解能ＥＳＩ－ＭＳ分析を、以下の条件下においてＴｈｅｒｍｏＬＴＱＸＬＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｂｒｅｍａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。Ｌｕｎａ親水性液体相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラム（２．０×５０ｍｍ^２、２００Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して、オリゴ糖混合物を分離した。移動相Ａは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）グレードの水で調製した５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。移動相Ｂは、９８％のＨＰＬＣグレードのアセトニトリルおよび２％のＨＰＬＣグレードの水で調製した５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。Ａｇｉｌｅｎｔ１２００オートサンプラーを介して５．０μｌの１２量体混合物（１．０μｇμｌ^－１）を注入した後、ＨＰＬＣバイナリポンプを使用して、２５０μｌｍｉｎ^－１の流速で１０分にわたって、３％Ａ～８０％Ａの勾配を供給した。ＬＣカラムを、ＬＴＱ－ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬフーリエ変換（ＦＴ）質量分析計（ＭＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ－Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）の標準エレクトロスプレーイオン化源にオンラインで直接接続した。インソースフラグメンテーションを防止するために使用される最適化パラメーターには、スプレー電圧４．２ｋＶ、キャピラリー電圧－４０Ｖ、チューブレンズ電圧－５０Ｖ、キャピラリー温度２７５℃、シース流速４０、および補助ガス流速２０が含まれた。質量スペクトルの外部校正では、通常、質量精度は３ｐｐｍ未満であった。すべてのＦＴ質量スペクトルを、２００～２０００Ｄａの質量範囲で６０，０００の分解能にて取得した。

ヒト血漿サンプルのＬＣ／ＭＳ二糖分析
健常対照対象およびＡＰＡＰ－ＡＬＦ患者のプールされた個々の血漿サンプルを、３００μｌの消化用緩衝液（ｐＨ７．０に調整された２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸アンモニウム）中で消化させた。組換えヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ（最適ｐＨ７．０～７．５）および組換えコンドロイチンリアーゼＡＢＣ（各１０ｍＵ、最適ｐＨ７．４）を各サンプルに加え、よく混合した。サンプルをすべて３７℃の水浴に１２時間置き、その後、遠心分離により酵素を除去することにより酵素消化を終了させた。フィルターユニットを２５０μｌの蒸留水で２回洗浄し、二糖生成物を含む濾液を真空遠心分離機により乾燥させた。乾燥サンプルは、ＤＭＳＯ／酢酸（１７／３、体積／体積）中で０．１Ｍ２－アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）１０μｌを加えることによってＡＭＡＣ標識して、室温で１０分間インキュベートし、続いて１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液１０μｌを加え、４５℃で１時間インキュベートした。０．５ｎｇμｌ^－１で調製されたＩｄｕｒｏｎ（英国）から購入したすべての１７－二糖標準を含む混合物を同様にＡＭＡＣ標識し、外部標準として各実行に使用した。ＡＭＡＣ標識反応後、サンプルを遠心分離にかけ、各上清を回収した。ＬＣは、ＡｇｉｌｅｎｔＰｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＥＣＣ１８（２．７μｍ、３．０×５０ｍｍ）カラムを使用して、４５℃にてＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＬＣシステムで実施した。移動相Ａは５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液であり、移動相Ｂはメタノールであった。移動相は、３００μｌｍｉｎ^－１の流速でカラムを通過した。勾配は０～１０分、５～４５％Ｂ；１０～１０．２分、４５～１００％Ｂ；１０．２～１４分、１００％Ｂ；１４～２２分、１００～５％Ｂであった。注入量は、５μｌである。検出器には、ＥＳＩ源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたトリプル四重極型質量分析システムを使用した。オンラインＭＳ分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで行った。ＭＳパラメーター：スプレー電圧３０００Ｖ、気化器温度３００℃、およびキャピラリー温度２７０℃の陰イオン化モード。

ＮＭＲ分析
１８量体および１８量体ＡＸａのＮＭＲスペクトルは、ＴｏｐＳｐｉｎ２．１．６ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を搭載したＢｒｕｋｅｒ８００ＭＨｚ標準ボアＮＭＲ分光計で取得した。サンプル（３．０～６．０ｍｇ）をそれぞれ、９９．９％Ｄ_２Ｏ０．４ｍｌ中に溶解させ、５０００ｘｇで１分間遠心分離にかけ、凍結乾燥させた。このプロセスを２回繰り返し、最終サンプルを９９．９９％Ｄ_２Ｏ０．４５ｍＬ中に溶解させた。１Ｈ分光法、^１Ｈ－^１Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ）、^１Ｈ－^１３Ｃ異種核１量子コヒーレンス分光法（ＨＳＱＣ）、^１Ｈ－^１Ｈ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）および^１Ｈ－^１Ｈ核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）の実験はすべて、２９８Ｋで行った。

