KR101883910B1 - 동일한 다당류 사슬 상의 4 또는 6번 위치에서 생물공학적으로 설페이트화된 콘드로이틴 설페이트, 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 결국 E. coli 균주 O5:K4:H4로부터 직접 제조되는 캡슐 다당류 K4의 산 가수분해에 의해 수득되거나, 또는 유전적으로 변형된 E.coli 균주로부터 직접적으로 생성되는, 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 골격으로부터 출발하는 화학적 설페이트화에 의한, 10 내지 30 kDa의 평균 분자량 (Mw)을 갖는 콘드로이틴 설페이트의 생산방법을 개시한다. 4번 또는 6번 위치의 N-아세틸-D-갈락토사민 잔기의 설페이트화는, 지금까지 기술된 합성 방법에 의해 수득된 것과는 상이하게, 동일한 다당류 사슬 내에 동시에 발생하여, 천연 콘드로이틴 설페이트에서 관찰된 설페이트화 패턴처럼 보인다.

Description

동일한 다당류 사슬 상의 4 또는 6번 위치에서 생물공학적으로 설페이트화된 콘드로이틴 설페이트, 및 그의 제조방법{Biotechnological sulphated chondroitin sulphate at position 4 or 6 on the same polysaccharide chain, and process for the preparation thereof}

본 발명은 설페이트화되지 않은(unsulphated) 콘드로이틴 골격으로부터 출발하는 화학적 설페이트화에 의한 콘드로이틴 설페이트의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 동일한 다당류 사슬 내의, N-아세틸-D-갈락토사민 잔기의 4번 위치 또는 6번 위치의 동시적인 설페이트화를 가능하게 한다. 그에 따라 수득된 콘드로이틴 설페이트는 지금까지 기술된 합성 방법에 의해 수득된 것과는 상이한, 천연 콘드로이틴 설페이트에서 관찰된 것과 동일한 설페이트화 패턴을 나타낸다.

또한, 본 발명은 SEC에 의해 결정된 4 내지 9 kDa의 평균 분자량 (Mw), 및 90% 4-설페이트 및 10% 6-설페이트 내지 10% 4-설페이트 및 90% 6-설페이트인 모노-설페이트기 분포를 갖는 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다.

콘드로이틴 설페이트 (CS)는, 상이한 위치에서 설페이트화되고 베타 1-3 결합에 의해 결합된 글루쿠론산 (GlcA) 잔기 및 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc) 잔기에 의해 형성된 이당류 서열로 구성되는, 글루코사미노글리칸 (GAG) 클래스에 속하는 복합 천연 다당류이다.

CS는 구조적 기능 및 생리적 기능을 위해 동물 조직에 존재한다. 그의 기원에 따라, CS는 주로 GalNAc의 4번 위치 또는 6번 위치에서 모노설페이트화된 두 종류의 이당류 단위 (각각 이당류 A 및 C의) 다양한 비율로 구성된다. 그러나, 설페이트기가 상이한 개수로 및 상이한 위치에 존재하는 이당류는 다당류 사슬에서 다양한 퍼센트로 존재할 수 있다. 또한, CS 골격은 설페이트화되지 않은 이당류를, 통상적으로 소량으로 포함한다. GlcA의 2번 위치 및 GalNAc의 6번 위치 (이당류 D), GlcA의 2번 위치 및 GalNAc의 4번 위치, 또는 GalNAc의 4번 및 6번 위치 (이당류 E)와 같이, 다양한 위치에서 산소 원자를 통해 결합된 두 개의 설페이트기를 갖는 디설페이트화된 이당류는, 특정 동물 공급원(animal source)에 따라, 다양한 퍼센트로 CS 골격 내에 존재할 수 있다 (Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006).

CS에서 발견되는 반복 이당류 단위는 R₂, R₄ 및 R₆가 독립적으로 H 또는 SO₃ ^-인, 하기 화학식을 갖는다:

반복 이당류 단위의 카복실레이트기 및 설페이트기의 음전하는 소듐 이온에 의해 중화된다.

다양하게 설페이트화된 이당류를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 약자의 의미가 하기에 기재된다:

디-0S (R2=H; R4=H; R6=H)

디-6S (C) (R2=H; R4=H; R6= SO3-)

디-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; R6=H)

디-4,6디S (E) (R2=H; R4= SO3-; R6= SO3-)

디-2,6디S (D) (R2= SO3-; R4=H; R6= SO3-)

디-2,4디S (B) (R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)

디-2,4,6트리S (R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)

또한, 상이한 동물 공급원으로부터 유래된 CS 시료는 상이한 분자량 및 전하 밀도를 특징으로 하고, 전하 밀도는 특정 설페이트기와 직접 상관된다.

표 1은 여러 동물 종의 연골 및 기타 조직으로부터 추출된 천연 CS에서 발견되는 주요 이당류를 나타낸다:

	소의 CS	돼지의 CS	닭의 CS	상어의 CS	홍어(skate)의 CS	오징어의 CS
Mn (kDa)	12-17	9-14	8-13	25-40	27-34	60-80
Mw (kDa)	20-26	14-20	16-21	50-70	50-70	80-120
다분산 지수	1.8-2.2	1.4-1.8	1.6-2.0	1.0-2.0	1.2-2.5	0.8-1.3
디-0S	6	6	8	3	3	13
디-6S	33	14	20	44	39	15
디-4S	61	80	72	32	43	50
디-2,6디S	ND	ND	ND	18	13	0
디-4,6디S	ND	ND	ND	2	1	22
디-2,4디S	ND	ND	ND	1	1	0
전하 밀도	0.90-0.96	0.92-0.96	0.90-0.94	1.15-1.25	1.08-1.20	1.00-1.20
4S/6S 비율	1.50-2.00	4.50-7.00	3.00-4.00	0.45-0.90	1.00-1.40	2.50-4.00

표 1 - Mn = 수평균 분자량; Mw = 평균 분자량; 다분산 지수 = Mw/Mn; 전하 밀도는 이당류 단위당 설페이트 기의 개수이다; ND = 확인되지 않음

표 1에 나타난 바와 같이, 육지 동물로부터 유래된 CS는 유사한 분자 질량 파라미터 (Mn 및 Mw)를 갖는 반면, 이는 보다 큰 분자 질량 값을 갖는, 어류 종으로부터 유래된 CS와는 상이하다. 또한, 육상(terrestrial) CS 시료는 1.0 미만의 전하 밀도 (CD) 값을 특징으로 하는 반면, 해양 CS 시료는 항상 1.0을 초과하는 CD 값을 갖는다. 이 특징은 설페이트화된 이당류의 상이한 분포에서 기인한다. 통상적으로, 디설페이트화된 이당류는 육상 CS에서 미량으로 발견되고, 천연 CS에서는 폴리설페이트화된 이당류 (트리- 및 테트라-설페이트)가 관찰되지 않는다.

트리- 및 테트라-설페이트화된 이당류의 부재는, 모노설페이트화된 이당류 (디-4S 및 디-6S) 및 설페이트화되지 않은 이당류 (디-0S)에 특이적인 용균 효소인, 디설페이트화된 이당류를 소화할 수 있으나 폴리설페이트화된 이당류에 상응하는 다당류를 가수분해할 수 없는 콘드로이티나제 ABC에 의한 다당류의 소화 후 분석에 의해 용이하게 증명될 수 있다. 콘드로이티나제 ABC에 의해 소화된 천연 CS의 형광단-보조 탄수화물 전기영동 (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis: FACE) 분석은, 선행기술로부터 유래된 합성 또는 반합성 CS에서 발견되는, 부분적으로 소화되지 않은 올리고당의 특징인 전기영동 밴드를 검출하지 않는다.

또한, 생합성 방법으로 인하여, 모든 천연 CS가 항상 동일한 다당류 사슬 상의 GalNAc의 4 또는 6번 위치에서 모노설페이트화된 이당류의 동시 존재를 나타낸다는 것이 잘 알려져 있다 (D’ Arcy SM et al., Carbohydr Res . 1994 Mar 4;255:41-59. Hardingham TE et al., Carbohydr Res . 1994 Mar 4;255:241-54. Cheng F, et al., Glycobiology. 1992 Dec; 2(6):553-61. Chai W et al., Anal Biochem. 1996 May 15;237(1):88-102. Zaia J et al., Anal Chem. 2001 Dec 15;73(24):6030-9. Desaire H et al., Anal Chem. 2001 Aug 1;73(15):3513-20).

CS에 대하여 그의 분자 구조와 관련된 상이한 활성이 보고되었다 (Kimata K et al., Mol Cell Biochem 1, 211, 1963. Volpi N. Biomaterials 23, 3015, 2002. Volpi N, Tarugi P. Biochimie 81, 955, 1999. Volpi N. Biomaterials 20, 1359, 1999. Suzuki S et al., J Biol Chem 243, 7, 1968).

CS는 항-염증 활성을 갖고, 현재 임상적 증거 및 다수의 임상 실험의 상응하는 메타-분석을 기초로, 유럽에서 골관절염 (OA)의 치료에 있어서 골관절염을 위한 지효성 증상 개선제 (symptomatic slow-acting drug for osteoArthritis: SYSADOA)로, 특히 무릎(Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003), 엉덩이(Jordan KM et al. Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003) 및 손(Zhang W et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007)의 골관절염 치료를 위해 권장되고 있다. 또한 CS는 유럽과 미국에서, 단독으로 또는 기타 성분과의 조합으로, 기능 식품(nutraceutical)으로 광범위하게 이용된다 (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).

상업적인 CS는 소와 돼지의 조직 (Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998), 조류의 조직 (Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002) 및 어류의 연골 (Sugahara K et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281, 2003)과 같은, 동물 조직으로부터 추출에 의해 수득된다.

