CN103582653A - 在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法 - Google Patents

在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了自未硫酸化的软骨素骨架开始，经化学硫酸化，生产具有10-30kDa平均分子量(Mw)的硫酸软骨素的方法，所述未硫酸化的软骨素骨架经大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4直接产生的荚膜多糖K4的酸水解得到或者由基因改造的大肠杆菌(E.coli)菌株直接生产。N-乙酰基-D-半乳糖胺残基4或6位的硫酸化同时发生于同一的多糖链中，模拟天然硫酸软骨素中观察到的硫酸化模式，其不同于用迄今描述的合成方法得到的硫酸化。

Description

在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法
发明技术领域
本发明涉及由未硫酸化的软骨素骨架开始，经化学硫酸化生产硫酸软骨素的方法。根据本发明的方法使得能够在同一多糖链内的N-乙酰基-D-半乳糖胺残基的4位或6位同时硫酸化。因此，得到的硫酸软骨素具有天然硫酸软骨素观察到的相同硫酸化模式，其不同于用目前描述的合成方法得到的硫酸软骨素。
本发明还涉及具有经SEC测定的平均分子量(Mw)4-9kDa，以及90%4-硫酸盐和10%6-硫酸盐至10%4-硫酸盐和90%6-硫酸盐的单硫酸化基团分布的硫酸软骨素。
技术背景
硫酸软骨素(CS)是属于糖胺聚糖(GAG)类的复杂天然多糖，其由不同位置硫酸化并通过β1-3键连接的葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)残基形成的二糖序列组成。
CS存在于动物组织中，具有结构功能和生理学功能。根据其来源，CS主要由不同百分比的GalNAc的4位或6位单硫酸化的两种类型的二糖单元(分别为二糖A和C)构成。然而，其中硫酸盐基团以不同数量和不同位置存在的二糖可以以不同百分比存在于多糖链中。CS骨架通常还含有少量未硫酸化的二糖。根据具体的动物来源，含有通过氧原子连接在不同位置例如GlcA的2位和GalNAc的6位(二糖D)、GlcA的2位和GalNAc的4位或者GalNAc的4位和6位(二糖E)的两个硫酸盐基团的二硫酸化二糖可以以不同百分比存在于CS骨架中(Volpi N.J Pharm Pharmacol61，1271，2009。Volpi N.J Pharm Sci96，3168，2007。Volpi N.Curr PharmDes12，639，2006)。
CS中发现的重复二糖单元具有下述化学式：
Figure BDA0000411634440000021
其中，R2、R4和R6独立地是H或SO3 -。
重复二糖单元中的羧酸根和硫酸盐基团的负电荷被钠离子中和。
最通常用于确定不同硫酸化的二糖的缩略词的意义如下文所示：
Di-0S         (R2=H;R4=H;R6=H)
Di-6S(C)      (R2=H;R4=H;R6=SO3-)
Di-4S(A)      (R2=H;R4=SO3-;R6=H)
Di-4,6diS(E)  (R2=H;R4=SO3-;R6=SO3-)
Di-2,6diS(D)  (R2=SO3-;R4=H;R6=SO3-)
Di-2,4diS(B)  (R2=SO3-;R4=SO3-;R6=H)
Di-2,4,6triS  (R2=SO3-;R4=SO3-;R6=SO3-)
来自不同动物源的CS样品也可通过不同分子量和电荷密度表征，电荷密度参数直接与具体的硫酸盐基团相关。
表1显示从不同动物种类的软骨和其他组织提取的天然CS中可见的主要二糖：
牛CS 猪CS 鸡CS 鲨鱼CS 鳐CS 乌贼CS
Mn(kDa) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80
Mw(kDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120
多分散性指数 1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.0-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3
Di-0S 6 6 8 3 3 13
Di-6S 33 14 20 44 39 15
Di-4S 61 80 72 32 43 50
Di-2,6diS ND ND ND 18 13 0
Di-4,6diS ND ND ND 2 1 22
Di-2,4diS ND ND ND 1 1 0
电荷密度 0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.15-1.25 1.08-1.20 1.00-1.20
4S/6S比率 1.50-2.00 4.50-7.00 3.00-4.00 0.45-0.90 1.00-1.40 2.50-4.00