ＨＭＧＢ１の発現
ヒトＨＭＧＢ１の完全なオープンリーディングフレームを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｃ－６Ｈｉｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）にクローニングした。トランスフェクションは、ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使用して実施した。組換えＨＭＧＢ１－ｈｉｓを、３１℃にて浮遊２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で産生した。細胞ライセートからのＨＭＧＢ１－ｈｉｓの精製は、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦａｓｔＦｌｏｗゲル（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して行った。精製後、ＨＭＧＢ１－ｈｉｓは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとその後に続く銀染色で測定すると、＞９９％純度であった。エンドトキシンの除去は、Ｄｅｔｏｘｉ－Ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施し、最終エンドトキシンレベルは、発色性ＬＡＬエンドトキシンアッセイ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）により、＜０．１ＥＵ／μｇタンパク質であった。組換えＨＭＧＢ１－ｈｉｓは、それぞれ細胞シグナル伝達アッセイおよび空気嚢（ａｉｒｐｏｕｃｈ）アッセイ（以下で詳細に記載）によって評価された、サイトカイン活性とケモカイン活性の両方を有していた。

ＨＳオリゴ糖からのエンドトキシンの除去
５０ｍｌ遠心フィルターユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００ｋ；ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を４，０００ｒｐｍで３０分間使用して、ＨＳオリゴ糖からエンドトキシンを除去した。フィルターインサートに毎回１ｍｌのエンドトキシンフリー水を再充填して、このプロセスを３回繰り返した。ろ過した溶液を収集した。エンドトキシンのレベルは、リムルスアメボサイトライセート（ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）キット（ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｆＣａｐｅＣｏｄＩｎｃ．）を使用して測定した。ＬＡＬ試験は、再構成パイロテル（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ）（感度０．０３エンドトキシン単位ｍｌ^－１）１００μｌを、動物の注射に使用される濃度である滅菌生理食塩水中の０．１ｍｇｍｌ^－１ＨＳオリゴ糖１００μｌに加えることによって実施した。パイロテルおよびＨＳオリゴ糖を、１０ｍｍ×７５ｍｍの非発熱処理した（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）ガラス反応管（ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓｏｆＣａｐｅＣｏｄＩｎｃ．）に加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート時間の終了時に、チューブを逆さにした。ゲル塊が形成されている場合、サンプルはエンドトキシン陽性である。サンプルが溶液中に残っている場合、陰性結果は、サンプル中のエンドトキシンがパイロテルの感度を下回っていることを意味する。試験されたＨＳオリゴ糖溶液はすべて陰性であった。

組織学／免疫組織化学
肝臓組織を室温で２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。肝臓切片（４μｍ）をヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、または抗好中球モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ａｂ２５５７、ＮＩＭＰ－Ｒ１４）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）もしくは抗シンデカン－１（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６００３５、クローン２８１．２）（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）およびヤギ抗ラットビオチン化二次抗体（Ａｂｃａｍ）で免疫染色した。フィブリン（フィブリノゲン）染色には、ポリクローナル抗フィブリン（フィブリノゲン）（ＤａｋｏｏｆＡｇｉｌｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用し、それに続いてヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用した。包埋、薄片化、およびＨ＆Ｅ染色は、ＵＮＣＣｈａｐｅｌＨｉｌｌのＡｎｉｍａｌＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｒｅ施設で実施した。Ｈ＆Ｅ分析は、ＵＮＣＣｈａｐｅｌＨｉｌｌのＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｒｅ施設で、ＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｃａｎａｄａ）を使用して実施した。ＩＨＣ画像を、明視野顕微鏡（ＬｅｉｃａＤＭ１０００ＬＥＤ、ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、ＩＬ、ＵＳＡ）に取り付けられたＨＤカメラを使用してキャプチャし、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。好中球の定量化では、サンプルごとに５つの１００倍画像をランダムに選択し、平均好中球／視野を報告した。

炎症のマウスモデル：腹膜炎および空気嚢
２つのモデル、すなわち腹膜炎および空気嚢炎症モデルを使用して、インビボでの好中球遊走を試験した。腹膜炎モデルでは、２０μｇの１８量体の非存在下または存在下で、３０ｍｇの肝臓ライセートをマウスの腹腔内に注入した。２０時間後、イソフルランの吸入によりマウスを安楽死させ、腹腔を氷冷ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄した。腹膜洗浄物を使用して、フローサイトメトリーを用いて好中球遊走を測定した。

空気嚢技法では、マウスの背中の皮下に３ｍｌの滅菌空気を注入する。３日後、嚢に滅菌空気を再充填する。６日目に、２２．３μｇの１８量体の非存在下または存在下で、５μｇの組換えＨＭＧＢ１を空気嚢内に注入した。対照マウスには、ＰＢＳ中２ｍｇｍｌ^－１ＢＳＡを注入した。４時間後、マウスをイソフルラン吸入により安楽死させ、空気嚢をＰＢＳのみで洗浄した。洗浄物を使用して、フローサイトメトリーを用いて好中球遊走を測定した。

フローサイトメトリー
腹膜洗浄物および空気嚢洗浄物を、Ｌｙ－６Ｇ／Ｌｙ－６Ｃ（モノクローナル抗マウスＲＢ６－８Ｃ５、ＰＥ－Ｃｙ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣｄ１１ｂ（モノクローナル抗マウスＭ１／７０、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する蛍光標識抗体で染色した。サンプルを、ＳｔｒａｔｅｄｉｇｍＳ１０００Ｅｘｉフローサイトメーターにて測定した。

