CN116987212B - 低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物和制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物和制备方法与应用；所述低分子量硫酸乙酰肝素是含有同系糖胺聚糖类化合物的混合物；所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物是所述低分子量硫酸乙酰肝素的化学衍生产物。所述低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物的制备方法具有原料易得，反应条件温和及成本低等优点。所述低分子量硫酸乙酰肝素或所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物具有优异的促进肝细胞DNA复制、促进肝细胞增殖、抗炎症、预防与治疗肝损伤的活性，可用于制备药物组合物，所述药物组合物具有良好的促肝细胞增殖及抗炎活性，可以用于预防或治疗肝损伤。

Description

低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物和制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物和制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肝损伤是指由药物、酒精、化学物质、病毒等原因造成的肝功能受损，严重时可危及生命。肝损伤类疾病，尤其是药物性和酒精性肝损伤，正严重影响着人类的健康。研究发现，肝脏具有强大的自我修复与再生功能。及时且快速地修复与再生能够一定程度上代偿受损的肝组织，起到缓解甚至逆转病情发展的作用。因此在肝损伤的预防与治疗中，促进肝细胞的增殖，提高肝脏的自我修复与再生能力，抑制炎症，具有非常重要的意义。
已有研究表明，猪肝提取物有助于肝损伤的治疗。目前猪肝提取物工艺主要采用如下方法获得：将幼龄动物肝脏裂解或匀浆，经蛋白酶酶解后，通过不同方式去除杂质，用超滤等方法得到某一分子量范围的混合物，如公开号为CN 111574612A的专利文献公开的一种促肝细胞生长素的制备方法。然而，本发明人发现，这种方法得到的为粗提物，成分不明确，同时包含了糖、蛋白和其他分子，实际扩大生产时无法对有效成分给出质量控制标准；更重要的是，临床应用中存在更大的免疫原性风险和其他不可预知的风险使其的使用受到极大的限制。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种低分子量硫酸乙酰肝素。
本发明的第二个目的在于提供上述低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物。
所述低分子量硫酸乙酰肝素和低分子量硫酸乙酰肝素衍生物均具有促肝组织损伤后修复及抗炎活性，且活性成分和结构明确。
本发明的第三个目的在于提供上述低分子量硫酸乙酰肝素的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供上述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的制备方法。
本发明的第五个目的在于提供上述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的应用。所述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物具有良好的促组织损伤后修复及抗炎活性，可以用于制备预防和/或治疗肝损伤的药物组合物。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种低分子量硫酸乙酰肝素，所述低分子量硫酸乙酰肝素为具有式(I)所示结构的同系糖胺聚糖类化合物的混合物；所述低分子量硫酸乙酰肝素是硫酸乙酰肝素原型的酶法降解、有效组分富集产物；
式(I)中，所述R1为SO3 -或H；所述R2为SO3 -或COCH3；
所述Sequence为含有IdoA-GlcNAc，GlcA-GlcNS6S，IdoA2S-GlcNS6S三个二糖基本组成单元的特异性功能域，主要结构为：IdoA-GlcNAc-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S和/或IdoA-GlcNAc-IdoA2S-GlcNS6SGlcA-GlcNS6S；m和n均为大于等于0的任意整数，m和n不能同时为0。
所述低分子量硫酸乙酰肝素是由二糖单元连接而成的线性多糖，聚合度大于等于10糖，每个糖链均包含特征结构；所述低分子量硫酸乙酰肝素非还原端主要结构为β-D-葡萄糖醛酸或α-L-艾杜糖醛酸，还原端为酶解产生的葡萄糖胺。
一种低分子量硫酸乙酰肝素衍生物，所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物为具有式(II)所示结构的同系糖胺聚糖类化合物的混合物；所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物是所述低分子量硫酸乙酰肝素的化学衍生产物；