表1-Mn=数均分子量；Mw=重均分子量；多分散性指数=Mw/Mn；电荷密度是每个二糖单元中硫酸盐基团的数目；ND=未确定
如表1中所示，来自陆栖动物的CS具有相似的分子量参数(Mn和Mw)，而其与源自鱼类的CS是不同的，源自鱼类的CS具有更大的分子量值。陆栖动物CS样品还以低于1.0的电荷密度(CD)值为特征，而海生CS样品总是具有超过1.0的CD值。所述特征是由于硫酸化二糖的不同分布引起的。通常，二硫酸化二糖可以以微量存在于陆栖动物CS中，且在天然的CS中，未发现多硫酸化的二糖(三-和四-硫酸盐)。
无三-和四-硫酸化的二糖可容易地通过用软骨素酶ABC消化多糖后的分析证实，软骨素酶ABC是单硫酸化二糖(Di-4S和Di-6S)和未硫酸化二糖(Di-0S)的特异性分解酶，其能消化二硫酸化二糖，但不能水解相应多硫酸化二糖的多糖链。用软骨素酶ABC消化的天然CS的FACE(荧光辅助糖电泳)分析检测不到部分未消化寡糖的特征电泳带，这些部分未消化寡糖可见于来自现有技术的合成或半合成CS中。
众所周知，由于生物合成过程，所有天然CS总是显示同一多糖链上GalNAc的4位或6位的单硫酸化二糖的同时存在(D’Arcy SM等人，Carbohydr Res.1994年3月4日；255：41-59。Hardingham TE等人，Carbohydr Res.1994年3月4日；255：241-54。Cheng F等人，Glycobiology.1992年12月；2(6)：553-61。Chai W等人，Anal Biochem.1996年5月15日；237(1)：88-102。Zaia J等人，Anal Chem.2001年12月15日；73(24)：6030-9。Desaire H等人，Anal Chem.2001年8月1日；73(15)：3513-20)。
已报道CS的与其分子结构相关的不同活性(Kimata K等人，Mol CellBiochem1，211，1963。Volpi N.Biomaterials23，3015，2002。Volpi N，Tarugi P。Biochimie81，955，1999。Volpi N.Biomaterials20，1359，1999。Suzuki S等人，J Biol Chem243，7，1968)。
CS具有抗炎活性，并且基于临床证据和相应的众多临床试验的元分析(meta-analysis)，作为骨关节炎慢作用药物(SYSADOA)，CS目前在欧洲推荐用于骨关节炎(OA)的治疗，特别是膝盖(Jordan KM等，Ann Rheum Dis62，1145，2003)、髋部(Jordan KM等人，Ann Rheum Dis62，1145，2003)和手(Zhang W等人，Ann Rheum Dis66，377，2007)骨关节炎的治疗。在欧洲和USA，CS还单独或与其他成分联合地广泛用作营养制品(McAlindon TE等人，JAMA283，1469，2000。Volpi N等人，Food AnalMeth1，195，2008。Volpi N等人，Separation Sc1，22，2009)。
市售CS是通过从动物组织例如牛和猪组织(Fuentes EP等人，ActaFarm Bonaerense17，135，1998)、鸟组织(Luo XM等人，Poult Sci81，1086-1089，2002)和鱼软骨(Sugahara K等人，Eur J Biochem239，871，1996。Lignot B等人，J Biotechnol103，281，2003)提取而得到的。
市售CS的动物源涉及与致病的可传染的传染原相关的安全问题例如牛海绵样脑病(BSE)，并限制了满足全世界的增长需求的可用的可能来源。所述因素已刺激研究生产CS的替代方法。
为了寻找生产CS的生物技术方法，已进行了大量努力，利用微生物作为前体多糖的来源，所述前体多糖具有与CS部分相似的结构，并进行化学硫酸化，以生产与天然CS类似的CS。
所述策略的一个示例是如EP1304338B1中所述的，从大肠杆菌(E.coli)O5:K4:H4的荚膜多糖K4生产生物技术CS。所述专利公开一方法，其中将液体培养物中生产的多糖K4提取和纯化，随后再溶解并进行酸水解，以消除键和至聚合物的GlcA残基的果糖残基。然后，根据两种不同的化学合成方法，将与CS的未硫酸化骨架(CH)相同的脱果糖聚合物在GalNAc残基的4位或6位硫酸化。所述专利还公开第三种方法，由此得到4位和6位二硫酸化的CS。其中描述的CS具有至少70%含量的硫酸化多糖，其由4位和6位单-和/或二-硫酸化的GalNAc残基、2'位未硫酸化的GlcA残基构成，并且所述的CS具有6-25kDa的分子量(Mw)和0.7-2.0的电荷密度(CD)。
在EP1304338B1中，根据所用的合成策略，作者公开并要求保护下述的可能性：
a)通过选择性保护所有存在的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)残基的6位而合成CS4S，由此得到所有N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)残基仅在4位选择性硫酸化的聚合物。