イムノブロット
肝臓ライセートは、屠殺時に組織を液体窒素で瞬間凍結することにより調製した。組織を、２００ｍＭＭＥＳ、５００ｍＭホスフェート、および１ｍＭＥＤＴＡを含む、ｐＨ６の緩衝液中で機械的に均質化し、その後３回の凍結融解を行った。溶解したサンプルを、４℃にて１００００×ｇで１５分間遠心分離にかけた。ビオチン化ＨＳオリゴ糖（最終濃度１５μＭ）を、１００μｌの未処理肝臓ライセート（約１２．５ｍｇ）と混合し、４℃にて一晩インキュベートした。Ｐｉｅｒｃｅ高結合能ストレプトアビジンアガロース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ビオチン化ＨＳオリゴ糖結合複合体を単離した。５０ｍＭＭＥＳ、５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６で洗浄した後、サンプルをＬＤＳ緩衝液で溶出した。溶出したサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ４～１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓタンパク質ゲルを使用して分離し、抗ＨＭＧＢ１抗体（Ａｂｃａｍ、ウサギモノクローナルＥＰＲ３５０７）およびヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を使用してアッセイした。

^３５Ｓ標識ＨＳの調製および組換えＨＭＧＢ１への結合試験
［^３５Ｓ］ＨＳを、［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ（４×１０^７ｃｐｍ）およびＮ－スルホトランスフェラーゼ（ＮＳＴ）（１００μｇｍｌ^－１）、ならびにウシ腎臓由来のＨＳを使用して、合計体積２ｍｌの５０ｍＭＭＥＳ中で調製した。［^３５Ｓ］ＨＳ（１．３５ｘ１０^５ｃｐｍ）を、ｐＨ６の５０ｍＭＭＥＳ、７０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール中の１μｇの組換えＨＭＧＢ１でインキュベートし、室温にて３０分間インキュベートした。５μｇのクロマチン免疫沈降グレードの抗ＨＭＧＢ１（Ａｂｃａｍ）を加え、４℃で１時間インキュベートした。ＤｙｎａｂｅａｄｓＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して反応混合物を精製し、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５の緩衝液で溶出した。溶出したサンプルを、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ；ＧＭＩ、Ｒａｍｓｅｙ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して［^３５Ｓ］計数について測定した。［^３５Ｓ］ＨＳは、組換えＨＭＧＢ１の非存在下で陰性対照として機能する。

表面プラズモン共鳴
ビオチン化ＨＳ１８量体（１８量体および１８量体ＡＸａ）を、製造元のプロトコルに基づいてストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した。手短に言えば、２０μｌのビオチン化ＨＳオリゴ糖を、ＳＡチップのフローセル２、３、および４（ＦＣ２、ＦＣ３、およびＦＣ４）に１０μｌｍｉｎ^－１の流速で注入した。ビオチン化オリゴ糖の固定化が成功したことを、ＳＡチップ上で５６３、８２３、５０５、５５３および１７６レゾナンスユニット（ＲＵ）の増加がそれぞれ観察されたことにより確認した。対照フローセル（ＦＣ１）は、飽和ビオチンを１分間注入して調製した。

組換えＨＭＧＢ１を、ｐＨ７．４の０．０１ＭＨＥＰＥＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０中で希釈した。１０００、５００、２５０、１２５、および６３ｎＭの濃度の組換えＨＭＧＢ１を、３０μｌｍｉｎ^－１の流速で注入した。組換えＨＭＧＢ１注入の最後に、同じ緩衝液をＳＡ表面上に流して、解離を促進させた。３分の解離時間後、２ＭＮａＣｌ３０μｌを注入して、ＳＡ表面を再生させた。応答を、２５℃で時間の関数（センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ））として監視した。種々の組換えＨＭＧＢ１濃度のセンソグラムを、１：１ラングミュアモデルに全体的に適合させた。ＳＰＲ測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ｃｏｎｔｒｏｌおよびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）を使用して操作されたＢＩＡｃｏｒｅ３０００で実施した。

ＡＰＡＰ－ＡＬＦ患者血漿
１．８ｍｇｍｌ^－１ＥＤＴＡを含むＡＰＡＰ－ＡＬＦ患者の血漿を、（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＤｉａｂｅｔｅｓａｎｄＤｉｇｅｓｔｉｖｅａｎｄＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａの）ＡｃｕｔｅＬｉｖｅｒＦａｉｌｕｒｅＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ（ＡＬＦＳＧ）バイオリポジトリから入手した。試験設計および収集方法の詳細については、以前記載されている（３５）。要約すると、選択基準および除外基準を満たす成人患者がＡＬＦＳＧレジストリに登録され、これは１９９８年に開始された。レジストリへの加入時に血漿サンプルを入手した。この試験では、ＡＰＡＰ過量投与患者の血漿のみを分析した。摂取されたＡＰＡＰの推定量、摂取から入院までの推定時間、過量投与の意図性、および患者の個体群統計（年齢、性別、人種、併存症など）を含む臨床データは、この試験では明らかにされていなかった。ＥＬＩＳＡキット（ヒトシンデカン－１ＥＬＩＳＡ、ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＮｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して、製造元のプロトコルに従って、血漿シンデカン－１レベルを測定した。血漿ＨＭＧＢ１レベルを、製造元のプロトコルに従ってＨＭＧＢ１ＥＬＩＳＡを使用して測定した。血漿ＡＬＴレベルは、ＡＬＴＩｎｆｉｎｉｔｙ試薬を使用して測定した。

