CN108350094A - 生产高纯度硫酸化ha的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产高纯度和硫酸化度为1‑3的硫酸化透明质酸(HA)、硫酸化HA‑衍生物和/或其混合物的改进方法，包括以下步骤：在有机磺酸存在下，将HA‑Na或HA‑衍生物‑Na溶解在非质子溶剂中；b)通过加入过量的硫酸化剂使获得的溶液硫酸化；c)在乙醇中进行沉淀直到获得沉淀物；d)在过量的NaCl存在下，将获得的沉淀物溶解在水和步骤a)中使用的非质子溶剂的混合物中，调节pH至3‑4的范围内；e)进一步用乙醇进行沉淀直到获得粉末；f)洗涤来自步骤e)的粉末并在真空下干燥由此获得的产物。本发明还涉及如此制备的高纯度和硫酸化度为1‑3的硫酸化HA、硫酸化HA‑衍生物和/或其混合物，以及相关的药物混合物。

Description

生产高纯度硫酸化HA的改进方法
技术领域
本发明涉及用于生产高纯度硫酸化HA的改进方法。
长久以来，人们都知道化学衍生化透明质酸(HA)的可能性，以获得保持起始分子的物理化学性质的结构，并获得新的特定特征。简而言之，HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替残基构成的杂多糖，其为直链，分子量可以为50,000-13x 106Da，这取决于其获得的来源以及所用的制备方法。
透明质酸在人体中几乎无处不在，其中它起着重要的作用，而不仅仅是作为许多组织细胞的机械支持，例如皮肤、肌腱、肌肉和软骨。HA与其膜受体CD44以及与阿片受体的相互作用也是已知的。
由于其化学性质，HA具有许多可衍生的官能团。在这种情况下，在本领域技术人员已知的各种可能的改性中，本发明感兴趣的改性是硫酸化，即用-SO3基团富集。这种衍生化可以针对大量可用的-OH基团(O-硫酸化)和N-乙酰基-D-葡糖胺残基在其脱乙酰化之后的胺基团(N-硫酸化)来进行(EP 702699；EP 940410；EP 971961；EP 889055)。不同的衍生化使分子适合各种用途；事实上，N-硫酸化衍生物对于医疗器械的生产特别有用。硫酸化产物的性质还取决于硫酸化程度，以每个二糖单元存在的-SO3基团的数目表示。
用于本发明目的的感兴趣的透明质酸硫酸化衍生物是O-硫酸化衍生物，其在本专利申请中简单地表示为HAS，并且其能够容易地穿过皮肤屏障，促进与之相关联的物质的通过。这些特性使其成为药理学和生物活性分子的皮肤吸收的极好载体。硫酸化也赋予透明质酸HA例如在血管支架涂层中已被开发的抗凝血肝素样性质。
最近还发现并证明HAS具有实际的药理学性质：它是一种强有力的抗炎剂，通过有效调节许多细胞因子的活性来发挥其作用，这些细胞因子包括促炎和抗炎细胞因子。由此，HAS可用于治疗由细胞因子水平改变介导的多种疾病(类风湿性关节炎、哮喘、全身性和皮肤自身免疫性疾病、病毒感染、特应性皮炎、湿疹、白癜风、淋巴瘤等)(WO2010130468；WO2010130466)。
目前已知用于生产HA的方法是特征在于相对有限的生产率和严格需要透析阶段的强制纯化步骤的方法。
因此，潜在如此巨大的HA和/或其硫酸化衍生物的治疗用途也产生了本发明提出要解决的生产性问题，即寻找生产硫酸化HA和/或其硫酸化衍生物的方法，其在时间和原材料方面更快速、更少消耗，并且重要的是尤其对于最终产品的加工产率和纯度而言特别有效。
发明概述
因此，本发明的目的涉及用于生产高纯度和硫酸化度为1-3的硫酸化透明质酸(HA)、硫酸化HA-衍生物和/或其混合物的改进方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在量为相对于HA或HA衍生物的重复二糖单元4.5-5.5摩尔/摩尔当量的有机磺酸，优选甲磺酸的存在下，将HA-Na或HA衍生物-Na溶解在优选选自二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)，更优选DMSO的非质子溶剂中；
b)通过加入过量的SO3-吡啶、SO3-三甲胺或其它硫酸化剂，优选SO3-吡啶，使步骤a)结束时获得的溶液硫酸化；
c)在乙醇，优选无水乙醇中沉淀，直至获得沉淀物；
d)在过量的NaCl存在下，将获得的沉淀物溶解在水和步骤a)中使用的非质子溶剂的混合物中，所述过量相对于残留的硫酸根基团(sulfate groups)计算，调节pH在3到4范围内；