상업적인 CS의 동물 기원은 광우병 (BSE)과 같은 질환을 유발하는 전염성 감염 물질과 연관된 안정성 문제를 포함하고, 증가하는 전세계적 수요를 충족시키기 위해 이용할 수 있는 가능한 공급원을 제한한다. 이들 인자는 CS를 생산하는 대안적인 방법으로의 연구를 촉진하였다.

CS의 구조와 부분적으로 유사한 구조를 갖는 전구체 다당류의 공급원으로 미생물을 이용하고 화학적 설페이트화를 수행하여 천연 CS와 유사한 CS를 생산하는, CS를 생산하는 생물공학적 방법을 찾기 위하여 집중적인 노력이 기울여졌다.

이 전략의 일례는 EP 1304338 B1에 기술된 바와 같은, E. coli O5:K4:H4의 캡슐(capsular) 다당류 K4로부터 CS의 생물공학적 생산이다. 이 특허는 액체 배지 중 생산된 다당류 K4를 추출하고 정제한 후, 재용해시키고, 산 가수분해를 수행하여, 중합체의 GlcA 잔기에 결합된 프럭토스 잔기를 제거하는 것인 방법을 개시한다. 그 후, CS의 설페이트화되지 않은 골격 (CH)과 동일한 탈프럭토실화 중합체는, 두 가지 상이한 화학 합성법에 따라 GalNAc 잔기의 4번 위치 또는 6번 위치에서 설페이트화된다. 또한, 이 특허는 4번 및 6번 위치에서 디설페이트화된 CS를 수득하는 제3의 방법을 개시한다. 본 명세서에 기술된 CS는, GalNAc 잔기의 4번 및 6번 위치에 모노- 및/또는 디-설페이트화되고, GlcA 잔기의 2' 위치가 설페이트화되지 않고, 6 내지 25 kDa의 분자량 (Mw) 및 0.7 내지 2.0의 전하 밀도 (CD)를 갖는 설페이트화된 다당류의 70% 이상의 함량을 갖는다.

EP 1304338 B1에서, 저자는 이용되는 합성 전략에 따라:

a) 존재하는 모든 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 잔기의 6번 위치를 선택적으로 보호함으로써 CS 4S를 합성하고, 그에 의해 모든 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 잔기의 4번 위치에만 선택적으로 설페이트화된 중합체를 수득하고,

b) 유사하게, 모든 GalNAc 잔기의 6번 위치에 있는 히드록시기가 설페이트화되어, 4번 위치에 존재하는 히드록실 잔기를 적절하게 보호하는 것인, 중합체를 수득하는 가능성을 개시하고 청구한다.

그러므로, EP 1304338 B1에 기술된 방법에 있어서, 천연 CS에 의한 상황과는 달리, 동일 사슬 내의 4 또는 6번 위치에서 동시적인 설페이트화는 일어나지 않는다.

최근 문헌 (Bedini E et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2011 May 18)은, 생산된 다당류 K4를 동일 사슬 내 GalNAc 잔기의 4번 위치 및/또는 6번 위치에서 설페이트화하는 방법을 기술한다. 그러나, Bedini 등에 의해 기술된 생물공학적 CS는 천연 CS의 분자량과 유사한 분자량, 즉 약 17 kDa을 가져서, 천연 추출물의 전형적인 낮은 생체이용률을 초래한다. Bedini 등은 그들이 수득한 생성물의 약리학적 특성을 보고하지 않는다.

본 발명은 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 골격 (CH)이 천연 미생물 다당류 i.l. (K4)의 산 가수분해에 의해 수득되거나, 특허출원 MI2010A001300 및 MI2010A001264에 기술된, E. coli 균주 DSM23644와 같은, 유전적으로 변형된 E.coli로부터 직접 생산되는, CH로부터 출발하는 화학적 설페이트화(chemical sulphation)를 따르는 CS의 생산방법을 기술한다. 본 명세서에 기술된 박테리아 균주는 K4의 프럭토실레이션을 위한 KfoE 유전자의 불활성화를 유발하는 돌연변이를 갖는다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 CS는 유럽 약전에 기술된 분석 방법을 기초로 95%를 초과하는 역가를 갖는 천연 CS의 특징을 나타낸다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 CS는, SEC에 의해 측정된, 10 내지 30 kDa, 바람직하게는 20 내지 30 kDa의 평균 분자량 (Mw)을 갖고, 90%의 4-설페이트 및 10%의 6-설페이트 내지 10%의 4-설페이트 및 90%의 6-설페이트인 모노-설페이트화기의 분포를 나타낸다(표 2).

본 발명에 기술된 CS 의 특징
Mw (kDa)	10 내지 30
콘드로이티나제 ABC에 의한 소화율(digestibility)	> 95%
디-0S	< 10%
디-6S	10 내지 90%
디-4S	90 내지 10%
디-2,6디S	< 5%
디-4,6디S	< 5%
디-2,4디S	< 5%
디-트리S	ND
디-테트라S	ND
역가 (w/w)	> 95% (o.d.b.)*
전하 밀도	0.8 내지 1.0
4S/6S 비율	0.1 내지 9.0

* - o.d.b.: 건조량 기준 (on dry basis)

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 CS는 소량 (<10%)의 설페이트화되지 않은 이당류 및 매우 낮은 퍼센트 (<5%)의 디설페이트화된 이당류를 포함한다; 트리설페이트화된 이당류는 확인될 수 없다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 CS는 0.8 내지 1.0의 전하 밀도 값을 특징으로 한다.

본 발명의 구현의 일부 형태에 있어서, 수득된 CS는 4번 위치에서 설페이트화된 이당류 (디-4S)와 6번 위치에서 설페이트화된 이당류 (디-6S) 간의 비율이 1 미만인 것으로 나타나는 반면, 다른 형태에 있어서 수득된 CS는 (4S) 이당류와 (6S) 이당류 간의 비율이 1을 초과하는 것으로 나타난다.

본 발명에 따른 방법은 위치-특이적 설페이트화를 조절(modulate)하여 상기 기재된 범위 내의 특정 4S/6S 비율을 갖는 CS를 생성할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은, E. coli 균주 O5:K4:H4에 의해 생성되는 캡슐 다당류 K4의 산 가수분해에 의해 수득되거나, 또는 유전적으로 변형된 E. coli로부터 직접적으로 생성되는 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 골격으로부터의 화학적 설페이트화에 의한 낮은 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 (CS) (LMW-CS BIOTEC, 4,000 내지 9,000 달톤)의 생산에 관한 것이다. 본 발명의 목적인 낮은 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트는 4,000 내지 9,000 달톤의 분자량 구간을 특징으로 하고, 이 분자량은 천연 기원의 콘드로이틴 설페이트, 육상의, 특히 소, 돼지 또는 조류 기원인 콘드로이틴 설페이트 (14,000 내지 26,000 달톤), 또는 해양 생물 기원의, 예를 들면 상어, 오징어, 가오리, 또는 경골 어류(bony fish)로부터 수득되는 콘드로이틴 설페이트 (통상적으로 >40.000 달톤)의 분자량보다 훨씬 작다. 이와 같은 특징을 고려할 때, 본 발명에 따른 콘드로이틴 설페이트는 사람에서 구강 투여 후 보다 높은 흡수 및 그로 인해 고순도의 천연 콘드로이틴 설페이트 또는 생물공학/화학 공정에 의해 생산된 콘드로이틴 설페이트보다 우수한 생체이용률을 나타낸다. 본 발명에 따른 콘드로이틴 설페이트는 고순도의 천연 콘드로이틴 설페이트의 항-염증 및 항-관절염 활성에 비교될 만한 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 콘드로이틴 설페이트는 염증 및 골관절염/관절염 과정의 치료 용도에 있어서 적합하다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC은, SEC (Mw)에 의해 측정된 평균 분자량 4 내지 9 kDa, 및 90% 4-설페이트 및 10% 6-설페이트 내지 10% 4-설페이트 및 90% 6-설페이트인 모노-설페이트기 분포를 갖는다. 본 발명에 따른 저분자량 CS의 특징은 상기 표 2에 기재된 보다 높은 분자량을 갖는 유도체의 특성과 실질적으로 동일하다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC은 디설페이트화된 이당류의 소량 (<10%) 설페이트화되지 않은 이당류 및 매우 낮은 비율의 (<5%) 디설페이트화된 이당류를 갖는 반면, 트리설페이트화된 이당류는 확인할 수 없다.

LMW-CS BIOTEC은 0.8 내지 1.0의 전하 밀도 값을 특징으로 하여, 육상 기원의 천연 CS의 전하 밀도 값과 비교될만하다 (표 1 참조).

또한, 본 발명에 따른 방법은, 천연 기원의 CS에 존재하는 범위와 유사한, 앞서 특정된 한계 범위 내의 특정 4S/6S 비율을 갖는 CS를 공급하기 위하여, 위치-특이적 설페이트화를 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC은, 특정 유기체에서 천연 CS에 대한 이화작용을 담당하는 용균 효소인, 콘드로이티나제 ABC에 의해 인식되고 소화되므로, 생물공학적 LMW-CS의 다당류 사슬이, 천연 효소의 특이적, 높고 민감성 인식에 해를 끼치기 쉬운 구조적 변형을 겪지 않았다는 것을 입증한다.