インビトロおよびエクスビボ抗ＦＸａ活性の測定
アッセイは以前に公開された方法に基づいていた（１９）。要約すると、ヒトＦＸａ（ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳｏｕｔｈＢｅｎｄ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を、ＰＢＳで５０Ｕｍｌ^－１に希釈した。発色基質Ｓ－２７６５（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を、水で１ｍｇｍｌ^－１に希釈した。インビトロ試験では、フォンダパリヌクスおよびＨＳオリゴ糖（１８量体、１２量体、６量体、および１８量体ＡＸａ）をＰＢＳ中に種々の濃度（１１～１３１ｎＭ）で溶解させた。１６μｌのサンプルを、６０μｌの３５μｌｍｌ^－１アンチトロンビン（ＣｕｔｔｅｒＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）で室温にて２分間インキュベートした。次に、１００μｌのＦＸａを加え、室温で４分間インキュベートした。３０μｌのＳ－２７６５基質を加え、反応混合物の吸光度を、４０５ｎｍで５分間連続して測定した。ＰＢＳは、対照サンプルとして機能する。各サンプルの最大勾配を、対照サンプルの最大勾配で割ることによりＦＸａ活性パーセントに変換した。

エクスビボでの試験では、ＡＰＡＰのみで処置されたマウスにおけるＡＰＡＰ過量投与の２４時間後に収集されたマウス血漿、１８量体、および１８量体ＡＸａを使用して、同じプロトコルに従った。

統計分析
すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして表される。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７．０３；ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して、実験群と対照群との間の統計的有意性を、対応のない両側スチューデントｔ検定によって、複数群間については一元配置ＡＮＯＶＡ続いてダネットまたはテューキーの多重比較検定によって、およびログランク検定によるカプランマイヤー生存曲線により分析した。

実施例３
ＨＳ１８量体の合成
１８量体の合成は、以前に公開された化学酵素的方法（１７、３１）に従って完了させた。要約すると、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のヘパロサンシンターゼ２（ＰｍＨＳ２）を使用して、単糖ＧｌｃＡ－ｐＮＰを適切なサイズの骨格鎖に伸長させた。次に、骨格鎖を、Ｎ－スルホトランスフェラーゼ（ＮＳＴ）、Ｃ_５－エピメラーゼ（Ｃ_５－ｅｐｉ）、および２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（２－ＯＳＴ）の修飾に供した。合成全体に関与する５つの主要な工程が存在し、工程ａ（ＧｌｃＮＴＦＡを付加する伸長工程）、工程ｂ（ＧｌｃＡを付加する伸長工程）、工程ｃ（ＬｉＯＨを使用した脱トリフルオロアセチル化）、工程ｄ（Ｎ－硫酸化工程）、工程ｅ（２－Ｏ－硫酸化／エピマー化）（図１Ａ～１Ｇ）が含まれていた。

工程ａは、ＧｌｃＮＴＦＡ残基の付加を含む、オリゴ糖骨格鎖を所望のサイズに伸長することであった。要約すると、ＧｌｃＡ－ｐＮＰ（３．２ｍＭ）を、トリス（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）、ＭｎＣｌ_２（５ｍＭ）、ｐｍＨＳ２（６０μｇｍｌ^－１）およびＵＤＰ－ＧｌｃＮＴＦＡ（４．５ｍＭ）を含む緩衝液中に溶解させて、次に３０℃で一晩インキュベートした。合計反応体積は４Ｌであった。Ｃ_１８カラム（３×１５ｃｍ、または１２０ｇ、Ｂｉｏｔａｇｅ）を、勾配溶出法（Ｈ_２Ｏ中０～１００％メタノール、０．１％トリフルオロ酢酸、５ｍｌｍｉｎ^－１）による精製に使用した。

工程ｂは、ＧｌｃＡ残基により伸長することであった。二糖（３．２ｍＭ）を、トリス（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）、ＭｎＣｌ_２（５ｍＭ）、ｐｍＨＳ２（３０μｇｍｌ^－１）およびＵＤＰ－ＧｌｃＡ（１．５ｍＭ）を含む緩衝液中に溶解させて、次に３０℃で一晩インキュベートした。合計反応体積は３ｌであった。Ｃ_１８カラム（３×１５ｃｍ、または１２０ｇ、Ｂｉｏｔａｇｅ）を、上記のような精製に使用した。

工程ｃは、アルカリ条件下でＧｌｃＮＴＦＡ残基をＧｌｃＮＨ_２残基に変換することであった。オリゴ糖（１３ｍＭ）の脱トリフルオロアセチル化を、氷浴下の０．１ＭＬｉＯＨ中で０．５時間実行した。生成物を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）により監視した。反応が完了した後、直ちに塩酸（１Ｍ）を用いてｐＨを７．０に調整した。

工程ｄは、ＮＳＴ酵素を使用してＧｌｃＮＨ_２残基をＧｌｃＮＳ残基に変換することであった。一例では、脱トリフルオロアセチル化四糖（１．３ｍＭ、ＧｌｃＮＨ_２－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＨ_２－ＧｌｃＡ－ｐＮＰ）を、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、５０ｍＭ）ｐＨ７．０を含む溶液中で、３７℃にて、Ｎ－スルホトランスフェラーゼ（３２μｇｍｌ^－１）およびＰＡＰＳ（１．５当量の遊離アミノ基量）で一晩インキュベートさせ、反応体積は５．６Ｌであった。

