EA023849B1 - Биотехнологический хондроитинсульфат, сульфатированный в положении 4 или 6 на его полисахаридной цепи, и способ его получения - Google Patents

Abstract

Изобретение раскрывает способ производства хондроитинсульфата со средней молекулярной массой (Mw) 10-30 кДа посредством химического сульфатирования исходя из основной цепи несульфатированного хондроитина, полученного, в свою очередь, посредством кислотного гидролиза капсульного полисахарида K4, полученного прямо из Е. coli штамма О5:K4:Н4 или непосредственно произведенного из генетически модифицированного штамма Е. coli. Сульфатирование N-ацетил-D-галактозаминового остатка в положении 4 или 6 имеет место одновременно в одной и той же полисахаридной цепи, имитируя характер сульфатирования, наблюдаемый в натуральном хондроитинсульфате, в отличие от сульфатирования, получаемого способами синтеза, описанными до настоящего времени.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения хондроитинсульфата посредством химического сульфатирования исходя из несульфатированной основной цепи хондроитина. Способ согласно настоящему изобретению дает возможность осуществлять одновременное сульфатирование одной и той же полисахаридной цепи в положении 4 или в положении 6 остатка Ν-ацетил-О-галактозамина. Хондроитинсульфат, получаемый таким образом, имеет такой же характер сульфатирования, как и тот, что наблюдается в натуральном хондроитинсульфате (в отличие от его препаратов, синтезируемых способами, описанными до настоящего времени).

Настоящее изобретение также относится к хондроитинсульфату, который имеет среднюю молекулярную массу, определенную посредством 8ЕС (δίζβ Ехс1и8юп СЬготаЮдгарЬу, эксклюзионная хроматография с фракционированием по размерам молекул, гель-фильтрация) (Μν), равную 4-9 кДа, и распределение моносульфатированных групп в диапазоне от 90% 4-сульфата и 10% 6-сульфата до 10% 4сульфата и 90% 6-сульфата.

Предпосылки создания изобретения

Хондроитинсульфат (С8) представляет собой сложный природный полисахарид, относящийся к классу гликозаминогликанов (САС), состоящий из дисахаридных последовательностей, образованных остатками глюкуроновой кислоты (С1сА) и Ν-ацетил-О-галактозамина (СаВДАс), сульфатированных в разных положениях и связанных бета-1-3-связями.

С8 присутствует в тканях животных со структурными и физиологическими функциями. В зависимости от его происхождения С8 преимущественно состоит из переменных процентных долей двух типов дисахаридной единицы, моносульфатированной в положении 4 или в положении 6 остатка СаВДАс (дисахариды А и С соответственно). Однако, в полисахаридных цепях могут присутствовать различные процентные доли дисахаридов, которые содержат разное число сульфатных групп, находящихся в разных положениях. Кроме того, основная цепь С8 содержит и несульфатированный дисахарид (как правило, в небольших количествах). Дисульфатированные дисахариды, имеющие две сульфатные группы, связанные через атом кислорода в разных положениях, таких как положение 2 в С1сА и положение 6 в Са1NАс (дисахарид Ό), положение 2 в С1сА и положение 4 в СаВДас или положения 4 и 6 в СаВДАс (дисахарид Е), могут присутствовать в основной цепи С8 в разных процентных долях в зависимости от конкретных животных-источников (Уо1р1 N. 1 РЬагт РЬагтасо1 61, 1271, 2009; Уо1р1 N. 1 РЬагт Зш 96, 3168, 2007; Уо1р1 Ν. Сигг РЬагт Вез 12, 639, 2006).

Повторяющаяся дисахаридная единица, найденная в С8, имеет следующую химическую формулу:

в которой К₂, К₄ и Кб независимо представляют собой Н или 8О₃-.

Отрицательные заряды карбоксилатных и сульфатных групп в повторяющейся дисахаридной единице нейтрализуются ионами натрия.

Расшифровка аббревиатур, наиболее часто используемых для обозначения различным образом сульфатированных дисахаридов, приведена ниже

Ди-05	(Е2=Н;	Е4=Н; Еб=Н)
ди-ез (с)	(Е2=Н;	Е4=Н; Еб=5ОЗ-)
Ди-45 (А)	[Е2=Н;	Е4=5ОЗ-; Еб—Н)
Ди-4,6ди5 (Ξ)	(Е2=Н;	Е4=5ОЗ-; Е6=5ОЗ-
Ди-2,бдиЗ (Д)	(К2=5ОЗ-,	? Е4=Н; Е6=ЗОЗ-)
Ди-2,4ди5 (В)	(К2=5ОЗ-,	; К4=5ОЗ-; Е6=Н)
Ди-2,4,бтриЗ	(Е2=$ОЗ-	; Е4=5ОЗ-; Е6=$ОЗ-)

Образцы С8, происходящие из разных животных-источников, также характеризуются разными молекулярными массами и плотностями зарядов, причем последний параметр прямо коррелирует с конкретными сульфатированными группами.

Табл. 1 показывает главные дисахариды, найденные в натуральном С8, экстрагированном из хряща и других тканей животных разных видов

- 1 023849

Таблица 1

плотность заряда представляет собой число сульфатных групп, приходящихся на дисахаридную единицу; N0 - не определено.

Как показано в табл. 1, С8, полученный из наземных животных, имеет сходные параметры молекулярной массы (Мп и Мто), которые, однако, отличаются от соответствующих параметров С8 рыб, который имеет более высокие значения молекулярной массы. Образцы С8 наземных животных, кроме того, характеризуются значениями плотности заряда (СЭ, сНагде 4еп81!у) менее 1,0, тогда как образцы С8 морских животных всегда имеют значения СЭ, превышающие 1,0. Причиной этого является разное распределение сульфатированных дисахаридов. Как правило, в С8 наземных животных находят следовые количества дисульфатированных дисахаридов; полисульфатированные дисахариды (три- и тетрасульфаты) в натуральном С8 не наблюдаются. Отсутствие три- и тетрасульфатированных дисахаридов можно легко обнаружить посредством анализа, проводимого после переваривания полисахарида хондроитиназой АВС - литическим ферментом, специфичным к моносульфатированным дисахаридам (Ди-48 и Ди-68) и к несульфатированным дисахаридам (Ди-08), который способен переваривать дисульфатированные дисахариды, но не может гидролизовать полисахаридную цепь с полисульфатированными дисахаридами. Анализ натурального С8, переваренного хондроитиназой АВС, выполняемый по методике РАСЕ (Р1иогорНоге-Азз1з£еб СагЬоНубга!е Е1ес£горНоге818, электрофорез углеводов с применением флуорофора), не детектирует электрофоретические фракции, характерные для частично непереваренных олигосахаридов, которые находят в синтетическом или полусинтетическом С8, полученном в прежних работах.

Кроме того, хорошо известно, что вследствие процессов биосинтеза все натуральные формы С8 всегда показывают одновременное присутствие моносульфатированных дисахаридов в положении 4 или 6 остатка ОаВДАс на одних и тех же полисахаридных цепях (Э'Агсу 8М е! а1., СагЬоНубг Ке8. 1994 Маг 4, 255: 41-59; НагбтдНат ТЕ е! а1., СагЬоНубг Ке8. 1994 Маг 4, 255: 241-54; СНепд Р, е! а1., О1усоЬю1оду 1992 Эес, 2(6): 553-61; СНа1 А е! а1., Апа1 ВюсНет. 1996 Мау 15, 237 (1): 88-102; 2а1а I е! а1., Апа1 СНет. 2001 Эес 15, 73 (24): 6030-9; Ое8а1ге Н е! а1., Апа1 СНет. 2001 Аид 1, 73 (15): 3513-20).

Сообщали о разных активностях С8 в зависимости от его молекулярной структуры (Кппа!а К е! а1., Мо1 Се11 ВюсНет 1, 211, 1963; Уо1р1 N. Вюта£епа18 23, 3015, 2002; Уо1р1 Ν, Тагид1 Р. ВюсЫт1е 81, 955, 1999; Уо1р1 Ν. Вюта!епа18 20, 1359, 1999; 8и/ик1 8 е! а1., I Вю1 СНет 243, 7, 1968).

С8 имеет противовоспалительную активность, и на основе клинических данных и соответствующего метаанализа многих клинических испытаний в настоящее время в Европе его рекомендуют применять при лечении остеоартрита (ОА) в качестве средства 8У8АЭОА (8утр!ота0с 81о\\-АсНпд Эгид Рог 08!еоАг!Нп!18 - симптоматического медленно действующего лекарственного средства для остеоартрита), в частности для лечения остеоартрита коленного сустава Цогбап К.М. е! а1., Апп КНеит ϋί8 62, 1145, 2003), тазобедренного сустава Догбап К.М. е! а1. Апп КНеит ϋί8 62, 1145, 2003) и суставов кисти (2Напд А е! а1., Апп КНеит ϋί8 66, 377, 2007). Кроме того, в Европе и в США С8 широко применяют в качестве биологически активной пищевой добавки (БАД, нутрицевтик) - индивидуально или в комбинации с другими ингредиентами (МсАНпбоп Т.Е. е! а1., 1АМА 283, 1469, 2000; Уо1р1 Ν. е! а1., Рооб Апа1 Ме!Н 1, 195, 2008; Уо1р1 Ν. е! а1., 8ерагаНоп 8с 1, 22, 2009).