e)进一步用乙醇，优选无水乙醇沉淀，直至获得粉末；
f)洗涤来自步骤e)的粉末并在真空下干燥由此获得的产物。
可以如下对步骤e)中获得的产物进行本发明方法步骤f)中的洗涤，：
f’)用8:2比例的乙醇/水洗涤沉淀物三次以除去溶剂；
f”)用乙醇/NaOH 0.1M 8:2；乙醇/HCl 8:2；乙醇/水8:2以及最后用无水乙醇连续洗涤以除去吡啶残留物。
本发明的另一个目的涉及通过本发明方法可获得的硫酸化度为1-3且纯度高于98％的硫酸化透明质酸(HA)或HA的硫酸化衍生物和/或其混合物。
本发明的目的还涉及在可药用的添加剂存在下，包含用本发明方法可获得的硫酸化度为1-3且纯度高于98％的硫酸化透明质酸或HA的硫酸化衍生物和/或其混合物的药物组合物。
本发明用于生产1-3度硫酸化HA的新改进方法具有在时间和原材料方面特别快速、更少消耗的主要优点，并且最重要的是在加工产率和最终产品纯度方面比目前已知的硫酸化HA的生产方法令人惊讶地更有效。
根据本发明的透明质酸和/或其衍生物的硫酸化方法，通过除去现有技术所有方法中认为必需的一些步骤(主要是透析步骤)，并且插入必要的技术改进，令人惊讶地允许以非常高的收率获得更纯的最终产品。
实际上，根据本发明方法的特别有利的方面是在沉淀阶段e)结束时形成非常精细且纯的沉淀，这使得可以除去已知方法的主要步骤之一，特别是透析步骤。最终产品的纯度也影响其特定的特性；在药物组合物的制剂阶段，例如，根据本发明获得的“活性成分”(硫酸化HA或HA-衍生物)与制剂的其他组分(无论它们是赋形剂还是其他药理学和/或生物活性物质)之间相互作用的风险最小化。根据本发明的方法其特征还在于极高的产率，实际上是定量的，根据现有技术的教导是绝对意想不到的。
本发明方法中使用的起始透明质酸可源自任何来源，例如从公鸡鸡冠(roostercombs)(EP138572)提取、本领域技术人员已知的发酵或生物合成(从芽孢杆菌属，WO2012032154)并且具有100,000至250,000Da，优选180,000至230,000Da，或500,000至750,000Da，优选700,000至730,000Da的平均分子量。
应该指出的是，平均分子量(MW)是指用“本征粘度(intrinsic viscosity)”方法计算的重均MW(Terbojevich等，Carbohydr.Res.,1986,363-377)。
在增强1-3度硫酸化HA的制备过程的本专利申请中，术语硫酸化度是指每个重复二糖单元的-SO3基团的数目，更具体地说：
1度硫酸化包含0.5至1.5个硫酸酯(sulfate)基团；
2度硫酸化包含1.5至2.5个硫酸酯基团；
3度硫酸化包含2.5至3.5个硫酸酯基团。
作为本发明目的的方法不仅能够成功制备硫酸化HA，而且能够制备透明质酸的硫酸化衍生物，即从通过化学改性起始HA获得的更复杂的分子开始，例如：
HA与脂族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列的胺的酰胺，酰胺化百分率为0.1-50％，而未酰胺化的剩余百分率的HA可用有机和/或无机碱成盐(-EP1095064 B1)；
HA与脂族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列的醇的酯，酯化百分率取决于所用醇的类型和链长，优选50-100％，而未酯化的剩余百分率的HA可用有机和/或无机碱成盐(-EP 216453 B1)；
HA的内酯，酯化百分率不超过20％，优选0.05-10％的酯化，而未酯化的剩余百分率的HA可用有机和/或无机碱成盐(-EP 341745 B1)。
如此获得的硫酸化透明质酸可以直接使用，但它也可以用作进一步衍生化的起始化合物。它可以例如通过间隔基结合到光反应性分子上，或结合到用于进行本领域已知的反应的其他化学实体(例如点击化学反应(click-chemistry reactions))。
发明详述
本领域已知的硫酸化方法通常包括以下步骤：
-在非质子溶剂(DMSO，DMF等)中以盐形式(优选四丁基铵-TBA)溶解HA。即使在该第一步中总体指出HA的溶解，但实际上得不到溶解，而更合适地是悬浮，因为HA不溶于非质子溶剂中，特别是将HA衍生成铵盐使其更容易悬浮。