工程ｅは、内部ＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ２Ｓ残基に変換することであり、Ｃ_５－エピメラーゼと２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（２－ＯＳＴ）の両方を含む。例えば、オリゴ糖ＧｌｃＮＴＦＡ－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＳ－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＳ－ＧｌｃＡ－ｐＮＰ（１．２ｍＭ）を、トリス（２５ｍＭ）緩衝液（ｐＨ７．５）ならびに半精製Ｃ_５－エピメラーゼ（３μｇｍｌ^－１）、２－ＯＳＴ（６．５μｇｍｌ^－１）およびＰＡＰＳ（１．８ｍＭ）を含む溶液中で、３７℃にて、一晩インキュベートさせ、反応体積は４．９Ｌであった。

硫酸化生成物を、Ｑ－セファロース高速フローカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ製）を使用して精製し、２０ｍＭＮａＯＡｃ－ＨＯＡｃ、ｐＨ５．０に２ＭＮａＣｌの０～１００％直線勾配をかけながら、３時間溶出した。生成物の結合親和性および反応スケールに基づいて、さまざまなサイズのＱ－セファロースカラムおよび塩勾配を選択した。

すべての伸長合成工程で、ポリアミンＩＩカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ製）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣにより、生成物を監視した。各工程の中間体の構造を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって特徴付けた。

実施例４
ＡＰＡＰ肝損傷のマウスモデル
すべての動物実験は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａａｔＣｈａｐｅｌＨｉｌｌ（ＣｈａｐｅｌＨｉｌｌ、ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙａｔＢｕｆｆａｌｏ（Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）のＩＡＣＵＣによって承認された。Ａｇｅｒ^－／－マウスは、元々ＡｎｇｅｌｉｋａＢｉｅｒｈａｕｓ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から寄贈された（３２）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＡｇｅｒ^－／－マウスを一晩（１２～１５時間）絶食させ、グルタチオンの貯蔵を枯渇させた後、ＡＰＡＰ（Ｓｉｇｍａ）を投与した。未処理ＡＰＡＰを温かい（約５０℃）滅菌０．９％塩化ナトリウム溶液（滅菌生理食塩水）中に溶解し、３７℃に冷却して、４００または６００ｍｇｋｇ^－１で腹腔内注入した。いくつかの実験では、ＡＰＡＰの３０分後に、約２００μｌの滅菌生理食塩水中の９．５μＭＨＳオリゴ糖をマウスに皮下注入し、再びＡＰＡＰの１２時間後に約１００μｌまたは当量体積の滅菌生理食塩水中の４．７５μＭＨＳオリゴ糖を皮下注入した。

１８量体の有効性をＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）と比較するために、ＡＰＡＰの３０分後に、滅菌生理食塩水中ｐＨ７．５で３００ｍｇｋｇ^－１ＮＡＣを腹腔内注入した。別個の実験では、１８量体処置群に、３００ｍｇｋｇ^－１ＮＡＣまたは０．３４ｍｇ／ｋｇ１８量体を、ＡＰＡＰの６時間後に投与し、次にＡＰＡＰの１８時間後に０．１７ｍｇｋｇ^－１１８量体を投与した。ＡＰＡＰの２４時間後に、マウスを安楽死させ、血液および肝臓組織を収集した。

生存試験（６００ｍｇｋｇ^－１ＡＰＡＰ）では、ＡＰＡＰの３０分後に、マウスに０．４ｍｇｋｇ^－１１８量体を注入し、その後、９６時間１２時間ごとに繰り返し注入するか、または当量体積の滅菌生理食塩水を注入した。

実施例５
ＡＰＡＰ誘発性肝損傷の評価
血漿ＡＬＴは、製造元の指示に従ってＡＬＴＩｎｆｉｎｉｔｙ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。血漿ＴＮＦ－αは、製造元の指示に従って、マウスＴＮＦ－α ＤｕｏＳｅｔキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して測定した。血漿ＨＭＧＢ１レベルは、製造元の指示に従って、ＨＭＧＢ１ＥＬＩＳＡキット（ＴｅｃａｎＵＳ、ＴｅｃａｎＴｒａｄｉｎｇＡＧ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。血漿シンデカン－１レベルは、製造元の指示に従って、マウスシンデカン－１ＥＬＩＳＡ（ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。肝臓のＧＳＨレベルは、製造元の指示に従って、グルタチオンアッセイキット（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）を使用して測定した。

実施例６
１８量体はＡＰＡＰ過量投与の３６時間後に肝損傷を大幅に低下させる
上記の例と同様に、約１０週齢で体重約２５グラムのＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄型マウスに、０時間に腹腔内注入によりアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ；４００ｍｇ／ｋｇ）を過量投与した。

ＡＰＡＰの３０分後、１２時間後、および２４時間後に、マウスは１８量体の皮下注入を繰り返して受けた。頸椎脱臼によりマウスを屠殺し、大静脈から採血し、組織学のために肝臓組織を採取した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を、肝損傷のバイオマーカーとして使用した。腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を炎症のマーカーとして使用した。ヘマトキシリンおよびエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）を、組織壊死の領域を定量化するための組織学的染色技法として使用した。