최종적으로, 4번 위치가 아닌 6번 위치에 설페이트화된 잔기에서 다당류를 가수분해하는 엔도리아제(endolyase)인, 콘드로이티나제 C에 의해 소화된 LMW-CS BIOTEC은, 천연 CS에서 일어나는 바와 같이, 동일한 다당류 사슬 상에서 디-6S 단위와 교대로 나타나는 디-4S 단위의 존재가 일반적인 올리고당 서열을 생성한다(도 1, 2 및 3). 구체적으로, 도 1은 콘드로이티나제 C에 의해 처리된 소 기원의 천연 콘드로이틴 설페이트를 도시한다. 동일한 다당류 사슬 상에서 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 있는 설페이트기의 존재를 나타내는 상이한 길이의 올리고당이 확인될 수 있다. 크로마토그램은 강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 수득되었다. 이 구배는 0 내지 60분에 50 mM NaCl 내지 1.2 M NaCl에 의해 얻어졌다;

도 2는 콘드로이티나제 C에 의해 처리된 돼지 기원의 천연 콘드로이틴 설페이트를 도시한다. 동일한 다당류 사슬 상에서 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 있는 설페이트기의 존재를 나타내는 상이한 길이의 올리고당이 확인될 수 있다. 크로마토그램은 강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 수득되었다;

도 3은 콘드로이티나제 C에 의해 처리된, 본 발명의 LMW-CS BIOTEC을 도시한다. 또한, 동일한 다당류 사슬 상에서 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 있는 설페이트기의 존재를 나타내는 상이한 길이의 올리고당이 확인될 수 있다.

크로마토그램은 강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 수득되었다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC이 사람에서 구강 흡수율 및 생체이용률에 대하여, 유럽 약전의 제1 표준인, 소 기원의 고순도 천연 CS와의 비교에 의해 평가되었다. CS (및 낮은 분자량을 갖는 유도체)의 분해에 특이적인 용균 효소를 생합성할 수 있는 박테리아의 존재가, 동물 세균총(animal bacterial flora)이 아닌 사람에서 존재하는 것으로 기술되기(Ahn MY, et al., Can J Microbiol 1998; 44:423-9) 때문에 이는 특히 중요하다.

사람에서 LMW-CS BIOTEC의 구강 흡수율 및 생체이용률을 공지된 기법에 의해 평가하였다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC을 가능한 항-염증 활성에 대해 하기와 같은 특정 시험을 이용하여 평가하였다:

백혈구, 즉 인간 백혈구 엘라스타제에 의해, 염증 과정 동안 생성된 단백질 분해 효소를 억제하는 능력 (Kostoulas G. et al., Biol Chem 378, 1481, 1997; Volpi N. Chem Biol Interact 105, 157, 1997; Ying QL et al., Am J Physiol. 272, L533, 1997); 인간 호중구에서 항화학주성(antichemotactic), 식세포 활성, 리소자임 방출 및 자유 라디칼에 의한 생물막의 손상을 억제하는 능력 (Matzner Y. et al., Thromb Haemost 52, 134, 1984; Ronca F, Palmieri L et al., Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A, 14, 1998).

이들 시험을 본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC에 대하여, 기준 화합물인, 유럽 약전의 제1 표준인 소 유래의 고순도 천연 CS와의 비교에 의해 수행하였다.

또한, 본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC를 항관절염(antiarthritic) 특성에 대해 동물 모델인, 과학계에 의해 광범위하게 인지되고 다수의 과학 논문에 공개된, "애주번트 관절염 (AA) 모델(Adjuvant Arthritis (AA) model)"에서 평가하였다. 또한, 이 결과를 기준 분자: 유럽 약전의 표준인, 소 유래의 고순도 천연 CS에 의해 이전에 얻어진 결과 (Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007)와 비교하였다. 실제로, OA 및 류마티스 관절염 (AR)의 동물 모델은 이들 발병 과정의 연구에 있어서 유용한 도구이다. "애주번트 관절염" (AA)은 가장 보편적으로 이용되는 모델 중 하나이다. 쥐에서의 AA는 다수의 항관절염 제제 및 약제를 철저한 임상 실험 전후에 시험하기 위해 광범위하게 이용되었던, 다발성 관절염(polyarthritis)의 실험 모델이다 (Bendele A et al., Toxicol Pathol 27, 134, 1999; Rovensky J et al., Rheumatol Int. 31, 507, 2011; Bauerova K et al., Interdisc Toxicol 4, 101, 2011). 또한, AA 시험에 의해 얻어진 동물 데이터가 사람에서의 결과와 비교된 다수의 연구가 수행되었다 (Kannan K et al., Pathophysiology 12, 167, 2005).

중합체 사슬의 4번 또는 6번 위치에서의 동시적인 모노설페이트화, 순도 및 낮은 분자량은, 본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC에 보다 우수한 구강 흡수율 및 보다 뛰어난 생체이용률을 제공한다.

본 발명의 일 양태는, 본 발명에 따른 CS 및 약제학 또는 영양약학(nutraceutical) 분야에서 허용가능한 담체의 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 정제, 경질 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐 또는 음료를 위한 분말 혼합물과 같은 여러 고체 형태, 또는 액체 형태 (용액), 바람직하게는 비경구 또는 경구 투여를 위한 약제학적 또는 영양약학적 제제의 형태로 제제화될 수 있다. 이 조성물은 기타 활성 성분 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.

또한, 이 조성물은, 바람직하게는, 하기 물질 중 하나 이상을 포함한다: 글루코사민 하이드로클로리드, 글루코사민 설페이트, N-아세틸 글루코사민, 히알루론산, 헤파린, 케라틴, 더마틴(dermatin), 메틸 설포닐 메탄, 엽산 및 환원된 엽산, 비타민 B군, S-아데노실메티오닌 (SAMe), 아스코르브산 또는 아스코르브산 망간. 이 조성물은 필요에 기초한 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다.

예를 들면, 그의 용도를 한정함이 없이, 본 발명에 기술된 CS 또는 조성물은 1일 100 내지 3000 mg, 바람직하게는 1일 1000 내지 2000 mg, 및 보다 바람직하게는 1일 1250 내지 1750 mg의 양으로, 1일 약 600 mg의 2회 분량 또는 400 mg의 3회 분량으로 나누어서 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은, 골관절염의 치료 또는 예방을 위한 또는 근골격의 건강(well-being) 유지를 위한 약제 또는 영양 보충제 성분으로서의, 기술된 CS, 또는 그의 조성물의 용도에 관한 것이다.

예를 들면, 기술된 CS 또는 그의 조성물은, 엉덩이, 손 또는 무릎의 골관절염 및 그의 주요 증상 (통증, 관절 종창(joint swelling), 염증), 알츠하이머병, 미생물 감염, 동맥경화증 및 골다공증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 제제, 식품 첨가물 또는 영양 보충제를 제조하기 위하여, 및 항종양 치료 및 신경 조직을 포함한 조직 재생에서 보조제(adjuvant)로서 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 유리한 특징은, GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에서의 설페이트화가 동일한 다당류 사슬 내에서 동시에 일어나, 현재까지 기술된 합성 방법에 의해 수득된 것과는 상이한, 천연 CS에서 관찰되는 설페이트화 패턴을 보이게 제조된다는(simulate) 것이다. 이 양태는 두 개의 상이한 효소 시스템, 즉 6번 위치 및 4번 위치에서 설페이트화된 단위(unit) 및 설페이트화되지 않은 단위를 소화할 수 있는 콘드로이티나제 ABC, 및 6번 위치에서 설페이트화된 잔기 및 설페이트화되지 않은 잔기에 대하여 가수분해할 수 있지만, 4번 위치에서 설페이트화된 잔기에 대하여 유사한 용해 절단(lytic cleavage)을 수행할 수 없는 콘드로이티나제 C의 이용에 의해 얻어진 데이터에 의해 확인된다. 콘드로이티나제 ABC에 의해서 및 콘드로이티나제 C 단독에 의해서 얻어진, 소화 산물은 Joon-Soo Sim 등에 의해 기술된 바와 같은 HPLC 크로마토그래피 기법에 의해(J. Chromatography B, 2005 vol. 818, 133-139), 정성적으로 및 정량적으로 분석되어, 이당류 디-0S, 디-4S 및 디-6S 및 효소에 의해 소화되지 않는 올리고당의 존재를 나타낸다.

콘드로이티나제 ABC에 의한 소화 산물의 분석은 설페이트화되지 않은 이당류 디-0S, 모노설페이트화된 이당류 디-4S 및 디-6S, 및 미량의 디설페이트화된 이당류 디-4,6S의 형성에 의해 산물의 거의 완전한 소화를 입증한다.

그러나, 콘드로이티나제 C에 의한 소화 산물에 대해 수행된 동일한 분석은 이당류 서열의 존재, 및 무엇보다도 올리고당 서열의 존재를 명백하게 나타내어, 동일한 사슬 상에 4번에서 설페이트화된 GalNAc의 존재로 인해 다당류를 완전하게 분해시킬 수 없는 효소의 능력을 나타낸다. 이는, 설페이트화 잔기가 4번에 존재할 경우, 이 효소는 작용할 수 없고, 결과적으로 올리고당 잔기를 남기기 때문이다. 또한, 상기 잔기는, 예를 들면, 천연 CS (소 및 돼지) 및 본 발명에 따라 수득된 생물공학적 CS에 의한 소화에 관련된 도 1, 2 및 3의 크로마토그래피 추적(chromatographic tracing)에서 나타낸 바와 같이, 겔 크로마토그래피 및 모세관 전기영동 (CE)과 같은, 크로마토그래피 및 전기영동 기법에 의해 명백하게 검출된다. 이들은 설페이트기가 동일한 다당류 사슬 상에서 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 존재하는, 상이한 길이의 여러 올리고당을 포함한다.

이 모든 특성은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 CS에 하기 특징을 갖는 천연 CS의 구조를 제공한다:

a) 모든 또는 거의 모든 GalNAc 잔기는 6번 또는 4번 위치에서 모노설페이트화된다;

b) 이용되는 합성 조건에 따라, 잔기 4S와 6S의 비율 (4S/6S)은 육상 기원 및 어류 기원의 CS에서 발견되는 비율과 완전히 유사하다.