式(II)中，所述R1为SO3 -或H；所述R2为SO3 -或COCH3；
所述Sequence为含有IdoA-GlcNAc，GlcA-GlcNS6S，IdoA2S-GlcNS6S三个二糖基本组成单元的特异性功能域，主要结构为：IdoA-GlcNAc-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S和/或IdoA-GlcNAc-IdoA2S-GlcNS6SGlcA-GlcNS6S；m和n均为大于等于0的任意整数，m和n不能同时为0；
所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物是由二糖单元连接而成的线性多糖，聚合度大于等于10，每个糖链均包含特征结构。所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物非还原端的主要结构为β-D-葡萄糖醛酸或α-L-艾杜糖醛酸，还原端为酶解产生的葡萄糖胺。部分糖醛酸的羧基经化学衍生与脱氧胆酸偶联。
本领域技术人员可理解，所述低分子量硫酸乙酰肝素是由一系列二糖组成相近的聚合度大于等于10的如式(I)所示的包含特征寡糖结构的化合物的混合物；所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物是在式(I)的基础上进行化学衍生得到，是由如式(II)所示的包含特征寡糖结构的化合物的混合物。由式(I)和式(II)可知，本发明提供的低分子量硫酸乙酰肝素和低分子量硫酸乙酰肝素衍生物均具有特征的寡糖序列和二糖组成，具有明确的结构。
所述低分子量硫酸乙酰肝素由脊索动物门哺乳纲动物肝脏来源硫酸乙酰肝素的酶法降解、亲和富集得到；所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物由所述低分子量硫酸乙酰肝素经过化学衍生得到。
上述低分子量硫酸乙酰肝素的制备方法，所述制备方法采用以下步骤：
步骤一：从哺乳动物肝脏中提取并纯化获得硫酸乙酰肝素原型；
所述硫酸乙酰肝素原型为具有式(III)所示结构的同系糖胺聚糖类化合物的混合物；可以看出，所述硫酸乙酰肝素原型是由重复连接的二糖单元排列而成的线性多糖，平均分子量约39kDa的大分子多糖物质。二糖单元为1,4连接的己糖醛酸和己糖胺，所述己糖醛酸以葡萄糖醛酸为主；
式(III)中，所述R1为SO3 -或H；所述R2为SO3 -或COCH3，n为大于0的任意整数。
进一步地，所述提取步骤包括：将脱脂后的哺乳动物肝脏剪碎、匀浆、超声破碎后，用水作提取溶媒，加入镁盐后依次用链霉菌蛋白酶E(ActinaseE)、核酸酶对组织匀浆进行酶解，煮沸，离心，去除蛋白与核酸，得到含有硫酸乙酰肝素原型的肝脏提取液。
进一步地，所述纯化步骤包括：先采用阴离子交换层析、强阴离子交换树脂、凝胶过滤层析、透析、超滤中的任意一种方法对所述肝脏提取液进行初步处理，得到含硫酸乙酰肝素原型的混合液。然后采用乙醇、甲醇及丙酮中的任意一种试剂从得到的混合液中沉淀获取固体产物，即得硫酸乙酰肝素原型粗品。
进一步地，将所述硫酸乙酰肝素原型粗品提纯，富集及除杂后得到硫酸乙酰肝素原型；
所述硫酸乙酰肝素原型粗品提纯，富集及除杂的步骤包括：将所述硫酸乙酰肝素原型粗品用水溶解后除去杂蛋白，在碱性条件下除去硫酸乙酰肝素原型粗品连接的肽段，对反应液用阴离子交换柱等方法进行富集纯化，除去多糖杂质，冻干，得到硫酸乙酰肝素原型精品，即硫酸乙酰肝素原型。
步骤二：将所述硫酸乙酰肝素原型经酶法降解制备低分子量硫酸乙酰肝素粗品。
进一步地，将肝素酶I和/或肝素酶II与所述硫酸乙酰肝素原型混合，于25-37℃酶解12-20h。酶解完成后，煮沸灭活肝素酶，并使用凝胶渗透色谱除去酶解产生的二糖及酶解引入的其他杂质，冻干，获得低分子量硫酸乙酰肝素粗品。并用高效液相色谱法及液相-质谱联用技术进行表征。
所述酶解条件可经调整组合制备一系列分子量及硫酸化修饰水平不同的低分子量硫酸乙酰肝素粗品。
步骤三：将所述低分子量硫酸乙酰肝素粗品经亲和层析，富集有效寡糖，再经脱盐，得到低分子量硫酸乙酰肝素精品，即低分子量硫酸乙酰肝素。
进一步地，将所述低分子量硫酸乙酰肝素粗品经蛋白亲和层析柱亲和富集，使用高浓度NaCl洗脱液洗脱后，经脱盐，冻干获得所述低分子量硫酸乙酰肝素精品，即低分子量硫酸乙酰肝素，结构如式(I)所示。
进一步地，所述蛋白亲和层析柱的制备步骤包括：将DIRAS2蛋白与氨基封闭的肝素进行孵育，保护其结构域，然后偶联至琼脂糖珠，作为亲和层析的固定相，发挥富集所述低分子硫酸乙酰肝素的作用，偶联完成后，装柱，使用琼脂糖珠封闭液封闭，并用2M NaCl水溶液清洗层析柱。
进一步地，所述DIRAS2蛋白为真核细胞重组表达蛋白。
进一步地，所述氨基封闭的肝素的制备采用以下步骤：
将肝素、肝素封闭缓冲液及乙酸酐混匀并充分涡旋振荡，每20min加一次乙酸酐，共加7次，经脱盐，得到氨基封闭的肝素。
进一步地，所述富集包括：亲和柱平衡、上样、洗去非特异性结合糖链及收集纯化特异性糖链。所述富集采用以下
步骤：将所述低分子量硫酸乙酰肝素粗品用上样缓冲液溶解后，加入所述蛋白亲和层析柱，用洗脱缓冲液A洗去非特异性糖链，用洗脱缓冲液B洗脱收集。