Коммерческий С8 получают посредством экстракции из тканей животных, таких как ткани крупного рогатого скота и свиней (Риеп!е8 Е.Р. е! а1., Ас!а Рагт Вопаегеп8е 17, 135, 1998), ткани птиц (Био Х.М. е! а1., РоиН 8с1 81, 1086-1089, 2002) и хрящи рыб (8идаНага К. е! а1., Еиг I ВюсНет 239, 871, 1996. Б1дпо£ В. е! а1., I Вю£есНпо1 103, 281, 2003).

Животное происхождение коммерческого С8 создает проблемы безопасности, обусловленные переносимыми возбудителями инфекций, вызывающими такие заболевания, как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (В8Е, Ьоуте 8ропдРогт епсерНа1ора!Ну), и ограничивает возможные источники удовлетворения спроса, растущего во всем мире. Эти факторы оказались стимулирующими для исследо- 2 023849 ваний альтернативных способов производства С8.

Предпринимались интенсивные попытки поиска биотехнологического способа производства С8 с использованием микроорганизма в качестве источника предшественника полисахарида, имеющего структуру, частично подобную структуре С8, и с проведением химического сульфатирования для производства С8, сходного с натуральным.

Одним из примеров этой стратегии является производство биотехнологического С8 из капсульного полисахарида К4 бактерий Е. сой О5:К4:Н4, как описано в ЕР 1304338В1. Указанный патент раскрывает способ, согласно которому полисахарид К4, произведенный в жидких культурах, экстрагируют и очищают, а затем повторно растворяют и подвергают кислотному гидролизу для удаления остатков фруктозы, связанных с остатками О1сЛ в этом полимере. Полимер, лишенный фруктозы, идентичный несульфатированной основной цепи С8 (СН), затем сульфатируют в положении 4 или в положении 6 остатка Оа1ЫЛс двумя разными способами химического синтеза. Указанный патент также раскрывает третий способ, по которому получают С8, дисульфатированный в обоих положениях (4 и 6). С8, описанный в этом документе, содержит по меньшей мере 70% сульфатированных полисахаридов, состоящих из остатков ОаШЛс, моно- и/или дисульфатированных в положениях 4 и 6 (положение 2' остатка О1сЛ является несульфатированным), и имеет молекулярную массу (Мте), равную 6-25 кДа, и плотность заряда (СО), равную 0,7-2,0.

В ЕР 1304338В1 авторы раскрывают и заявляют в зависимости от применяемой стратегии синтеза следующие возможности:

a) возможность синтезирования С8 48 посредством избирательной защиты положения 6 во всех присутствующих остатках Ν-ацетилгалактозамина (ОаШЛс) и, таким образом, получения полимера, избирательно сульфатированного только в положении 4 всех остатков Ν-ацетилгалактозамина (ОаШЛс).

b) возможность получения полимера, в котором, аналогичным образом, гидроксильные группы в положении 6 всех остатков ОаШЛс являются сульфатированными, причем подходящим образом защищают гидроксильные остатки, присутствующие в положении 4.

В способе, описанном в ЕР 1304338В1, никогда не происходит сульфатирование одной и той же цепи одновременно в положениях 4 или 6 - в отличие от ситуации с натуральным С8.

Недавняя публикация (Вейпй Е с1 а1., Аидете Сйет Ιηί Ей Епд1. 2011 Мау 18) описывает способ, по которому произведенный полисахарид К4 является сульфатированным в положении 4 и/или в положении 6 остатка ОаВДЛс в одной и той же цепи. Однако, биотехнологический С8, описанный ВеЙ1П1 е1 а1., имеет молекулярную массу, сходную с молекулярной массой натурального С8 (т.е. приблизительно 17 кДа), что приводит к низкой биодоступности, типичной для натуральных экстрагированных продуктов. ВеЙ1П1 е1 а1. не сообщают ни о каких фармакологических характеристиках полученного ими продукта.

Список фигур

Фиг. 1 относится к натуральному хондроитинсульфату крупного рогатого скота, обработанному хондроитиназой С. Образованы разнообразные олигосахариды разной длины, демонстрирующие присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка ОаШЛс на одной и той же полисахаридной цепи.

Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (ЗЛХ-ПРЬС) и с УФ-детектированием при 232 нм. Градиент получали, повышая концентрацию ΝηΟ от 50 мМ до 1,2 М в интервале от 0 до 60 мин.

Фиг. 2 относится к натуральному свиному хондроитинсульфату, обработанному хондроитиназой С. Образованы разнообразные олигосахариды разной длины, демонстрирующие присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка ОаВДЛс на одной и той же полисахаридной цепи.

Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (ЗЛХ-ПРЬС) и с УФ-детектированием при 232 нм.

Фиг. 3 относится к биотехнологическому хондроитинсульфату согласно настоящему изобретению, обработанному хондроитиназой С. Для этого полисахарида также образованы разнообразные олигосахариды разной длины, демонстрирующие присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка ОаШЛс на одной и той же полисахаридной цепи.

Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (ЗЛХ-ПРЬС) и с УФ-детектированием при 232 нм.

Описание изобретения

Настоящее изобретение описывает способ получения С8 посредством химического сульфатирования исходя из несульфатированной основной цепи хондроитина (СН), причем этот СН получают кислотным гидролизом натурального микробного полисахарида (К4) или производят прямо из генетически модифицированных бактерий Е. сой, таких как Е. сой штамма Ό8Μ23644, описанных в заявках на патенты ΜΙ2010Α001300 и ΜΙ2010Α001264. Бактериальный штамм, описанный в них, несет мутацию, которая вызывает инактивацию гена КТоЕ, обеспечивающего фруктозилирование К4.

Согласно анализам, проведенным по методикам, описанным в Европейской фармакопее, С8, полученный способом согласно настоящему изобретению, демонстрирует характеристики натурального С8 с титром, превышающим 95%.

С8, полученный способом согласно настоящему изобретению, имеет среднюю молекулярную массу

- 3 023849 (Мте). измеренную посредством ЗЕС. равную 10-30 кДа (предпочтительно 20-30 кДа), и демонстрирует распределение моносульфатированных групп в диапазоне от 90% 4-сульфата и 10% 6-сульфата до 10% 4сульфата и 90% 6-сульфата (табл. 2).

Таблица 2

Характеристики СЗ. описанного в настоящем изобретении

Мм (кДа)	10-30
Перевариваемость хондроитиназой АВС	>95%
Ди-05	<10%
Ди-65	10-90%
Ди-45	90-10%
Ди-2,6ди5	<5%
Ди-4,6ди5	<5%
Ди-2,4ди5	<5%
Ди-три5	Νϋ
Ди-тетра5	Νϋ
Титр (по массе)	>95% (о.Н.Ь.)*
Плотность заряда	0,8-1,0
Отношение 45/65	0, 1-9, 0

- о.ТЬ. (оп 4гу Ьа81з) в расчете на сухое вещество

СЗ. полученный способом согласно настоящему изобретению. содержит небольшое количество (<10%) несульфатированного дисахарида и очень низкие процентные доли (<5%) дисульфатированных дисахаридов; трисульфатированные дисахариды не могут быть идентифицированы.

СЗ. полученный способом согласно настоящему изобретению. характеризуется значениями плотности заряда. равными 0.8-1.0.

В некоторых формах осуществления настоящего изобретения полученный СЗ показывает отношение между дисахаридом. сульфатированным в положении 4 (Ди-4З). и дисахаридом. сульфатированным в положении 6 (Ди-6З). составляющее менее 1. тогда как в других формах он показывает отношение между (4З)-дисахаридом и (6З)-дисахаридом. превышающее 1.

Способ согласно настоящему изобретению дает возможность модулировать сайт-специфичное сульфатирование для производства СЗ с конкретным отношением 4З/6З в вышеуказанном диапазоне.

Настоящее изобретение также относится к производству хондроитинсульфата (СЗ) с низкой молекулярной массой (Й-МУ-СЗ В1ОТЕС. 4000-9000 Да) посредством химического сульфатирования исходя из несульфатированной основной цепи хондроитина. который. в свою очередь. получают кислотным гидролизом капсульного полисахарида К4. продуцируемого Е. сой штамма О5:К4:Н4. или прямым производством из генетически модифицированных бактерий Е. сой. Хондроитинсульфат с низкой молекулярной массой. который является предметом настоящего изобретения. характеризуется диапазоном молекулярной массы 4000-9000 Да. что намного меньше. чем у хондроитинсульфатов натурального происхождения - как из наземных животных (например. крупного рогатого скота. свиней или птиц (1400026000 Да)). так и из морских (например. полученных из акул. кальмаров. скатов или костистых рыб (как правило. более 40000 Да)). С учетом этих характеристик. хондроитинсульфат согласно настоящему изобретению характеризуется более высокой абсорбцией после перорального введения и поэтому лучшей биодоступностью у людей. чем высоко очищенный натуральный хондроитинсульфат или хондроитинсульфат. производимый биотехнологическими/химическими способами.

Хондроитинсульфат согласно настоящему изобретению обладает противовоспалительной и противоартритной активностью. сравнимой с активностью высоко очищенного натурального хондроитинсульфата. Хондроитинсульфат согласно настоящему изобретению подходит для применения при лечении воспалительных и остеоартритных/артритных процессов.