-通过加入过量的SO3-吡啶、SO3-三甲胺或本领域技术人员已知的其他等同试剂进行硫酸化；
-用有机溶剂进行第一次沉淀；
-离心分离沉淀物；
-溶解由此获得的沉淀物；
-第二次沉淀“纯”产品，以及
-透析以除去溶剂和其他残留物。
在现有技术的方法中，“沉淀物的溶解”和“第二次沉淀”步骤重复多次以除去至少过量的溶剂和试剂。
显而易见的是，本发明的方法与现有技术的方法明显不同，特别是在下面示出的一些步骤中，首先要记住，在本发明方法的情况下，起始物料仅仅是钠盐，无论是HA本身的情况，还是上述的衍生物之一。如果起始聚合物是HA，其将具有100,000至250,000Da，特别是180,000至230,000Da或500,000至750,000Da，特别是700,000至730,000Da的平均起始MW。在现有技术中，尽管考虑了钠盐，但不管使用的MW如何，起始物料通常是四丁基铵盐，即透明质酸TBA(四丁基铵)盐，其必须预先合成；这意味着进一步的初步生产步骤。
表征本发明方法的步骤是以下过程的步骤a)，c)-e)：
a)在添加有机磺酸，优选甲磺酸的非质子溶剂中溶解HA-Na(或HA-衍生物-Na)；该添加使得可以获得实际的清澈溶液，其在600纳米处具有≤0.04AU的吸光度值，其是用于定义清澈的标准参考值；HA的全部溶解确保了聚合物以预定的程度定量硫酸化。在现有技术中从未描述过甲磺酸或其它有机磺酸用于这些目的的用途；
-非质子溶剂优选选自DMSO(二甲亚砜)、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)，并且甚至更优选DMSO；
-甲磺酸的用量为4.5-5.5摩尔/摩尔当量，并且优选等于5摩尔/摩尔当量，相对于HA的重复二糖单元。较低的值不产生溶解，而较高的值产生溶解，但在最终沉淀阶段，观察到收率急剧下降(<60％)(如表1所示)；
在20至30℃的温度T下溶解20至28小时，优选在25℃下溶解24小时，直到获得清澈溶液；
b)硫酸化：根据已知技术进行该步骤，通过添加过量的SO3-吡啶、SO3-三甲胺或本领域技术人员已知的其它试剂，优选SO3-吡啶(吡啶三氧化硫的络合物)；
c)首先在乙醇，优选无水乙醇中进行沉淀，直至获得棕色橡胶状沉淀物；
d)在NaCl和原料已经溶解于其中的相同非质子溶剂存在下，将如此获得的沉淀物溶解在水中(已知技术)，调节pH至3-4的范围内，优选3.3-3.5。加入的NaCl的量必须绝对过量，以确保所有残留的硫酸酯基团均为钠盐形式(见表2)；
e)用乙醇，优选无水乙醇进行第二次沉淀，由此获得非常精细且纯的沉淀物，仅一次通过，其不需要透析，并且其可以直接通过至后续步骤；
f)反复洗涤和真空干燥由此获得的产物。
可以如下对步骤e)中获得的产物进行本发明方法步骤f)中提供的洗涤：
f’)通过用8:2比例的乙醇/水洗涤沉淀三次除去溶剂；
f”)通过用乙醇/NaOH 0.1M 8:2；乙醇/HCl 8:2；乙醇/水8:2以及最后用无水乙醇连续洗涤除去吡啶残留物。用乙醇/NaOH 0.1M 8:2进行洗涤在这一步骤中特别重要，因为它使得可以几乎完全除去吡啶，使得到的粉末具有极高的纯度，总是>98％(表3表示在这个意义上进行的测试)。
根据已知技术进行真空干燥。
根据本发明的方法特征在于极高的收率：实际上，该方法使得可以获得≥98％的产率；表征本发明方法的步骤的组合可以使所有使用的HA都实际上被定量硫酸化。该结果是绝对令人惊讶的，因为根据现有技术的已知方法描述的产率要低得多：
EP 889055，Shiseido，实施例2：从2克起始HA(产率50％；硫酸化程度计算为20％)获得1.2克HAS；
EP 702699，Fidia，实施例1：对于3度硫酸化产率约为62％；
WO2010130446，Fidia，实施例2：对于3度HAS(9.7克HAS)描述的产率在86-88％的范围内(从10克HA-TBA获得9.7克HAS 3)。
根据本发明方法的特征还在于生产的产物纯度高于98％：所得到的硫酸化产物是极精细的粉末，具有可忽略的吡啶和有机溶剂残留物，因此不需要透析步骤，这与现有技术中已知的不同：
EP 889055，Shiseido，实施例2：用3升蒸馏水透析“过夜”，替换3次；
EP 702699，实施例1和WO 2010/130446，实施例2：透析的持续时间不祥，但进行直至除去反应残留物。