일반적으로, 본 발명에 따른 CS는 E. coli 균주 O5:K4:H4 (EP 1304338 B1)에 의해 자연적으로 생산된 캡슐 다당류 K4 또는 설페이트화되지 않은 콘드로이틴 (CH)의 구조를 갖는 다른 다당류를 출발 기질로 이용하여 수득될 수 있다.

첫 번째 경우, E. coli 균주 O5:K4:H4의 배양액으로부터 수득된 다당류 K4는 발효의 완료시 열산 가수분해(thermoacid hydrolysis)에 의해 탈프럭토실화되고(defructosylated), 콘드로이틴은 Rodriguez 및 Jann에 의해 기술된 방법의 개조(adaptation)에 따라 정제된다 (Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988).

대안적으로, 출발 다당류는, 예를 들면, K4의 프럭토실화를 담당하는 KfoE 유전자에서 유도된 돌연변이로 인해, 설페이트화되지 않은 천연 CH와 동일한 다당류를 생산하는, MI2010A001300에 기술된 E. coli 균주 DSM23644의 배양물로부터 수득된다. 이 경우에 탈프럭토실화는 필요하지 않다; 그러나, 열산 가수분해 단계는, 처리 결과 침전되는 박테리아의 내독소를 포함한, 일부 불순물을 제거하기 위해 유지된다. 그 후 이 콘드로이틴 (CH)은 원심분리, 투석 및 분무 건조에 의해 정제된다.

가수분해는 연속 원심분리에 의해 바이오매스로부터 분리된, 배양물 상층액에서 수행된다. K4의 부분적인 가수분해 및 탈프럭토실화는 90 내지 95℃에서 30 내지 50분 동안 pH 2.8 내지 3.0에서 인큐베이션에 의해 수행된다.

인큐베이션 기간 후, 결과로 얻은 현탁액은 40℃ 미만의 온도, 바람직하게는 20 내지 30℃에서 냉각되어, 가수분해 반응을 중단시키고(quench), pH는 동시에 4 내지 4.5로 조정된다. 결과로 얻은 현탁액은, 순서대로, 연속 원심분리에 의한 정화(clarification), 한외여과 및 최종적으로, 30 kDa 막을 통한 물에 의한 투석을 거친다.

투석된 농축물(dialysed retentate) (최초 배양액 부피의 약 1/10)을 여과시키고 최종적으로 분무 건조기에 의해 건조시켜, CH 구조를 갖는 다당류를 얻고, 이를 설페이트화 과정에 적용시킨다. 수득된 CH는 모세관 전기영동 (CE) 또는 HPLC에 의해 결정될 경우, 건조량 기준 (w/w)으로 80 내지 90%의 역가를 갖는다.

이와 같이 수득된 CH는 소듐 염의 형태를 취하고, 설페이트화되기 위하여 유리산 또는 그의 염으로 전환될 필요가 있다.

동일한 다당류 사슬의 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치를 무작위로 모노설페이트화할 수 있게 하는, 본 발명에 따른 설페이트화 방법은, 동시에 GalNAc 4번 및 6번 위치를 포함하는 오르토에스테르의 형성 및, 놀랍게도, 주로 4번 또는 6번에서 하이드록실을 방출하도록 조절될 수 있는, 에스테르의 후속 재배열을 포함하여, 이들 하이드록실의 선택적 설페이트화를 가능하게 한다.

본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 콘드로이틴 소듐 염을 유리산으로 전환시키거나 또는, 대안적으로, 테트라메틸-, 테트라에틸- 또는 테트라부틸-암모늄과 같은 4차 암모늄 이온에 의한 그의 염으로 전환시키거나, 또는 피리딘에 의해 그의 염으로 전환시키는 단계. 바람직하게는 테트라부틸암모늄 (TBA) 염이 이용된다.

대안적으로, 산 형태의 콘드로이틴 (CH)은 메탄올 및 아세틸 클로라이드에서의 반응 후 그의 메틸 에스테르로 전환된다.

b) 산 촉매반응의 존재하에서, 콘드로이틴 염, 또는 콘드로이틴 메틸 에스테르를, R은 수소, 메틸, 에틸 또는 페닐로부터 선택되고, R₁은 메틸 또는 에틸로부터 선택되는, 식 RC(OR₁)₃의 오르토에스테르와 반응시켜, GalNAc 잔기의 4번 및 6번 알코올 작용기에 의한 출발 오르토에스테르의 두 알콕실의 이동에 의해 형성되는 사이클릭 오르토에스테르를 수득하는 단계. 이 단계에서 수득된 화합물에서, 존재하는 모든 또는 거의 모든 이당류 단위는 R, R₁은 앞서 정의된 바와 같은 것인 하기 식 I로 표시되는 사이클릭 오르토에스테르 구조를 갖는다:

이용될 수 있는 오르토에스테르의 예는 트리메틸 오르토아세테이트, 트리에틸 오르토아세테이트, 트리메틸 오르토포르메이트, 트리에틸 오르토포르메이트, 트리메틸 오르토프로피오네이트, 트리에틸 오르토프로피오네이트 또는 트리메틸 오르토벤조에이트이다. 바람직하게는, 트리메틸 오르토아세테이트 또는 트리에틸 오르토아세테이트가 이용된다. 트리메틸 오르토아세테이트의 이용이 특히 바람직하다.

캄포설폰산, 파라톨루엔설폰산, 메탄설폰산으로부터 선택되는 산 또는 설폰 레진, 바람직하게는 캄포설폰산 또는 설포닉 레진, 보다 바람직하게는 캄포설폰산이 산 촉매로 이용된다.

c) 피리딘, 또는 트리에틸아민 또는 트리이소프로필아민과 같은 3차 유기 염기, 및 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재하에서, R₂가 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필로부터 선택되는 식 (R₂CO)₂O의 카복시산의 무수물과의 아실화에 의해, GlcA 잔기의 2' 및 3' 위치에 있는 알코올기를 보호하여, 콘드로이틴 내에서 발견되는 반복 이당류 단위가, R, R₁ 및 R₂가 앞서 정의된 바와 같은 하기 식 II로 표시되는, 2' 및 3'에서 아실화된 사이클릭 오르토에스테르 구조를 갖는 생성물을 얻는 단계:

바람직하게는 아세트산 무수물이 이용된다.

d) 수용성 유기산(organic water-soluble acid)과 물의 혼합물에서, 또는 물에서 수행되는 반응인, 사이클릭 오르토에스테르로부터 에르테르로 재배열시키는 단계. 다당류 서열의 여러 GalNAc 단위 상에서 무작위로 발생하는 이와 같은 재배열은, 남아 있는 위치 (각각 6 또는 4)에서 이용되는 가용성 유기산에 의한 에스테르의 동시적 형성과 함께, 하나 또는 다른 히드록시기 (각각 4 또는 6에서)의 방출을 촉진하도록 조절될 수 있다. 그 결과는, 동일한 다당류 사슬 내에서, 두 상이한 이당류 단위, 즉:

- 위치 6번에 있는 히드록시기, 2' 및 3'가 아실화되고, 4번에 있는 히드록시기는 유리 상태인 구조를 갖는, R 및 R₂가 앞서 정의된 바와 같은 것인 식 IIIa로 표시되는 단위;

; 또는

- 위치 4번에 있는 히드록시기, 2' 및 3'가 아실화되고, 6번에 있는 히드록시기는 유리 상태인 구조를 갖는, R 및 R₂가 앞서 정의된 바와 같은 것인 식 IIIb로 표시되는 단위;

의 형성이다.

20 내지 40℃의 온도, 바람직하게는 실온에서, 1 내지 48시간 동안, 바람직하게는 3 내지 38시간 동안, 및 보다 바람직하게는 38시간 동안 반응을 수행함으로써, 놀랍게도 6번에 유리 하이드록실을 갖는 화합물의 보다 많은 양이 관찰되는 반면, 반응이 40 내지 70℃의 온도, 바람직하게는 60℃에서, 1 내지 48시간 동안, 바람직하게는 3 내지 38시간 동안, 및 보다 바람직하게는 18시간 동안 수행될 경우, 4번 위치에 유리 하이드록실을 갖는 생성물이 우세하다. 수용성 유기산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 타르타르산, 시트르산으로부터 선택되거나 또는 예를 들면, Sepra SCX 50 ㎛ 65A와 같은 양이온 레진, 바람직하게는 아세트산 또는 프로피온산, 및 보다 바람직하게는 아세트산이다.

d) 그 후 EP 1304338 B1에 이미 기술된 방법에 따른, DMF 중의 피리딘 설퍼 트리옥사이드에 의한, 또는 DMF-설퍼 트리옥사이드 복합체에 의한 설페이트화에 의해 CS를 수득하고, 이는 본 명세서에서 이용된 재배열 조건 및 결과적으로 존재하는 구조 IIIa 및 IIIb의 퍼센트에 따라, 이당류 IIIa의 4번 위치 또는 이당류 IIIb의 6번 위치에 동시적으로 및 다양하게 설페이트화될 것이다. 설페이트화 반응 후, EP 1304338 B1에 기술된 과정에 따라, 염기성 처리(basic treatment)에 의해, GlcA 잔기의 2' 및 3' 위치 및 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 존재하는 아실기의 제거에 의해, 4번 및 6번이 부분적으로 설페이트화된 CS 소듐 염을 얻는다.

이 과정 중 이용된 일부 기법은 다당류 사슬의 탈중합화를 초래함으로써, 낮은 분자량 (LMW)을 특징으로 하는, GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에서 설페이트화된 CS를 생성한다.

