CN104190383A

CN104190383A - 一种低分子量肝素亲和纯化介质和纯化低分子量肝素方法

Info

Publication number: CN104190383A
Application number: CN201410419993.6A
Authority: CN
Inventors: 黄佳莹; 许雯; 曹林
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明属于生物医药领域，提供一种低分子量肝素亲和纯化介质、由该介质形成的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球及低分子量肝素亲和纯化方法。本发明提供的一种低分子量肝素亲和纯化介质，包含三个组成部分：聚乙烯亚胺、交联物质和微球结构；其中，交联物质包括交联剂和表面活性剂，微球结构包括微球和微球载体。利用本发明提供的纯化介质进行纯化，不仅可以很好的集合低分子量肝素而且也排除了其他类肝素，达到良好的分离纯化的目的，可以用于大规模快速高效制备低分子量肝素钠。

Description

一种低分子量肝素亲和纯化介质和纯化低分子量肝素方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种低分子量肝素亲和纯化介质、由该介质形成的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球及低分子量肝素亲和纯化方法。

背景技术

肝素钠是猪的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物质。肝素是有六糖或八糖重复单位组成的线性链状分子。三硫酸双糖单位是肝素的主要双糖单位，L-艾杜糖醛酸是此双糖的糖醛酸，二硫酸双糖的糖醛酸是D-葡萄糖醛酸，三硫酸双糖和二硫酸双糖以约3：1的比例交替联结。肝素钠白色粉末，有引湿性，对热稳定。溶于水，不溶于丙酮等有机溶剂。分子量一般在8000～25000道尔顿，平均分子量约为13000道尔顿，肝素是趋于螺旋形的纤维状分子，与其它粘多糖相比，其特性粘度较小，为0.1～0.2，有旋光性。肝素在185～200nm有特性吸收峰，在230～300无光吸收。如有杂蛋白在，则最大吸收在265～292nm，最小吸收在240～260nm。肝素在红外890、940cm-1有特征吸收峰，测定1210～1150cm-1吸收强度，可作快速分析用。肝素的O-硫酸基在低温时对酸水解相当稳定，但N-硫酸基对酸水解敏感。在碱性条件下，N-硫酸基相当稳定。肝素与氧化剂反应，可能被降解成酸性产物。还原剂的存在，不影响肝素的活性。肝素具有抗凝血作用，肝素在体内外均能延长凝血时间，肝素能降低LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)，升高HDL，对防止动脉粥样硬化有多方面的有益作用，肝素能减少红细胞的凝聚作用，使全血粘度和血浆粘度降低，有利于防止血栓性疾病。

普通肝素用于临床至今已有近70年的历史，近年来其地位逐渐被近十年发展起来的新一代肝素类抗凝药物——低分子量肝素所取代。低分子量肝素具有效价高，副作用低的优点。目前，低分子量肝素已经占据了肝素类药品市场的绝大部分比重(90％)。

目前国外市场已有8种低分子量肝素药物上市，分别为依诺肝素钠、那曲肝素钙、亭扎肝素钠、帕肝素钠、达肝素钠、贝米肝素钠、舍扎肝素钠、阿地肝素钠等。化学法生产低分子量肝素主要是利用亚硝酸钠、双氧水等化学试剂降解肝素，化学法是随机降解，没有选择性，特异性差，会作用于肝素分子的抗凝活性五糖核心基团，使得抗Factor Xa活性下降，产生没有抗凝效果的副产物，因此需要对低分子量肝素进行高效的纯化，提高效价，降低副作用风险。

目前，低分子肝素钠的纯化主要是基于氧化法，以有机溶剂分级沉淀获得，这类方法存在以下缺陷：1.氧化剂难以清除；2.低分子肝素钠的结构易于破坏。因此，限制了大规模快速高效制备低分子量肝素钠的生产。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中的不足，提供一种高效、快速可大规模分离纯化低分子肝素钠的介质和方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1、本发明提供一种低分子量肝素亲和纯化介质，该介质包含三个组成部分：聚乙烯亚胺、交联物质和微球结构；其中，交联物质包括交联剂和表面活性剂，微球结构包括微球和微球载体。

2.上述1提供的低分子量肝素亲和纯化介质，其中，聚乙烯亚胺为分枝状形式；交联剂为5-胺基－1－戊醇，1,4-丁二醇双丙烯酸酯，1,3-丁二醇双丙烯酸酯或1,3-丁二醇双丙烯酸酯的衍生物；微球为葡萄聚糖。