进一步地，亲和层析所用缓冲体系为HEPES、Tris-HCl或磷酸盐缓冲液。将所述低分子量硫酸乙酰肝素粗品用上样缓冲液溶解后上样，所述上样缓冲液中NaCl浓度为0M，所述上样缓冲液的pH为7.1；用洗脱缓冲液A洗去非特异性糖链，所述洗脱缓冲液A中NaCl浓度为0.15M，所述洗脱缓冲液A的pH为7.1；用洗脱缓冲液B洗脱收集，所述洗脱缓冲液B中NaCl浓度为2M，所述洗脱缓冲液B的pH为7.1。
上述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的制备方法，所述制备方法采用以下步骤：
将所述低分子量硫酸乙酰肝素经化学修饰，获得低分子量硫酸乙酰肝素衍生物。
进一步地，所述化学修饰包括配体准备、羧基活化、衍生物制备三个步骤。
配体准备：首先将脱氧胆酸溶于甲醇中，60℃搅拌回流6h，真空干燥，冷水洗涤，冻干得脱氧胆酸甲酯。将脱氧胆酸甲酯溶于乙二胺中，120℃搅拌回流8h，加水沉淀并洗涤，冻干得到脱氧胆乙胺。
羧基活化：将所述低分子量硫酸乙酰肝素在80℃溶于甲酰胺，冷却至室温，加入碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌20min。
衍生物制备：将脱氧胆乙胺和L-半胱氨酸分别溶于二甲基甲酰胺，并将含有脱氧胆乙胺的二甲基甲酰胺溶液缓慢滴入羧基活化后的反应体系，然后缓慢滴入含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液，继续于室温搅拌反应20h。在水和甲醇的混合溶液中透析24h，在二蒸水中透析24h，冻干得所述低分子硫酸乙酰肝素衍生物，结构如式(II)所示。
一般来说，制备过程中pH值、反应时间、温度等条件对糖链解聚程度会产生影响，因此，通过改变反应条件可以制备一系列分子量分布及硫酸化修饰水平及衍生化修饰有差异的低分子量硫酸乙酰肝素。
本发明所述的低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物的制备方法，还可以有效去除残留的透明质酸等多糖杂质，提高特异性功能糖链的含量，提高本发明所述产物的纯度和生物利用度。
上述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的应用，所述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物可用于制备药物组合物。
本发明研究发现，所述硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物具有优异的促进肝细胞DNA复制、促进肝细胞增殖、抗炎症、预防与治疗肝损伤的活性。本发明提供的具有抗炎、促进肝细胞DNA复制与增殖、预防和治疗肝损伤活性的低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物较目前临床促肝细胞增殖药物相比，具有结构明确、质量可控的优势。
本发明提供低分子量硫酸乙酰肝素及衍生物在抗炎、促进肝细胞DNA复制、抗炎、促肝细胞增殖、预防和治疗肝损伤、治疗病毒性肝炎、保肝、护肝等方面的应用，所述应用为所述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物在制备促肝细胞增殖、预防或治疗肝损伤药物组合物中的应用。以及以所述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物为有效成分与药物赋形剂组成的药物组合物。
本发明提供促肝细胞增殖、促肝细胞DNA复制、抗炎、预防和治疗肝损伤的药物组合物，所述药物组合物含有本发明提供的能够有效促进肝损伤后修复及抗炎活性的低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物，所述药物组合物还包括药用赋形剂。
所述药物组合物的剂型为注射用水溶液、注射用冻干粉、口服片剂、口服胶囊剂、口服液剂或口服颗粒剂。所述含低分子量硫酸乙酰肝素的药物组合物通常制备为系统给药制剂，可以是适合静脉、肌肉内注射的给药制剂。所述含低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的药物组合物通常制备为口服给药制剂。在这些制剂中，优选的药物组合物剂型为注射用水溶液、注射用冻干粉针剂，以及经消化道给药的口服片剂、胶囊剂等。
相较于现有技术，本发明具有以下有益而独特的效果：
(1)本发明提供的低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物功能特异性结构明确，有效组分含量高，无动物来源的蛋白类杂质，便于扩大生产时的质量控制与临床应用中不良反应监测。所述低分子量硫酸乙酰肝素是由二糖单元连接而成的线性多糖，聚合度大于等于10，且每条糖链中至少包含一个特异性功能域，功能域糖链特征为包含IdoA-GlcNAc、GlcA-GlcNS6S，IdoA2S-GlcNS6S三个二糖基本组成单元，且主要结构为：IdoA-GlcNAc-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S和/或IdoA-GlcNAc-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S；所述低分子量硫酸乙酰肝素衍生物由低分子量硫酸乙酰肝素化学衍生而成。