b)得到聚合物，其中类似地，适当地保护4位存在的羟基，将所有GalNAc残基的6位羟基硫酸化。
因此，在EP1304338B1所述的方法中，同一链的4位或6位不发生同时硫酸化，这不同于天然的CS。
最近的出版物(Bedini E等人，Angew Chem Int Ed Engl.2011年5月18日)描述一种方法，其中将产生的多糖K4的同一链中的GalNAc残基的4位和/或6位硫酸化。然而，Bedini等人描述的生物技术CS具有与天然CS类似的分子量，即大约17kDa，导致天然提取的产品具有典型的低生物利用度。Bedini等人未报道他们所得到产品的任何药理学特性。
附图
图1涉及用软骨素酶C处理的牛来源的天然硫酸软骨素。形成了各种不同长度的寡糖，这证实在同一多糖链上的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。
通过在强阴离子-交换柱上的梯度分离(SAX-HPLC)和232nm的UV检测，得到色谱图。通过0-60分钟的50mM NaCl至最多1.2M NaCl实现梯度。
图2涉及用软骨素酶C处理的猪来源的天然硫酸软骨素。形成了各种不同长度的寡糖，这证实在同一多糖链上的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。
通过在强阴离子-交换柱上的梯度分离(SAX-HPLC)和232nm的UV检测，得到色谱图。
图3涉及用软骨素酶C处理的根据本发明的生物技术硫酸软骨素。对于所述多糖，也形成了各种不同长度的寡糖，这证实在同一多糖链的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。
通过在强阴离子-交换柱上(SAX-HPLC)的梯度分离和232nm的UV检测，得到色谱图。
发明详述
本发明描述CS的生产方法，所述方法从未硫酸化的软骨素骨架(CH)起始，进行化学硫酸化，所述CH通过天然微生物多糖i.l.(K4)的酸水解得到或者由基因改造的大肠杆菌例如大肠杆菌菌株DSM23644直接生产，如专利申请MI2010A001300和MI2010A001264中所述。其中描述的菌株携带突变，该突变致使用于K4果糖化的KfoE基因失活。
根据本发明方法得到的CS呈现天然CS的特征，根据欧洲药典描述的分析方法，具有超过95%的效价。
根据本发明方法得到的CS具有经SEC测量的10-30kDa的平均分子量(Mw)，优选20-30kDa，并具有90%4-硫酸盐和10%6-硫酸盐至10%4-硫酸盐和90%6-硫酸盐的单硫酸化基团分布(表2)。
Figure BDA0000411634440000061
Figure BDA0000411634440000071
＊-o.d.b.:基于干燥的
表2
根据本发明方法得到的CS含有少量(<10%)的未硫酸化二糖和非常低百分比(<5%)的二硫酸化二糖；未鉴定到三硫酸化二糖。
根据本发明方法得到的CS特征在于0.8-1.0电荷密度值。
在本发明一些实施方式中，得到的CS显示4位硫酸化二糖(Di-4S)和6位硫酸化二糖(Di-6S)之间的比率低于1，而在其他方式中，其显示(4S)二糖和(6S)二糖之间的比率大于1。
根据本发明的方法使得能够调控位置特异性硫酸化，以生产具有上文所述范围内的特定4S/6S比率的CS。
本发明还涉及通过非硫酸化软骨素骨架的化学硫酸化生产低分子量硫酸软骨素(CS)(LMW-CS BIOTEC，4,000-9,000道尔顿)，而所述非硫酸化软骨素骨架通过大肠杆菌菌株O5:K4:H4生产的荚膜多糖K4的酸水解得到或者由基因改造的大肠杆菌直接生产。为本发明的目标的低分子量硫酸软骨素以4,000-9,000道尔顿的分子量区间为特征，所述分子量区间明显低于天然来源无论是陆栖动物特别是牛、猪或鸟来源(14,000-26,000道尔顿)或者海生来源例如鲨鱼、乌贼、鳐鱼或多骨鱼(通常>40,000道尔顿)得到的硫酸软骨素的分子量区间。基于所述特性，口服施用后，根据本发明的硫酸软骨素在人体中呈现比高度纯化的天然硫酸软骨素或者用生物技术/化学方法生产的硫酸软骨素更高的吸收，并由此呈现更好的生物利用度。根据本发明的硫酸软骨素具有与高度纯化的天然硫酸软骨素可比的抗炎和抗关节炎活性。根据本发明的硫酸软骨素适合于在治疗炎症和骨关节炎/关节炎方法中使用。
根据本发明的LMW-CS BIOTEC具有经SEC测量的4-9kDa的平均分子量(Mw)，以及90%4-硫酸盐和10%6-硫酸盐至10%4-硫酸盐和90%6-硫酸盐的单硫酸化基团分布。根据本发明的低分子量CS的特征基本与上文表2中报道的较高分子量衍生物的特征一致。
根据本发明的LMW-CS BIOTEC含有少量(<10%)的未硫酸化二糖和非常低百分比(<5%)的二硫酸化二糖；并未鉴定到三硫酸化二糖。
LMW-CS BIOTEC具有0.8-1.0电荷密度值的特征，其与陆栖动物来源的天然CS的电荷密度值是可比较的(参见表1)。
根据本发明的方法还使得能够调控位置特异性硫酸化，以提供具有上文所述范围内的特定4S/6S比率的CS，所述4S/6S比率与天然来源的CS呈现的比率相似。
