ITMI20120136A1 - Condroitin solfato biotecnologico a basso peso molecolare solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e procedimento per la sua preparazione - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“CONDROITIN SOLFATO BIOTECNOLOGICO A BASSO PESO MOLECOLARE SOLFATATO IN POSIZIONE 4 O 6 SULLA STESSA CATENA POLISACCARIDICA DOTATO DI ATTIVITÀ ANTIINFIAMMATORIA E ANTIARTRITICA E PROCEDIMENTO PER LA SUA PREPARAZIONEâ€
La presente invenzione riguarda la produzione di condroitin solfato (CS) a basso peso molecolare (LMW-CS BIOTEC, 4.000 - 9.000 Dalton) mediante solfatazione chimica a partire da uno scheletro di condroitina non solfatata, a sua volta ottenuta mediante idrolisi acida del polisaccaride capsulare K4 prodotto dal ceppo di E. coli O5:K4:H4, oppure essendo prodotta direttamente da un E. coli modificato geneticamente. Il condroitin solfato a basso peso molecolare dell’invenzione, prodotto mediante strategie biotecnologiche-chimiche, ha percentuali relative di disaccaridi e densità di carica comparabili a quelle dei condroitin solfati naturali.
Il condroitin solfato a basso peso molecolare oggetto dell’invenzione à ̈ caratterizzato da un intervallo di peso molecolare, 4.000-9.000 Dalton nettamente inferiore a quello dei condroitin solfati di origine naturali sia di natura terrestre, in particolare di origine bovina, suina o aviaria (14.000-26.000 Dalton) che di origine ittica, ad esempio da squalo, calamaro, razza o da pesci ossei (in genere > di 40.000 Dalton). Per queste caratteristiche, il condroitin solfato dell’invenzione mostra maggiore assorbimento in seguito a somministrazione orale e quindi migliore biodisponibilità nell’uomo rispetto a quelle di condroitin solfato naturale altamente puro o condroitin solfato prodotto mediante processi biotecnologico-chimici. Il condroitin solfato dell’invenzione à ̈ dotato di attività antiinfammatoria e antiartritica comparabile a quelle mostrate dal condroitin solfato naturale altamente puro. Il condroitin solfato dell’invenzione trova impiego nel trattamento dei processi infiammatori e artrosici/artritici.
L’invenzione riguarda anche un processo per la preparazione di un condroitin solfato a basso peso molecolare che comprende la solfatazione chimica di condroitina non solfatata prodotta mediante tecniche biotecnologiche. Il procedimento dell’invenzione consente la solfatazione contemporanea, all’interno della stessa catena polisaccaridica, della posizione 4 o della posizione 6 del residuo di N-acetil-D-galattosamina.
Il processo dell’invenzione permette di ottenere un CS avente struttura polisaccaridica comparabile a quella dei CS naturali, evitando i problemi associati a estratti di origine animale, come ad esempio la possibile presenza di prioni e virus.
I prodotti ottenuti sono pertanto più sicuri, più puri e più attivi rispetto ai noti CS a basso peso molecolare, ottenuti per depolimerizzazione di CS nativo.
Background tecnico
Il condroitin solfato (CS) Ã ̈ un polisaccaride naturale complesso appartenente alla classe dei glicosamminoglicani (GAGs), costituito da sequenze disaccaridiche formate da residui solfatati in posizione diversa di acido glucuronico (GlcA) e N-acetil-D-galattosamina (GalNAc) legati da legami beta 1-3.
Il CS à ̈ presente nei tessuti animali con funzioni strutturali e fisiologiche. A seconda dell’origine, Il CS à ̈ costituito principalmente da percentuali variabili di due tipi di unità disaccaridiche monosolfatate, in posizione 4 o in posizione 6 di GalNAc (rispettivamente disaccaride A e C). Tuttavia all’interno delle catene polisaccaridiche possono essere presenti in varie percentuali disaccaridi nei quali i gruppi solfato sono presenti in diverso numero e in posizioni diverse. Nello scheletro del CS à ̈ presente anche il disaccaride non solfatato, generalmente in piccole quantità . Disaccaridi disolfatati aventi due gruppi solfato legati attraverso l’atomo di ossigeno in varie posizioni, come in posizione 2 di GlcA e in 6 di GalNAc (disaccaride D), in posizione 2 di GlcA e in 4 di GalNac, o in posizione 4 e 6 di GalNAc (disaccaride E), possono essere presenti nello scheletro di CS in percentuali variabili a seconda delle fonti animali specifiche (Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006). La presenza di solfatazione in posizione 3 del GlcA à ̈ possibile sebbene in quantità estremamente piccole, tale presenza à ̈ rara nei CS di natura terrestre e più probabile in CS molto solfatati generalmente di origine ittica (Fongmoon D, Shetty AK, Basappa, Yamada S, Sugiura M, Kongtawelert P, Sugahara K. J Biol Chem 282, 36895, 2007).
L’unità ripetuta del disaccaride che si trova nel CS presenta la seguente formula chimica
in cui R2, R4e R6sono indipendentemente H o SO -3.
Le cariche negative dei gruppi carbossilato e solfato presenti nella unità ripetuta del disaccaride sono generalmente neutralizzati da ioni sodio.
Il significato degli acronimi più ricorrenti utilizzati per identificare i disaccaridi variamente solfatati à ̈ riportato qui sotto:
Di-0S (R2=H; R4=H; R6=H)
Di-6S (C) (R2=H; R4=H; R6= SO3-)
Di-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; R6=H)
Di-4,6diS (E) (R2=H; R4= SO3-; R6= SO3-)
Di-2,6diS (D) (R2= SO3-; R4=H; R6= SO3-)
Di-2,4diS (B) (R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)
Di-2,4,6triS (R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)
I campioni di CS provenienti da diverse fonti animali sono caratterizzati anche da un’eterogeneità di peso molecolare e di densità di carica, quest’ultimo parametro essendo direttamente correlato agli specifici gruppi solfatati.
La Tabella 1 illustra come esempio i principali disaccaridi che si trovano nel CS naturale estratto dalla cartilagine e da altri tessuti di differenti specie animali:
CS Bovino CS Suino CS di gallina<CS di>CS di manta CS disqualocalamaro
Mn (kDa) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80 Mw (kDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120 Indice di Polidispersità 1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.0-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3
Di-0S 6 6 8 3 3 13 Di-6S 33 14 20 44 39 15 Di-4S 61 80 72 32 43 50 Di-2,6diS nd nd nd 18 13 0 Di-4,6diS nd nd nd 2 1 22 Di-2,4diS nd nd nd 1 1 0
Densità di Carica 0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.15-1.25 1.08-1.20 1.00-1.20 Rapporto 4S/6S 1.50-2.00 4.50-7.00 3.00-4.00 0.45-0.90 1.00-1.40 2.50-4.00 Tabella 1 - Mn = peso molecolare medio numerico; Mw = peso molecolare medio ponderale; Indice di polidispersità = Mw/Mn; la densità di carica à ̈ il numero di gruppi solfato per unità disaccaridiche; ND = Non individuato.