得られたデータは、すべての１８量体化合物（表１）が血漿ＡＬＴレベルを低下させたことを示した。試験した１８量体はすべて効果的であったが、ＮＳ２Ｓ硫酸化パターンはＡＬＴの最も均一な低下をもたらし（ＡＰＡＰ対照と比較して平均の最大差）、その結果を表１に示す。

実施例７
結果および考察
自然供給源から単離されたＨＳは、異なる多糖鎖長および硫酸化パターンを有する非常に複雑な混合物である。構造的に均質なＨＳオリゴ糖の欠如、特に全長ＨＳと同様の機能を示す長いＨＳオリゴ糖の欠如により、治療剤としてのＨＳの利益を活用する取り組みが妨げられる（Ｌｉｕ、２０１４年）。我々は最近、優れた効率でＨＳオリゴ糖を合成する化学酵素法を開発した（Ｘｕ、２０１１年、Ｘｕ、２０１４年、Ｘｕ、２０１７年）。ここでは、ＨＳ１８糖（１８量体）３２３ｍｇを含むＨＳオリゴ糖を合成した（図１Ａ～１Ｇおよび図２）。これは、これまでに合成された最長のＨＳオリゴ糖の１つに相当する。１８量体の構造は、高分解能質量分析およびＮＭＲによって確認された。純度は、高分解能アニオン交換高速液体クロマトグラフィーによって＞９８％であると判定された。

１８量体の肝保護効果を、ＡＰＡＰ誘発性ＡＬＦマウスモデルで調べた。ＡＰＡＰの過量投与後に１８量体で処置したマウスは、正常肝細胞数が多い（図３Ａ）こと、および肝障害のバイオマーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血漿レベルが低い（図３Ｃ）ことが示すように、ＡＰＡＰ対照マウスよりも有意に健康な肝臓を有していた。１８量体による処置により、肝臓への好中球浸潤の減少および組織壊死因子α（ｔｉｓｓｕｅｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α）（ＴＮＦ－α）の血漿レベルの低下が示され（図３Ｂおよび６Ａ）、局所および全身性炎症の減弱を示唆している。１８量体によってまた、致死的なＡＰＡＰの過量投与（６００ｍｇｋｇ^－１）後の死亡率が低下し、対照群における４２％の生存率と比較して、９６時間で９０％の生存率がもたらされた（図３Ｄ）。ＡＰＡＰ対照および１８量体処置マウスの肝グルタチオン（ＧＳＨ）レベルは、試験の過程で本質的に同じであった（図６Ｂ）。ＧＳＨレベルは、ＮＡＰＱＩが形成されるにつれて低下し（Ｔａｃｋｅ、２０１５年；Ｎａｍ、２０１７年）、したがってデータは、１８量体が、ＡＰＡＰから細胞毒性中間体であるＮＡＰＱＩへの代謝変換に影響を与えないことを示唆している。これらの結果は、１８量体がＡＰＡＰ代謝に影響を与えるのではなく、炎症反応を軽減することにより肝損傷を改善することを実証している。

２連の証拠は、１８量体がＡＰＡＰ過量投与後の炎症を軽減するためにＨＭＧＢ１を標的にすることを示唆している。まず、我々は、１８量体が、２つのインビボモデルにおいてＨＭＧＢ１媒介好中球浸潤を減少させることを発見した。空気嚢モデルでは、組換えＨＭＧＢ１の注入により、広範囲の好中球浸潤が誘発され（図４Ａ）、１８量体の共投与により影響が大幅に低下した。１８量体によって、ＨＭＧＢ１により媒介されることが知られているプロセス（４）であるが、肝臓ライセートにより誘発された腹膜炎モデルにおける好中球浸潤も減少した（図６Ｃ）。次に、ＲＡＧＥノックアウトマウスまたはＡｇｅｒ^－／－マウスを使用して、１８量体がＨＭＧＢ１／ＲＡＧＥ軸を標的とすることを実証した。ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥとの相互作用は、ＡＰＡＰの過量投与における炎症誘発性反応に不可欠であるため（Ｈｕｅｂｅｎｅｒ、２０１５年）、１８量体の肝保護効果はＲＡＧＥの存在に依存すると予想される。ＡＰＡＰ過量投与後肝好中球浸潤が増加し、この増加は、Ａｇｅｒ^－／－マウスよりも野生型（ＷＴ）の方が有意に大きかった（図４Ｂ）。１８量体処置Ａｇｅｒ^－／－マウスは好中球浸潤の減少を示さなかったが、ＷＴマウスは１８量体処置に応答した（図４Ｂ）。さらに、Ａｇｅｒ^－／－マウスにおける１８量体処置では、ＡＬＴレベルを低下させることができなかった（図６Ｄ）。このデータは、１８量体は、ＲＡＧＥの非存在化では保護効果を失ったことを示唆している。