(2)本发明提供的低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物能够显著地促进肝细胞增殖、促进肝损伤后修复、抗炎，低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物制备的药物组合物对肝损伤具有预防与治疗作用，可促进肝功能恢复。本发明提供的含有所述低分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的药物组合物补充了现有抗肝损伤药物中无多糖药物的空白。所述低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物还具有高生物利用度的优势，可作为药物组合物的主要成分，所述药物组合物具有促进肝损伤后修复及抗炎活性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为第一实施例制备的哺乳动物肝脏来源硫酸乙酰肝素原型LC-MS/MS-MRM总离子流图；
图2为第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素的SEC色谱图；
图3为第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素二糖组成单元LC-MS分析数据统计图；
图4为第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素亚硝酸降解LC-MS分析数据统计图；
图5为第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物LC-MS总离子流图；
图6为第一实施例制备的硫酸乙酰肝素原型、第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素及第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物促肝细胞增殖活性数据统计图；
图7为第一实施例制备的硫酸乙酰肝素原型、第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素及第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物促肝细胞DNA复制活性数据统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。现根据说明书附图和具体实施例对本发明进一步说明。第一实施例：猪肝来源硫酸乙酰肝素原型制备
1.将猪肝去除胆囊和结缔组织后剪碎，用匀浆器进行匀浆。
2.破碎：用超声破碎仪将所述肝脏匀浆进一步破碎，得到组织匀浆。用丙酮脱脂，离心，收集沉淀，烘干。
3.以水为提取溶剂，用NaOH将组织匀浆pH调至8-9。向上述组织匀浆中加入Actinase E(浓度为2g/kg)，在55℃酶解48h。酶解结束后煮沸灭活，室温后后加入镁盐和核酸酶至镁离子浓度1.5mM、核酸酶浓度2.5U/mL，酶解24h。达到酶解时间后，将酶解后的混合物煮沸。超速离心(离心机转速为8000g，时间为15min)，取上清液。用强阴离子交换树脂富集硫酸乙酰肝素，用0.2M NaCl水溶液洗去杂质，然后用15％的NaCl水溶液(w/v)洗脱，重复3次。可以采用阴离子交换层析、强阴离子交换树脂、凝胶过滤层析、透析及超滤中的任意一种方法对所述肝脏提取液进行初步处理。
4.向洗脱液中加入2倍体积的乙醇，静置12h，离心，取沉淀。将沉淀60℃常压干燥，得到硫酸乙酰肝素原型粗品。可以采用乙醇、甲醇及丙酮中的任意一种试剂进行沉淀获取固体产物。
5.硫酸乙酰肝素原型粗品提纯：将所述硫酸乙酰肝素原型粗品用水溶解，于4℃用2M HCl调节pH至1.2-1.5。杂蛋白变性沉淀，迅速于12000rpm离心取上清，用2M NaOH水溶液调节pH至9.0-10.0。然后加入质量浓度为1％的双氧水对所述硫酸乙酰肝素原型粗品进行氧化静置过夜，离心取上清。经盐酸中和多余的氢氧化钠后得硫酸乙酰肝素原型粗品溶液。
6.硫酸乙酰肝素原型粗品富集：首先将阴离子交换柱用高纯水平衡3个柱体积后，将所述硫酸乙酰肝素原型粗品溶液反复上样3次。然后用200mM NaCl水溶液冲洗3个柱体积，除去杂质。最后，用2M NaCl水溶液洗脱目标硫酸乙酰肝素。用截留分子量3kDa的透析袋透析，除去多余的盐，冻干，获得硫酸乙酰肝素冻干样品。
7.去除其他多糖类杂质：向上述的硫酸乙酰肝素冻干样品中加入透明质酸酶、硫酸软骨素酶、硫酸皮肤素酶，在37℃下酶解48h。酶解完成后，煮沸灭活，超速离心，取上清液。用截留分子量3kDa的透析袋除去多糖类杂质，收集目标产物。对目标产物进行冻干，得到硫酸乙酰肝素原型精品，即硫酸乙酰肝素原型(记为HS)。
8.表征：用肝素酶I、II、III，将硫酸乙酰肝素原型完全酶解为二糖，并通过LC-MS/MS-MRM的方法，实现八种二糖组成单元及其末端的相对定量，并计算平均分子量。结果如图1所示，通过分析，所述猪肝来源硫酸乙酰肝素原型平均分子量约39kDa，平均每个二糖组成单元所含硫酸基团个数约1.4，其具有上述式(I)所示的结构。