根据本发明的LMW-CS BIOTEC可被软骨素酶ABC识别和消化，软骨素酶ABC是负责分解代谢特定生物体中天然CS的分解酶，由此，表明所述生物技术LMW-CS的多糖链未进行易于损害天然酶的特异性、高敏感识别的结构修饰。
最后，软骨素酶C消化的LMW-CS BIOTEC产生在同一多糖链上存在与Di-6S单元交替的Di-4S单元的典型寡糖序列，如同天然CS存在的那样(图1、2和3)，软骨素酶C是在6位硫酸化的残基处而非4位硫酸化的残基处水解多糖的内切酶(endolyase)。图1特别描述用软骨素酶C处理的牛来源的天然硫酸软骨素。可看见不同长度的寡糖，其表明在同一多糖链的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。通过在强阴离子-交换柱上的梯度分离(SAX-HPLC)和232nm的UV检测，得到色谱图。在0至60分钟从50mM NaCl至1.2M NaCl实现梯度；
图2描述用软骨素酶C处理的猪来源的天然硫酸软骨素。可看见不同长度的寡糖，其表明在同一多糖链上的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。通过在强阴离子-交换柱上的梯度分离(SAX-HPLC)和232nm的UV检测，得到色谱图；
图3描述用软骨素酶C处理的本发明的LMW-CS BIOTEC。再次，可看见不同长度的寡糖，其表明在同一多糖链上的GalNAc残基的4位或6位存在硫酸盐基团。
通过在强阴离子-交换柱上的梯度分离(SAX-HPLC)和232nm的UV检测，得到色谱图。
通过与欧洲药典第一标准高度纯化的牛来源的天然CS相比，已评价了根据本发明的LMW-CS BIOTEC在人体的口服吸收和生物利用度。这是特别重要的，因为已描述在人细菌群落而不是动物细菌群落中存在能生物合成特异性降解CS(和低分子量衍生物)的分解酶的细菌(Ahn MY等人，Can J Microbiol1998；44：423-9)。
通过已知的技术，已在人体中评价LMW-CS BIOTEC的口服吸收和生物利用度。
利用特异性试验，评价根据本发明的LMW-CS BIOTEC的可能抗炎活性，所述试验例如：
抑制炎症过程中白细胞产生的蛋白水解酶，即人白细胞弹性蛋白酶的能力(Kostoulas G.等人，Biol Chem378，1481，1997；Volpi N.Chem BiolInteract105，157，1997；Ying QL等人，Am J Physiol.272，L533,1997)；抑制人中性白细胞中的抗趋化性活性、吞噬性活性、溶菌酶释放和自由基对生物膜的损害的能力(Matzner Y.等人，Thromb Haemost52，134，1984；Ronca F,Palmieri L等人，骨关节炎软骨(Osteoarthritis Cartilage)6SupplA，14，1998)。
通过与参照化合物高度纯化的牛来源天然CS相比，对根据本发明的LMW-CS BIOTEC进行所述测试，所述高度纯化的牛来源天然CS是欧洲药典的第一标准。
还在动物模型“佐剂性关节炎(AA)模型”中评价了根据本发明的LMW-CS BIOTEC的抗关节炎性质，该模型是科学界广泛公认的，并已发表了大量科学论文。再次，将结果与先前用参照分子(欧洲药典标准，高纯度的天然牛来源CS)得到的结果相比较(Volpi N.J Pharm Sci96，3168，2007)。事实上，OA和类风湿性关节炎(AR)的动物模型是研究所述病理过程的有用工具。“佐剂性关节炎”(AA)是最常用的模型之一。大鼠的AA是多关节炎的试验模型，其已广泛用于测试临床试验之前和之后的众多抗关节炎物质和药物(Bendele A等人，Toxicol Pathol27，134，1999；RovenskyJ等人，Rheumatol Int.31，507，2011；Bauerova K等人，Interdisc Toxicol4，101，2011)。已进行了很多研究，其中在动物上，用AA试验得到的数据被与人体中的结果相比较(Kannan K等人，Pathophysiology12，167，2005)。
所述聚合物链的4位或6位的同时单硫酸化、纯度和低分子量赋予根据本发明LMW-CS BIOTEC更高的口服吸收和更好的生物利用度。
本发明一方面涉及根据本发明的CS和制药或营养制品领域可接受载体的组合物。所述组合物可配制成各种固体形式例如片剂、硬胶囊、软明胶胶囊或用于饮用的粉末混合物或者液体形式(溶液剂)，优选配制为用于肠胃外或口服施用的药物或营养制品形式。所述组合物可含有其他活性或非活性成分。
组合物还可优选含有至少一种下述物质：氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐、N-乙酰基氨基葡萄糖、透明质酸、肝素、角蛋白、皮肤素(dermatin)、甲基磺酰甲烷、叶酸盐/酯和还原的叶酸盐/酯、B族维生素、S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)、抗坏血酸或抗坏血酸锰。根据需求，可将所述组合物以有效量施用至患者。