ЙМУ-СЗ В1ОТЕС согласно настоящему изобретению имеет среднюю молекулярную массу. измеренную посредством ЗЕС (Мте). равную 4-9 кДа. и распределение моносульфатированных групп в диапазоне от 90% 4-сульфата и 10% 6-сульфата до 10% 4-сульфата и 90% 6-сульфата. Характеристики СЗ с низкой молекулярной массой согласно настоящему изобретению являются существенно такими же. как у производных с более высокой молекулярной массой. указанных выше в табл. 2.

ЙМУ-СЗ В1ОТЕС согласно настоящему изобретению имеет небольшое количество (<10%) несульфатированного дисахарида и очень низкие процентные доли (<5%) дисульфатированных дисахаридов. тогда как трисульфатированные дисахариды являются неидентифицируемыми.

ЙМУ-СЗ В1ОТЕС характеризуется значениями плотности заряда. равными 0.8-1.0. что сравнимо со значениями. характерными для натурального СЗ наземного происхождения (см. табл. 1).

Способ согласно настоящему изобретению также дает возможность для модулирования сайтспецифичного сульфатирования. обеспечивающего получение СЗ с конкретным отношением 4З/6З в вышеуказанных пределах. которые подобны значениям. характерным для СЗ натурального происхождения.

ЙМУ-СЗ В1ОТЕС согласно настоящему изобретению узнается и переваривается хондроитиназой АВС - литическим ферментом. задачей которого является катаболизирование натурального СЗ в кон- 4 023849 кретных организмах, тем самым демонстрируя, что полисахаридные цепи биотехнологического БМА-С8 не подвергались структурным модификациями, способным помешать специфическому высокочувствительному узнаванию природными ферментами.

И наконец, БМА-С8 В1ОТЕС, переваренный хондроитиназой С (эндолиазой, которая гидролизует полисахарид у остатков, сульфатированных в положении 6, но не в положении 4), производит олигосахаридные последовательности, типичные для присутствия Ди-48-единиц, чередующихся с Ди-6-единицами на одной и той же полисахаридной цепи, как это происходит и в натуральном С8 (фиг. 1, 2 и 3). В частности, фиг. 1 описывает натуральный хондроитинсульфат крупного рогатого скота, обработанный хондроитиназой С. Можно видеть олигосахариды различной длины, что указывает на присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка СаВДАс на одной и той же полисахаридной цепи. Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (8АХНРЬС) и с УФ-детектированием при 232 нм. Градиент получали, повышая концентрацию ЫаС1 от 50 мМ до 1,2 М в интервале от 0 до 60 мин;

фиг. 2 описывает натуральный свиной хондроитинсульфат, обработанный хондроитиназой С. Можно видеть олигосахариды различной длины, что указывает на присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка СаШАс на одной и той же полисахаридной цепи. Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (8АХ-НРЬС) и с УФдетектированием при 232 нм;

фиг. 3 описывает БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению, обработанный хондроитиназой С. И опять видны олигосахариды различной длины, что указывает на присутствие сульфатных групп в положении 4 или 6 остатка СаВДАс на одной и той же полисахаридной цепи.

Хроматограмму получали посредством градиентного разделения на колонке с сильным анионооменником (8АХ-НРЬС) и с УФ-детектированием при 232 нм.

БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению оценивали по пероральной абсорбции и биодоступности у людей в сравнении с высокоочищенным натуральным С8 крупного рогатого скота, первым стандартом Европейской фармакопеи. Это особенно важно, поскольку описано, что в бактериальной флоре человека (но не других животных) присутствует бактерия, способная биосинтезировать литический фермент, специфично расщепляющий С8 (и производные с низкой молекулярной массой) (Апп М.У., е! а1., Сап I МюгоЪю1 1998, 44: 423-9).

Пероральную абсорбцию и биодоступность БМА-С8 В1ОТЕС оценивали у людей посредством известных технических приемов.

БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению проверяли на возможную противовоспалительную активность, используя специфичные тесты, такие как:

способность ингибировать протеолитический фермент, продуцируемый лейкоцитами при воспалительных процессах конкретно, человеческую лейкоцитарную эластазу (Ко8!ои1а8 С. е! а1., Вю1 СНет 378, 1481, 1997; Уо1р1 N. СНет Бю1 Ιι Пегас! 105, 157, 1997; Ушу ЦЬ е! а1., Ат I РЬу8ю1. 272, Ь533, 1997);

способность ингибировать антихемотаксическую, фагоцитарную активность, высвобождение лизоцима и повреждение биологической мембраны свободными радикалами в человеческих нейтрофилах (Ма1/пег Υ. е! а1., ТНготЪ Наето81 52, 134, 1984; Копса Р., РаНтеп Ь. е! а1., О81еоаг1НпП8 СагШаде 6 8ирр1 А, 14, 1998).

Эти тесты проводили на препарате БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению в сравнении с референсным соединением (высокоочищенным натуральным С8 крупного рогатого скота, который является первым стандартом Европейской фармакопеи).

БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению также оценивали по антиартритным свойствам в модели с животными (модель адъювантного артрита (АА)), которая является широко признанной в научном сообществе и которая была опубликована во многих научных статьях. И опять, результаты сравнивали с результатами, полученными ранее с референсной молекулой стандартом Европейской фармакопеи, высокоочищенным натуральным С8 крупного рогатого скота (Уо1р1 N. 1 РНагт 8ш 96, 3168, 2007). Фактически, модели ОА и ревматоидного артрита (АК) у животных являются полезными инструментами для изучения этих патогенных процессов. Адъювантный артрит (АА) является одной из наиболее широко применяемых моделей. АА у крыс представляет собой экспериментальную модель полиартрита, которую широко применяют для испытания многих противоартритных средств и медикаментов до и после тщательных клинических испытаний (Вепбе1е А. е! а1., Тохюо1 Ра!Но1 27, 134, 1999; Коуеп8ку I. е! а1., КНеита1о1 1пЕ 31, 507, 2011; Ваиегоуа К. е! а1., 1п1егФ8с Тохюо1 4, 101, 2011). Были также проведены многочисленные исследования, в которых данные, полученные в тестах на животных с АА, сравнивали с результатами, полученными у людей (Каппап К. е! а1., Ра1НорНу8ю1оду 12, 167, 2005).

Одновременное моносульфатирование в положениях 4 и 6 полимерной цепи, чистота и низкая молекулярная масса придают препарату БМА-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению более высокую абсорбируемость и лучшую биодоступность.

Один аспект настоящего изобретения относится к композиции С8 согласно настоящему изобретению и носителя, приемлемого в фармацевтической или нутрицевтической области. Указанную композицию можно получать в различных твердых формах, таких как таблетки, жесткие капсулы, мягкие жела- 5 023849 тиновые капсулы или порошкообразные смеси для напитков, или в виде жидких форм (растворов), предпочтительно в форме фармацевтических или нутрицевтических препаратов для парентерального или перорального введения. Композиция может содержать другие активные или неактивные ингредиенты.

Кроме того, композиция может предпочтительно содержать по меньшей мере одно из следующих веществ: гидрохлорид глюкозамина, сульфат глюкозамина, Ν-ацетилглюкозамин, гиалуроновую кислоту, гепарин, кератин, дерматин, метилсульфонилметан, фолаты и восстановленные фолаты, витамины группы В, 8-аденозилметионин (8АМе), аскорбиновую кислоту или аскорбат марганца. Композицию можно вводить пациентам в эффективных количествах, соответствующих их потребностям.

В качестве примера, но без ограничения для их применения, можно указать, что С8 или композицию, описанную в настоящем изобретении, можно вводить в количестве от 100 до 3000 мг в день (предпочтительно от 1000 до 2000 мг в день и более предпочтительно от 1250 до 1750 мг в день), разделяя на две дозы приблизительно по 600 мг или на три дозы по 400 мг.

Настоящее изобретение также относится к применению описанного С8 или его композиции для лечения или предупреждения остеоартрита или для поддержания нормального состояния скелетномышечной системы в качестве ингредиента лекарственного средства или пищевой добавки.

Например, описанный С8 или его композицию можно применять для изготовления фармацевтического препарата, диетической или пищевой добавки для предупреждения и/или лечения остеоартрита тазобедренного сустава, суставов кисти или коленного сустава и их главных симптомов (болезненности, опухания суставов, воспаления), болезни Альцгеймера, микробных инфекций, артериосклероза и остеопороза, а также в качестве вспомогательного средства при противоопухолевом лечении и регенерации тканей, включая нервную ткань.

Выгодной характеристикой способа согласно настоящему изобретению является то, что сульфатирование в положении 4 или 6 остатка Са1ЫАс имеет место одновременно в одной и той же полисахаридной цепи, имитируя характер сульфатирования, наблюдаемый в натуральном С8, в отличие от картины сульфатирования, получаемой способами синтеза, описанными до настоящего времени. Этот аспект подтверждается данными, полученными с применением систем двух ферментов - хондроитиназы АВС, которая способна переваривать единицы, сульфатированные в положении 6 и в положении 4, и несульфатированные единицы, и хондроитиназы С, являющейся эндолиазой, способной гидролизовать в соответствии с остатками, сульфатированными в положении 6, и с несульфатированными остатками, но не способной осуществлять такое же литическое расщепление в соответствии с остатками, сульфатированными в положении 4. Продукты переваривания, полученные с одной хондроитиназой АВС и с одной хондроитиназой С, анализировали с использованием хроматографической техники НРЬС, как описано у 1οοη-8οο 8ίπι е! а1. (1. СНготаЮщарНу В., 2005 νοί. 818, 133-139), качественно и количественно показывающей присутствие дисахаридов Ди-08, Ди-48 и Ди-68 и любых олигосахаридов, не перевариваемых ферментами.