第二实施例：低分子量硫酸乙酰肝素的制备
1.取硫酸乙酰肝素原型1g，溶于30mL酶解缓冲液中，加入5IU肝素酶I，于37℃酶解14h。酶解完成后，煮沸灭活并超速离心去除肝素酶I。使用凝胶渗透色谱除去酶解产生的二糖及酶解引入的其他杂质，冻干，得到低分子量硫酸乙酰肝素粗品。所用肝素酶I可替换为肝素酶II。
2.氨基封闭的肝素的制备：将1mg肝素、肝素封闭缓冲液及1.6μL乙酸酐混匀并充分涡旋振荡，每20min加一次乙酸酐，共加7次，使用截留分子量10kDa的超滤膜脱盐，得到氨基封闭的肝素。肝素封闭缓冲液为：50mM碳酸钠，10％甲醇。
3.蛋白亲和层析柱制备：将0.5mg DIRAS2蛋白与氨基封闭的肝素于37℃混匀孵育1h。将活化的琼脂糖珠与蛋白及肝素混合，于4℃下摇床偶联12h。偶联完成后，装柱，使用琼脂糖珠封闭液封闭，并用2M NaCl水溶液清洗层析柱。DIRAS2蛋白为真核细胞重组表达蛋白。琼脂糖珠封闭液为0.1M Tris-HCl，pH 8.0。
4.低分子量硫酸乙酰肝素制备：首先用洗脱缓冲液B(2M NaCl，0.01M Tris-HCl)和上样缓冲液(0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl)分别洗涤亲和柱5个柱体积。将低分子量硫酸乙酰肝素粗品溶于上样缓冲液，并加入亲和柱，封闭柱底，轻柔吹打填料，静置5min，打开柱底，收集流穿。重复上样3次。上样结束后，用洗脱缓冲液A洗去非特异性结合组分。再用洗脱缓冲液B洗脱5个柱体积，并收集流穿。将所得流穿减压浓缩后，用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，脱盐，除去杂质，用液质水洗涤收集膜上组分，冻干后得到低分子量硫酸乙酰肝素精品，即低分子量硫酸乙酰肝素(记为LMWHS)。
5.低分子量硫酸乙酰肝素表征：(1)将所得低分子量硫酸乙酰肝素10μg溶于80％乙腈水溶液中，通过高效液相色谱法进行相聚合度分析，数据谱图如图2。谱图分析所见，高含量组分聚合度大于等于10。(2)用肝素酶I、II、III，将低分子量硫酸乙酰肝素完全酶解为二糖，并通过LC-MS的方法，实现八种二糖组成单元的相对定量，结果如图3所示。通过亚硝酸降解法保留糖醛酸残基的差向异构信息，通过LC-MS法实现不同糖醛酸残基的相对定量，结果如图4所示。将完整糖链、完全酶解和亚硝酸降解所获得的结构信息输入计算机辅助高通量测序软件，通过分析，得到低分子量硫酸乙酰肝素的特异性功能序列的序列信息为：聚合度大于等于10，且每条糖链中至少包含一个特异性功能域。功能域糖链的特征为含有IdoA-GlcNAc、GlcA-GlcNS6S，IdoA2S-GlcNS6S三个二糖基本组成单元，主要结构为：IdoA-GlcNAc-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S和/或IdoA-GlcNAc-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S。
第三实施例：低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的制备。
1.脱氧胆酸(1.177g)溶于甲醇(5mL)与37％盐酸混合。混合物于60℃搅拌回流6h，旋蒸至干燥，真空干燥。冷水洗涤，冻干，得到脱氧胆酸甲酯
2.脱氧胆酸甲酯溶于乙二胺中于120℃回流搅拌8h。冷却至室温，加水沉淀完全，过滤。过量的水冲洗3次，冻干，得到脱氧胆乙胺。
3.活化羧基：低分子量硫酸乙酰肝素(10mg)，在80℃溶于甲酰胺(20mL)，冷却至室温，加入碳二亚胺盐酸盐(EDC)(36.8mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(61.3mg)，混合物在室温下搅拌20min。
4.将脱氧胆乙胺(34.8mg)溶于二甲基甲酰胺(DMF，20mL)中，得到含有脱氧胆乙胺的二甲基甲酰胺溶液；将L-半胱氨酸溶于二甲基甲酰胺(20mL)中，得到含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液；脱氧胆乙胺和L-半胱氨酸的摩尔为1：1。
将含有脱氧胆乙胺的二甲基甲酰胺溶液缓慢滴入羧基活化后的反应体系，然后缓慢滴入含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液。将混合物在室温下搅拌20h，在水和甲醇的混合物(v/v从25：75到75：25)中透析24h，在二蒸水中透析24h冻干，得到低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(记为LMWHS-DE)。
5.低分子量硫酸乙酰肝素衍生物表征。将所得低分子量硫酸乙酰肝素衍生物10μg，溶解在80％乙腈中，涡旋振荡，离心取上清，使用LC-MS进行分析。结果如图5所示。
第四实施例：第一实施例制备的硫酸乙酰肝素原型、第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素及第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物促肝细胞增殖活性实验