또한, 콘드로이틴은 산을 반응 용매 또는 공-용매로 이용하여, 오르토에스테르 재배열 단계에서 탈중합화될 수 있다. 이 단계에서 산의 고농도는, 다당류 사슬의 단절(rupture)을 초래하고, 결과적으로 4 내지 9 kD 범위의 낮은 분자량 사슬을 생성한다.

기술된 방법에 의해 수득된, 4,000 내지 9,000 달톤의 LMW-CS BIOTEC은, 쥐의 관절염 실험 동물 모델 (애주번트 관절염 AA)에서 효능이 평가되었고, 이 결과는 900 mg/kg에 의한 일일 경구 처리 후, 동일한 실험 모델에서 이용된 추출물 기원의 약제학적 등급의 천연 CS에 대한 결과(Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 2011, Epub ahead of print)와 비교되었다.

AA는 불완전한 프로인트 보조제 중 미코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)의 단일 피내 주사에 의해 유도되었다. 이 실험은 건강한 동물, 처리되지 않은 관절염 동물 및 처리된 관절염 동물을 포함하였다. 처리된 동물 중, 1군의 동물은, 관절염이 유도되기 전 14일 동안, AA의 유도 후 28일 동안 계속된, 1일 900 mg/kg의 LMW-CS BIOTEC의 투여로 구성된 전처리의 대상이 되었다. 또 다른 군의 동물은 AA의 유도 후 28일 동안만 1일 900 mg/kg의 LMW-CS BIOTEC으로 처리했다.

뒷발에 발생한 부종은 전처리된 동물에서 유의하게 감소되었다. 본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC에 의한 전-처리 (900 mg/kg/일)는 미처리 대조군에 비하여 실험 내내 부종을 유의하게 감소시켰다. 또한, LMW-CS BIOTEC에 의한 전-처리는 미처리 관절염 대조군에 비하여 약 8 내지 15%까지 체중을 회복시킨다.

관절염의 중증도를 증가된 수준의 종창 및 관절주위의 홍반에 기초하여 정량하였다. 전-처리 및 처리로 투여된, 900 mg/kg/일의 LMW-CS BIOTEC은 관절염 점수(score)를 감소시키는데 유의하게 효과적이다. 또한, 전-처리는 아급성기 (AA 유도 후 14일차 내지 28일차) 전반에 걸쳐 효과적인 반면, 처리는, 급성기(AA 유도 후 첫 14일)가 아닌, 중장기 AA 유도 후 21 내지 28일에만 효과적이다.

관절염/골관절염 과정에서 발생하는 만성 염증 과정의 결과인, 산화 스트레스는, 동물 모델에서 급성기 및 아급성기에 유의하게 증가한다. 증가된 산화 스트레스는 혈장에서 내인성 항산화제의 높은 소비를 유도하고, 결과적으로, 전체 항산화 상태로 측정된, 혈장 항산화제 능력(plasma antioxidant capacity)의 감소를 유발한다. LMW-CS BIOTEC에 의한 전-처리는 동물 모델에서, 전체 항산화 상태를 교정하는데 효과적이어서, 유의하게 내인성 항산화제의 소비를 감소시킨다. 산화 스트레스에 따라 증가하고, 따라서 산화 스트레스에 대한 우수한 마커로 간주되는, 관절 조직 호모게네이트(homogenate)에서 측정된, γ-글루타밀 트랜스퍼라제의 활성은, 미처리 동물과 비교하여, 실험적으로 유도된 다발성 관절염을 갖는 동물에서 상당히 더 크고, LMW-CS BIOTEC에 의해 처리된 동물에서 상당히 더 낮은 것으로 입증되었다.

염증 유발 사이토카인인 인터루킨-1β (IL-1β) 및 인터루킨-6 (IL-6)은, 실험적으로 유도된 관절염 동물 모델에서 유의하게 증가하여, 급성기에 IL-6은, 건강한 대조군에 비해 10배 높은 수준을 나타내는 극적인 증가를 나타냈다. LMW-CS BIOTEC의 치료 효과는 급성기인, 14일차부터 이미 명백하여, AA를 앓는 동물에 비하여 IL-6 농도를 약 30 내지 40% 감소시켰다.

염증 단백질에 대한 기본 마커(basic marker), 즉 C-반응성 단백질 (CRP)은 IL-6와 매우 유사한 시간 프로파일을 갖는다. 급성기에서의 증가는 건강한 대조군보다 실험 관절염 모델에서 약 7.5배 더 컸다. CRP에 대한 LMW-CS BIOTEC의 효과는, IL-6 수준에 대한 그의 효과와 같이, 급성기에, 혈장 CRP 농도에서 유의한 감소를 갖는 것으로 관찰된다.

호중구의 식세포 작용 및 세포 내 산화 증가에 관하여, 건강한 대조군과 실험적으로 유도된 AA를 앓는 대조군 간에 관찰된 차이는 증가된 식세포 활성의 경우에 유의하였다. 전-처리 기반의 LMW-CS BIOTEC 투여는 식세포작용 및 산화물 배출에 있어서 유의한 감소를 유도하였다.

본 발명에 따른 LMW-CS BIOTEC은, 만성 염증 과정의 결과 생성된 관절염 과정의 중증도 및 산화 스트레스를 유의하게 감소시킨다. LMW-CS BIOTEC에 의한 전-처리는 아급성기 전반에 걸쳐 효과적인 반면, AA 발병 1일차부터의 처리는 만성기 동안에만 효과적이다. 이 효과는 전체 항산화 상태 및 γ-글루타밀 트랜스퍼라제의 활성에서의 향상에 의해 확인된다. 전-처리로 투여된 LMW-CS BIOTEC도, 염증 유발 사이토카인, 혈장 내의 C-반응성 단백질의 생성, 호중구의 식세포 활성 및 세포 내 산화물 배출을 감소시킨다. 최종적으로, LMW-CS BIOTEC는 급성기 및 아만성기(subchronic stage)에서 실험적인 관절염/골관절염의 발달을 둔화시키고, 질환의 마커를 감소시키는데 효과적인 것으로 입증되어, 기준 화합물의 효과와 동등한, 그의 이로운 활성을 뒷받침한다.

도 1은 콘드로이티나제 C에 의해 처리된, 소 유래의 천연 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다. 동일한 다당류 사슬 상의 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 설페이트기의 존재를 입증하는, 상이한 길이의 다양한 올리고당이 형성된다.
강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 크로마토그램을 얻었다. 구배는 50 mM NaCl 내지 1.2 M NaCl에 의해 0 내지 60분 동안 얻었다.
도 2는 콘드로이티나제 C에 의해 처리된, 돼지 유래의 천연 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다. 동일한 다당류 사슬 상의 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 설페이트기의 존재를 입증하는, 상이한 길이의 다양한 올리고당이 형성된다.
강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 크로마토그램을 얻었다.
도 3은 콘드로이티나제 C에 의해 처리된, 본 발명에 따른 생물공학적 콘드로이틴 설페이트에 관한 것이다. 이 다당류에서도 역시, 동일한 다당류 사슬 상의 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 설페이트기의 존재를 입증하는, 상이한 길이의 다양한 올리고당이 형성된다.
강 음이온-교환 컬럼 (SAX-HPLC) 상에서의 구배 분리 및 232 nm에서의 UV 검출에 의해 크로마토그램을 얻었다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 설명될 것이다.

실시예 1: 콘드로이틴의 테트라-알킬 암모늄 또는 피리디늄 염의 제조

다당류 K4 또는 E. Coli 균주 DSM23644의 발효로부터 수득된 다당류에서 출발하여, 상기 기술된 방법에 의해 가수분해, 정제 및 건조 후 수득된 CH 소듐 염을 수성 매질에 용해시킨다. 완전한 용해 후, 이 용액을 Amberjet 1200 H, Rohm and Haas, 또는 그 등가물과 같은, 양이온-교환 수지에 의해 패킹된 컬럼 내로 도입한다.

pH 1.5-4.0에서, 또는 바람직하게는 pH 1.5-2.0에서 용리된 분획을 수집하고, pH 6.0-8.0, 또는 바람직하게는 6.5-7.0이 얻어질 때까지, 테트라메틸-, 테트라에틸- 및 테트라부틸-암모늄 또는 피리디늄으로부터 선택된 이온의 수용액을 첨가한다. 그 후 용액을 동결-건조 또는 분무 건조에 의해 완전히 건조될 때까지 증발시켜 상응하는 염을 얻는다.

실시예 2: 상응하는 사이클릭 메틸 오르토에스테르 CH (CH-cMOE)의 형성에 의한 GalNAc 부분의 히드록실화된 관능기 (4번 및 6번)의 보호

플라스크 내에서 테트라부틸 암모늄 (TBA) 염과 같은 콘드로이틴으로부터 수득된 염을 디메틸포름아미드 (DMF)와 각각 5.2 g 및 130 ml의 양으로 혼합한다. 8.49 g의 트리메틸 오르토아세테이트를 플라스크 내로 점적한 후, 300 mg의 캄포설폰산을 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 72시간 동안 유지한다. 그 후 반응물을 진공하에서 증발시켜 건조시키고, 추가로 40℃에서 20시간 동안 스토브-건조시켜(stove-dried) 6.1 g의 콘드로이틴-MOE TBA를 고체 형태로 얻는다.

반응 산물에 대한 분석을 수행하여 보호가 일어났다는 것을 확인하였다. 출발 물질의 소멸 및 더 큰 분자량 (48 KDa)을 갖는 신규 생생물의 출현을 SEC-HPLC에 의해 규명하였다. 유리 CH를 가수분해할 수 있지만 보호된 CH를 가수분해할 수 없는 효소인, 콘드로이티나제 ABC에 의한 소화에 의해 수행된 분석은, 출발 CH 분자의 미보호된(unprotected) 퍼센트가 15% 미만인 것을 입증하였다.