La Tabella 1 mostra come il CS derivante da animali terrestri abbia parametri di massa molecolare simili (Mn e Mw), mentre à ̈ diversa da quella proveniente da specie ittiche, queste ultime avendo valori di massa molecolare superiori. I CS di origine terrestre presentano un peso molecolare mediamente compreso fra 14 e 26 kDa come Mw mentre i CS di origine ittica da calamaro, pesci cartilaginei ed ossei mediamente presentano un peso molecolare maggiore di 50 kDa come Mw. Inoltre i campioni di CS terrestre sono caratterizzati anche da valori di densità di carica (CD) inferiori a 1.0, mentre i campioni di CS ittici mostrano sempre valori di CD superiori a 1.0. Questa caratteristica à ̈ dovuta alla differente distribuzione dei disaccaridi solfatati. Generalmente i disaccaridi disolfatati si trovano in quantità in tracce nel CS terrestre e nel CS naturale non si osservano quantità significative di disaccaridi polisolfatati (tri- e tetra-solfati).
Sono state riportate differenti attività per CS in relazione alla sua struttura molecolare (Kimata K et al., Mol Cell Biochem 1, 211, 1963. Volpi N. Biomaterials 23, 3015, 2002. Volpi N, Tarugi P. Biochimie 81, 955, 1999. Volpi N. Biomaterials 20, 1359, 1999. Suzuki S et al., J Biol Chem 243, 7, 1968). In particolare, il CS presenta attività antinfiammatoria dimostrata a livello molecolare, cellulare ed in diversi modelli animali. Ad esempio, CS con peso molecolare maggiore di circa 2000 inibisce l’attività dell’elastasi leucocitaria umana (HLE), mentre le frazioni con una massa molecolare inferiore sono molto meno efficaci (Volpi N. Chem-Biol Interact, 105, 157, 1997). La solfatazione à ̈ un punto chiave per l’inibizione dell’attività di questo enzima. Inoltre, il CS inibisce specificamente le attività elastolitiche di diversi tipi di catepsine attraverso la formazione di specifici complessi di CS-catepsina (Yasuda Y., Li Z., Greenbaum D., Bogyo M., Weber E., Bromme D.J Biol Chem, 279, 36761, 2004. Li Z., Hou W.S., Escalante-Torres C.R., Gelb B.D., Bromme D. J Biol Chem, 277, 28669, 2002). CS a dosi crescenti à ̈ stata somministrata per via orale in topi una volta al giorno, in un modello di artrite indotta da collagene di tipo II (Omata T, Itokazu Y, Inoue N, Segawa Y. Arzneimittel Forschung 50, 148, 2000). Alla dose più elevata (1000 mg/kg), il CS inibisce significativamente i processi edematosi, la sinovite e la distruzione della cartilagine articolare. Risultati analoghi sono stati osservati in un simile modello animale mediante somministrazione orale di CS a basso peso molecolare (Cho SY, Sim JS, Jeong CS, Chang SY, Choi DW, Toida T, Kim YS. Biol Pharm Bull 27, 47, 2004) e CS purificato estratto da cartilagine di Raja (Jin C-H, Yang U, Kim S-H, Ryu J-W, Lee J-C, Lee D-S, Lee T-H. Food Sci Biotechnol 16, 594, 2007). Inoltre, à ̈ stato dimostrato che l’assunzione orale di CS inibisce la produzione di IgE specifiche e la reazione anafilattica indotta da antigene mediante up-regolazione della differenziazione delle cellule T, seguito da down-regolazione della risposta Th2 (Sakai S, Akiyama H, Sato Y, Yoshioka Y, Linhardt RJ, Goda Y, Maitani T, Toida T. J Biol Chem 281, 19872, 2006). Inoltre, in un modello di coniglio con lesioni della cartilagine articolare, CS grado farmaceutico ha prodotto un effetto protettivo sulla cartilagine danneggiata (Uebelhart D, Thonar EJ, Zhang J, Williams JM. Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 6, 1998). Infine, la somministrazione di CS à ̈ in grado di ridurre la concentrazione di molecole proinfiammatorie come proteina C-reattiva (CRP) e di IL-6 e la traslocazione nucleare del fattore nucleare-kB in un modello di coniglio di aterosclerosi aggravato da artrite cronica (Herrero-Beaumont G, Marcos ME, Sánchez-Pernaute O, Granados R, Ortega L, Montell E, Vergés J, Egido J, Largo R. Br J Pharmacol 154, 843, 2008).
Da recenti studi, risulta chiaro che l’artrite infiammatoria (e i processi cronici che ne derivano) sono innescati dalla attivazione dei recettori Toll-like (TLR), sia su organizzazioni linfatici secondari o presso la sinovia dal momento che i TLR sono noti per mediare l’attivazione di NF-kB e MAPKs conseguente alla produzione di citochine pro-infiammatorie. Un mediatore critico del segnale intracellulare di TLR à ̈ Il fattore di trascrizione NF-kB, che regola la produzione di varie citochine, molecole di adesione e fattori antiapoptotici. Diversi studi in vitro a livello molecolare (Vallià ̈res M, du Souich P. Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 1, S1, 2010. Egea J, GarcÃa AG, Verges J, Montell E, López MG. Osteoarthritis Cartilage 18 Suppl 1, S24, 2010) hanno evidenziato che il CS à ̈ in grado di ridurre i processi di infiammazione agendo Sulla traslocazione nucleare di NF-kB, uno dei biomarcatori principalmente associato a IL-1, IL-6 e CRP, noti fattori proinfiammatori.
Per le sue proprietà antiinfiammatorie, il CS à ̈ attualmente raccomandato nel trattamento dell’osteoartrite (OA) come farmaco sintomatico ad azione lenta (Symptomatic Slow Acting Drug for Osteo Arthritis, SYSADOA) in Europa, in particolare per il trattamento dell’OA del ginocchio (Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003), dell’anca (Jordan KM et al. Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003) e della mano (Zhang W et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007) in base a numerose evidenze cliniche e a relative meta-analisi di numerosi studi clinici. Inoltre, il CS à ̈ ampiamente utilizzato anche come nutraceutico in Europa e negli USA, da solo o in combinazione con altri ingredienti (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009). Infine, recenti studi clinici hanno dimostrato la capacità del CS di agire come molecola in grado di modificare le strutture extracellulari in particolare dei tessuti cartilaginei nell’uomo (Reginster JY,et al., Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007; Kahan A, et al., Arthritis Rheum 60, 524, 2009).