例如，但不是限制其应用，可将本发明描述的CS或组合物以100-3000mg/天，优选1000-2000mg/天，并更优选1250-1750mg/天的量施用，每天将其分成大约600mg的双剂量或者400mg的三剂量。
本发明还涉及所述的CS或其组合物作为药物或营养补剂的成分用于治疗或预防骨关节炎或者用于维持肌肉与骨骼健康的用途。
例如，可将描述的CS或其组合物用于制备药物制品、膳食添加剂或营养补剂，其用于预防和/或治疗髋部、手或膝盖的骨关节炎及其主要症状(疼痛、关节肿胀、炎症)、阿尔茨海默氏病、微生物感染、动脉硬化和骨质疏松，以及作为抗肿瘤治疗和组织再生(包括神经组织)的辅助剂。
根据本发明的方法的一个有利特征是GalNAc残基4位或6位的硫酸化在同一多糖链中同时发生，模拟天然CS中观察到的硫酸化模式，不同于迄今描述的合成方法得到的CS。通过用两种不同酶系统即软骨素酶ABC和软骨素酶C得到的数据证实了这一方面，软骨素酶ABC能消化在6位和4位硫酸化的单元以及未硫酸化的单元，而软骨素酶C是能相应水解在6位硫酸化的残基和未硫酸化残基但对于在4位硫酸化残基不能进行相似溶解裂解的内切酶(endolyase)。根据Joon-Soo Sim等人描述的(J.Chromatography B，2005，818卷，133-139)，用HPLC色谱技术分析单独用软骨素酶ABC和软骨素酶C得到的消化产物，定性和定量地表明二糖Di-0S、Di-4S和Di-6S，以及未被酶消化的任何寡糖的存在。
用软骨素酶ABC消化的产物分析表明产品几乎完全消化，形成未硫酸化二糖Di-0S、单硫酸化二糖Di-4S和Di-6S及微量二硫酸化二糖Di-4,6S。
然而，对用软骨素酶C消化的产品进行相同分析清楚地显示存在二糖序列和上述所有寡糖序列，表明由于在同一链上存在4位硫酸化的GalNAc，该酶不能完全裂解多糖。这是因为当硫酸盐基团存在于4位时，酶不能发挥作用，并由此剩下寡糖残基。所述残基还可通过色谱和电泳技术例如凝胶色谱和毛细管电泳(CE)清楚地检测到，例如如同图1、2和3的色谱描记图中所示，图1、2和3涉及天然CS(牛和猪)和根据本发明得到的生物技术CS的软骨素酶C消化。它们含有各种不同长度的寡糖，其中硫酸盐基团存在于同一多糖链上的GalNAc残基的4位或6位。
所有这些性质使得用根据本发明方法得到的CS具有天然CS的结构，其具有下述特征：
a)所有或几乎所有GalNAc残基在6位或4位被单硫酸化；
b)根据所用的合成条件，残基4S和6S(4S/6S)的比率与陆栖动物和鱼来源的CS中发现的比率完全类似。
通常，可利用大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4(EP1304338B1)天然生产的荚膜多糖K4或者具有未硫酸化软骨素(CH)结构的其它多糖作为起始底物，得到根据本发明的CS。
在第一种情况下，将从大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4的培养液中得到的多糖K4通过热酸(thermoacid)水解而在发酵末期脱果糖化，并且根据修改的Rodriguez和Jann描述的方法(Eur.J.Biochem.117,117-124,FEBS1988)纯化软骨素。
或者，例如从MI2010A001300中所述的大肠杆菌(E.coli)菌株DSM23644的培养物中得到起始多糖，由于负责K4果糖化的KfoE基因中诱导的突变，菌株DSM23644产生与天然未硫酸化CH相同的多糖。在该情况下，不必脱果糖化；然后，保留热酸水解步骤，以消除一些杂质，包括细菌内毒素，由于处理，内毒素沉淀。然后，通过离心、透析和喷雾干燥纯化软骨素(CH)。
将通过连续离心从生物质中分离的培养上清液进行水解。通过在90-95℃和pH2.8-3.0温孵30-50min，完成K4的部分水解和脱果糖化。
温孵期后，将得到的混悬液在低于40℃优选20-30℃的温度冷却，以终止水解反应，并同时将pH调至4-4.5。将得到的混悬液依次经连续离心、超滤和最终经30kDa膜用水的透析而进行净化。
将透析的渗余物(大约起始培养肉汤体积的1/10)过滤，并最终用喷雾干燥器干燥，得到待用于硫酸化过程的具有CH结构的多糖。根据毛细管电泳(CE)或HPLC测定的，得到的CH具有基于干物质的80-90%(w/w)的效价。
由此得到的CH为钠盐形式，并且为了要硫酸化，需要转化成游离酸或其盐。
根据本发明的硫酸化方法使得同一多糖链的GalNAc残基的4位或6位被随机单硫酸化，该方法包括同时涉及GalNAc的4位和6位的原酸酯的形成，以及其随后重排为酯，令人惊奇地，该重排可被调控以主要释放4位或6位的羟基，由此，使得能够选择性硫酸化这些羟基。
根据本发明的方法包含下述步骤：
a)将软骨素钠盐转化成游离酸，或者替代地，转化成其与季铵离子例如四甲基-、四乙基-或四丁基-铵的盐，或者与吡啶的盐。优选使用四丁铵(TBA)盐。
或者，在甲醇和乙酰氯中反应后，将酸形式的软骨素(CH)转化成其甲酯。