실시예 3: 콘드로이틴 사이클릭 오르토에스테르의 2',3' 아세틸화 (2',3'디아세틸 CH-cMOE)

사이클릭 메틸 오르토에스테르로 보호된, 선행 단계로부터 유래된 콘드로이틴 (CH-cMOE)(4.79 g)을, 23.95 ml의 아세토니트릴, 15.69 ml의 트리에틸아민 (TEA), 6.21 ml의 아세트산 무수물 및 78.96 mg의 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)을 포함한 반응 플라스크 내로 도입한다. 25 내지 26℃에서 2시간의 교반 후, 94 ml의 디-이소프로필 에테르를 첨가하여 점성 고체를 얻은 후, 여과지를 통해 여과하고 45℃에서 24시간 동안 진공하에 스토브-건조시킨다. 그에 의해 수득된 중간체 사이클릭 오르토에스테르는 분홍색 고체의 외관을 갖는다.

실시예 4: 사이클릭 메틸 오르토에스테르로부터 4번 위치에서 우세한 아세테이트의 형성, 및 6번 위치에서 유리 히드록시기를 갖는, 에스테르로의 재배열 (도 IIIB 참조)

선행 단계로부터 얻어진 중간체 (2.42 g)를 반응 플라스크 내로 도입하고, 여기에 18.8 ml의 96% 아세트산 및 2.35 ml의 탈염수를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 38시간 동안 교반한 후, 0.6 M NaCl 용액 100 ml을 첨가하고 혼합물을 5 kDa 막을 통해 한외여과하고 투석하여, pH 3.32의 농축물을 회수한다.

용액을 진공하에 45 내지 50℃에서 증발시킨다; 밤새도록 추가적인 스토브-건조 후, 유리질 고체의 외관을 갖는 생성물 1.38 g을 수득한다.

실시예 5: 사이클릭 메틸 오르토에스테르로부터 6번 위치에서 우세한 아세테이트의 형성, 및 4번 위치에서 유리 히드록시기를 갖는, 에스테르로의 재배열 (도 IIIA 참조)

선행 단계로부터 얻어진 중간체 사이클릭 오르토에스테르 2.42 g을 14.52 ml의 96% 아세트산 및 탈염수 9.8 ml을 포함한 반응 플라스크 내로 도입하고 60℃에서 17.5시간 동안 가열한 후, 0.6 M NaCl 100 ml을 첨가하고 용액 (pH 2.27)을 한외여과하고 투석하여 pH 3.56의 농축물을 회수한다.

용액을 진공하에 45 내지 50℃에서 증발시키고, 밤새도록 추가적인 스토브-건조 후, 유리질 고체의 외관을 갖는 생성물 1.12 g을 수득한다.

실시예 6: 설퍼 트리옥사이드 피리디늄 복합체에 의한 콘드로이틴 설페이트의 제조

실시예 4에 기술된 바와 같이 얻어진 중간체 (0.76 g)를 46.0 ml의 DMF를 포함한 플라스크 내로 도입하고, 30℃에서 10분 동안 혼합물을 교반한다. 0.72 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄을 첨가하고 출발 물질이 용해되었을 때 (약 10분), 용액을 교반하에 30℃에서 1시간 동안 방치한다. 그 후, 추가로 0.72 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄을 첨가한 후, 추가로 0.72 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄을 첨가한다. 이 용액을 30℃에서 1시간 동안 더 교반한다.

실온에서 10% NaHCO₃ 수용액 50 ml (pH 7.81)에 혼합물을 부음으로써 반응을 중단시킨다. 여과 후 용액을 진공하에 (10 mBar) 증발시켜 건조시키고, 잔여물을 150 ml의 0.6 M NaCl에 의해 재용해시키고, 최종적으로, 이 용액을 한외여과한다.

6 부피 교체(changes of volume) 후 농축물은 pH 9.22를 갖는다; 1N HCl에 의해 pH를 6.7로 조정하고 한외여과를 계속하여, 0.6N NaCl 용액을 탈염수로 교체한다.

결과로 얻은 용액을 다시 2 부피 동안 한외여과한 후, 20 ml 부피로 투석한다. 투석된 용액을 진공하에서 농축시켜 건조시킨다 (10 mBar, 45℃).

이렇게 얻어진 생성물 (0.88 g)을 34.0 ml의 0.2N 소다 (NaOH)로 용해시키고 교반하에 2시간 동안 40℃로 가열한다. 최종적으로, 용액을 0.6M 소듐 클로라이드 수용액으로 희석하고, 5 kDa 막을 통해 한외여과하고, 탈염수에 의해 투석한다. 농축물을 진공하에 농축하여 건조시키고 (45℃, 10 mBar), 0.67 g의 콘드로이틴 설페이트를 얻는다. HPLC-SEC에 의해 결정된, 분자량 29 kDa을 갖는 최종 생성물은:

- 95%를 초과하는 콘드로이티나제 ABC에 의한 소화율;

- 18/82의 4S/6S 비율;

- 약 0.9의 총 전하 밀도 값;

- 본 발명의 특징인, 동일한 다당류 사슬 상에 4-설페이트화 및 6-설페이트화 단위의 존재로 인한 올리고당의 존재에 의해 입증된, 콘드로이티나제 C에 의한 단지 부분적인 소화율을 나타낸다.

실시예 7: 설퍼 트리옥사이드 피리디늄 복합체에 의한 콘드로이틴 설페이트의 제조

실시예 5에서 기술된 바와 같이 얻어진 중간체 (1.12 g)를 67.2 ml의 DMF를 포함한 플라스크 내로 도입하고, 50℃에서 10분 동안 혼합물을 교반한다. 1.05 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄을 첨가하고 출발 물질이 용해되었을 때 (약 10분), 용액을 교반하에 50℃에서 1시간 동안 방치한다. 그 후, 추가로 1.05 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄을 첨가한다. 이 용액을 50℃에서 1시간 동안 더 교반한다.

실온 (RT)에서 10% NaHCO₃ 수용액 60 ml (pH 7.81)에 혼합물을 부음으로써 반응을 중단시킨다. 여과 후 용액을 진공하에 (10 mBar) 증발시켜 건조시키고, 잔여물을 30 ml의 0.6 M NaCl로 재용해시킨다. 최종적으로, 이 용액을 한외여과한다.

6 부피 교체 후 농축물은 pH 9.22를 갖는다; 1N HCl에 의해 pH를 중성으로 (7.5) 조정하고 미세여과(microfiltration)를 계속하여, 0.6N NaCl 용액을 탈염수로 교체한다.

결과로 얻은 용액을 다시 2 부피로 한외여과한 후, 20 ml 부피로 투석한다. 투석된 용액을 진공하에서 농축시켜 건조시키고 (10 mBar, 45℃), 1.53 g의 생성물을 얻는다.

이 잔여물을 59.6 ml의 0.2N 소다 (NaOH)에 용해하고 2시간 동안 60℃에서 가열한다. 최종적으로, 용액을 0.6M 소듐 클로라이드 수용액으로 희석하고, 3 kDa 막을 통해 한외여과하고, 탈염수에 의해 투석한다. 농축물을 진공하에 (45℃, 10 mBar) 농축시켜 건조시키고, 0.76 g의 콘드로이틴 설페이트를 얻는다.

이렇게 얻어진 생성물은 HPLC-SEC에 의해 결정된 분자량 15.4 kDa; 95%를 초과하는 콘드로이티나제 ABC에 의한 소화율; 82/18의 4S/6S 비율; 및 약 1.09의 총 전하 밀도 값을 갖는다. 본 발명의 특성인, 콘드로이티나제 C에 의한 감소된 소화율과 함께, 콘드로이티나제 ABC에 의해 얻어진 거의 완전한 소화 (생성물의 95%보다 높은 비율이 분해됨)는 동일한 다당류 사슬 상에서 4-설페이트화 및 6-설페이트화의 존재를 입증한다.

또한, 콘드로이티나제 ABC에 의한 95%를 초과하는 소화율은, 본 발명의 CS 다당류 사슬 중 폴리설페이트화된 (트리- 및 테트라-설페이트화된) 이당류의 부재를 입증한다.

실시예 8: 콘드로이틴 (CH) 메틸 에스테르의 제조

3 L 플라스크에서 2시간 동안 실온에서 교반하에 둔 1.3 L의 메탄올과 14.43 g의 아세틸 클로라이드 용액에 산 형태의 10.0 g의 CH를 첨가하고, 얻어진 현탁액을 20시간 동안 교반하에 방치한다.

시간이 경과한 후, 현탁액을 여과하고 고체를 100 ml의 메탄올로 세척하고 (2 x 50 ml) 진공하에 50℃에서 건조시켜 9.4 g의 건조 고체를 회수한다.

동일한 과정으로 이 반응을 다시 반복하고, 제2 기간 경과 후, 현탁액을 0 내지 5℃에서 60분 동안 냉각시키고, 여과시킨다. 얻어진 고체를 냉 메탄올 (0-5℃)로 세척하고 진공하에 50℃에서 3시간 동안 스토브-건조시켜 6.3 g의 고체를 회수한다.

실시예 9: 오르토에스테르 형성에 의한 CH 메틸 에스테르의 GalNAc 부분의 히드록실화된 관능기 (4번 및 6번)의 보호

150 ml의 디메틸포름아미드 (DMF) 및 선행 단계에서 수득된 6.0 g의 생성물을 칼슘 클로라이드 밸브 및 질소 흐름을 갖춘 500 ml 플라스크 내로 도입한다. 그 후 20.06 g의 트리메틸 오르토아세테이트와 0.71 g의 캄포설폰산을 첨가한다. 얻어진 용액을 50℃ (내부 온도)에서 18시간 동안 가열한다.