Анализ продуктов переваривания хондроитиназой АВС демонстрирует почти полное переваривание продукта с образованием несульфатированного дисахарида Ди-08, моносульфатированных дисахаридов Ди-48 и Ди-68 и следы дисульфатированного дисахарида Ди-4,68.

Однако, такой же анализ, проведенный на продуктах переваривания хондроитиназой С, ясно показывает присутствие дисахаридных последовательностей и, прежде всего, олигосахаридных последовательностей, указывая на неспособность фермента расщеплять полисахарид полностью вследствие присутствия на той же цепи остатков Са1ЫАс. сульфатированных в положении 4. Это происходит из-за того, что там, где присутствует остаток, сульфатированный в положении 4, фермент не способен действовать, вследствие чего он оставляет олигосахаридные остатки. Указанные остатки также четко детектируются посредством хроматографической или электрофоретической техники, такой как гельпроникающая хроматография и капиллярный электрофорез (СЕ), как показано, например, на хроматограммах, приведенных на фиг. 1, 2 и 3, относящихся к перевариванию хондроитиназой С натурального С8 (крупного рогатого скота и свиного) и биотехнологического С8, полученного согласно настоящему изобретению. Они содержат разнообразные олигосахариды разной длины, в которых сульфатные группы присутствуют в положении 4 или 6 остатка ОаШАс на одной и той же полисахаридной цепи.

Все эти свойства придают препарату С8, полученному способом согласно настоящему изобретению, структуру натурального С8, имеющего следующие характеристики:

a) все или почти все остатки ОаШАс являются моносульфатированными в положении 6 или 4;

b) в зависимости от применяемых условий синтеза отношение между остатками 48 и 68 (48/68) является полностью аналогичным отношению, найденному в С8, выделенном как из наземных животных, так и из рыб.

Как правило, С8 согласно настоящему изобретению можно получать, используя в качестве исходного субстрата капсульный полисахарид К4, продуцируемый естественным образом бактериями Е. той штамма О5:К4:Н4 (ЕР 1304338 В1), или другой полисахарид, имеющий структуру несульфатированного хондроитина (СН). В первом случае полисахарид К4, полученный из культуральной среды Е. той штамма О5:К4:Н4, в конце ферментации дефруктозилируют кислотным гидролизом при нагревании, а хондроитин очищают, приспосабливая для этого способы, которые описали Ρούπ§ικζ апй 1апп (Еиг. 1. Βίο- 6 023849 сНет. 117, 117-124, ЕЕБ8 1988).

В качестве альтернативы, исходный полисахарид получают, например, из культуры Е. сой штамма Ό8Μ23644, описанного в ΜI2010Α001300, который вследствие мутации, индуцированной в гене КЮЕ, ответственном за фруктозилирование К4, продуцирует полисахарид, идентичный натуральному несульфатированному СН. В этом случае дефруктозилирование не является необходимым, однако сохраняется стадия кислотного гидролиза при нагревании, проводимая для удаления некоторых загрязнений, включая бактериальные эндотоксины, которые осаждаются в результате этой обработки. Хондроитин (СН) затем очищают посредством центрифугирования, диализа и распылительной сушки.

Гидролиз проводят с культуральным супернатантом, отделяемым от биомассы посредством непрерывного центрифугирования. Частичный гидролиз и дефруктозилирование К4 проводят посредством инкубирования при 90-95°С в течение 30-50 мин при рН 2,8-3,0.

После этого периода инкубации получаемую суспензию охлаждают при температуре ниже 40°С (предпочтительно 20-30°С), чтобы погасить реакцию гидролиза, и одновременно доводят рН до 4-4,5. Суспензию, полученную в результате этого, подвергают осветлению посредством непрерывного центрифугирования, ультрафильтрации и конечного диализа против воды через мембрану 3 0 кДа.

Диализованный ретентат (приблизительно 1/10-я часть объема исходного культурального бульона) фильтруют и окончательно сушат в распылительной сушилке, получая полисахарид, имеющий структуру СН, который подвергают процессу сульфатирования. Полученный СН имеет титр, определенный посредством капиллярного электрофореза (СЕ) или НРЕС, который в расчете на сухое вещество составляет 8090 мас.%.

СН, полученный таким образом, принимает форму натриевой соли, и для сульфатирования его необходимо преобразовать в свободную кислоту или ее соль.

Способ сульфатирования согласно настоящему изобретению, который дает возможность случайным образом моносульфатировать остатки ОаШЛс в положении 4 или 6, включает образование сложного ортоэфира, который одновременно вовлекает положения 4 и 6 в ОаШЛс, и его последующую перегруппировку до сложного эфира, которую, неожиданным образом, можно модулировать, обеспечивая высвобождение гидроксила преимущественно в положении 4 или 6, тем самым давая возможность для избирательного сульфатирования этих гидроксилов.

Способ согласно настоящему изобретению включает следующие стадии:

a) преобразование натриевой соли хондроитина в свободную кислоту или, альтернативно, в ее соль с ионом четвертичного аммония (таким как тетраметил-, тетраэтил- или тетрабутиламмоний) или с пиридином. Предпочтительно применяют соль тетрабутиламмония (ТВА).

В качестве альтернативы, хондроитин (СН) в кислотной форме преобразуют в его метиловый сложный эфир после реакции в метаноле и ацетилхлориде.

b) Реакция соли хондроитина или метилового сложного эфира хондроитина со сложным ортоэфиром формулы КС(ОК4)з, в которой К является выбранным из водорода, метила, этила или фенила, а К! является выбранным из метила или этила, в присутствии кислотного катализатора, посредством которой получают циклический сложный ортоэфир, образованный движением двух алкоксилов исходного сложного ортоэфира к спиртовым функциональным группам в положениях 4 и 6 остатка ОаШЛс. В соединении, получаемом на этой стадии, все или почти все присутствующие дисахаридные единицы обладают структурой циклического сложного ортоэфира, представленного формулой I

где К и К! являются такими, как определено выше.

Примерами сложных ортоэфиров, которые можно использовать, являются триметилортоацетат, триэтилортоацетат, триметилортоформиат, триэтилортоформиат, триметилортопропионат, триэтилортопропионат или триметилортобензоат. Предпочтительно применяют триметилортоацетат или триэтилортоацетат. Особо предпочтительным является применение триметилортоацетата.

В качестве кислотного катализатора используют кислоту, выбранную из камфорсульфоновой кислоты, паратолуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты или сульфоновой смолы (предпочтительно камфорсульфоновую кислоту или сульфоновую смолу, более предпочтительно камфорсульфоновую кислоту).

с) Защита спиртовых групп в положениях 2' и 3' остатка О1сА посредством ацилирования ангидридом карбоновой кислоты формулы (К₂СО)₂О, где К₂ является предпочтительно выбранным из метила, этила или пропила, в присутствии пиридина или третичного органического основания (такого как триэтиламин или триизопропилэтиламин) и каталитических количеств 4-диметиламинопиридина (ΌΜΑΡ) с получением продукта, в котором повторяющаяся дисахаридная единица, находящаяся в хондроитине, имеет структуру циклического сложного ортоэфира, ацилированного в положениях 2' и 3', которая представлена формулой II

- 7 023849

где К, К! и К₂ являются такими, как определено выше.

Предпочтительно применяют уксусный ангидрид.

ά) Перегруппировка из циклического сложного ортоэфира до сложного эфира - реакция, которую проводят в смеси водорастворимой органической кислоты с водой или только в воде. Эту перегруппировку, происходящую случайным образом в различных единицах ОаШЛс полисахаридной последовательности, можно модулировать, способствуя высвобождению того или иного гидроксила (в положении 4 или 6 соответственно), с одновременным образованием сложного эфира с растворимой органической кислотой, используя оставшееся положение (4 или 6 соответственно). Результатом этого является образование двух разных дисахаридных единиц в одной и той же полисахаридной цепи, а именно дисахаридных единиц со структурой, в которой гидроксилы в положениях 6, 2' и 3' являются ацилированными, а гидроксил в положении 4 является свободным; указанные единицы представлены формулой 111а

где К и К₂ являются такими, как определено выше; или дисахаридных единиц со структурой, в которой гидроксилы в положениях 4, 2' и 3' являются ацилированными, а гидроксил в положении 6 является свободным; указанные единицы представлены формулой ШЬ

где К и К₂ являются такими, как определено выше.

При проведении реакции при температуре 20-40°С (предпочтительно при комнатной температуре) в течение 1-48 ч (предпочтительно в течение 3-38 ч и более предпочтительно в течение 38 ч) неожиданно наблюдали большее количество соединения, имевшего свободный гидроксил в положении 6, тогда как при проведении реакции при температуре 40-70°С (предпочтительно при 60°С) в течение 1-48 ч (предпочтительно в течение 3-38 ч и более предпочтительно в течение 18 ч) преобладает продукт со свободным гидроксилом в положении 4. Водорастворимая органическая кислота является выбранной из уксусной, муравьиной, пропионовой, винной, лимонной кислоты или катионной смолы, такой как, например, 8ерга 8СХ 50 рт 65А (предпочтительными являются уксусная кислота или пропионовая кислота, а более предпочтительна уксусная кислота).