構造－活性相関試験を実行して、さまざまな形態のＨＳを使用したＨＭＧＢ１への結合、およびＡＰＡＰモデルにおける保護を調べた。６量体、１２量体、および２つの１８量体を含む４つのビオチン化オリゴ糖を合成した（図４Ｅ）（構造および特徴については、図７を参照のこと）。これらの中で、６量体、１２量体、１８量体は鎖長のみが異なっており、硫酸化パターンは異なっていなかった。これらのオリゴ糖は、抗第Ｘａ因子活性を欠いているため、非抗凝固性である。１８量体ＡＸａは、強力な抗第Ｘａ因子活性を有する高度に硫酸化された抗凝固性１８糖である（図８Ａおよび８Ｂ）。１８量体および１８量体ＡＸａでは、マウスの肝臓ライセート由来のＨＭＧＢ１に結合することが観察されたが、６量体でも１２量体でも観察されず、このことは、結合に最低限必要な鎖長が存在することを示唆している（図４Ｃ）。ＨＭＧＢ１結合定数（Ｋ_Ｄ）は、表面プラズモン共鳴により１８６ｎＭ（１８量体の場合）および６５ｎＭ（１８量体ＡＸａ）であると測定されたが、ＡＬＴ（図４Ｄ）および好中球浸潤（図８Ｃ）により測定すると、１８量体のみが肝保護効果を示した。６量体および１２量体による肝保護の欠如が、ＨＭＧＢ１に結合できないことと相関していることは明らかである。しかし、１８量体ＡＸａは、ＨＭＧＢ１に結合することができるが、これも肝保護を欠いていた。抗凝固性未分画ヘパリンも、ＡＰＡＰの過量投与後の肝保護を欠いていたため、肝保護の欠如はその抗凝固活性によるものである可能性がある（図８Ｄ）。Ｋｏｐｅｃおよび同僚は、ＡＰＡＰの過量投与後に肝臓の修復を活性化するためにフィブリンが必要であると報告している（２０）。１８量体ＡＸａを投与すると、フィブリン形成が減少し、したがって、肝保護が失われる。

１８量体の保護的役割をさらに理解するために、肝細胞に存在する主要なＨＳプロテオグリカンであるシンデカン－１の役割を、ＡＰＡＰの過量投与に対応して調査した。シンデカン－１は、ＨＳ鎖が結合したコアタンパク質を含み、病的状態ではマトリックスメタロプロテアーゼによって細胞表面から切断される（Ｐａｒｋ、２０００年）。血漿シンデカン－１のより高いが変動するレベルが、ＡＰＡＰの過量投与後２４時間にわたってマウスにおいて観察された（図５Ａ）。同時に、ＨＭＧＢ１（図５Ａ）、ＡＬＴ、および肝好中球浸潤の血漿レベルは、時間の経過とともに増加した（図９Ａおよび９Ｂ）。細胞表面シンデカン－１の喪失を、肝臓切片の免疫染色によって確認した。切断されたシンデカン－１上のＨＳ鎖のサロゲート分子としてウシ腎臓由来の^３５Ｓ標識ＨＳを使用して、我々は、ＨＭＧＢ１がＨＳに結合することを実証し（図５Ｂ）、これは、異なる供給源由来のＨＳを使用した以前の報告と一致している（９）。これらの結果は、切断されたシンデカン－１がそのＨＳ鎖を介してＨＭＧＢ１に結合することを示唆している。血漿シンデカン－１レベルの有意な増加はまた、ＡＰＡＰ誘発性ＡＬＦを有する患者から観察された（図５Ｃ）。特に、ＡＰＡＰ－ＡＬＦ患者における切断されたシンデカン－１レベルは、コアタンパク質分析により測定されたたＡＰＡＰ過量投与マウスにおけるレベルよりも約２００倍高かった。ＨＳ鎖分析により、ＡＬＦ患者における切断されたシンデカン－１のレベル上昇が確認された（図１０Ａ）。ＡＰＡＰ－ＡＬＦ患者におけるＨＭＧＢ１およびＡＬＴも、健常対照群よりも高く（図１０Ｂおよび１０Ｃ）、これは以前の報告と一致している（２２）。

ＡＰＡＰ過量投与後のヒトおよびマウスにおけるシンデカン－１切断とＨＭＧＢ１放出との間の関係では、内因性保護経路が強調されている。シンデカン－１は、最初の発作後に切断され、ＨＭＧＢ１の炎症誘発性活性を中和し、それによって無菌的炎症を制限する。実際、シンデカン－１^－／－マウスは、ＷＴ動物よりもＡＰＡＰ誘発性ＡＬＦの影響を受けやすい（Ｎａｍ、２０１７年）。広範なＡＰＡＰ障害のとき、おそらく切断されたシンデカン－１はすべてのＨＭＧＢ１を中和するには不適切であると考えられ、シンデカン－１にＨＳの擬態型である１８量体を付加することにより、さらになる保護を与える。

ＮＡＰＱＩ誘発性細胞障害の後に無菌的炎症が発生するため、我々は、ＡＰＡＰの過量投与後のさらに遅れた１８量体による処置の可能性を検討した。Ｎ－アセチル－システイン（ＮＡＣ）は、ＡＰＡＰ過量投与の標準的処置法であるＮＡＰＱＩ中和抗酸化剤である。しかし、ＮＡＣ処置はＡＰＡＰ摂取から８時間以内に与えられた場合にのみ有効である（Ｂａｉｌｅｙ、２０１６年）。マウスにおいてＡＰＡＰの６時間後に投与した場合、ＮＡＣはその保護効果を失うが、１８量体はなおもＡＬＴを低下させることができる（図５Ｄ）。これらのデータは、１８量体による処置には、より広い治療ウィンドウを提供することにより、遅発性のＡＰＡＰ過量投与患者にとって潜在的利点があることを示唆している。