Tutte queste attività biologiche e farmacologiche sono in stretta relazione con la struttura e le proprietà del condroitin solfato. Infatti, per numerose attività biologiche, à ̈ stata dimostrata una stretta relazione strutturafunzione del CS (Volpi N Ed. Advances in Pharmacology, Vol. 53, Elsevier Science, 2006; Yamada S, Sugahara K. Curr Drug Disc Technol 5, 289, 2008; Sugahara K et al., Curr Opin Struct Biol 13, 612, 2003; Yip GW et al., Mol Cancer Ther 5, 2139, 2006; Shriver Z et al., Nat Rev Drug Discovery 3, 863, 2004). Inoltre, l’attività biologica à ̈ spesso dovuta alla presenza di sequenze oligosaccaridiche specifiche in grado di interagire con proteine, fattori di crescita, enzimi, ecc. Ovviamente, prodotti poco puri per la presenza di residui di reattivi di reazione, o con modificazioni strutturali generate da reazioni collaterali del processo di sintesi, o per l’assenza di specifiche sequenze oligosaccaridiche, non mostrano di possedere attività o addirittura di risultare dannosi. È ben nota a tutti la crisi avvenuta con l’eparina contaminata da CS sovrasolfatato (OSCS) in cui questa molecola artificiale ottenuta mediante sovrasolfatazione del CS in posizioni aspecifiche e avente altissima densità di carica (maggiore di 2,5-3,0) presente nell’eparina utilizzata per via endovena ha provocato la morte di centinaia di pazienti negli Stati Uniti ed in Europa (Kishimoto TK et al., New Engl. J. Med. 358, 2457, 2008; McKee J et al., J Clin Pharmacol 50, 1159, 2010; Ramacciotti E et al., Clin Appl Thromb Hemost 17, 126, 2011). Infine, preparazioni di CS utilizzate come integratori alimentari o anche come farmaci in trials clinici si sono dimostrati inefficaci molto probabilmente a causa di una scarsa qualità dei prodotti utilizzati, in particolare concentrazioni di principio attivo basse (Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007; Rainsford KD J Pharm Pharmacol 61, 1263, 2009).
Il CS naturale à ̈ somministrato per via orale ed à ̈ in grado di esplicare la sua azione di farmaco SYSADOA grazie all’assorbimento a livello della mucosa intestinale di catene poli(oligo)saccaridiche. Dai dati presenti in letteratura, il CS naturale somministrato per via orale à ̈ assorbito come polisaccaride ad alto peso molecolare insieme a derivati generati da una parziale depolimerizzazione e desolfatazione. Questi risultati sono ulteriormente confermati dagli effetti terapeutici di CS (e di altri polisaccaridi solfatati), quando somministrati per via orale. In effetti, studi precedenti hanno dimostrato che dopo l’assorbimento per via orale la curva plasmatica media del CS raggiunge il picco di massimo assorbimento a 3,2 h (Conte A. et al., Arzneim-Forsch/Drug Res 1991; 41: 768-72), 4,0 h (Ronca G, Conte A. Int J Clin Pharm Res 1993; XIII (Suppl): 27-34), 5,0 h (Conte A. et al., Arzneim-Forsch/Drug Res 1995; 45: 918-25), 2,4 h (CS da bovino) (Volpi N. Osteoarthritis Cartilage 2002; 10: 768-77) e 8,7 h (CS da cartilagine di squalo) (Volpi N. Osteoarthritis Cartilage 2003; 11: 433-41). Dopo la somministrazione per via orale, una bassa quantità di CS attraversa il tratto superiore dell’intestino come molecola intatta (Barthe L et al., Arzneim-Forsch/Drug Res 2004; 54: 286-92), mentre nel tratto gastrointestinale distale la macromolecola à ̈ parzialmente degradata e desolfatata (Barthe L. et al., Arzneim-Forsch/Drug Res 2004; 54: 286-92), presumibilmente dagli enzimi della flora intestinale (Ahn MY et al., Can J Microbiol 1998; 44: 423-9) presenti nell’uomo. Di conseguenza, circa il 5% di CS di origine bovina (Volpi N. Osteoarthritis Cartilage 2002; 10: 768-77) e il 2,5-3% di CS da cartilagine di squalo (Volpi N. Osteoarthritis Cartilage 2003; 11: 433-41) viene assorbito come frazioni oligosaccaridiche aventi un peso molecolare superiore a circa 2,0 kDa.
Da quanto esposto e presente in letteratura scientifica, grazie al suo alto peso molecolare, il CS di origine bovina à ̈ assorbito per circa il 5% mentre quello di origine ittica avente un maggiore peso molecolare, viene assorbito per circa il 2,5-3%. Inoltre, gran parte del CS à ̈ parzialmente degradato (e desolfatato) nel tratto gastrointestinale distale, presumibilmente dagli enzimi della flora intestinale umana, dove poi vengono assorbiti frammenti e oligomeri. Di conseguenza, l’assorbimento dipende strettamente dal grado di depolimerizzazione del CS e un polimero a più basso peso molecolare verrebbe più facilmente assorbito di un polisaccaride naturale avente alto peso molecolare.
Il CS commerciale à ̈ ottenuto per estrazione di tessuti animali, come per esempio tessuti bovini e suini (Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998), di uccelli (Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002) e cartilagini di pesci (Sugahara K et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003). Tuttavia, l’origine animale del CS commerciale comporta problemi di sicurezza associati ad agenti infettivi trasmissibili che provocano patologie come l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e la peste suina e limita le eventuali fonti in considerazione della crescente domanda a livello mondiale. Queste considerazioni hanno stimolato la ricerca di metodi alternativi per la produzione di CS.
Sono stati svolti sforzi intensi per trovare una via biotecnologica per la produzione di CS, utilizzando un microorganismo come fonte di un polisaccaride precursore che mostri una struttura parzialmente simile a quella di CS e procedendo attraverso la solfatazione chimica per produrre un CS simile a quello naturale.
Un esempio di questa strategia à ̈ la produzione di CS biotecnologico a partire dal polisaccaride capsulare K4 di E. coli O5:K4:H4 come descritto in EP 1304338 B1. Questo brevetto descrive un procedimento in cui il polisaccaride K4 prodotto in colture liquide viene estratto e purificato, e successivamente ridisciolto e sottoposto a idrolisi acida per eliminare i residui di fruttosio legati ai residui di GlcA del polimero. Il polimero defruttosilato, identico allo scheletro non solfatato di CS, viene poi solfatato in posizione 4 o in posizione 6 del residuo GalNAc seguendo due diverse vie di sintesi chimica. Tuttavia, il procedimento di EP 1304338 non consente la solfatazione contemporanea nelle posizioni 4 o 6 all’interno della stessa catena, contrariamente a quanto avviene nel CS naturale. Inoltre, EP 1304338 non descrive l’attività antiinfiammatoria e antiartritica del CS ottenuto.
In una recente pubblicazione (Bedini E et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2011 May 18), si descrive un procedimento in cui il polisaccaride K4 prodotto viene solfatato in posizione 4 e/o in posizione 6 del residuo GalNAc all’interno della stessa catena. Tuttavia, il CS biotecnologico descritto da Bedini et al. presenta un peso molecolare simile a quello dei CS naturali, dell’ordine di 17 kDa, con conseguente bassa biodisponibilità tipica dei prodotti naturali di origine estrattiva. Bedini et al. non riportano alcuna caratterizzazione farmacologica del prodotto da loro ottenuto.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La presente invenzione descrive un metodo per la produzione di CS a basso peso molecolare (LMW-CS BIOTEC) in seguito a selettiva solfatazione chimica a partire da uno scheletro di condroitina non solfatata (CH), questa CH essendo ottenuta mediante idrolisi acida di un polisaccaride microbico naturale (cioà ̈ K4), oppure essendo prodotta direttamente da E. coli geneticamente, come per esempio il ceppo E. coli DSM23644 descritto nelle
domande di brevetto MI2010A001300 e MI2010A001264. Il ceppo batterico
ivi descritto reca una mutazione che provoca l’inattivazione del gene KfoE
per la fruttosilazione di K4.