材料：HepG2细胞、HuH7细胞、Cell Counting Kit-8(CCK-8)、DMEM(高糖)培养基。
试验方法如下：
将上述细胞培养至对数生长期(培养基配方：10％胎牛血清、1％双抗)，酶解分散后，于96孔板中均匀铺板。
按实验分组(空白对照组、实验组)配制培养基，实验组包括HS组、LMWHS组、LMWHS-DE。实验组培养基为分别含有硫酸乙酰肝素原型(HS)、低分子量硫酸乙酰肝素(LMWHS)和低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(LMWHS-DE)100μg/mL的培养基。37℃，5％CO2培养48h。达到培养时间后，弃除原培养基，每孔加入等量含CCK-8的培养基，37℃，5％CO2，暗处孵育1h，用酶标仪测定各孔吸光度，计算细胞存活率。计算公式：(OD值实验组-OD值空白组)/(OD值对照组-OD值空白组)×100％。
结果如图6所示，可以看出，本实施例所述硫酸乙酰肝素和低分子量硫酸乙酰肝素均能够显著促进肝细胞增殖，细胞存活率相较于对照组均大于100％。
第五实施例：第一实施例制备的硫酸乙酰肝素原型、第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素及第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物促肝细胞DNA复制活性实验
材料：HepG2细胞、HuH7细胞、CCK-8试剂、DMEM(高糖)培养基、Edu ProliferationKit。
试验方法如下：
将上述细胞培养至对数生长期(培养基配方：10％胎牛血清、1％双抗)，酶解分散后，于12孔板中均匀铺板。按实验分组(空白对照组、实验组)配置培养基，实验组包括HS组、LMWHS组、LMWHS-DE组。实验组培养基为分别含有硫酸乙酰肝素(HS)和低分子量硫酸乙酰肝素(LMWHS)及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(LMWHS-DE)100μg/mL的培养基。37℃，5％CO2培养48h。EDU标记：实验当天，将每孔中的培养基去除，更换新的培养基。向培养基中加入EDU母液，37℃，5％CO2培养3h。用不含酚红的细胞用胰蛋白酶溶液，将细胞从孔板上酶解、收集，离心(4℃，转速800g)收集细胞沉淀。
细胞固定和通透：用洗涤缓冲液洗涤两次后，用固定液重悬细胞沉淀，避光固定15min。再次用洗涤缓冲液洗涤；用渗透缓冲液再次重悬细胞，室温孵育15min。
EDU反应：向每管中加入500μL反应混合液，混匀。室温避光孵育30min。用渗透缓冲液洗涤两次后，加入PBS重悬细胞，移入流式管。流式细胞仪以Ex/Em＝491/520nm处进行分析，统计处于DNA复制过程中的细胞占比。
结果如图7所示，可以看出，本实施例所述硫酸乙酰肝素和低分子量硫酸乙酰肝素及其衍生物均能够显著促进肝细胞DNA复制，实验组处于DNA复制过程中的细胞占比较对照组有显著性差异。
第六实施例：第一实施例制备的硫酸乙酰肝素原型、第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素及第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物对肝损伤的治疗与保护活性
材料：BALB/c小鼠，SD大鼠、ALT Elisa试剂盒。
1.实验方法：
1.1.药物性肝损伤动物体内实验
实验分组：将小鼠随机分为正常组、模型组、实验组。实验组包括HS组、LMWHS组、LMWHS-DE组。
建模方法：所述模型组和实验组腹腔注射对乙酰氨基酚(450mg/kg)，建立小鼠肝损伤模型，正常组腹腔注射等量生理盐水。
给药方法：
(1)经循环系统给药：实验组尾静脉注射硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(300μg/kg)，正常组和模型组尾静脉注射等量生理盐水。每24h给药一次，在建模后72h进行内眦取血，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
(2)经消化系统给药：实验组灌胃给予硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(1mg/kg)，正常组和模型组灌胃等量生理盐水。每24h给药一次，在建模后72h进行内眦取血，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
1.2.酒精性肝损伤动物体内实验
实验分组：将大鼠随机分为正常组、模型组、实验组。实验组包括HS组、LMWHS组、LMWHS-DE组。
建模方法：所述模型组和实验组给予酒精灌胃6周，建立小鼠酒精性肝损伤模型，正常组腹腔注射等量生理盐水。
给药方法：
(1)经循环系统给药：实验组尾静脉注射硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(300μg/kg)，正常组和模型组尾静脉注射等量生理盐水，每24h给药一次，同时继续酒精灌胃。给药6周后腹主动脉取血，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