3.上述2提供的低分子量肝素亲和纯化介质，其中，表面活性剂为叶酸聚氧乙烯醚类，微球载体大小为150-200微米。

4.包括上述1-3任一项提供的低分子量肝素亲和纯化介质的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球，其中，亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球的分子量为13万至20万道尔顿。

5.上述4提供的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球在纯化低分子量肝素上的应用。

6.本发明还提供一种纯化低分子量肝素的方法，该方法包括如下步骤：5％氯化钠溶液使肝素降解产物低分子量肝素粗品完全溶解；盐酸调节pH至4.0-5.0；加入亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球，搅拌，静置沉淀12小时，微球沉淀后去除上清，1M的氯化钠漂洗2次，然后用2M氯化钠洗脱；在溶液中加入10％质量比的固体氯化钠搅拌溶解。向浓缩液中加入体积比35-50％的乙醇，静置2小时收沉淀得纯化的低分子量肝素。

本发明的有益效果：

肝素的多糖结构在中性和碱性环境下带负电荷，能够跟带正电荷的物质以离子方式结合。而聚乙烯亚胺是一种带强正电荷物质，其聚合物链中每相隔3个原子，即每“第3原子”(every third atom)都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体，能够吸附带负电荷的低分子量肝素钠，是作为低分子量肝素钠纯化理想的材料。并且，线性聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)含有重复的乙胺单元，具有很好的水溶性，通过合成合适分子量大小的聚乙烯亚胺，可以很好的集合低分子量肝素而且也排除了其他类肝素，即会与低分子量肝素达到特异性结合，达到良好的分离纯化的目的，可以用于大规模快速高效制备低分子量肝素。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

试验材料：

分支聚乙烯亚胺(bPEI,800Da)，5-胺基－1－戊醇(5-amino-1-pentanol)，1,4-丁二醇双丙烯酸酯(BDDA)，1,3-丁二醇双丙烯酸酯(BDA)和MTT(3-(4,5-dimethylthiazd-2-yl)-2,5-diphenyltentrazolium bromide)购自美国Sigma-Aldrich公司。乙二醇双甲基丙烯酸酯(EGDMA)是南京祥龙化学材料厂提供。合成原料使用前需要在N₂保护下进行减压蒸馏处理。其余试剂均为分析纯。(1)交联PEI的合成

本发明所述的交联PEI的合成基本步骤如下所述：称取bPEI 800放入反应瓶中使其溶解在新蒸的二氯甲烷中,然后加入与bPEI适当摩尔量的交联剂EGDMA或BDDA，为了改善溶解性、提高效率，反应混合物里可以适当加入叶酸等表面活性剂等。反应瓶用耐溶剂的聚四氟乙烯塞子密封,然后在一定温度下磁力搅拌反应一段时间，反应完毕用己烷或乙醚沉淀,冻干后在-70℃下保存，改变单体与交联剂及反应时间可以组合合成出一系列化合物。

①EGDMA-PEI 800-20h的合成

称取1克bPEI 800单体放入10ml小反应瓶中使其溶解在100ml新蒸的二氯甲烷中,然后加入与bPEI千分之十摩尔量的交联剂EGDMA，为了改善溶解性、提高效率，反应混合物里加入混合物质量千分之一质量比的叶酸聚氧乙烯醚作为表面活性剂。反应瓶用耐溶剂的聚四氟乙烯塞子密封,然后在20-60度磁力搅拌反应20h，反应完毕用己烷沉淀,冻干后在-70℃下保存。

②BDDA-PEI 800-20h的合成

称取1克bPEI 800单体放入10ml小反应瓶中使其溶解在100ml新蒸的二氯甲烷中,然后加入与bPEI五十分之一摩尔量的交联剂BDDA，为了改善溶解性、提高效率，反应混合物里加入混合物质量千分之一质量比的叶酸作为表面活性剂。反应瓶用耐溶剂的聚四氟乙烯塞子密封,然后在20-60度磁力搅拌反应20h，反应完毕用己烷沉淀,冻干后在-70℃下保存。

③对照组：BDDA-AP-20h的合成

称取10g 5-胺基-1-戊醇(5-amino-1-pentanol，AP)为单体，然后加入百分之一BDDA进行交联反应，表面活性剂叶酸聚氧乙烯醚，在100℃下反应20小时。反应完毕用乙醚沉淀,冻干后在-70℃下保存。