実施例８
結論
ＨＭＧＢ１媒介無菌的炎症を標的とすることによりＡＰＡＰ誘発性ＡＬＦを処置するための合成ＨＳの使用が、本明細書に開示されている。均質なオリゴ糖の利用能により、この効果の根底にある候補の標的および化合物を同定することができるようになった。ＨＭＧＢ１を中和させることに加えて、シンデカン－１のＨＳは、肝臓の修復を活性化し、ケモカインの活性を調節することもできる。１８量体も、これらの機能に寄与することができる。ＨＳは患者の忍容性が良好であり（Ｓｈｒｉｖｅｒ、２００４年）、ＨＳの高度に硫酸化された形態である未分画ヘパリンは、ほぼ１世紀にわたって抗凝固剤として使用されてきた（Ｓｚａｊｅｋ、２０１６年）。ここで、ＨＳオリゴ糖の合成を大規模かつ費用対効果の高い方法で実現することができる。ＨＭＧＢ１を中和する合成オリゴ糖は、ＡＬＦに有望な治療法を提供するはずである。ＨＭＧＢ１は、癌、脳卒中、および関節炎を含むさまざまな病態に関与しているため（Ｖｅｎｅｒｅａｕ、２０１６年）、新規なＨＳ系治療薬により、ＨＭＧＢ１の阻害剤としての有望な機会が提供される。

参考文献
すべての特許、特許出願およびその出版物、科学雑誌記事、ならびにデータベースエントリ（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリおよびその中で利用可能なすべての注釈）を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されているすべての参考文献は、本明細書で使用される方法論、技法、および／または組成物の補足、説明、背景の提供、または教示を行う限りにおいて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書にて開示する主題の種々の詳細は、本明細書にて開示する主題の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、前述の説明は、例示のみを目的としたものであり、限定を目的としたものではない。

Claims

抗炎症特性を有する小分子化合物であって、以下の構造

のうちの１つを含む非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子構造を含む、小分子化合物。
（式中、Ｒ＝－Ｈまたは－ＳＯ_３Ｈである）
で示される二糖構造単位を含む小分子化合物をさらに含む組成物において提供される、請求項１に記載の小分子化合物。
二糖構造単位を含む前記小分子化合物が、非抗凝固性ヘパリン、非抗凝固性低分子量ヘパリン、およびＯ－脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）からなる群から選択される、請求項２に記載の小分子化合物。
前記オリゴ糖分子構造が、インビボで肝損傷に対して保護する、請求項１から請求項３のいずれかに記載の小分子化合物。
前記オリゴ糖分子構造が、インビボで好中球浸潤を減少させる、請求項１から請求項４のいずれかに記載の小分子化合物。
前記オリゴ糖分子構造が、インビボで炎症を低下させる、請求項１から請求項５のいずれかに記載の小分子化合物。
非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子構造を含む小分子化合物を含む、炎症を処置するための治療剤であって、
前記小分子化合物は、対象に投与され、
前記非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子構造は、以下の構造

のうちの１つを含む、治療剤。
前記対象が、炎症の増加をもたらす任意の損傷を患っている、請求項７に記載の治療剤。
前記対象が肝損傷を患っている、請求項７又は請求項８に記載の治療剤。
処置を必要とする前記対象が、パラセタモール（ＡＰＡＰ）の過量投与を患っている対象である、請求項７から請求項９のいずれかに記載の治療剤。
前記小分子化合物の投与が、前記対象における好中球浸潤を減少させる、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の治療剤。
前記小分子化合物の投与が、前記対象における炎症を低下させる、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の治療剤。
前記小分子化合物の投与が、前記対象における肝障害および多臓器系不全に対して保護する、請求項７から請求項１２のいずれかに記載の治療剤。
処置を受ける前記対象が薬物誘発性炎症を患っている、請求項７から請求項１３のいずれかに記載の治療剤。
非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子構造を含む小分子化合物を含む、パラセタモール（ＡＰＡＰ）の過量投与を処置するための治療剤であって、
前記小分子化合物は、対象に投与され、
前記非抗凝固性ヘパラン硫酸オリゴ糖分子構造は、以下の構造

のうちの１つを含む、且つ、
前記対象における前記ＡＰＡＰの過量投与による障害が軽減する、治療剤。
前記対象における前記ＡＰＡＰの過量投与の前記処置が、前記過量投与後０時間～２４時間の間、または前記過量投与後少なくとも１２時間以内に有効である、請求項１５に記載の治療剤。
前記対象における前記ＡＰＡＰの過量投与の前記処置が、肝損傷および／または多臓器系不全に対する保護を含む、請求項１５又は請求項１６に記載の治療剤。
前記対象における前記ＡＰＡＰの過量投与の前記処置が、前記対象における好中球浸潤の減少を含む、請求項１５から請求項１７のいずれかに記載の治療剤。
前記対象における前記ＡＰＡＰの過量投与の前記処置が、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質と終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）との間の相互作用を遮断することを含む、請求項１５から請求項１８のいずれかに記載の治療剤。