从工业角度来说，除去透析步骤非常重要，因为它显著节省了成本(更少的步骤、更短的等待时间、更少的处置)。因此，不存在任何透析步骤是本发明方法的重要方面。因此，高纯度产品的生产非常重要，不仅因为它除去了繁重的工业步骤，而且从绝对意义上说，因为可以直接使用来自生产过程的最终产品，在纯度方面不需要任何进一步的预防措施，极大地简化了技术制剂师的工作；通过使用根据本发明的硫酸化HA(或HA衍生物)，事实上，它可以制备任何药物形式，而没有通常存在于化学合成结束时与杂质相关的任何类型的风险。
事实上，应该记住的是，对于某些药物形式，具有高纯度、但不是绝对的,即所谓的“化妆品程度”的产品就足够了；这些通常是药物剂型，例如用于未损伤的皮肤、功能性食品或食品补充剂等。
另一方面，其他药物形式需要具有“药物程度”纯度的产品：即产品必须是非常纯的，以使它们也可以以特定的药物形式使用，例如注射(皮内、肌内、静脉内、眼内)或在特定区域使用(由溃疡、疱疹感染、血管疾病、粘液(mucose)等损伤的皮肤)。
这些特别有利的技术结果归因于本发明方法的各种基本特征的组合，具体来说：
-在预选的非质子溶剂中HA-Na(或HA-衍生物-Na)的溶解步骤中存在有机磺酸，优选甲磺酸；
-在过量NaCl和最初使用的非质子溶剂的存在下，将沉淀物溶解在水中；和
-在用乙醇进行最终沉淀之前将pH值调节到非常窄的范围内。
pH值是重要的：下表2中所示的数据显示，即使相对于所要求范围的最小变化，也会导致形成“淤泥样”沉淀物，在用标准技术洗涤和干燥之前不可避免地需要数个透析步骤。
这不是基于已知技术描述或设想的调整，因为现有技术中描述了在中性pH(EP8890559，WO 2010/130446)或绝对碱性(EP 702699)下的沉淀。因此，在典型酸性pH值下的稳定化可能导致本发明方法的令人惊讶的结果是完全不可预测的。
因此，本发明方法不仅显著提高了工艺产率和产品的纯度，而且相对于已知方法还允许除去一些工艺步骤，因此也使其在工业上更为便利。
和现有技术的内容相比，这些结果是完全不可预知和令人惊讶的。
表1：甲磺酸对DMSO中HA-Na溶解作用的评估(温度24℃；时间：24小时)
*用UV/Vis分光光度计对DMSO(空白)进行测量；它表达了清澈程度：当它在600纳米处具有≤0.04AU的吸光度值时，溶液是清澈的。
加入甲磺酸的重要性是明显的。进一步的测试表明，通过使用更高含量的甲磺酸(6和6.5摩尔/摩尔当量)，HA-Na完全溶解，但在最终沉淀阶段，产率显着降低，低于已知技术方法的产率，另外，所得沉淀物的纯度低于90％。
表2：与NaCl、DMSO存在及在用乙醇进行第二次沉淀前调节pH有关的沉淀物的特性
第2-5列和第7列中所示溶液的pH值用3M NaOH调节。第1列和第6列中所示的pH值是在反应环境中获得的。
水、有机溶剂和正确的pH值的组合产生所期望的效果：只有当根据本发明的目的验证DMSO、NaCl存在和pH调节的条件时，得到的才是高产率的非常精细的纯粉末形式的沉淀物。
表3：洗涤步骤中乙醇/NaOH混合物的影响
在洗涤步骤中加入乙醇/NaOH 0.1M 8:2的混合物使得最终产物中的残留吡啶含量急剧降低(≤0.02％w/w)，甚至在乙醇/HCl 0.1M混合物之前使用时更是如此。另一方面，如果单独使用后者，则不能充分除去吡啶。
在以下实施例中，如在上表中那样，通过本领域技术人员已知的ICP-OES分析(利用等离子体源的原子发射光谱分析)来确定硫酸化度；用该技术计算摩尔DS，其表示与HA结合的S的量，并因此表示每个二糖单元的取代度(ICP“18021Sigma-AldrichTrace的硫标准)。HAS样品的每个重复单元的平均MW由摩尔DS和随后的摩尔含量计算，当与起始HA的摩尔含量比较时，摩尔含量表示％产率(Macromolecules，2005,38,4647-4654)。
根据已知技术(欧洲药典8.0，标准5.4:残留溶剂),通过气相色谱法分析杂质(吡啶和DMSO)，最终产物直接进样，计算其相对于生成的HAS的总比率(w/w％)。
如已经提到的那样，根据本发明获得的硫酸化透明质酸(或其衍生物)不仅工业上经济便利，而且最重要的是它具有高纯度；这意味着在制备用于各种疾病治疗中任何给药途径(从皮肤到静脉内)的药物组合物中，其可以直接使用，或适当地与其他物质结合使用，其中硫酸化HA的治疗作用已经通过科学研究仔细审查了，因此在现有技术中是众所周知的。