ά) За этим следует сульфатирование комплексом пиридина с триоксидом серы в ΌΜΕ способом, уже описанным в ЕР 1304338 В1, или комплексом триоксида серы с ΌΜΕ, проводимое для получения С8, который соответственно применяемым условиям перегруппировки (а следовательно, и соответственно процентным долям присутствующих в нем структур 111а и 111Ь), будет различным образом сульфатированным в положении 4 дисахарида 111а или в положении 6 дисахарида 111Ь. За реакцией сульфатирования следует удаление ацильных групп, присутствующих в положениях 2' и 3' остатка О1сЛ и в положении 4 или 6 остатка ОаШЛс, осуществляемое обработкой основанием по процедуре, описанной в ЕР 1304338 В1, с получением натриевой соли С8, частично сульфатированного в положениях 4 и 6.

Некоторые технические приемы, применяемые в данном способе, приводят к деполимеризации полисахаридной цепи, так что получают С8, сульфатированный в положении 4 или 6 остатка Са1\Лс, характеризующийся низкой молекулярной массой (1о^ то1еси1аг \\Όΐμ1ιΙ, I ,М\\).

Хондроитин можно также деполимеризовывать на стадии перегруппировки сложного ортоэфира, используя кислоту в качестве растворителя или вспомогательного растворителя для этой реакции. Высокая концентрация кислоты на этой стадии приводит к разрыву полисахаридной цепи с последующим образованием цепей с низкой молекулярной массой в диапазоне 4-9 кДа.

Препарат ЬМ\-С8 В1ОТЕС (4000-9000 Да), полученный описанным способом, оценивали по его эффективности в модели экспериментального артрита у крыс (адъювантный артрит, АА), сравнивая с результатами, полученными с натуральным С8 экстракционного происхождения фармацевтической категории, применявшимся в той же экспериментальной модели (Ваиегоуа К. е1 а1., О§1еоаг1Ьп118 СагШауе

- 8 023849

2011, электронная публикация до появления в печати), после лечения суточной дозой 900 мг/кг.

АА индуцировали единичной внутрикожной инъекцией МусоЪас1егшт Ъи1упсит в неполном адъюванте Фрейнда. Эксперименты проводили со здоровыми животными, с артритными животными без лечения и с артритными животными, которые подвергались лечению. Среди животных, которых подвергали лечению, у одной группы животных проводили предварительное лечение, которое заключалось в ежедневном введении ЬМ^-С8 В1ОТЕС в дозе 900 мг/кг в течение 14 дней перед индуцированием артрита и которое было продолжено в течение 28 дней после индуцирования АА. Другой группе животных ЬМ^-С8 В1ОТЕС в водили в суточной дозе 900 мг/кг только в течение 28 дней после индуцирования АА.

Отек, развивавшийся в задней лапе, был значительно меньшим у животных, подвергнутых предварительному лечению.

Предварительное лечение препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению (900 мг/кг/день) значительно уменьшало отек в течение всего эксперимента по сравнению с контролем без лечения. Предварительное лечение препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС, кроме того, восстанавливало массу тела приблизительно на 8-15% по сравнению с контрольными животными с артритом без лечения.

Тяжесть артрита количественно оценивали по повышающейся степени опухлости и периартикулярной эритемы. ЬМ^-С8 В1ОТЕС, вводимый в дозе 900 мг/кг/день при предварительном и основном лечении, достоверно эффективен в отношении снижения балльной оценки артрита. Кроме того, предварительное лечение является эффективным на подострой стадии (с 14-го по 28-й день после индуцирования АА), тогда как основное лечение эффективно только на стадии средней тяжести (от 21-го до 28-го дня после индуцирования АА) и неэффективно на острой стадии (в первые 14 дней после индуцирования АА).

Окислительный стресс (последствие хронических воспалительных процессов, которое имеет место при артритных/остеоартритных процессах) значительно усиливается в модели у животных на острой и субхронической стадии. Усиленный окислительный стресс индуцирует высокое потребление эндогенных антиоксидантов плазмы, следствием чего является снижение антиоксидантной способности плазмы, измеренной в виде общего антиоксидантного статуса. Предварительное лечение препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС эффективно корректирует общий антиоксидантный статус в модели у животных, значительно уменьшая потребление эндогенных антиоксидантов. Активность γ-глутамилтрансферазы, которая увеличивается при окислительном стрессе и поэтому рассматривается как хороший маркер окислительного стресса, измеренная в гомогенатах ткани сустава, оказалась значительно большей у животных с экспериментально индуцированным полиартритом, но была значительно более низкой у животных, которых лечили препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС, по сравнению с животными без лечения.

Интерлейкин-1 β (Ιΐ-1β) и интерлейкин-6 (10-6), провоспалительные цитокины, значительно повышались у животных с моделью экспериментально индуцированного артрита, с резким ростом 1Ь-6 на острой стадии, когда его уровень был в 10 раз выше уровня контрольных здоровых животных. Терапевтический эффект ЬМ^-С8 В1ОТЕС был заметен уже с 14-го дня (на острой стадии), когда концентрация 1Ь-6 была приблизительно на 30-40% ниже, чем у животных с АА.

Основной маркер воспалительных белков - С-реактивный белок (СКР) - имеет временной профиль, очень похожий на профиль 1Ь-6. Увеличение на острой стадии было в модели с экспериментальным артритом приблизительно в 7,5 раз большим, чем у здоровых контрольных животных. Эффект, оказываемый препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС на СКР, подобно его эффекту, оказываемому на уровень 1Ь-6, наблюдается на острой стадии и заключается в значительном понижением концентрации СКР в плазме.

В отношении фагоцитарной активности и увеличения внутриклеточного окисления нейтрофилов наблюдаемые различия между здоровыми контрольными животными и контрольными животными с индуцированным экспериментальным АА были достоверными в случае увеличенной фагоцитарной активности. Введение ЬМ^-С8 В1ОТЕС на основе предварительного лечения индуцировало значительное уменьшение фагоцитоза и окислительного взрыва.

Препарат ЬМ^-С8 В1ОТЕС согласно настоящему изобретению значительно уменьшал тяжесть артритных процессов и окислительный стресс, являющийся результатом хронических воспалительных процессов. Предварительное лечение препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС эффективно в течение всей подострой стадии, тогда как основное лечение, проводимое с первого дня начала АА, является эффективным только в течение хронического периода. Эти эффекты подтверждены улучшением общего антиоксидантного статуса и активности γ-глутамилтрансферазы. ЬМ^-С8 В1ОТЕС, вводимый в виде предварительного лечения, также уменьшал продуцирование провоспалительных цитокинов, С-реактивного белка в плазме, фагоцитарную активность и внутриклеточный окислительный взрыв нейтрофилов. И наконец, ЬМ^-С8 В1ОТЕС оказался эффективным в отношении замедления развития экспериментального артрита/остеоартрита как на острой, так и на субхронической стадии, и в отношении понижения уровней маркеров заболевания, что таким образом свидетельствует о его благоприятной активности, сравнимой с активностью референсного соединения.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано нижеследующими примерами.

- 9 023849

Пример 1. Получение тетраалкиламмонийной или пиридиниевой соли хондроитина.

Натриевую соль СН, полученную после гидролиза, очистки и сушки, проведенных по методикам, описанным выше, исходя из полисахарида К4 или полисахарида, полученного ферментацией Е. сой штамма Ό8Μ23644, растворяли в водной среде. После полного растворения раствор наносили на колонку с катионообменной смолой, такой как АтЬере! 1200 Н (Койт апй Наак), или с ее эквивалентом.

Собирали фракции, элюированные при рН 1,5-4,0 или предпочтительно при рН 1,5-2,0, и добавляли водный раствор иона, выбранного из тетраметил-, тетраэтил- и тетрабутиламмония или пиридиния, до получения рН 6,0-8,0 или предпочтительно рН 6,5-7,0. Затем раствор полностью выпаривали досуха посредством лиофилизации или распылительной сушки, получая соответствующую соль.

Пример 2. Защита гидроксилированных функций (4 и 6) ОаШАс-части с образованием соответствующего циклического метилового сложного ортоэфира СН (СН-сМОЕ).

Соль, полученную из хондроитина, такую как тетрабутиламмонийная (ТВА) соль, смешивают с диметилформамидом (ΌΜΡ) в колбе в количестве 5,2 г и 130 мл соответственно. В эту же колбу по каплям добавляли 8,49 г триметилортоацетата, после которого добавляли 300 мг камфорсульфоновой кислоты и реакционную смесь поддерживали при 70°С в течение 72 ч. Затем реакционную смесь выпаривали досуха в вакууме и дополнительно сушили в сушильном шкафу при 40°С в течение 20 ч, получая 6,1 г хондроитин-МОЕ ТВА в форме твердого вещества.