b)在酸催化剂存在下，使软骨素盐或软骨素甲酯与其中R选自氢、甲基、乙基或苯基并且R1选自甲基或乙基的式RC(OR1)3的原酸酯反应，由此得到环状原酸酯，该环状原酸酯由GalNAc残基的4和6位醇官能团移除起始原酸酯的两个烷氧基而形成。在该步骤得到的化合物中，所有或几乎所有存在的二糖单元具有式I所示的环状原酸酯结构，
Figure BDA0000411634440000131
其中R、R1如上文所定义。
可使用的原酸酯的示例是原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯或原苯甲酸三甲酯。优选使用原乙酸三甲酯或原乙酸三乙酯。原乙酸三甲酯的使用是特别优选的。
选自樟脑磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸或砜树脂的酸，优选樟脑磺酸或磺酸树脂，更优选樟脑磺酸用作酸催化剂。
c)在吡啶或有机叔碱例如三乙胺或三异丙基乙胺，以及催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，通过用式(R2CO)2O的羧酸酸酐酰化而保护GlcA残基的2’和3’位的醇基团，其中R2优选选自甲基、乙基或丙基，得到产物，其中软骨素中可见的重复二糖单元具有2’和3’酰化的环状原酸酯结构，其由式II所示
Figure BDA0000411634440000141
其中，R、R1和R2如上文所定义。
优选使用乙酸酐。
d)环状原酸酯向酯的重排，在水溶性有机酸和水的混合物中或者仅在水中完成反应。该重排随机发生于多糖序列的不同GalNAc单元，其可以被调控以促进一个或另一个羟基(分别在4或6位)的释放，同时在剩余位置(分别在6或4位)与所用的可溶性有机酸形成酯。结果是在同一多糖链上，两种不同二糖单元形成，即：
-具有其中6、2’和3’位羟基被酰化而4位羟基游离的结构的那些，所述单元被式IIIa表示；
Figure BDA0000411634440000142
Figure BDA0000411634440000151
其中，R和R2如上文所定义；或者
-具有其中4、2’和3’位羟基被酰化而6位羟基游离的结构的那些，所述单元被式IIIb表示；
Figure BDA0000411634440000152
其中，R和R2如上文所定义。
通过将反应在20-40℃的温度下优选室温下进行1-48小时、优选3-38小时，并更优选38小时，令人吃惊地观察到较大量的具有6位游离羟基的化合物，而当反应在40-70℃、优选60℃的温度下进行1-48小时、优选3-38小时，并更优选18小时时，具有4位游离羟基的产物占优势。水溶性有机酸选自乙酸、甲酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸或阳离子树脂例如Sepra SCX50μm65A，优选乙酸或丙酸，并更优选乙酸。
d)随后，根据EP1304338B1中已描述的方法，用DMF中的吡啶三氧化硫硫酸化，或者用DMF-三氧化硫络合物硫酸化，以得到CS，根据所用的重排条件和随后其中存在的结构IIIa和IIIb的百分比，该CS将在二糖IIIa的4位或者二糖IIIb的6位被同时且不同地硫酸化。硫酸化反应后，根据EP1304338B1中描述的步骤，通过碱处理，除去GlcA残基的2’和3’位以及GalNAc残基的4位或6位上存在的酰基，得到4位和6位部分硫酸化的CS钠盐。
方法中所用的一些技术引起多糖链的解聚，从而生产特征为低分子量(LMW)的在GalNAc残基的4位或6位硫酸化的CS。
利用酸作为反应的溶剂或共溶剂，在原酸酯重排阶段，软骨素也可解聚。在该阶段高浓度的酸引起多糖链的断裂，从而产生4-9kD的低分子量链。
用大鼠的动物关节炎试验模型(佐剂性关节炎AA)评价用所述方法得到的4,000-9,000道尔顿的LMW-CS BIOTEC的功效，并且用900mg/kg每天口服治疗后，将结果与相同试验模型中用提取来源的药用级天然CS的结果相比较(Bauerova K.等人，骨关节炎软骨(OsteoarthritisCartilage)2011，印刷前的电子公开版)。
通过单一皮内注射不完全弗罗因德佐剂中的奶酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)诱导AA。试验包含健康动物、未治疗的关节炎动物和治疗的关节炎动物。在治疗的动物中，将一组动物进行如下预处理：诱导关节炎之前，一天施用900mg/kg LMW-CS BIOTEC，持续14天；诱导AA后，再持续28天。仅仅在诱导AA后，28天期间，将另一组动物每天用900mg/kg LMW-CS BIOTEC治疗。
在预处理动物中，后爪形成的水肿显著减轻。试验中，与未治疗的对照相比，用根据本发明的LMW-CS BIOTEC(900mg/kg/天)预处理显著减轻水肿。与未治疗的关节炎对照相比，用LMW-CS BIOTEC预处理还恢复大约8-15%的体重。
根据肿胀和关节周红斑增加的水平，将关节炎的严重性定量化。在降低关节炎打分中，作为预处理和治疗施用的900mg/kg/天LMW-CSBIOTEC都是显著有效的。并且，整个亚急性期(诱导AA后第14天至第28天)，预处理是有效的，而治疗仅在中长期即诱导AA后第21天至第28天是有效的，在急性期(诱导AA后的前14天)是无效的。