在这方面，应该记住硫酸化HA可以用于：
·与免疫系统缺陷有关的疾病；
·与炎性细胞因子例如TNF的增加或激活有关的疾病，其可以呈现全身性(骨关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、血管疾病、脉管炎、深静脉血栓形成、硬皮病等)，以及也可以呈现在皮肤(非特异性皮炎、特应性皮炎、脂溢性皮炎、荨麻疹、光敏性皮炎、湿疹、皮肤和/或粘膜刺激、口疮性口炎、裂隙等)或特定区域(间质性膀胱炎等)；
·与血管内皮损伤的真皮皮肤表现有关的疾病，例如创伤、表面和/或深血管出血、水肿、血肿、凝块清创(纤维蛋白溶解作用)等；
·自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩氏病和所有慢性炎症性肠病、哮喘、糖尿病、多发性硬化症和脱髓鞘疾病、星形细胞增生症、星形胶质细胞增生、移植后的器官排斥等。此外，真皮皮肤表现的自身免疫性疾病包括牛皮癣、红斑狼疮和/或盘状、皮炎、湿疹等；
·病毒性疾病，如艾滋病毒感染、单纯疱疹病毒性肝炎或生殖器疱疹、巨细胞病毒、水泡性口炎病毒。对于这些疾病，已证明1或3度硫酸化HAS特别有活性。
硫酸化HA还具有极高的水合性能，这归功于硫酸酯盐基团，使其比起始分子更容易通过皮肤屏障，并积聚在皮肤表层。这些性质可用于任何形式的以干燥、苔藓化、粗糙、瘙痒、发红、炎症和表面脱屑为特征的皮肤疾病。
由于其显著的皮肤渗透性，硫酸化HA作为单独不能穿过皮肤屏障分子的真皮吸收的优异促进剂起作用。以这种方式，分子可以到达真皮并发挥它们的作用。这些分子可以是药物(例如，甾体和非甾体抗炎剂、用于局部使用的化疗剂、抗生素、抗病毒剂、抗凝血剂和/或纤维蛋白溶解剂、局部麻醉剂、抗胆碱能剂、血管扩张剂、血管收缩剂)、激素、蛋白质、酶(例如，胶原酶、透明质酸酶、蛋白酶)，植物提取物、其他聚合物(例如硫酸软骨素、透明质酸的化学改性衍生物)。
可在合适的可药用添加剂存在下包含可通过本发明的方法获得的硫酸化度为1-3且纯度高于98％的硫酸化透明质酸或硫酸化HA的衍生物和/或其混合物的药物组合物可以用于局部给药(以霜剂、凝胶剂、药膏、软膏剂、薄膜、洗剂、含药和透皮硬膏剂等形式)、口服给药(以胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、饮料、功能性食品等形式)、注射给药(皮内、关节内、静脉内、肌肉内等)、透粘膜给药(直肠、阴道、向颊)、通过吸入和局部区域给药(例如眼内、膀胱内)。
显然根据治疗用途和施用部位选择药物剂型；不管所选择的药物剂型如何，所述药物组合物还可以包含合成和天然来源的生物和/或药理学活性物质，例如药物、植物提取物、蛋白质、肽、维生素、氨基酸、葡萄糖胺聚糖、天然、半合成或合成来源的聚合物；后一类还包括通过用苄醇酯化、通过用十六烷基酰胺(酰胺化程度5％)酰胺化、通过内酯化(酯化度5％)等获得的透明质酸衍生物。
在可能的联合中，可以提到下述：
根据本发明的1度或2度HAS与用苄醇酯化的透明质酸联合治疗间质性膀胱炎，酯化百分率为50-100％，优选50-75％；
1度或3度HAS与天然提取物(Boswella)、维生素和尿素联合治疗牛皮癣和脂溢性皮炎。
1度或2度HAS与硫酸软骨素联合用于局部治疗泌尿系统疾病；
1度或2度HAS和/或与硫酸软骨素和/或HA联合用于关节软骨损伤(来自老化、创伤、骨关节炎)的关节内治疗。
在以下实施例中更详细地说明了本发明。
实施例1：分子量200kDa的透明质酸钠盐(HANa)在DMSO中的硫酸化-3度硫酸化
1)将1.00克HANa悬浮在55毫升二甲亚砜(DMSO)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在25℃下混合24小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将5.0克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在25℃下搅拌24小时。