Для подтверждения того, что защита действительно имела место, проводили анализ продукта реакции. Посредством §ЕС-НРЬС было подтверждено исчезновение исходного продукта и появление нового продукта с более высокой молекулярной массой (48 кДа). Анализы, проведенные посредством переваривания хондроитиназой АВС, - ферментом, способным гидролизовать свободный СН, но не способным гидролизовать защищенный СН, - продемонстрировали, что процентная доля защищенных молекул исходного СН составляла менее 15%.

Пример 3. 2',3'-ацетилирование циклического сложного ортоэфира хондроитина (2',3'-диацетил-СНсМОЕ).

Хондроитин, полученный на предыдущей стадии, защищенный в виде циклического метилового сложного ортоэфира (СН-сМОЕ) (4,79 г), вносили в реакционную колбу с 23,95 мл ацетонитрила, 15,69 мл триэтиламина (ТЕА), 6,21 мл уксусного ангидрида и 78,96 мг 4-диметиламинопиридина (ΌΜΑΓ). После перемешивания в течение 2 ч при 25-26°С добавляли 94 мл диизопропилового простого эфира, получая вязкое твердое вещество, которое затем отфильтровывали на фильтровальной бумаге и сушили в сушильном шкафу в вакууме при 45°С в течение 24 ч. Промежуточный циклический сложный ортоэфир, полученный таким образом, имел вид твердого вещества розового цвета.

Пример 4. Перегруппировка из циклического метилового сложного ортоэфира с преимущественным образованием ацетата в положении 4 и со свободным гидроксилом в положении 6 (см. фиг. 111Ь).

Промежуточное соединение, полученное на предыдущей стадии (2,42 г), вносили в реакционную колбу, в которую добавляли 18,8 мл 96%-ной уксусной кислоты и 2,35 мл деминерализованной воды. Смесь перемешивали в течение 38 ч при комнатной температуре, после чего добавляли 100 мл 0,6М раствора №С1, и полученную смесь подвергали ультрафильтрации через мембрану 5 кДа и диализовали, получая ретентат с рН 3,32.

Этот раствор выпаривали в вакууме при 45-50°С; после дополнительной сушки в сушильном шкафу в течение ночи получали 1,38 г продукта в виде стеклообразного твердого вещества.

Пример 5. Перегруппировка из циклического метилового сложного ортоэфира с преимущественным образованием ацетата в положении 6 и со свободным гидроксилом в положении 4 (см. фиг. 111а).

Промежуточный циклический сложный ортоэфир (2,42 г), полученный с предыдущей стадии, вносили в реакционную колбу с 14,52 мл 96%-ной уксусной кислоты и 9,8 мл деминерализованной воды и нагревали при 60°С в течение 17,5 ч, после чего добавляли 100 мл 0,6М №С1 и раствор (рН 2,27) подвергали ультрафильтрации и диализовали, получая ретентат с рН 3,56.

Этот раствор выпаривали в вакууме при 45-50°С и после дополнительной сушки в сушильном шкафу в течение ночи получали 1,12 г продукта в виде стеклообразного твердого вещества.

Пример 6. Получение хондроитинсульфата с пиридиниевым комплексом триоксида серы.

Промежуточное соединение, полученное как описано в примере 4 (0,76 г), вносили в колбу с 46,0 мл ΌΜΡ, перемешивая смесь при 30°С в течение 10 мин. Добавляли 0,72 г пиридиниевого комплекса триоксида серы и после растворения исходного материала (приблизительно через 10 мин) раствор оставляли на 1 ч при перемешивании при 30°С. Затем добавляли дополнительно 0,72 г пиридиниевого комплекса триоксида серы, после чего следовало еще одно добавление 0,72 г пиридиниевого комплекса триоксида серы. Раствор перемешивали в течение еще одного часа при 30°С.

Реакцию гасили, выливая смесь в 50 мл 10%-ного NаНСΟз в воде при комнатной температуре (рН 7,81). После фильтрования раствор досуха выпаривали в вакууме (10 мбар), остаток повторно растворяли в 150 мл 0,6М №С1 и, наконец, подвергали ультрафильтрации.

После 6-кратной замены объема ретентат имел рН 9,22; рН доводили до 6,7, добавляя 1н НС1, и продолжали ультрафильтрацию, заменяя 0,6н раствор №С1 деминерализованной водой.

Раствор, полученный в результате этого, опять подвергали ультрафильтрации (2 об.) и затем диали- 10 023849 зовали до объема 20 мл. Диализованный раствор концентрировали в вакууме досуха (10 мбар, 45°С).

Продукт, полученный таким образом (0,88 г), растворяли в 34,0 мл 0,2н каустической соды (№ЮН) и нагревали при 40°С при перемешивании в течение 2 ч. В конце процедуры этот раствор разбавляли, добавляя 0,6М водный раствор хлорида натрия, подвергали ультрафильтрации через мембрану 5 кДа и диализовали против деминерализованной воды. Ретентат концентрировали в вакууме досуха (45°С, 10 мбар), получая 0,67 г хондроитинсульфата. Конечный продукт, который имел молекулярную массу 29 кДа, определенную посредством НРЬС-ЗЕС, показывал:

перевариваемость хондроитиназой АВС, превышавшую 95%; отношение 43/63, равное 18/82;

общую плотность заряда, равную приблизительно 0,9;

только частичную перевариваемость хондроитиназой С, что было продемонстрировано присутствием олигосахаридов, обусловленным наличием на одной и той же полисахаридной цепи как единиц, сульфатированных в положении 4, так и единиц, сульфатированных в положении 6, характерных для настоящего изобретения.

Пример 7. Получение хондроитинсульфата с пиридиниевым комплексом триоксида серы.

Промежуточное соединение, полученное как описано в примере 5 (1,12 г), вносили в колбу с 67,2 мл ΌΜΡ, и смесь перемешивали при 50°С в течение 10 мин. Добавляли 1,05 г пиридиниевого комплекса триоксида серы и после растворения исходного материала (приблизительно через 10 мин) раствор оставляли на 1 ч при перемешивании при 50°С. Затем добавляли дополнительно 1,05 г пиридиниевого комплекса триоксида серы. Раствор перемешивали в течение еще одного часа при 50°С.

Реакцию гасили, выливая смесь в 60 мл 10%-ного NаНСОз в воде при комнатной температуре (КТ) (рН 7,81). После фильтрования раствор досуха выпаривали в вакууме (10 мбар) и остаток повторно растворяли в 30 мл 0,6М №С1. В конце процедуры раствор подвергали ультрафильтрации.

После 6-кратной замены объема ретентат имел рН 9,22; рН доводили до нейтральности (7,5%), добавляя 1н НС1, и продолжали микрофильтрацию, заменяя 0,6н раствор Ν;·ιΟ деминерализованной водой.

Раствор, полученный в результате этого, опять подвергали ультрафильтрации (2 об.) и затем диализовали до объема 20 мл. Диализованный раствор концентрировали в вакууме досуха (10 мбар, 45°С), получая 1,53 г продукта.

Этот остаток растворяли в 59,6 мл 0,2н каустической соды (№ОН) и нагревали при 60°С в течение 2 ч. В конце процедуры этот раствор разбавляли, добавляя 0,6М водный раствор хлорида натрия, подвергали ультрафильтрации через мембрану 3 кДа и диализовали против деминерализованной воды. Ретентат концентрировали в вакууме досуха (45°С, 10 мбар), получая 0,76 г хондроитинсульфата.

Продукт, полученный таким образом, имел молекулярную массу 15,4 кДа, определенную посредством НРЬС-ЗЕС, перевариваемость хондроитиназой АВС, превышавшую 95%; отношение 48/68, равное 82/18; и общую плотность заряда, равную приблизительно 1,09. Почти полное переваривание, полученное с хондроитиназой АВС (более 95% продукта подвергалось разложению), вместе с пониженной перевариваемостью хондроитиназой С, что характерно для настоящего изобретения, демонстрирует существование как единиц, сульфатированных в положении 4, так и единиц, сульфатированных в положении 6, на одной и той же полисахаридной цепи.

Перевариваемость хондроитиназой АВС, превышающая 95%, кроме того, демонстрирует отсутствие полисульфатированных (три-и тетрасульфатированных) дисахаридов в полисахаридной цепи СЗ, который относится к настоящему изобретению.

Пример 8. Получение метилового сложного эфира хондроитина (СН).

10,0 г СН в кислотной форме добавляли к раствору 1,3 л метанола и 14,43 г ацетилхлорида, помещенному в 3-литровую колбу для перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч, и полученную суспензию оставляли перемешиваться в течение 20 ч.

По истечении этого времени суспензию фильтровали и твердое вещество промывали 100 мл метанола (2x50 мл) и сушили при 50°С в вакууме, получая 9,4 г сухого твердого вещества.

Реакцию повторяли еще раз по той же процедуре и после завершения второго периода суспензию в течение 60 мин охлаждали при 0-5°С и затем фильтровали. Полученное твердое вещество промывали холодным метанолом (0-5°С) и сушили в сушильном шкафу в вакууме в течение 3 ч при 50°С, получая 6,3 г твердого вещества.

Пример 9. Защита гидроксилированных функций (4 и 6) СаШАс-части метилового сложного эфира СН посредством образования сложного ортоэфира.