Il LMW-CS dell’invenzione ha caratteristiche di un CS naturale con un
titolo superiore al 95% in base ai metodi analitici descritti nella Farmacopea
Europea.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione ha un peso molecolare medio
misurato mediante SEC (Mw) di 4-9 kDa e presenta una distribuzione di
gruppi mono-solfati variante da 90% di 4-solfato e 10% di 6-solfato a 10% di
4-solfato e 90% di 6-solfato (Tabella 2).
Caratteristiche del LMW-CS BIOTEC descritto nella presente invenzione
Mw (kDa) 4-9
Digeribilità con condroitinasi ABC > 95%
Di-0S < 10% Di-6S 10 - 90% Di-4S 90 - 10% Di-2,6diS < 5%
Di-4,6diS < 5%
Di-2,4diS < 5%
Di-triS nd
Di-tetraS nd
Titolo (w/w) > 95% (o.d.b.)* Densità di Carica 0.8-1.0 ;Rapporto 4S/6S 0.1-9.0 ;;Tabella 2 - Mw = peso molecolare medio ponderale; la densità di ;carica à ̈ il numero di gruppi solfato per unità disaccaridiche; nd = Non individuato; *- o.d.b.: on dry basis.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione mostra una piccola quantità (<10%) di disaccaride non solfatato e percentuali molto basse (<5%) di disaccaridi disolfatati, mentre non sono individuabili disaccaridi trisolfatati.
Il LMW-CS BIOTEC à ̈ caratterizzato da valori di densità di carica di 0.8 - 1.0, paragonabili ai valori dei CS naturali di origine terrestre (vedi Tabella 1).
Il procedimento dell’invenzione consente anche di modulare la solfatazione sito-specifica allo scopo di fornire un CS con uno specifico rapporto 4S/6S nei limiti sopra indicati e analoghi a quelli presenti nei CS di origine naturale.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione viene riconosciuto e digerito dalla condroitinasi ABC, un enzima litico che ha il compito di catabolizzare i CS naturali in organismi specifici, dimostrando che le catene polisaccaridiche del LMW-CS biotecnologico non hanno riportato modificazioni strutturali tali da comprometterne il riconoscimento specifico e altamente sensibile di enzimi naturali.
Infine, il LMW-CS BIOTEC digerito con condroitinasi C, una endoliasi che idrolizza il polisaccaride in corrispondenza dei residui solfatati in posizione 6, ma non in posizione 4, produce sequenze oligosaccaridiche tipiche della presenza di unità Di-4S alternate a unità Di-6S sulla stessa catena polisaccaridica analogamente a quanto accade per il CS naturale. (Figure 1-2-3). In particolare la Figura 1 descrive Condroitin solfato naturale di origine bovina trattato mediante condroitinasi C. Sono visibili oligosaccaridi di lunghezza diversa che evidenziano la presenza di gruppi solfato in posizione 4 oppure 6 del residuo di GalNAc sulla stessa catena polisaccaridica. Il cromatogramma à ̈ stato ottenuto mediante separazione in gradiente su colonna a scambio anionico forte (SAX-HPLC) e rivelazione in UV a 232 nm. Il gradiente à ̈ stato ottenuto mediante NaCl 50 mM fino a NaCl 1.2 M da 0 a 60 minuti;
la Figura 2 descrive Condroitin solfato naturale di origine suina trattato mediante condroitinasi C. Sono visibili oligosaccaridi di lunghezza diversa che evidenziano la presenza di gruppi solfato in posizione 4 oppure 6 del residuo di GalNAc sulla stessa catena polisaccaridica. Il cromatogramma à ̈ stato ottenuto mediante separazione in gradiente su colonna a scambio anionico forte (SAX-HPLC) e rivelazione in UV a 232 nm;
la Figura 3 descrive LMW-CS BIOTEC oggetto della presente invenzione trattato mediante condroitinasi C. Visibili anche in questo caso oligosaccaridi di lunghezza diversa che evidenziano la presenza di gruppi solfato in posizione 4 oppure 6 del residuo di GalNAc sulla stessa catena polisaccaridica.
Il cromatogramma à ̈ stato ottenuto mediante separazione in gradiente su colonna a scambio anionico forte (SAX-HPLC) e rivelazione in UV a 232 nm.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione à ̈ stato valutato per assorbimento orale e biodisponibilità nell’uomo in comparazione con CS naturale altamente puro di origine bovina, il primo standard della Farmacopea Europea. Questo risulta particolarmente importante in quanto nella flora batterica umana e non nell’animale à ̈ stata descritta la presenza di un batterio in grado di biosintetizzare un enzima litico specifico per la degradazione del CS (e derivati a basso peso molecolare) (Ahn MY, et al., Can J Microbiol 1998; 44: 423-9).
L’assorbimento orale e la biodisponibilità del LMW-CS BIOTEC sono stati valutati nell’uomo mediante tecniche note.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione à ̈ stato valutato per la possibile attività antiinfiammatoria utilizzando test specifici quali:
la capacità di inibire un enzima proteolitico prodotto durante i processi infiammatori dai leucociti, la elastasi leucocitaria umana (Kostoulas G. et al., Biol Chem 378, 1481, 1997; Volpi N. Chem Biol Interact 105, 157, 1997; Ying QL et al., Am J Physiol. 272, L533, 1997):
la capacità di inibire l’attività antichemotattica, fagocitica, il rilascio di lisozima e il danno della membrana biologica da parte di radicali liberi in neutrofili umani (Matzner Y. et al., Thromb Haemost 52, 134, 1984; Ronca F, Palmieri L et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998).
Questi test sono stati condotti sul LMW-CS BIOTEC dell’invenzione, in confronto con un composto di riferimento, un CS naturale di origine bovina altamente puro, il primo standard della Farmacopea Europea.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione à ̈ stato valutato anche per proprietà antiartritiche in un modello animale, “Adjuvant Arthritis (AA) model†, largamente riconosciuto dalla comunità scientifica e pubblicato in numerosi lavori scientifici. Anche in questo caso i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli ottenuti precedentemente con la molecola di riferimento: lo standard della Farmacopea Europea, un CS naturale di origine bovina altamente puro, (Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007). Infatti, i modelli animali di OA e artrite reumatoide (AR) sono strumenti utili per studiare questi processi patogeni. L’“Adjuvant Arthritis†(AA) à ̈ uno dei modelli più diffusi. L’AA nel ratto à ̈ un modello sperimentale di poliartrite che à ̈ stato ampiamente utilizzato per testare numerosi agenti e farmaci antiartritici sia prima che dopo accurate indagini cliniche (Bendele A et al., Toxicol Pathol 27, 134, 1999; Rovensky J et al., Rheumatol Int. 31, 507, 2011; Bauerova K et al., Interdisc Toxicol 4, 101, 2011). Esistono inoltre numerosi studi nei quali i dati sull’animale ottenuti con il test AA sono stati confrontati con i risultati sull’uomo (Kannan K et al., Pathophysiology 12, 167, 2005).