发生于关节炎/骨关节炎过程中的慢性炎症过程的结果---氧化性应激在动物模型中在急性期和亚慢性期显著增加。增加的氧化应激诱导血浆中内源性抗氧化剂高消耗，并由此引起以总抗氧化剂状况测量的血浆抗氧化剂容量降低。用LMW-CS BIOTEC预处理在校正动物模型中的总抗氧化剂状况方面是有效的，显著降低内源性抗氧化剂的消耗。与未治疗的动物相比，关节组织匀浆中测量的与氧化应激相应增加并由此认为是氧化应激良好标志的γ-谷氨酰转移酶的活性证实在试验诱导多关节炎动物中显著更高，并且在用LMW-CS BIOTEC治疗的动物中显著更低。
促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)在试验诱导的关节炎动物模型中显著增加，IL-6在急性期急剧增加，呈现比健康对照高10倍的水平。在急性期，LMW-CS BIOTEC的治疗效果从第14天已经很明显，与患有AA的动物相比，降低大约30-40%的IL-6浓度。
炎症蛋白的基本标志即C-反应蛋白(CRP)具有与IL-6非常相似的时间曲线(profile)。在急性期，试验关节炎模型中的增加比健康对照高大约7.5倍。如同其对IL-6水平的作用，在急性期观察到LMW-CS BIOTEC对CRP的作用，血浆CRP浓度显著降低。
对于中性白细胞的吞噬性活性和细胞内的氧化增加，观察到的健康对照和患诱导的实验AA的对照之间的差异在增加的吞噬性活性方面是显著的。基于预处理的施用LMW-CS BIOTEC诱导吞噬作用和突发性氧化作用的显著降低。
根据本发明的LMW-CS BIOTEC显著降低关节炎过程的严重性和慢性炎症过程产生的氧化应激。用LMW-CS BIOTEC预处理在整个亚急性期是有效的，而自AA发作第1天的治疗仅在慢性期是有效的。总抗氧化剂状况和γ-谷氨酰转移酶活性的增加证实所述效果。作为预处理施用的LMW-CS BIOTEC还降低促炎细胞因子、血浆内C-反应蛋白、中性白细胞的吞噬性活性和细胞内突发性氧化作用的产生。最后，在急性期和亚慢性期，LMW-CS BIOTEC已表明在延缓实验性关节炎/骨关节炎进程方面是有效的，并且在降低疾病的标志物方面是有效的，因此，支持其有益活性，与参照化合物相似。
将通过下面的实施例进一步解释本发明。
实施例1：软骨素四-烷基铵或吡啶
Figure BDA0000411634440000171
盐的制备
由多糖K4或大肠杆菌(E.Coli)菌株DSM23644发酵得到的多糖起始，经上文所述的方法水解、纯化和干燥后得到CH钠盐，将CH钠盐溶解于含水媒介中。完全溶解后，将溶液引入到装载有阳离子-交换树脂例如Amberjet1200H、Rohm和Haas等的柱子中。
收集在pH1.5-4.0或者优选在pH1.5-2.0洗脱的流分，并加入选自四甲基铵、四乙基铵和四丁基铵或者吡啶
Figure BDA0000411634440000181
的离子的水溶液，直至得到6.0-8.0的pH或者优选6.5-7.0的pH。然后，通过冷冻干燥或者喷雾干燥，将溶液蒸发至完全干燥，得到相应的盐。
实施例2：保护GalNAc部分的羟基化官能团(4和6)形成相应的环状甲基原酸酯CH(CH-cMOE)
将自软骨素得到的盐例如四丁基铵(TBA)盐与二甲基甲酰胺(DMF)在烧瓶中分别以5.2g和130ml的量混合。将8.49g原乙酸三甲酯滴到烧瓶中后，加入300mg樟脑磺酸，并将反应混合物在70℃保持72h。然后，将反应物真空蒸发，并进一步在40℃的干燥炉中保持20h，以得到固体形式的6.1g软骨素-MOE TBA。
对反应产物进行分析，以确保实现了保护。用SEC-HPLC确定起始产物的消失和具有较高分子量(48KDa)的新产物的出现。通过用能水解游离而不是保护的CH的酶――软骨素酶ABC消化完成的分析表明起始CH分子未保护的百分比低于15%。
实施例3：软骨素环状原酸酯的2’,3’乙酰基化(2’,3’二乙酰基CH-cMOE)
将保护为环状甲基原酸酯(CH-cMOE)的来自前述步骤的软骨素(4.79g)引入到反应烧瓶中，烧瓶中含有23.95ml乙腈、15.69ml三乙胺(TEA)、6.21ml乙酸酐和78.96mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。在25-26℃搅拌2小时后，加入94ml异丙基醚，以得到粘稠固体物，然后，将其经滤纸过滤，并在45℃的干燥炉中真空干燥24h。由此得到的中间体环状原酸酯具有粉红色固体的外观。
实施例4：环状甲基原酸酯重排为的酯，主要形成4位乙酸酯且6位为游离羟基(参见图IIIB)
将前一步骤得到的中间体(2.42g)引入到反应烧瓶中，向其中加入18.8ml96%的乙酸和2.35ml去矿物质水。将混合物在室温搅拌38h后，加入100ml0.6M的NaCl溶液，并将混合物经5kDa的膜超滤和透析，以得到pH3.32的渗余物。
将溶液在45-50℃真空蒸发；在干燥炉中进一步干燥过夜后，得到1.38g玻璃状固体外观的产品。
实施例5：环状甲基原酸酯重排为酯，主要形成6位乙酸酯且4位为游离羟基(参见图IIIA)