В 500-мл колбу с клапаном из хлорида кальция и потоком азота вносили 150 мл диметилформамида (ΌΜΡ) и 6,0 г продукта, полученного на предыдущей стадии. Затем добавляли 20,06 г триметилортоацетата и 0,71 г камфорсульфоновой кислоты. Полученный раствор нагревали при 50°С (внутренняя температура) в течение 18 ч.

В конце этого периода раствор оставляли охлаждаться при комнатной температуре и концентрировали в вакууме, получая 8,5 г продукта.

Пример 10. Ацетилирование 2',3'-гидроксилов продукта, произведенного в примере 9.

В 250-мл колбу с клапаном из хлорида кальция и потоком азота при комнатной температуре вноси- 11 023849 ли 8.0 г продукта. полученного на предыдущей стадии. 40 мл ЭМР. 28.6 г триэтиламина. 17.15 г уксусного ангидрида и 96 мг диметиламинопиридина.

Полученный раствор оставляли перемешиваться в течение 3 ч; по истечении этого времени в колбу добавляли 150 мл изопропилового простого эфира. в результате чего осаждалось аморфное твердое вещество. Жидкости удаляли декантированием. к твердому веществу добавляли 100 мл изопропилового простого эфира и оставляли перемешиваться в течение 1 ч. Твердое вещество затем отфильтровывали. промывали 50 мл изопропилового простого эфира и сушили в вакууме при 40°С. получая 8.52 г продукта.

Пример 11. Перегруппировка сложного ортоэфира. полученного в примере 10.

В 250-мл колбу вносили 7.0 г продукта. полученного на предыдущей стадии. 72.8 г ледяной уксусной кислоты и 8.7 мл воды. получая раствор. который оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем этот раствор разбавляли. добавляя 150 мл 0.6М хлорида натрия. и раствор. полученный в результате этого. очищали посредством ультрафильтрации через мембрану 5 кДа. После диализа полученный раствор концентрировали в вакууме и получали 6.7 г твердого продукта.

Пример 12. Сульфатирование трижды ацетилированного метилового сложного эфира.

В 250-мл колбу с потоком азота и клапаном из хлорида кальция вносили 670 мг продукта. полученного на предыдущей стадии. и 40 мл ЭМР.

К полученному раствору добавляли 630.44 г пиридиниевого комплекса триоксида серы. и раствор. полученный в результате этого. нагревали при 50°С (внутренняя температура) в течение 1 ч. Затем в колбу при той же температуре добавляли 630.44 г пиридиниевого комплекса триоксида серы и опять оставляли перемешиваться в течение 1 ч.

По истечении этого времени раствор охлаждали до комнатной температуры и в колбу при той же температуре добавляли 40 мл 3%-ного ЫаНСО₃. получая раствор. который концентрировали в вакууме. получая 2.3 г твердого вещества. смешанного с неорганическими солями. Полученный продукт разбавляли в 150 мл 0.6М хлорида натрия и подвергали ультрафильтрации через мембрану 5 кДа.

После диализа полученный раствор концентрировали в вакууме. получая 1.32 г твердого продукта.

Пример 13. Получение хондроитинсульфата.

Продукт. полученный на предыдущей стадии. вносили в 100-мл колбу с 33 мл 0.2М каустической соды. Раствор нагревали при 40°С (внутренняя температура) в течение 2 ч. после чего его охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовывали. добавляя 1М НС1.

Раствор разбавляли. добавляя 150 мл 0.6М хлорида натрия. и подвергали ультрафильтрации через мембрану 5 кДа. После диализа и концентрирования раствора в вакууме получали 350 мг твердого вещества.

Продукт. полученный в этом примере. имел молекулярную массу 11 кДа. отношение 4З/6З. равное 47/53. и плотность заряда. равную 0.9.

Пример 14. Образование циклического сложного ортоэфира на гидроксильных функциях в положениях 4 и 6 ОаШАс-части с одновременной деполимеризацией полисахаридной цепи.

Суспензию тетрабутиламмонийной соли хондроитина. полученную как описано выше (4.07 г; 6.535 ммоль). в диметилформамиде (101 мл) выдерживали при перемешивании в потоке азота при комнатной температуре (20-25°С). Добавляли триметилортоацетат (9.03 мл. 71.89 ммоль) и камфорсульфоновую кислоту (1.82 г; 7.84 ммоль). Суспензию нагревали до 70°С (внутренняя температура) и через несколько минут наблюдалось полное растворение. Реакцию поддерживали при перемешивании при той же температуре в течение 18-20 ч. На следующий день реакционную смесь концентрировали. удаляя растворитель посредством испарения в вакууме. и получали 13.67 г продукта в форме ярко-желтого резиноподобного остатка.

Содержание незащищенного хондроитина. оставшегося после переваривания. составляло 4.6%. Присутствие сложного ортоэфира было продемонстрировано соответствующим сигналом РТ1К.

Продукт. полученный таким образом. использовали на последующих стадиях. как описано выше. пока не получали препарат ЬМУ-СЗ В1ОТЕС. сульфатированный в положении 4 или 6 остатка ОаШАс.

Пример 15. Раскрытие циклического сложного ортоэфира хондроитина посредством его превращения в обычный сложный эфир с преимущественным образованием ацетата в положении 4 или 6 ОаШАсчасти и одновременной деполимеризацией полисахаридной цепи.

В 250-мл трехгорлую колбу вносили сложный ортоэфир хондроитина (3.00 г). воду (3.14 мл) и уксусную кислоту (26.25 г; 437 ммоль). Полученную суспензию нагревали в течение 36 ч при комнатной температуре (20-25°С). Затем добавляли воду. доводя общий объем раствора до 100 мл. Раствор. полученный таким образом. подвергали ультрафильтрации (мембрана 5 кДа). Собранный ретентат диализовали против небольшого объема (20 мл) и затем концентрировали в вакууме досуха. получая 1.55 г твердого остатка. соответствующего желаемому продукту (триацетилхондроитину).

Продукт. полученный таким образом. использовали на последующих стадиях. как описано выше. пока не получали препарат ЬМУ-СЗ В1ОТЕС. сульфатированный в положении 4 или 6 остатка ОаШАс.

Пример 16. Индукция артрита (адъювантный артрит. АА) у крыс и лечение препаратом ЬМУ-СЗ В1ОТЕС.

- 12 023849

Сорок самцов крыс ЬеЮк с массой 150-190 г, случайным образом распределенных на четыре группы по 10 животных в каждой, содержали в полипропиленовых клетках, поддерживая температуру 22±2°С, и кормили стандартной лабораторной диетой с неограниченным доступом к воде.

Экспериментальные группы были следующими:

1) Контрольная группа здоровых животных без лечения.

2) Контрольная группа животных с артритом, индуцированным адъювантом (АА), без лечения.

3) Группа крыс с артритом, которых лечили пероральными дозами 900 мг/кг массы тела в день препарата ЬМ^-С8 В1ОТЕС в течение 28 дней после индуцирования АА (дни эксперимента 0-28).

4) Группа, подвергавшаяся предварительному лечению пероральными дозами 900 мг/кг массы тела в день препарата ЬМ^-С8 В1ОТЕС в течение 14 дней, предшествовавших индуцированию адъювантного артрита, и в течение 28 дней после индуцирования АА (дни эксперимента от -14 до +28).

Артрит экспериментально индуцировали у крыс в день 0 посредством однократной внутрикожной инъекции 1 мл смеси, состоявшей из термоинактивированных МусоЬас1егшт Ьи1уггеит в неполном адъюванте Фрейнда.

Препарат ЬМ^-С8 В1ОТЕС растворяли в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл и вводили перорально через желудочный зонд в виде единичной дозы.

В конце 28-дневного лечения крыс умерщвляли под анестезией и отбирали кровь и ткани, анализируемые для оценки параметров, наблюдаемых в данном исследовании.

Пример 17. Эффекты ЬМ^-С8 В1ОТЕС на оценку АА у крыс по данным о развитии отека, массе тела и числе баллов по шкале артрита.

Отек, который развивался вследствие артрита, оценивали, измеряя увеличение объема задней лапы подходящим инструментом. Эти измерения выполняли до индуцирования АА и в 28-й день исследования.

Массу тела крыс измеряли до индуцирования АА и в конце лечения (28-й день). Эффект, оказываемый лечением на этот параметр, оценивали, сравнивая различные степени увеличения массы в разных группах в течение периода лечения.

Число баллов по шкале оценки артрита определяли, соотнося эту шкалу со степенью опухлости суставов конечностей и периартикулярной эритемы. Оценку по шкале артрита или артрограмму определяли как сумму общей отечности (в мл, максимально 8 баллов), плюс диаметр передней лапы (в мм, максимально 5 баллов), плюс диаметр струпа на месте нанесения МусоЬас1егшт Ьи1уггеит, измеренный параллельно позвоночнику (в мм, максимально 5 баллов), для каждого животного.

Пример 18. Эффект ЬМ^-С8 В1ОТЕС на активность γ-глутамилтрансферазы как маркера окислительного стресса, индуцированного АА.

Окислительный стресс оценивали, измеряя активность γ-глутамилтрансферазы в гомогенатах ткани сустава, полученной от крыс в конце лечения препаратом ЬМ^-С8 В1ОТЕС. Фермент γглутамилтрансферазу считают маркером окислительного стресса.