La contemporanea monosolfatazione in 4 o in 6 della catena polimerica, la purezza e il basso peso molecolare conferiscono al LMW-CS BIOTEC, dell’invenzione un maggiore assorbimento orale ed una migliore biodisponibilità .
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione può essere ottenuto come descritto in MI2011A000289 utilizzando come substrato di partenza il polisaccaride capsulare K4 prodotto naturalmente dal ceppo di E. coli O5:K4:H4 (EP 1304338 B1) oppure un altro polisaccaride avente la struttura della condroitina non solfatata (CH).
Nel primo caso il polisaccaride K4, ottenuto da un brodo di coltura del ceppo O5:K4:H4 di E. coli, viene defruttosilato a fine fermentazione mediante idrolisi termoacida e la condroitina ottenuta purificata in accordo a un adattamento dei metodi descritti da Rodriguez e Jann (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988).
Alternativamente, il polisaccaride di partenza à ̈ un polisaccaride avente la struttura della CH non solfata, ottenuto, per esempio, dalla coltura del ceppo di E. coli DSM23644 descritto in MI2010A001300, che, in virtù di una mutazione indotta nel gene KfoE responsabile della fruttosilazione del K4, produce un polisaccaride identico alla CH naturale non solfatata. In questo caso non à ̈ necessaria la defruttosilazione, ma l’idrolisi termoacida viene mantenuta allo scopo di eliminare alcune impurezze, tra cui le endotossine batteriche che precipitano per effetto del trattamento. Successivamente si procede alla purificazione della condroitina (CH) mediante centrifugazione, dialisi e spray drying.
L’idrolisi viene condotta a 90°-95°C per 30-50 min a pH 2,8-3,0 sul surnatante della coltura separato dalla biomassa mediante centrifugazione continua. L’idrolisi viene arrestata raffreddando la sospensione a una temperatura inferiore a 40°C, preferibilmente a 20°C - 30°C, e aggiustando il pH a 4-4,5.
La sospensione risultante viene sottoposta in sequenza a chiarificazione, mediante centrifugazione continua, ultrafiltrazione ed infine a dialisi con acqua su una membrana da 30 kDa.
Il ritentato dializzato viene filtrato e infine essiccato mediante spray dryer per ottenere un polisaccaride avente la struttura della CH da sottoporre al processo di solfatazione. La CH ottenuta presenta un titolo sul secco (w/w) del 80 - 90% come determinato mediante analisi in elettroforesi capillare (CE) o in HPLC.
La CH così ottenuta à ̈ sotto forma di sale sodico e per essere solfatata richiede la sua trasformazione in acido libero o in un suo sale.
Il procedimento di solfatazione descritto nella domanda MI2011A000289 che consente di mono-solfatare in modo casuale le posizioni 4 o 6 del residuo GalNAc della stessa catena polisaccaridica si basa sulla formazione di un orto estere che coinvolge contemporaneamente le posizioni 4 e 6 della GalNAc e il suo successivo riarrangiamento a estere che può essere modulato al fine di liberare prevalentemente l’ossidrile in 4 o quello in 6, permettendo così la relativa selettiva solfatazione di questi ossidrili. Alcuni accorgimenti nel processo consentono di ottenere una depolimerizzazione della catena polisaccaridica tale da produrre alla fine un CS solfatato in posizione 4 o 6 della GalNAc caratterizzato da un basso peso molecolare (LMW). Il procedimento della solfatazione comprende:
a) La trasformazione della condroitina sale sodico in acido libero o, in alternativa, in un suo sale con uno ione ammonio quaternario, quale ad esempio tetrametil-, tetraetil- e tetrabutil-ammonio, o con la piridina. Alternativamente, la condroitina (CH) in forma acida viene trasformata nel suo metilestere dopo reazione in metanolo e acetil cloruro.
b) La reazione del sale di condroitina, o della condroitina metilestere con un orto estere di formula RC(OR1)3, in cui R à ̈ scelto tra idrogeno, metile, etile o fenile ed R1à ̈ scelto tra metile o etile, in presenza di catalisi acida, ottenendo in questo modo la formazione di un orto estere ciclico che si forma per spostamento di due alcossili dell’orto estere di partenza da parte delle funzioni alcoliche 4 e 6 del residuo di GalNAc. Nel composto ottenuto in questo passaggio tutte o quasi tutte le unità disaccaridiche presenti possiedono una struttura di orto estere ciclico rappresentata dalla formula I,
OR1
<O>
OO<O>
O O O
OO
H O OH NHAc
I
in cui R e R1sono come sopra definiti.
Come catalizzatore acido si utilizza un acido scelto tra acido canfosolfonico, acido para-toluensolfonico, acido metansolfonico o una resina solfonica. Usando un rapporto substrato/acido superiore allo stechiometrico e tempi di riscaldamento maggiori, si induce, oltre alla formazione dell’ortoestere, una depolimerizzazione della condroitina, ottenendo, dopo gli stadi di deprotezione e solfatazione, un CS a basso peso molecolare.
c) La protezione dei gruppi alcolici in posizione 2’ e 3’ del residuo GlcA mediante acilazione con un’anidride di un acido carbossilico di formula (R2CO)2O, in cui R2à ̈ preferibilmente scelto tra metile, etile o propile in presenza di piridina o di una base organica terziaria, ad esempio trietilammina o triisopropiletilammina, e di quantità catalitiche di 4-dimetilamminopiridina (DMAP), per dare un prodotto in cui l’unità ripetuta del disaccaride che si trova nella condroitina ha una struttura di ortoestere ciclico acilato in 2’ e 3’ rappresentata dalla formula II
OR1
O<O>O<O>
O O
OOO
O NHAc
R2 O
R2
O
O
II
in cui R, R1ed R2sono come sopra definiti.
d) Il riarrangiamento da ortoestere ciclico ad estere, reazione che viene eseguita in una miscela di un acido organico solubile in acqua ed acqua. Questo riarrangiamento che avviene in modo casuale sulle varie unità di GalNAc della sequenza polisaccaridica, può essere modulato come descritto in MI2011A000289 al fine di favorire la liberazione dell’uno o dell’altro ossidrile (rispettivamente in 4 o in 6), con la contemporanea formazione dell’estere con l’acido organico solubile utilizzato sulla restante posizione (rispettivamente in 6 o in 4). Come risultato si ottiene la formazione, all’interno della stessa catena polisaccaridica, delle due differenti unità disaccaridiche aventi una struttura in cui gli idrossili in posizioni 6, 2’, 4’ sono acilati e quello in 4 libero, rappresentate dalla formula IIIa e quelle aventi una struttura in cui gli idrossili in posizioni 4, 2’, 4’ sono acilati e quello in 6 à ̈ libero, rappresentate dalla formula IIIb;
O R
<O>
OOH<O>
O O O
OOO
R2 O NHAc
R2
O
O
IIIa
in cui R ed R2sono come sopra definiti; oppure,
R
<O>
OO O<OH>
O O
OOO
O NHAc
R2 O
O R2
O
IIIb
in cui R ed R2sono come sopra definiti.