2)然后将90毫升乙醇加入该溶液中，得到棕色橡胶状沉淀。过滤分离由此获得的产物，溶解于32毫升水中并加入1.3克NaCl。最后加入24毫升DMSO，用3M NaOH将pH值调节到3.4。通过加入90毫升乙醇将由此获得的衍生物以非常精细的粉末形式沉淀。过滤分离由此获得的产物，用乙醇/水(8/2)溶液洗涤3次。为了除去残留的吡啶，将粉末用乙醇/NaOH0.1M(8:2)溶液洗涤3次，用乙醇/HCl0.1M(8:2)溶液洗涤两次，用乙醇/水(8:2)溶液洗涤两次，最后用纯乙醇洗涤两次。将由此获得的淡黄白色粉末在40℃于真空泵中干燥24小时。
得到1.70克非常细的淡黄白色粉末，其相当于98％的收率，纯度为99.4％。
实施例2：分子量200kDa的透明质酸钠盐(HANa)在DMSO中的硫酸化-2度硫酸化
将1.00克HANa悬浮在55毫升二甲亚砜(DMSO)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在25℃下混合20小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将4.0克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在23℃下搅拌22小时。
然后如实施例1第2项中所述进行相同操作。
得到1.51克非常细的淡黄白色粉末，其相当于98％的收率，纯度为99.2％。
实施例3：分子量200kDa的透明质酸钠盐(HANa)在DMSO中的硫酸化-1度硫酸化
将1.00克HANa悬浮在55毫升二甲亚砜(DMSO)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在26℃下混合26小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将2.4克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在27℃下搅拌27小时。
然后根据实施例1第2项中所述进行相同操作。
得到1.26克非常细的白色粉末，其相当于99％的收率，纯度为99.5％。
实施例4：分子量700kDa的透明质酸钠盐(HANa)在DMSO中的硫酸化-3度硫酸化
将1.00克HANa悬浮在55毫升二甲亚砜(DMSO)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在28℃下混合20小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将5.0克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在29℃下搅拌1.5小时。
然后根据实施例1第2项中所述进行相同操作。
得到1.75克非常细的淡黄白色粉末，其相当于98％的收率，纯度为99.1％。
实施例5：分子量200kDa的透明质酸钠盐(HANa)在NMP中的硫酸化-3度硫酸化
将1.00克HANa悬浮在55毫升N-甲基-吡咯烷酮(NMP)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在25℃下混合23小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将5.0克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在24℃下搅拌20小时。
然后根据实施例1第2项中所述进行相同操作。
得到1.67克非常细的淡黄白色粉末，其相当于98％的收率，纯度为98.9％。
实施例6：分子量200kDa的透明质酸钠盐(HANa)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的硫酸化-3度硫酸化
将1.00克HANa悬浮在55毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。将0.8毫升纯甲磺酸加入该悬浮液中，混合物在22℃下混合25小时；由此获得清澈的无色溶液(600纳米处的吸光度＝0.02AU)。将5.0克复合吡啶三氧化硫(吡啶SO3)加入该溶液中，将混合物在22℃下搅拌25小时。
然后根据实施例1第2项中所述进行相同操作。
得到1.73克非常细的淡黄白色粉末，其相当于98％的收率，纯度为99.1％。

Claims (11)