(2)经消化系统给药：实验组灌胃给予硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(1mg/kg)，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每24h给药一次，同时继续酒精灌胃。给药6周后腹主动脉，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
1.3.化学性肝损伤动物体内实验
实验分组：将小鼠随机分为正常组、模型组、实验组。实验组包括HS组、LMWHS组、LMWHS-DE组。
建模方法：所述模型组和实验组给予腹腔注射0.12％CCl4大豆油溶液，0.2mL/10g，建立小鼠化学性肝损伤模型。
给药方法：
(1)经循环系统给药：实验组尾静脉注射硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(300μg/kg)，正常组和模型组尾静脉注射等量生理盐水。每24h给药一次，在建模后72h进行内眦取血，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
(2)经消化系统给药：实验组灌胃给予硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物(1mg/kg)，正常组和模型组灌胃等量生理盐水。每24h给药一次，在建模后72h进行内眦取血，获得血清，用Elisa试剂盒检测转氨酶的含量。
2.实验结果：
2.1.硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物对药物性肝损伤的预防与治疗作用实验结果如表1所示。
表1
注：表中*表示该组数据与模型组相比具有显著性差异。
由表1可以看出，对乙酰氨基酚所致小鼠药物性肝损伤，模型组血清中转氨酶的含量较正常组显著增高。而本发明所提供的猪肝来源硫酸乙酰肝素原型及低分子量硫酸乙酰肝素，通过循环系统和消化系统给药，均能够显著降低小鼠血清中的转氨酶含量，低分子量硫酸乙酰肝素衍生物通过消化系统给药能够达到较好的治疗效果，对于药物性肝损伤具有显著的预防与治疗作用。
2.2.硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物对酒精性肝损伤的预防与治疗作用实验结果如表2所示。
表2
注：表中*表示该组数据与模型组相比具有显著性差异。
由表2可以看出，本发明成功通过酒精梯度灌胃法建立大鼠酒精性肝损伤模型，模型组血清中转氨酶的含量较正常组显著增高。本发明所提供的猪肝来源硫酸乙酰肝素原型及低分子量硫酸乙酰肝，通过循环系统和消化系统给药，均能够显著降低小鼠血清中的转氨酶含量，低分子量硫酸乙酰肝素衍生物通过消化系统给药能够达到较好的治疗效果(P均小于0.05)，对于酒精性肝损伤具有显著的预防与治疗作用。
2.3.硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物对化学性肝损伤的预防与治疗作用如表3所示。
表3
注：表中*表示该组数据与模型组相比具有显著性差异。
由表3可以看出，本发明成功通过腹腔注射四氯化碳法建立大鼠化学性肝损伤模型，模型组血清中转氨酶的含量较正常组显著增高。而本发明所提供的猪肝来源硫酸乙酰肝素原型及低分子量硫酸乙酰肝素，通过循环系统和消化系统给药均能够显著降低小鼠血清中的转氨酶含量，低分子量硫酸乙酰肝素衍生物通过消化系统给药能够达到较好的治疗效果(P均小于0.05)，以上结果说明猪肝来源硫酸乙酰肝素原型、低分子量硫酸乙酰肝素及低分子量硫酸乙酰肝素衍生物对于化学性肝损伤具有显著的预防与治疗作用。
综上可知，本发明所提供的猪肝来源硫酸乙酰肝素及一系列分子量分布有差异的低分子量硫酸乙酰肝素对于肝损伤的治疗与保护效果较为广谱，可作为临床药物性肝损伤、酒精性肝损伤、化学性肝损伤、病毒性肝损伤等的治疗与预防药物。
第七实施例：低分子量硫酸乙酰肝素注射剂
1.低分子硫酸乙酰肝素冻干粉
材料：第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素
配方：
工艺：称取处方量的低分子量硫酸乙酰肝素加入注射用水，搅拌至完全溶解。加入0.5％的药用活性炭，加热至70℃，搅拌30min。稍冷后减压过滤，除去活性炭。检测中间体含量，合格后，用0.22μm的微孔滤膜，过滤除菌。分装于西林瓶中，每瓶0.5mL，按冻干曲线进行冻干，压塞，轧盖，检验。
2.低分子硫酸乙酰肝素注射液
材料：第二实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素
配方：
原/辅料 用量
低分子量硫酸乙酰肝素 25g
注射用水 1000mL
称取处方量的低分子量硫酸乙酰肝素加入注射用水，搅拌至完全溶解。加入0.5％的药用活性炭，加热至70℃，搅拌30min。稍冷后减压过滤，除去活性炭。检测中间体含量，合格后，用0.22μm的微孔滤膜，过滤除菌。灌装于安瓿瓶中，每瓶2mL，密封，检查，即得。
第八实施例：低分子量硫酸乙酰肝素衍生物的口服制剂
材料：第三实施例制备的低分子量硫酸乙酰肝素衍生物
配方(以1000片计)：
原/辅料 用量
低分子量硫酸乙酰肝素衍生物 25g