L’acido organico solubile in acqua à ̈ scelto tra acido acetico, formico, propionico, tartarico, citrico o una resina cationica quale ad esempio Sepra SCX 50 µm 65A, preferibilmente acido acetico o acido propionico, più preferibilmente acido acetico. In alternativa allo stadio b), la depolimerizzazione della condroitina può essere ottenuta in questo stadio utilizzando l’acido come solvente o co-solvente della reazione. L’alta concentrazione di acido in questo stadio porta a una rottura della catena polisaccaridica con conseguente produzione di catene a basso peso molecolare, nel range di 4-9 kD.
La reazione con piridinio-solfotriossido in DMF secondo il metodo già descritto in EP 1304338 B1 oppure con il complesso DMF-solfotriossido porta alla solfatazione alla posizione 4 del disaccaride IIIa o alla posizione 6 del disaccaride IIIb. La reazione di solfatazione à ̈ poi seguita dalla rimozione, mediante trattamento basico, dei gruppi acilici presenti nelle posizioni 2’ e 3’ del residuo GlcA e nelle posizioni 4 o 6 del residuo GalNAc, secondo le procedure descritte in EP 1304338 B1, per dare il CS dell’invenzione parzialmente solfatato in 4 e in 6.
Il LMW-CS BIOTEC, 4.000 - 9.000 Dalton ottenuto dal procedimento descritto à ̈ stato valutato per la sua efficacia in un modello animale di artrite sperimentale (Adjuvant Arthritis AA) nel ratto confrontando i risultati ottenuti con quelli relativi al CS naturale di origine estrattiva di grado farmaceutico utilizzato nello stesso modello sperimentale (Bauerova K. Et al., Osteoarthritis Cartilage. 2011, Epub ahead of print) dopo trattamento giornaliero di 900 mg/kg, per via orale.
L’AA à ̈ stata indotta da una singola iniezione intradermica di Mycobacterium butyricum in adiuvante incompleto di Freund. Gli esperimenti comprendevano animali sani, animali artritici non trattati, animali artritici trattati. Tra gli animali trattati un gruppo di animali à ̈ stato sottoposto ad un pretrattamento consistente nella somministrazione di 900 mg/kg di LMW-CS BIOTEC al giorno per 14 giorni prima dell’induzione dell’artrite proseguendo per i 28 giorni successivi all’induzione dell’AA. Un altro gruppo di animali à ̈ stato trattato con 900 mg/kg di LMW-CS BIOTEC al giorno esclusivamente durante i 28 giorni successivi all’induzione della AA.
L’edema sviluppato nella zampa posteriore diminuiva significativamente negli animali pretrattati. Il pre-trattamento con il LMW-CS BIOTEC dell’ invenzione (900 mg/kg/gg) riduce significativamente l’edema per la durata dell’intero esperimento rispetto ai controlli non trattati. Il pretrattamento con LMW-CS BIOTEC à ̈ inoltre in grado di ripristinare il peso corporeo di circa l’8-15% rispetto al controllo artritico non trattato.
La gravità dell’artrite à ̈ stata quantificata sulla base dei livelli crescenti di gonfiore e eritema periarticolare. 900 mg/kg/gg di LMW-CS BIOTEC somministrato sia come pre-trattamento che come trattamento risultano significativamente efficaci nel diminuire lo score artritico. Inoltre, il pre-trattamento à ̈ efficace durante l’intera fase subacuta (dal giorno 14 fino al giorno 28 successivi all’induzione dell’AA), mentre il trattamento à ̈ efficace esclusivamente a medio-lungo termine, nei giorni 21 - 28 successivi all’induzione dell’AA e non nella fase acuta (primi 14 giorni dall’induzione della AA).
Lo stress ossidativo, conseguenza dei processi infiammatori cronici che si verificano nei processi artritici/artrosici, aumenta significativamente nel modello animale sia in fase acuta che subcronica. L’aumentato stress ossidativo induce un elevato consumo di antiossidanti endogeni nel plasma e causa quindi un abbassamento della capacità antiossidante plasmatica, misurata come lo stato antiossidante totale. Il pre-trattamento con LMW-CS BIOTEC à ̈ efficace nel correggere lo stato antiossidante totale nel modello animale riducendo significativamente il consumo di antiossidanti endogeni. L’attività della γ-glutamil transferasi, che aumenta in corrispondenza di uno stress ossidativo ed à ̈ quindi considerata un buon marker dello stress ossidativo stesso, misurata in omogenati tissutali delle articolazioni, à ̈ risultata notevolmente maggiore negli animali con poliartrite sperimentale indotta, e notevolmente ridotta negli animali trattati con LMW-CS BIOTEC, in confronto con gli animali non trattati.
L’interleuchina-1β (IL-1β e l’interleuchina-6 (IL-6), citochine pro-infiammatorie, sono risultate significativamente aumentate nel modello animale di artrite sperimentale indotta, con un drammatico aumento di IL-6 in fase acuta, che mostra un livello 10 volte superiore rispetto ai controlli sani. L’effetto terapeutico del LMW-CS BIOTEC era palese già dal giorno 14, in fase acuta, riducendo la concentrazione di IL-6 di circa il 30-40% rispetto agli animali affetti da AA.
Il marcatore di base delle proteine infiammatorie, la proteina C-reattiva (CRP), ha un profilo temporale molto simile a IL-6. L’incremento in fase acuta à ̈ stato di circa 7,5 volte nel modello di artrite sperimentale rispetto ai controlli sani. Analogamente a quanto accade per il livello di IL-6, l’effetto del LMW-CS BIOTEC nei confronti della CRP si nota in fase acuta con una significativa riduzione della concentrazione di CRP nel plasma.
Per quanto riguarda l’attività fagocitica e l’incremento ossidativo intracellulare dei neutrofili, le differenze osservate tra il controllo sano e il controllo affetto da AA sperimentale indotta sono state significative verso un aumento dell’attività fagocitaria. La somministrazione del LMW-CS BIOTEC nel regime di pre-trattamento ha indotto una riduzione significativa della fagocitosi e del “burst†ossidativo.
Il LMW-CS BIOTEC dell’invenzione à ̈ in grado di ridurre significativamente la gravità sia dei processi artritici che lo stress ossidativo generato come conseguenza dei processi infiammatori cronici. Il pre-trattamento con LMW-CS BIOTEC à ̈ efficace durante l’intera fase subacuta, mentre il trattamento dal giorno 1 dell’instaurazione della AA si rivela efficace solo nel periodo cronico. Gli effetti sono confermati da un miglioramento dello stato antiossidante totale e dell’attività della γ-glutamil transferasi. Il LMW-CS BIOTEC somministrato in un regime di pre-trattamento à ̈ in grado inoltre di ridurre la produzione di citochine pro-infiammatorie, la proteina C-reattiva nel plasma, l’attività fagocitaria e il burst ossidativo intracellulare dei neutrofili. Infine, il LMW-CS BIOTEC si dimostra efficace nel rallentare lo sviluppo dell’artrite/artrosi sperimentale sia in fase acuta che subcronica e nella riduzione dei markers della malattia, sostenendo in tal modo la sua attività benefica al pari del composto di riferimento.