그 기간의 종료시, 반응물을 방치하여 실온에서 냉각시키고 진공하에 농축시켜 8.5 g의 생성물을 얻는다.

실시예 10: 실시예 9로부터 유래한 생성물의 2', 3' 히드록시기의 아세틸화

선행 단계에서 얻어진 8.0 g의 생성물, 40 ml의 DMF, 28.6 g의 트리에틸아민, 17.15 g의 아세트산 무수물 및 96 mg의 디메틸아미노피리딘을 실온에서 칼슘 클로라이드 밸브 및 질소 흐름을 갖춘 500 ml 플라스크 내로 도입한다.

얻어진 용액을 교반하에 3시간 동안 방치한다; 시간이 경과한 후, 150 ml의 이소프로필 에테르를 플라스크에 첨가하고 무정형 고체가 침전된다. 경사 분리(decanting)에 의해 물을 제거하고 100 ml의 이소프로필 에테르를 고체에 첨가하고 교반하에 1시간 동안 방치한다. 그 후 고체를 여과하고 50 ml의 이소프로필 에테르로 세척하고 진공하에 40℃에서 건조시켜 8.52 g의 생성물을 회수한다.

실시예 11: 실시예 10으로부터 유래한 오르토에스테르의 재배열

선행 단계에서 얻어진 7.0 g의 생성물, 72.8 g의 빙초산 및 8.7 ml의 물을 250 ml 플라스크 내로 도입하여 용액을 수득하고 실온에서 교반하에 3시간 동안 방치한다. 그 후 용액을 0.6 M 소듐 클로라이드로 150 ml로 희석하고 결과로 얻은 용액을 5 KD 막을 통한 한외여과에 의해 정제한다. 투석 후, 얻어진 용액을 진공하에 농축시키고 6.7 g의 고체 생성물을 회수한다.

실시예 12: 트리아세틸 메틸 에스테르의 설페이트화

선행 단계에서 얻은 670 mg의 생성물을 질소 흐름 및 40 ml의 DMF를 포함한 칼슘 클로라이드 밸브를 갖춘 250 ml 플라스크 내로 도입한다.

630.44 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄 복합체를 얻어진 용액에 첨가하고 결과로 얻은 용액을 50℃ (내부 온도)에서 1시간 동안 가열한다. 그 후 630.44 g의 설퍼 트리옥사이드 피리디늄 복합체를 동일한 온도에서 플라스크에 첨가하고 다시 교반하에 1시간 동안 방치한다.

시간이 경과한 후, 용액을 실온까지 냉각시키고 40 ml의 3% NaHCO₃를 동일한 온도에서 플라스크에 첨가하여, 용액을 생성하고 진공하에 농축시켜, 무기 염과 혼합된 2.3 g의 고체를 얻는다. 얻어진 생성물을 150 ml의 0.6 M 소듐 클로라이드로 희석시키고 5 KDa 막을 통해 한외여과한다.

투석 후, 얻어진 용액을 진공하에서 농축시키고 1.32 g의 고체 생성물을 회수한다.

실시예 13: 콘드로이틴 설페이트를 수득하기 위하여

선행 단계에서 수득된 생성물을 33 ml의 0.2 M 소다를 포함한 100 ml 플라스크 내로 도입한다. 용액을 40℃ (내부 온도)에서 2시간 동안 가열한 후, 실온까지 냉각시키고 1M HCl에 의해 중화시킨다.

용액을 150 ml의 0.6 M 소듐 클로라이드로 희석하고 5 KDa 막을 통해 한외여과한다. 용액의 투석 및 진공 하에서 농축 후, 350 mg의 고체를 얻는다.

이 실시예에서 수득된 생성물은 분자량 11 KDa, 47/53의 4S/6S 비율, 및 전하 밀도 값 0.9를 갖는다.

실시예 14: 다당류 사슬의 동시적인 탈중합화를 동반한, GalNAc 부분의 4번 및 6번의 히드록실 관능기 상에서의 사이클릭 오르토에스테르의 형성

디메틸포름아미드 (101 ml) 중, 전술된 바와 같이 수득된 콘드로이틴 테트라부틸암모늄 염 (4.07 g; 6.535 mmols)의 현탁액을 교반하에 및 주위 온도(20 내지 25℃)에서 질소 흐름하에 유지하였다. 트리메틸 오르토아세테이트 (9.03 ml, 71.89 mmols) 및 캄포설폰산 (1.82 g; 7.84 mmols)을 첨가하였다. 이 현탁액을 70℃ (내부 온도)까지 가열하고, 불과 수 분 후에 완전한 용해를 관찰하였다. 반응을 18 내지 20시간 동안 동일한 온도에서 교반하에 유지하였다. 다음날, 진공 하의 증발에 의해 용매를 제거함으로써 반응물을 농축시켜, 밝은 노란색의 고무질(rubbery) 잔여물의 형태로 13.67 g의 생성물을 얻었다.

소화 후 탈보호된 콘드로이틴의 잔여량은 4.6%이다. 오르토에스테르의 존재는 FTIR에서 해당하는 신호에 의해 입증된다.

이렇게 얻어진 생성물을, GalNAc 잔기 상의 4번 또는 6번 위치가 설페이트화된 LMW-CS BIOTEC를 얻을 때까지, 전술된 바와 같은 후속 단계에서 이용하였다.

실시예 15: GalNAc 부분의 4번 또는 6번 위치에서 아세테이트의 우세한 형성을 동반한, 콘드로이틴의 사이클릭 오르토에스테르의 에스테르로의 개환(opening), 및 다당류 사슬의 동시적인 탈중합화

콘드로이틴 오르토에스테르 (3.00 g), 물 (3.14 ml) 및 아세트산 (26.25 g; 437 mmols)을 250 ml 삼목 플라스크 내로 도입하였다. 얻어진 현탁액을 36시간 동안 주위 온도 (20 내지 25℃)에서 가열하였다. 그 후 물을 첨가하여 총 부피 100 ml의 용액을 제조하였다. 이렇게 얻어진 용액을 한외여과하였다 (5 KD 막). 수집된 농축물을 작은 부피로 (20 ml) 투석한 후, 진공 하에 증발에 의해 건조될 때까지 농축시켜, 원하는 생성물 (트리아세틸 콘드로이틴)에 상응하는 1.55 g의 고체 잔여물을 얻었다.

이렇게 얻어진 생성물을, GalNAc 잔기 상의 4번 또는 6번 위치가 설페이트화된 LMW-CS BIOTEC를 얻을 때까지, 전술된 바와 같은 후속 단계에서 이용하였다.

실시예 16: 쥐에서 관절염 (애주번트 관절염, AA)의 유도, 및 LMW-CS BIOTEC에 의한 처리

150 내지 190 g의 Lewis 쥐 40마리를 각 10마리 동물로 구성된 4개 군으로 무작위로 분류하고, 22 ± 2℃의 온도로 유지되는 환경의 폴리프로필렌 우리(cage)에서 사육하고, 표준 실험실 식이로 급식하고 물에 대한 접근을 자유롭게 하였다.

실험군은 하기와 같았다:

1) 미처리 건강 대조군

2) 애주번트 유도 관절염 (AA)을 갖는 미처리 대조군

3) AA 유도 후 28일 동안 (실험 0 내지 28일) 체중 kg 당 900 mg/일의 LMW-CS BIOTEC 경구 투여로 처리된 관절염 쥐의 군

4) AA(articles of association)의 유도에 선행하는 14일 동안 및 AA 유도 후 28일 동안 (실험 -14 내지 +28일) 체중 kg 당 900 mg/일의 LMW-CS BIOTEC 경구 투여로 전처리된 군

쥐에서 0일차에 불완전한 프로이드 보조제 중 가열에 의해 불활성화된 미코박테리움 부티리쿰으로 이루어진 혼합물 1 ml의 1회 피내 주사에 의해 실험적으로 관절염을 유도하였다.

LMW-CS BIOTEC을 20 mg/ml의 농도로 증류수에 용해시키고 강제급식(gavage)에 의해 1일 1회 용량으로 경구 투여하였다.

28일 동안의 처리 종료에 쥐를 마취 하에 희생시키고 관련된 혈액과 조직을 수집하고 분석하여 이 연구에서 관찰된 파라미터를 평가하였다.

실시예 17: 쥐에서 발생한 부종, 체중 및 관절염 점수 기록에 의한 AA의 평가에 있어서 LMW-CS BIOTEC의 효과

관절염의 결과로 발생한 부종을 측정에 적합한 캘리퍼(caliper)에 의해 뒷발의 부피 증가를 관찰함으로써 측정하였다. 측정은 AA 유도 전 및 연구 28일차에 수행하였다.

쥐의 체중을 AA 유도 전 및 처리 종료 (28일)시에 측정하였다. 이 파라미터에 대한 처리 효과를 치료 기간 동안 상이한 군에서의 다양한 체중 증가를 비교함으로써 평가하였다.

관절염 점수를 발의 관절 종창(paw joint swelling) 및 관절주위 홍반의 범위의 결과로 간주함으로써 평가하였다. 각 동물에 대해, 관절염 점수 또는 관절조영상(arthrogram)을, 척추에 평행하게 측정된 미코박테리움의 적용 부위에서, 부종의 총합 (ml, 최대 8점), 및 앞발의 직경 (mm, 최대 5점), 및 딱지(scab)의 직경 (mm, 최대 5점)으로 측정하였다.