预胶化淀粉 16g
羧甲基淀粉钠 22.5g
微晶纤维素钠 36.15g
硬脂酸镁 0.35g
工艺：分别称取配方量的原辅料，混合均匀，加入适量粘合剂制成适宜的软材，过30目筛制粒，在50±5℃干燥，用30目筛整粒，加硬脂酸镁混合压片即得。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种低分子量硫酸乙酰肝素，其特征在于，所述低分子量硫酸乙酰肝素是含有式（I）所示结构的同系糖胺聚糖类化合物的混合物，所述同系糖胺聚糖类化合物的聚合度大于等于10；
；
式（I）；
式（I）中，所述R1为SO3 -或H；所述R2为SO3 -或COCH3；m和n均为大于等于0的任意整数，m和n不能同时为0；
所述Sequence的结构为：IdoA-GlcNAc-GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S和/或IdoA-GlcNAc-IdoA2S-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S；
所述低分子量硫酸乙酰肝素的制备方法采用以下步骤：
（1）将肝脏进行前处理获得组织匀浆，经酶解，纯化，得到硫酸乙酰肝素原型；
（2）将步骤（1）得到的硫酸乙酰肝素原型经肝素酶酶解，得到低分子量硫酸乙酰肝素粗品，经蛋白亲和柱富集提纯，得到所述低分子量硫酸乙酰肝素；
步骤（2）中，所述富集提纯采用以下步骤：
步骤一、将DIRAS2蛋白与氨基封闭的肝素于37℃孵育1 h，与琼脂糖珠于4℃偶联12 h，再经装柱，封闭，清洗，得到蛋白亲和层析柱；所述DIRAS2蛋白为真核细胞重组表达蛋白；所述氨基封闭的肝素采用以下步骤制备：将肝素、肝素封闭缓冲液及乙酸酐混匀，每20 min加一次乙酸酐，共加7次，经脱盐，得到所述氨基封闭的肝素；
步骤二、将步骤（2）中得到的低分子量硫酸乙酰肝素粗品溶解后，加入步骤一制备的蛋白亲和层析柱，再经洗脱，收集，脱盐，冻干，得到所述低分子量硫酸乙酰肝素；
步骤（2）中，所述硫酸乙酰肝素原型与肝素酶的比例为1 g：（0.5-10 ）IU；所述肝素酶为肝素酶I和/或肝素酶II；所述酶解的温度为25-37℃，时间为12-20 h。
2.一种权利要求1所述的低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物，其特征在于，所述低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物为含有式（II）所示结构的同系糖胺聚糖类化合物的混合物，所述同系糖胺聚糖类化合物的聚合度大于等于10；
；
式（II）；
式（II）中，所述R1为SO3 -或H；所述R2为SO3 -或COCH3；
所述Sequence为含有IdoA-GlcNAc，GlcA-GlcNS6S，IdoA2S-GlcNS6S三个二糖基本组成单元的功能域；m和n均为大于等于0的任意整数，m和n不能同时为0。
3.一种权利要求2所述的低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用以下步骤：
（1）将权利要求1所述低分子量硫酸乙酰肝素于80℃溶于甲酰胺，加入碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，于室温下进行搅拌反应；
（2）将含有脱氧胆乙胺的二甲基甲酰胺溶液滴入步骤（1）获得的体系中，再滴入含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液，于室温搅拌反应，经透析，冻干，得到所述低分子硫酸乙酰肝素衍生物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述低分子量硫酸乙酰肝素、碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、脱氧胆乙胺及甲酰胺的质量体积比为1.00 mg：3.68 mg：6.13 mg：3.48 mg：2.00 mL；
步骤（2）中，所述含有脱氧胆乙胺的二甲基甲酰胺溶液中脱氧胆乙胺与二甲基甲酰胺的质量体积比为1.74 mg：1 mL；所述含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液中的二甲基甲酰胺与所述含有L-半胱氨酸的二甲基甲酰胺溶液中的二甲基甲酰胺的体积相同；所述脱氧胆乙胺及L-半胱氨酸的摩尔比为（1：1）-（1：5）；所述反应的时间为18-20 h；
所述脱氧胆乙胺采用以下步骤制备：
（1）将脱氧胆酸溶于甲醇，再与盐酸混合，搅拌反应，得到脱氧胆酸甲酯；
（2）将步骤（1）得到的脱氧胆酸甲酯溶于乙二胺，搅拌反应，得到所述脱氧胆乙胺。
5.权利要求1所述的低分子量硫酸乙酰肝素的应用，其特征在于，所述低分子量硫酸乙酰肝素可用于制备肝损伤药物组合物。
6.权利要求2所述的低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物的应用，其特征在于，所述低分子量硫酸乙酰肝素的衍生物可用于制备肝损伤药物组合物。
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