L’attività anti-artritica e anti-infiammatoria del LMW-CS BIOTEC dell’invenzione e le particolari condizioni necessarie al suo ottenimento sono ora illustrate da alcuni esempi:
Esempio 1: formazione dell’ortoestere ciclico sulle funzioni ossidriliche in 4 e 6 della porzione GalNAc con contemporanea depolimerizzazione della catena polisaccaridica
Una sospensione di sale di tetrabutilammonio della condroitina, come ottenuta dal processo descritto in MI2011A000289, (4,07 g; 6,535 mmoli) in Dimetilformammide (101 ml) à ̈ stata mantenuta in agitazione sotto azoto, a temperatura ambiente (20-25°C). Ad essa si à ̈ aggiunto il trimetilortoacetato (9,03 ml, 71,89 mmoli), e l’acido canfosolfonico (1,82 g; 7,84 mmoli). La sospensione à ̈ stata scaldata a 70°C interni, osservando già dopo pochi minuti la completa dissoluzione. La reazione à ̈ stata mantenuta in agitazione alla medesima temperatura per 18-20 h. L’indomani la reazione à ̈ stata concentrata allontanando il solvente mediante evaporazione sottovuoto, fornendo 13,67 g di prodotto in forma di un residuo gommoso, giallo intenso.
Il contenuto residuo di Condroitina non protetta dopo digestione à ̈ il 4,6%. La presenza dell’ortoestere à ̈ dimostrata dal segnale relativo in FT-IR.
Il prodotto così ottenuto à ̈ stato poi utilizzato nei passaggi successivi secondo quanto descritto in MI2011A000289 fino ad ottenere un LMW-CS BIOTEC solfatato in 4 o in 6 sulla GalNAc.
Esempio 2: apertura dell’ortoestere ciclico della condroitina ad estere con prevalente formazione dell’acetato in 4 o in 6 della porzione GalNAc con contemporanea depolimerizzazione della catena polisaccaridica
In un pallone a tre colli da 250 ml sono stati caricati Condroitina orto estere (3,00 g), acqua (3,14 ml) e acido acetico (26,25 g; 437 mmoli). La sospensione ottenuta à ̈ stata scaldata per 36 h a temperatura ambiente (20-25°C). Al termine si à ̈ aggiunta acqua fino a giungere ad un volume complessivo di 100 ml. La soluzione così ottenuta à ̈ stata ultrafiltrata (membrana 5 KD). Il retentato raccolto à ̈ stato dializzato a piccolo volume (20 ml), quindi concentrato a secchezza mediante evaporazione sottovuoto, fornendo 1,55 g di residuo solido corrispondente al prodotto desiderato (Triacetil condroitina).
Il prodotto così ottenuto à ̈ stato poi utilizzato nei passaggi successivi secondo quanto descritto in MI2011A000289 fino ad ottenere un LMW-CS BIOTEC solfatato in 4 o in 6 sulla GalNAc.
Esempio 3: induzione dell’artrite (Adjuvant Arthritis, AA) nei ratti e trattamento con LMW-CS BIOTEC
40 ratti Lewis maschi del peso compreso tra 150 - 190 g sono stati suddivisi in modo casuale in quattro gruppi da 10 animali ciascuno, stabulati in gabbie di polipropilene in un ambiente mantenuto alla temperatura di 22 ± 2°C e nutriti con dieta standard da laboratorio e acqua ad libitum.
I gruppi sperimentali erano i seguenti:
1) Un gruppo di controllo sano non trattato.
2) Un gruppo di controllo con artrite indotta da adiuvante (AA) non trattato.
3) Un gruppo di ratti artritici trattato oralmente con LMW-CS BIOTEC alla dose di 900 mg/giorno per kg di peso corporeo per 28 giorni dopo l’induzione della AA (giorni 0 - 28 dell’esperimento).
4) Un gruppo pretrattato oralmente con LMW-CS BIOTEC alla dose di 900 mg/giorno per kg di peso corporeo per 14 giorni precedenti l’induzione della AA e per i successivi 28 giorni dopo l’induzione della AA (giorni -14 - 28 dell’esperimento).
L’artrite sperimentale à ̈ stata indotta il giorno 0 nei ratti mediante una singola iniezione intradermica di 1 ml una miscela composta da Mycobacterium butyricum inattivato al calore in adiuvante incompleto di Freund.
Il LMW-CS BIOTEC era disciolto in acqua distillata alla concentrazione di 20 mg/ml e somministrato oralmente come singola dose giornaliera tramite gavage.
Alla fine dei 28 giorni di durata dei trattamenti i ratti sono stati sacrificati in anestesia e il sangue e i tessuti interessati raccolti e analizzati per la valutazione dei parametri osservati nello studio.
Esempio 4: effetti del LMW-CS BIOTEC sull’assessment della AA nei ratti mediante controllo dell’edema sviluppato, del peso corporeo e dello score artritico
L’edema sviluppato in conseguenza dell’artrite era misurato osservando l’aumento del volume della zampa posteriore mediante un calibro adatto alla misurazione. Le misure sono state effettuate prima dell’induzione della AA e al giorno 28 dello studio.
Il peso corporeo dei ratti era controllato prima dell’induzione della AA e alla fine del trattamento (giorno 28). L’effetto del trattamento su questo parametro à ̈ stato valutato confrontando i diversi incrementi ponderali dei diversi gruppi nel periodo di trattamento.
Lo score artritico à ̈ stato valutato attribuendo un punteggio all’osservazione del rigonfiamento articolare della zampa e dell’entità dell’eritema periarticolare. Lo score artritico o artogramma viene misurato come la somma totale tenendo conto dell’edema (in ml, max. punti 8), più il diametro della zampa anteriore (in mm, max. punti 5), più il diametro della crosta nel sito di applicazione del Mycobacterium butyricum misurata parallelamente alla colonna vertebrale (in mm, max. punti 5) per ogni animale.
Esempio 5: effetto del LMW-CS BIOTEC sull’attività della γ-glutamil transferasi quale marker dello stress ossidativo indotto da AA
Lo stress ossidativo à ̈ stato valutato misurando l’attività della γ-glutamil transferasi in omogenati di tessuto articolare prelevato dai ratti alla fine dei trattamenti con LMW-CS BIOTEC. La γ-glutamil transferasi à ̈ considerato un marker dello stress ossidativo.
L’attività della γ-glutamil transferasi cellulare à ̈ stata determinata in omogenati di tessuto prelevati dalla zampa posteriore e valutata con il metodo di Orlowski e Meister (Orlowski M, Meister A. The gamma-glutamyl cycle: a possible transport system for amino acids. Proc Natl Acad Sci USA 1970; 67: 1248-1255) come successivamente modificato da Ondrejickova et al. (Cardioscience 1993; 4: 225-230). I campioni sono stati omogeneizzati in un buffer (2,6 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4, 15 mM EDTA, 68 mM NaCl, pH 8,1) a 1:9 (w/v) mediante UltraTurax TP 18/10 (Janke & Kunkel, Germania) per 1 min a 0°C. I substrati, 8,7 mM γ-glutamyl p-nitroanilide e 44 mM di metionina, sono stati aggiunti al 65% di alcool isopropilico in concentrazioni finali di 2,5 mM e 12,6 mM, rispettivamente. Dopo incubazione per 60 min a 37°C, la reazione à ̈ stata arrestata aggiungendo 2,3 ml di metanolo freddo, e le provette centrifugate per 20 min a 5000 giri. L’assorbanza del surnatante à ̈ stata misurata con uno spettrofotometro Specord 40 (Jena, Germania) in cuvette da 0,5 cm a 406 nm. Miscele di reazione in assenza di substrato o accettore sono stati utilizzati come campioni di riferimento.