(2)分子量的测定

将PEI标准品、交联的PEI样品配成10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL的PBS溶液，pH调为7.4。记录每个样品的溶液在大气压下流过1mm(外径)毛细管的时间，溶液的特性粘度(inherent viscosity)η_inh＝lnη_rel/c,这里η_rel相对粘度(relative viscosity)η_rel＝t_solution/t_solvent,聚合物溶液流出毛细管的时间与溶剂流出毛细管的时间的比值,c是聚合物的浓度。合成的聚合物的分子量由下面的公式计算得到，η_Inh＝KM^a,这里M是分子量，K and a是Mark-Houwink参数，K and a的数值可由已知分子量的PEI标准品采用上述公式计算得到。经过测定，上述合成的交联PEI：EGDMA-PEI 800-20h、BDDA-PEI800-20h分子量分别为150kDa、145kDa、对照组：BDDA-AP-20h分子量为120kDa。说明以bPEI形成的交联PEI分子量可得到良好的控制，适合与低分子肝素进行结合，达到良好纯化的目的。

(3)微球交联

将直径为150-200微米的琼脂糖微球用溴化氢活化2小时，离心去除活化剂，纯水漂洗，加入合成不同分子量的PEI与微球交联得不同大小的亲和聚乙烯亚胺葡聚糖微球，其分子大小为为13万至20万道尔顿。

(4)低分子量肝素钠纯化

1、溶解：

将1公斤肝素钠用0.01-1％终浓度双氧水氧化降解2-16小时，获得低分子量肝素钠粗品加入到5％氯化钠溶液中使粗品完全溶解，得溶解液。

2、离心过滤：

6000r/min离心溶解液30分钟，弃去残渣，用5mol/L氢氧化钠调pH至6-7.5.。

3、碱化：

溶液添加硼酸钾后用5mol/L氢氧化钠将溶液调至pH12-13。

4、过滤除菌：

将还原液用除菌级滤板过滤，得还原液。

5、超滤：

清液用超滤机(超滤膜截流孔径为1000分子量)浓缩至一定体积。

6、亲和纯化：

将超滤液中加入2-5公斤的亲和聚乙烯亚胺葡聚糖微球，搅拌，静置沉淀12小时，微球沉淀后去除上清，1M的氯化钠漂洗2次，然后用2M氯化钠洗脱。

7、乙醇沉淀：

洗脱液过滤膜过滤，滤液中加入10％固体氯化钠，搅拌溶解。按浓缩液重量加入35-50％乙醇，边搅拌，搅拌结束后静置2小时。

8、脱水：将沉淀加入丙酮，脱水处理10小时。

9、干燥：

将脱水后的沉淀物烘箱干燥得到精品低分子量肝素。获得的低分子量肝素钠用抗凝血酶方法测定，检测结果抗凝血因子Ⅷ为3.5，抗凝血因子Ⅱb在3.3，有效成分分子量小于8000的部分为92％。

Claims

1.一种低分子量肝素亲和纯化介质，其特征在于：该介质包含三个组成部分：聚乙烯亚胺、交联物质和微球结构；其中，交联物质包括交联剂和表面活性剂，微球结构包括微球和微球载体。

2.权利要求1所述的低分子量肝素亲和纯化介质，其特征在于：聚乙烯亚胺为分枝状形式；交联剂为5-胺基－1－戊醇，1,4-丁二醇双丙烯酸酯，1,3-丁二醇双丙烯酸酯或1,3-丁二醇双丙烯酸酯的衍生物；微球为葡萄聚糖。

3.权利要求2所述的低分子量肝素亲和纯化介质，其特征在于：表面活性剂为叶酸聚氧乙烯醚类，微球载体大小为150-200微米。

4.包括权利要求1-3任一项所述的低分子量肝素亲和纯化介质的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球，其特征在于：亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球的分子量为13万至20万道尔顿。

5.权利要求4所述的亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球在纯化低分子量肝素上的应用。

6.一种纯化低分子量肝素的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：5％氯化钠溶液使肝素降解产物低分子量肝素粗品完全溶解；盐酸调节pH至4.0-5.0；加入亲和纯化聚乙烯亚胺葡萄聚糖微球，搅拌，静置沉淀12小时，微球沉淀后去除上清，1M的氯化钠漂洗2次，然后用2M氯化钠洗脱；在溶液中加入10％质量比的固体氯化钠搅拌溶解。向浓缩液中加入体积比35-50％的乙醇，静置2小时收沉淀得纯化的低分子量肝素。