실시예 18: AA에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 마커로서 γ-글루타밀 트랜스퍼라제의 활성에 대한 LMW-CS BIOTEC의 효과

LMW-CS BIOTEC에 의한 처리 종료시 쥐로부터 채취한 관절 조직의 호모게네이트에서 γ-글루타밀 트랜스퍼라제의 활성을 측정함으로써 산화 스트레스를 평가하였다. γ-글루타밀 트랜스퍼라제가 산화 스트레스에 대한 마커로 고려된다.

뒷발로부터 채취한 조직의 호모게네이트에서 세포의 γ-글루타밀 트랜스퍼라제의 활성을 결정하고, Ondrejickova 등에 의해 변형된 (Cardioscience 1993; 4: 225-230) Orlowski 및 Meister 방법에 의해 평가하였다 (Orlowski M, Meister A. The gamma-glutamyl cycle: a possible transport system for amino acids. Proc Natl Acad Sci USA 1970; 67: 1248-1255). 시료를 1:9 (w/v) 용액으로 완충용액 (2.6 mM NaH₂PO₄, 50 mM Na₂HPO₄, 15 mM EDTA, 68 mM NaCl, pH 8.1)에서 UltraTurax TP 18/10 (Janke & Kunkel, Germany)에 의해 1분 동안 0℃에서 균질화하였다. 기질인, 8.7 mM의 γ-글루타밀 p-나트로아닐리드 (γ-glutamyl p-nitroanilide) 및 44 mM의 메티오닌을 각각 최종 농도 2.5 mM 및 12.6 mM로 65%의 이소프로필 알코올에 첨가하였다. 37℃에서 60분 동안 인큐베이션 후, 2.3 ml의 냉 메탄올을 첨가함으로써 반응을 중지시키고, 시험관을 20분 동안 5000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액의 흡광도를 0.5 cm 큐벳(cuvette)에서 406 nm에서 Specord 40 분광계 (Jena, Germany)에 의해 측정하였다. 기질 또는 수용체(acceptor)가 없는 반응 혼합물을 기준 시료로 이용하였다.

실시예 19: 혈장에서 염증 유발 사이토카인 (I-1, IL-6) 및 C-반응성 단백질 (CRP)의 수준 평가에 의한 AA에 의해 유도된 염증 상태에 대한 LMW-CS BIOTEC의 효과

실험의 종료시 쥐로부터 혈액 시료를 채취하고, 헤파린을 항응고제로 포함한 시험관에 보관했다; 혈장을 원심분리에 의해 혈액 세포로 이루어진 입자 부분(corpuscular part)으로부터 분리하고, 특정 상업용 키트를 이용한 ELISA 기법에 의해 염증 사이토카인 (IL-1, IL-6)을 분석하였다.

쥐의 혈장에서 ELISA 키트 (Immunology Consultant Laboratories, Inc., ICL)에 의해 C-반응성 단백질을 분석하였다. 비오틴-접합된 2차 항체의 항-쥐 C-반응성 단백질 항체와의 반응을 스트랩타비딘-홀스래디쉬 퍼옥사다제 (HRP)의 활성에 의해 평가하였다. 그 후 Labsystems Multiskan RC microplate 판독기를 이용하여 메틸-벤지딘과 면역 복합체와 결합된 HRP와의 반응을 450 nm에서 측정하였다. ELISA 키트의 설명에 따라 표준 교정 곡선을 이용하여 결과를 계산하였다.

실시예 20: AA에 의해 유도된 식세포 활성 및 호중구 산화물 배출에 대한 LMW-CS BIOTEC의 효과

호중구의 식세포 활성 및 산화물 배출(oxidative burst) 평가의 완료시 쥐의 혈액으로부터 호중구 집단을 추출하였다. 제어된 조건 하에서 플루오레신으로 표지된 옵손화된(opsonised) 스타필로코쿠스 아우레우스 (SPA-FITC) (Invitrogen Molecular Probes, USA)를 이용하여, 식세포 작용, 즉 박테리아의 섭취에 대한 측정을 수행하였다. 그 후 리튬-헤파린 중 말초 혈액의 분량을 하이드로에티딘(hydroethidine) (Invitrogen molecular probes, USA) (5 ml의 디메틸포름아미드 중 15.75 mg, Merck, Germany)과 함께 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 37℃에서 15분 동안 SPA-FITC에 의한 처리 후, 시험관을 얼음 중에 놓음으로써 반응을 중단시켰다. 냉 암모늄 클로라이드/포타슘 클로라이드로 이루어진 용해 용액 (200 ml 탈이온수, 1.658 g NH₄Cl, 0.2 g KHCO₃ 및 7.4 mg Na₂EDTA, pH 7.2-7.4)에 의해 적혈구의 후속 용해를 15분 동안 수행하였다. 식세포의 평균 퍼센트는 하나 이상의 SPA-FITC 입자를 섭취한 과립성백혈구(granulocyte)의 퍼센트를 나타내고, 호흡폭발(respiratory burst)의 평균 퍼센트는 에티듐(ethidium)으로 표지된 과립성백혈구의 퍼센트를 나타낸다.

Claims (19)

1. 하기 단계를 포함하는, 동일한 다당류 사슬 내의 모든 N-아세틸-D-갈락토사민 단위가 무작위적으로 또는 4- 또는 6- 위치에서 모노설페이트화 되어 있는 콘드로이틴 설페이트 소듐 염을 제조하는 방법:
   a. 콘드로이틴 소듐 염을 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄 또는 테트라부틸암모늄으로부터 선택되는 4차 암모늄 양이온에 의해 그의 염으로, 또는 피리디늄 염으로 전환시키는 단계;
   b. 단계 a)에서 수득된 화합물을, R이 수소, 메틸, 에틸 또는 페닐로부터 선택되고 R₁이 메틸 또는 에틸로부터 선택되는 것인 식 RC(OR₁)₃의 오르토에스테르(orthoester)와, 산 촉매반응의 존재하에서 반응시켜, 콘드로이틴 내에 존재하는 반복 이당류 단위가, R 및 R₁이 상기 정의된 바와 같은 하기 식 I을 갖는 것인 화합물을 얻는 단계
   

   

   ;
   c. 단계 b)에서 수득된 화합물의 글루쿠론산 단위의 2'- 및 3'- 위치에 있는 히드록시기를, R₂가 메틸, 에틸 또는 프로필로부터 선택되는 것인 식 (R₂CO)₂O의 무수물과, 피리딘, 또는 트리에틸아민 또는 트리이소프로필아민으로부터 선택되는 유기 3차 염기 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재하에서 반응시킴으로써 보호하여, 콘드로이틴 내에 존재하는 반복 이당류 단위가, R, R₁ 및 R₂가 상기 정의된 바와 같은 하기 식 II를 갖는 것인 화합물을 얻는 단계
   

   

   ;
   d. 단계 c)에서 수득된 생성물에 존재하는 오르토에스테르 작용기를, 수용성 유기산(organic water-soluble acid)에 의해 재배열시켜, 상기 다당류 내의 반복 GalNAc 단위가, R 및 R₂가 상기 정의된 바와 같은 식 IIIa 또는 IIIb를 갖는 이당류 단위로 이루어진 것인 에스테르 유도체를 얻는 단계
   

   

   ; 및
   e. 단계 d)에서 수득된 화합물의 모노-설페이트화 후, 상기 모노-설페이트화 단계에서 수득된 화합물 IIIa 및 IIIb에서 GlcA 잔기의 2' 및 3' 위치 및 GalNAc 잔기의 4번 또는 6번 위치에 존재하는 아실기를 제거하는 단계.
2. 청구항 1에 있어서, 단계 a)의 콘드로이틴 소듐 염은 E. coli 균주 O5:K4:H4의 배양액에 의해 생산된 캡슐 다당류(capsular polysaccharide) K4로부터, 또는 E. coli 균주 DSM23644의 배양액에 의해 생산된 다당류로부터 출발하여 수득되는 것인 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 단계 b)는 트리메틸 오르토아세테이트, 트리에틸 오르토아세테이트, 트리메틸 오르토포르메이트, 트리에틸 오르토포르메이트, 트리메틸 오르토프로피오네이트, 트리에틸 오르토프로피오네이트 또는 트리메틸 오르토벤조에이트로부터 선택되는 오르토에스테르에 의해 수행되는 것인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 단계 b)의 산 촉매반응은 캄포설폰산, 파라-톨루엔설폰산, 메탄설폰산으로부터 선택되는 산에 의해 또는 설폰 레진에 의해 수행되는 것인 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 단계 c)는 아세트산 무수물을 이용하여 수행되는(effected) 것인 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 단계 d)는 20 내지 40℃에서 수행되는 것인 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 단계 d)는 40 내지 70℃에서 수행되는 것인 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 단계 d)는 수용성 유기산과 물의 혼합물에서 또는 물에서 수행되는 것인 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 유기산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 타르타르산, 또는 시트르산으로부터 선택되는 것인 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 수득된 콘드로이틴 설페이트 소듐 염은 10 내지 30 kDa의 평균 분자량 (Mw)을 갖는 것인 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 콘드로이틴 설페이트 소듐 염은 모노설페이트기의 비율이 90/10 4S/6S 내지 10/90 4S/6S인 분포를 갖는 것인 방법.
12. 청구항 1에 있어서, 수득된 콘드로이틴 설페이트 소듐 염 내의 4-위치에서 설페이트화된 N-아세틸-D-갈락토사민 단위와 6-위치에서 설페이트화된 N-아세틸-D-갈락토사민 단위 간 비율은 1 미만인 것인 방법.
13. 청구항 1에 있어서, 수득된 콘드로이틴 설페이트 소듐 염 내의 4-위치에서 설페이트화된 N-아세틸-D-갈락토사민 단위와 6-위치에서 설페이트화된 N-아세틸-D-갈락토사민 단위 간 비율은 1을 초과하는 것인 방법.
    
    
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제

Images