Активность клеточной γ-глутамилтрансферазы определяли в гомогенатах ткани задней лапы и оценивали по методике Орловского и Мейстера (Ог1о\У51б М, МеМег А. ТНе датта-д1и1ату1 сус1е: а рохмЫе 1гаи8рог1 ууДет Гог атто аабк. Ргос ЫаН Асаб δα И8А 1970; 67: 1248-1255) в модификации, которую предложили Опбгсрскоуа е! а1. (Сатбюкаеисе 1993; 4: 225-230). Образцы гомогенизировали в буфере (2,6 мМ ЫаН₂РО₄, 50 мМ Ыа₂НРО₄, 15 мМ ЕЭТА. 68 мМ ЫаС1, рН 8,1) в 1:9 (мас./об.) растворе с использованием ИИгаТигах ТР 18/10 Цапке & Кипке1, Оегтаиу) в течение 1 мин при 0°С. Субстраты (8,7 мМ γглутамил-п-нитроанилида и 44 мМ метионина) добавляли к 65%-ному изопропиловому спирту в конечных концентрациях 2,5 и 12,6 мМ соответственно. После инкубации в течение 60 мин при 37°С реакцию останавливали, добавляя 2,3 мл холодного метанола, и пробирки центрифугировали в течение 20 мин при 5000 об/мин. На спектрофотометре §ресогб 40 Цеиа, Оегтаиу) в 0,5-см кюветах измеряли поглощение при 406 нм. В качестве референсных образцов использовали реакционные смеси в отсутствие субстрата или акцептора.

Пример 19. Эффект ЬМ^-С8 В1ОТЕС на воспалительное состояние, индуцированное АА, оцениваемый по уровням провоспалительных цитокинов (1Ь-1, 1Ь-6) и С-реактивного белка (СКР) в плазме.

Образцы крови получали от крыс в конце эксперимента и помещали в пробирки, содержавшие гепарин в качестве антикоагулянта; центрифугированием отделяли плазму от корпускулярной части, состоявшей из клеток крови, и определяли воспалительные цитокины (1Ь-1, 1Ь-6), используя коммерческие наборы для анализа по методике ЕЫ8А.

С-реактивный белок определяли в плазме крыс с набором ЕЫ8А (1ттиио1оду СоикиИаи! ЬаЬога1опек, 1ис., 1СЬ). Реакцию конъюгированных с биотином вторичных антител с антителами к крысиному Среактивному белку оценивали по активности пероксидазы хрена (НКР), конъюгированной со стрептавидином. Затем на микропланшетном ридере ЬаЬ8у81ет8 МиШккаи КС при 450 нм измеряли реакцию метилбензидина с НКР, связанной с иммунными комплексами. Результаты рассчитывали, используя стандартную калибровочную кривую по инструкции, прилагаемой к набору ЕЫ8А.

Пример 20. Эффект ЬМ^-С8 В1ОТЕС на фагоцитарную активность и на окислительный взрыв ней- 13 023849 трофилов, индуцированные АА.

Популяцию нейтрофилов извлекали из крови крыс в конце оценки их фагоцитарной активности и окислительного взрыва. Измерения фагоцитоза (т.е. поглощения бактерий) проводили в контролируемых условиях с использованием 81арЬу1ососси§ аигеиз, меченного флуоресцеином (8РЛ-ИТС) (1пургоуеп Мо1еси1аг РгоЬез, И8Л). Аликвоты периферической крови с литий-гепарином затем инкубировали с гидроэтидином (1пуйгоуеп то1еси1аг ргоЬез, И8Л) (15,75 мг в 5 мл диметилформамида, Мегск, Оегтапу) в течение 15 мин при 37°С. После обработки 8РЛ-ИТС в течение 15 мин при 37°С реакцию прерывали, помещая пробирки в лед. Последующий лизис эритроцитов проводили в течение 15 мин с лизирующим раствором, состоявшим из холодного раствора хлорида аммония и хлорида калия (200 мл деионизованной воды, 1,658 г ИИ₄С1, 0,2 г КНСО₃ и 7,4 мг Иа₂ЕВТЛ, рН 7,2-7,4). Средний процент фагоцитных клеток представляет собой процентную долю гранулоцитов, которые поглотили, по меньшей мере одну частицу 8РЛ-ИТС, а средний процент респираторного взрыва представляет собой процентную долю гранулоцитов, меченных этидием.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения натриевой соли хондроитинсульфата, в котором все Ν-ацетил-Игалактозаминовые единицы в одной и той же полисахаридной цепи моносульфатированы либо случайным образом, либо в положении 4 или 6, причем указанный способ включает следующие стадии:

   a) преобразование натриевой соли хондроитина в его свободную кислоту или в ее соль с катионом четвертичного аммония, выбранным из тетраметиламмония, тетраэтиламмония или тетрабутиламмония, или в соль пиридиния, или в метиловый сложный эфир;

   b) реакция соединения, полученного на стадии а), со сложным ортоэфиром формулы КС(ОК₁)₃, в которой К является выбранным из водорода, метила, этила или фенила, а К₁ является выбранным из метила или этила, в условиях кислотного катализа с получением соединения, в котором повторяющаяся дисахаридная единица, присутствующая в хондроитине, имеет формулу I в которой К и К₁ являются такими, как определено выше;

   с) защита гидроксильных групп в положениях 2' и 3' единиц глюкуроновой кислоты в соединении, полученном на предыдущей стадии, посредством реакции с ангидридом формулы (К₂СО)₂О, в которой К₂ является выбранным из метила, этила или пропила, в присутствии пиридина или органического третичного основания, выбранного из триэтиламина или триизопропиламина, и 4-диметиламинопиридина (ИМЛР) с получением соединения, в котором повторяющаяся дисахаридная единица, присутствующая в хондроитине, имеет формулу II в которой К, К₁ и К₂ являются такими, как определено выше;

   ά) перегруппировка функционального фрагмента сложного ортоэфира, присутствующего в продукте, полученном на стадии с), с органической водорастворимой кислотой с получением сложноэфирного производного, в котором повторяющиеся единицы ОаШЛс в полисахариде состоят из триацильных производных, имеющих формулу 111а или 111Ь в которой К и К₂ являются такими, как определено выше;

   - 14 023849

   е) моносульфатирование соединения, полученного на стадии б), с последующим удалением Оацильных групп, присутствующих в соединениях 111а и ШЬ, полученных на предыдущей стадии.
2. 2. Способ по п.1, где натриевую соль хондроитина стадии а) получают исходя либо из капсульного полисахарида К4, продуцируемого культуральным бульоном Е. сой штамма О5:К4:Н4, либо из полисахарида, продуцируемого культуральным бульоном Е. со11 штамма Э8М23644.
3. 3. Способ по п.1, где стадию Ь) проводят со сложным ортоэфиром, выбранным из триметилортоацетата, триэтилортоацетата, триметилортоформиата, триэтилортоформиата, триметилортопропионата, триэтилортопропионата или триметилортобензоата.
4. 4. Способ по п.1, где кислотный катализ стадии Ь) осуществляют с кислотой, выбранной из камфорсульфоновой кислоты, паратолуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты, или с сульфоновой смолой.
5. 5. Способ по п.1, где стадию с) проводят с уксусным ангидридом.
6. 6. Способ по п.1, где стадию б) проводят при 20-40°С.
7. 7. Способ по п.1, где стадию б) проводят при 40-70°С.
8. 8. Способ по п.1, где стадию б) проводят в смеси воды с органической водорастворимой кислотой или в одной воде.
9. 9. Способ по п.8, где органическая кислота является выбранной из уксусной, муравьиной, пропионовой, винной, лимонной кислоты или катионной смолы.
10. 10. Способ по п.1, где полученная натриевая соль хондроитинсульфата имеет среднюю молекулярную массу (МА) 10-30 кДа.
11. 11. Способ по п.10, где натриевая соль хондроитинсульфата имеет распределение моносульфатных групп, отношение которых находится в диапазоне от 90/10 48/68 до 10/90 48/68.
12. 12. Способ по п.1, где отношение между единицами Ν-ацетил-О-галактозамина, сульфатированного в положении 4 и в положении 6, в полученной натриевой соли хондроитинсульфата составляет менее 1.
13. 13. Способ по п.1, где отношение между единицами Ν-ацетил-О-галактозамина, сульфатированного в положении 4 и в положении 6, в полученной натриевой соли хондроитинсульфата составляет более 1.
14. 14. Натриевая соль хондроитинсульфата, полученная согласно способу по п.1, имеющая среднюю молекулярную массу, составляющую от 4000 до 9000 Да, определенную посредством хроматографии с фракционированием по размерам молекул (8ЕС), и имеющая биотехнологическое происхождение, в которой все Ν-ацетил-О-галактозаминовые единицы в одной и той же полисахаридной цепи являются моносульфатированными либо случайным образом, либо в положении 4 или 6 с распределением моносульфатных групп, отношение которых составляет от 90/10 48/68 до 10/90 48/68.
15. 15. Применение натриевой соли хондроитинсульфата по п.14 для предупреждения и лечения остеоартрита и/или поддержания нормального состояния скелетно-мышечной системы.
16. 16. Композиция для предупреждения и лечения остеоартрита и/или поддержания нормального состояния скелетно-мышечной системы, содержащая натриевую соль хондроитинсульфата по п. 14 и один или более фармацевтически или нутрицевтически приемлемых эксципиентов.