1.一种用于生产高纯度和硫酸化度为1-3的硫酸化透明质酸(HA)、硫酸化HA-衍生物和/或其混合物的改进方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在用量为相对于HA或HA衍生物的重复二糖单元4.5-5.5摩尔/摩尔当量的有机磺酸存在下，将HA-Na或HA-衍生物-Na溶解在优选选自二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮，更优选二甲亚砜的非质子溶剂中；
b)通过加入过量的SO3-吡啶、SO3-三甲胺或其它硫酸化剂，优选SO3-吡啶，使步骤a)结束时获得的溶液硫酸化；
c)在乙醇，优选无水乙醇中进行沉淀以获得沉淀物；
d)在过量的NaCl存在下，将由此获得的沉淀物溶解在水和步骤a)中使用的非质子溶剂的混合物中，所述过量相对于残留的硫酸根基团计算，调节pH在3到4范围内；
e)进一步用乙醇，优选无水乙醇沉淀以获得粉末；
f)洗涤来自步骤e)的粉末，并在真空下干燥由此获得的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤f)的洗涤如下：
f')用8:2比例的乙醇/水洗涤沉淀物三次以除去溶剂；
f”)用乙醇/NaOH 0.1M 8:2；乙醇/HCl 8:2；乙醇/水8:2以及最后用无水乙醇连续洗涤以除去吡啶残留物。
3.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述溶解步骤a)在20至30℃的温度T下进行20至28小时，优选在25℃下进行24小时。
4.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中所述溶解步骤a)在有机磺酸存在下进行，所述的有机磺酸是甲磺酸。
5.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中在步骤d)中，将pH调节至3.3-3.5的范围内。
6.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中步骤a)中使用的HA-Na的透明质酸的起始平均分子量为100,000至250,000Da，优选180,000至230,000Da，或500,000至750,000Da，优选700,000至730,000Da。
7.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中步骤a)中使用的HA-衍生物-Na的HA-衍生物选自
-HA与脂族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列的胺的酰胺，酰胺化百分率为0.1-50％；
-HA与脂族、芳脂族、脂环族、芳族、环状和杂环系列的醇的酯，酯化百分率取决于所选择的醇的类型和链长，优选50-100％；
-HA的内酯，酯化百分率不超过20％，优选0.05-10％；
未经酰胺化或未经酯化的剩余百分率的HA分别用有机和/或无机碱成盐。
8.用权利要求1-7中一项或多项所述的方法可获得的硫酸化度为1-3且纯度高于98％的硫酸化透明质酸(HA)或硫酸化HA的衍生物和/或其混合物。
9.包含根据权利要求8的硫酸化度为1-3且纯度高于98％的硫酸化透明质酸或硫酸化HA的衍生物和/或其混合物以及可药用添加剂的药物组合物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其为用于局部给药的霜剂、凝胶剂、药膏、软膏剂、薄膜、洗剂或含药硬膏剂形式，用于口服给药的胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或饮料形式，或配制用于可注射、经粘膜、吸入或局部区域给药。
11.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述组合物包含与硫酸化HA或硫酸化HA衍生物和/或其混合物结合的葡萄糖胺聚糖，特别是多糖，合成或天然来源的生物和/或药理学活性物质，例如药物、植物提取物、蛋白质、肽、氨基酸、和/或其混合物。
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