Esempio 6: effetto del LMW-CS BIOTEC sullo stato infiammatorio indotto da AA mediante valutazione dei livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6) e proteina C-reattiva (CRP) nel plasma
Campioni di sangue sono stati prelevati ai ratti alla fine dell’esperimento in provette contenenti eparina come anticoagulante, il plasma à ̈ stato separato dalla parte corpuscolare costituita dalle cellule ematiche tramite centrifugazione e le citochine infiammatorie (IL-1, IL-6) sono state dosate con tecnica ELISA utilizzando kit commerciali specifici.
La proteina C-reattiva à ̈ stata dosata nel plasma di ratto mediante kit ELISA (Immunology Consultant Laboratories, Inc., ICL). La reazione dell’anticorpo secondario biotina-coniugato con anticorpi anti-ratto proteina C-reattiva viene valutata mediante l’attività della streptavidina-perossidasi di rafano (HRP). La reazione della metil-benzidina con HRP legato ai complessi immunitari viene quindi misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre della Labsystems Multiskan RC. I risultati sono stati calcolati utilizzando la curva standard di calibrazione secondo le indicazioni del kit ELISA.
Esempio 7: effetto del LMW-CS BIOTEC sull’attività fagocitica e sul burst ossidativo dei neutrofili indotto da AA
La popolazione dei neutrofili à ̈ stata estratta dal sangue dei ratti al fine della valutazione della loro attività fagocitica e del burst ossidativo. Le misure di fagocitosi, cioà ̈ l’ingestione di batteri, si à ̈ svolta in condizioni controllate utilizzando Staphylococcus aureus opsonizzati e marcati con fluoresceina (SPA-FITC) (Molecular Probes Invitrogen, USA). Aliquote di sangue periferico in litio-eparina sono stati quindi incubati con idrossietidina (Invitrogen sonde molecolari, USA) (15,75 mg in 5 ml di dimetilformammide, Merck, Germania) per 15 minuti a 37°C. Dopo il trattamento con SPA-FITC per 15 minuti a 37°C, la reazione à ̈ stata interrotta mettendo le provette in ghiaccio. La successiva lisi degli eritrociti viene eseguita per 15 min con una soluzione di lisi costituita da ammonio cloruro/potassio cloruro a freddo (200 ml di acqua deionizzata, 1,658 g di NH4Cl, 0,2 g di KHCO3, 7,4 mg Na2EDTA, pH 7,2-7,4). La percentuale media di cellule fagocitarie rappresenta la percentuale di granulociti che ha ingerito almeno una particella di SPA-FITC e la percentuale media del burst respiratorio rappresenta la percentuale di granulociti marcati con etidio.
Claims (6)
- RIVENDICAZIONI 1. Un condroitin solfato di peso molecolare compreso fra 4000 e 9000 dalton di origine biotecnologica in cui all’interno della stessa catena polisaccaridica le unità di N-acetil-D-galattosammina risultano essere tutte monosolfatate in modo casuale o in posizione 4 o in 6.
- 2. Un condroitin solfato secondo la rivendicazione 1 avente una distribuzione di gruppi mono-solfato il cui rapporto varia da 90/10 4S/6S sino a 10/90 4S/6S.
- 3. Un processo per la preparazione del condroitin solfato delle rivendicazioni 1 o 2 che prevede: a) la trasformazione di condroitina sale sodico nel suo acido libero o in un suo sale di tetrametilammonio, tetraetilammonio, tetrabutilammonio, piridinio o nel metilestere; b) la reazione del composto ottenuto nel passaggio a) con un ortoestere di formula RC(OR1)3, in cui R à ̈ scelto tra idrogeno, metile, etile o fenile ed R1à ̈ scelto tra metile o etile, in presenza di un acido scelto fra acido canfosolfonico, acido para-toluensolfonico, acido metansolfonico o una resina solfonica in quantità uguale o superiore allo stechiometrico, per dare un composto in cui l’unità ripetuta del disaccaride ha formula I R OR1 <O> OO<O> O O O OO H O OH NHAc I in cui R ed R1sono come sopra definiti; c) la protezione dei gruppi idrossilici nelle posizioni 2’ e 3’ delle unita di acido glucuronico del composto ottenuto nel passaggio precedente mediante reazione con una anidride di formula (R2CO)2O in cui R2à ̈ scelto tra metile, etile o propile, in presenza di piridina o di una base organica terziaria scelta tra trietilammina, triisopropilammina e 4-dimetilamminopiridina (DMAP), a dare un composto in cui l’unità ripetuta del disaccaride ha la formula II R OR1 <O> OO<O> O O OOO O O NHAc R2 O R2 O II in cui R, R1ed R2sono come sopra definiti; d) il riarrangiamento della funzione ortoesterica presente sul prodotto ottenuto nel passaggio c) con una soluzione acquosa di acido organico scelto tra acido acetico, formico, propionico, tartarico, citrico o una resina cationica, per dare un derivato estereo in cui le unità di GalNAc che si ripetono nel polisaccaride sono costituite da triacil derivati aventi formula di struttura IIIa o IIIb O R <O> OOH<O> O O O OOO R2 O NHAc R2 O O IIIa R <O> OO O<OH> O O OOO O R2 O NHAc O R2 O IIIb in cui R ed R2sono come sopra definiti; e) la mono-solfatazione del composto ottenuto nel passaggio d) seguita da rimozione dei gruppi O-acilici presenti nei composti IIIa e IIIb ottenuti nel passaggio precedente.
- 4. Il processo secondo la rivendicazione 3 in cui la condroitina sale sodico del passaggio a) Ã ̈ ottenuta a partire dal polisaccaride capsulare K4 prodotto da un brodo di coltura del ceppo O5:K4:H4 di E. Coli, o a partire dal polisaccaride prodotto da un brodo di coltura del ceppo DSM23644 di E. Coli.
- 5. Condroitin solfato delle rivendicazioni 1-2 per uso nella prevenzione e nel trattamento dell’osteoartrite e/o per il mantenimento del benessere del sistema muscolo-scheletrico.
- 6. Composizioni comprendenti il condroitin solfato delle rivendicazioni 1-2 e uno o più eccipienti farmaceuticamente o nutraceuticamente accettabili.
Priority Applications (28)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| IT000136A ITMI20120136A1 (it) | 2012-02-02 | 2012-02-02 | Condroitin solfato biotecnologico a basso peso molecolare solfatato in posizione 4 o 6 sulla stessa catena polisaccaridica dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e procedimento per la sua preparazione |
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