将前一步骤得到的2.42g中间体环状原酸酯引入到反应烧瓶中，烧瓶中含有14.52ml96%的乙酸和9.8ml去矿物质水，并加热至60℃，保持17.5h。然后，加入100ml0.6M的NaCl溶液，并将溶液(pH2.27)超滤和透析，得到pH3.56的渗余物。
将溶液在45-50℃真空蒸发，并在干燥炉中进一步干燥过夜后，得到1.12g玻璃状固体状外观的产品。
实施例6：用三氧化硫吡啶络合物制备硫酸软骨素
将根据实施例4中所述得到的中间体(0.76g)引入到含有46.0ml DMF的烧瓶中，将混合物在30℃搅拌10min。加入0.72g三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000192
并当原料已溶解时(大约10min)，将溶液在30℃搅拌1h。然后，再加入0.72g三氧化硫吡啶后，再加入0.72g三氧化硫吡啶将溶液在30℃再搅拌1h。
通过在室温下，将混合物倒入到50ml10%NaHCO3的水溶液(pH7.81)中而终止反应。过滤后，将溶液真空(10mBar)蒸发至干，将残留物再用150ml0.6M NaCl溶解，并最终，将溶液超滤。
6次体积变化后，渗余物具有9.22的pH；用1N HCl调pH至6.7，并继续超滤，用去矿物质水代替0.6N NaCl溶液。
将得到的溶液再超滤2体积，然后透析至20ml的体积。将透析溶液真空浓缩至干(10mBar，45℃)。
将由此得到的产物(0.88g)用34.0ml0.2N苏打(NaOH)溶解，并在搅拌下加热至40℃，保持2h。最后，将溶液用0.6M氯化钠水溶液稀释，经5kDa的膜超滤，并用去矿物质水透析。将渗余物真空(45℃，10mBar)浓缩至干，得到0.67g硫酸软骨素。用HPLC-SEC测量具有29kDa分子量的终产物，显示：
-软骨素酶ABC的消化率超过95%；
-18/82的4S/6S比率；
-总电荷密度值大约0.9；
-用软骨素酶C仅部分消化，其由寡糖的存在而证实，这是由在同一多糖链上存在4-硫酸化和6-硫酸化单元(本发明的特征)而导致的。
实施例7：用三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000201
络合物制备硫酸软骨素
将如实施例5中所述得到的中间体(1.12g)引入到含有67.2ml DMF的烧瓶中，将混合物在50℃搅拌10min。加入1.05g三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000202
并当原料已溶解时(大约10min)，将溶液在50℃搅拌1h。然后，再加入1.05g三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000203
将溶液在50℃再搅拌1h。
通过在室温(RT)下，将混合物倒入到60ml10%NaHCO3的水溶液中(pH7.81)而终止反应。过滤后，将溶液真空(10mBar)蒸发至干，并将残留物再用30ml0.6M NaCl溶解。最终，将溶液超滤。
6体积变化后，渗余物具有9.22的pH；用1N HCl调pH至中性(7.5)，并继续微孔过滤，用去矿物质水代替0.6N NaCl溶液。
将得到的溶液再超滤2体积，然后透析至20ml体积。将透析溶液真空浓缩至干(10mBar，45℃)，得到1.53g产品。
将残留物溶解于59.6ml0.2N苏打(NaOH)中，并在60℃加热2h。最后，将溶液用0.6M氯化钠水溶液稀释，经3kDa的膜超滤，并用去矿物质水透析。将渗余物真空(45℃，10mBar)浓缩至干，得到0.76g硫酸软骨素。
由此得到的产物具有HPLC-SEC测量的15.4kDa分子量；软骨素酶ABC的消化率超过95%；82/18的4S/6S比率；和总电荷密度值大约1.09。用软骨素酶ABC实现的几乎完全消化(超过95%的产物被裂解)和用软骨素酶C的降低的消化率为本发明的特征，其表明在同一多糖链上4-硫酸化和6-硫酸化单元的存在。
软骨素酶ABC超过95%的消化率还表明本发明涉及的CS多糖链中无多硫酸化(三-和四-硫酸化的)二糖。
实施例8：软骨素(CH)甲酯的制备
向在3升烧瓶中在室温下搅拌2小时的1.3L甲醇和14.43g乙酰氯的溶液中，加入10.0g酸形式的CH，并将得到的混悬液搅拌20小时。
当所述时间过去后，将混悬液过滤，并将固体物用100ml甲醇(2x50ml)洗涤，并在50℃下真空干燥，得到9.4g干燥固体物。
以相同步骤将反应再重复一次，并当第二次结束时，将混悬液在0-5℃冷却60分钟后，过滤。将得到的固体物用冷甲醇(0-5℃)洗涤，并在50℃的干燥炉中真空干燥3小时，得到6.3g固体物。
实施例9：通过形成原酸酯保护CH甲酯的GalNAc部分的羟基化官能团(4和6)
将150ml二甲基甲酰胺(DMF)和6.0g前一步骤中得到的产物引入具有氯化钙阀和氮气流的500ml烧瓶中。然后，加入20.06g原乙酸三甲酯和0.71g樟脑磺酸。将得到的溶液在50℃(内温)加热18小时。
在18小时末，将得到的溶液在RT冷却并真空浓缩，得到8.5g产品。
实施例10：实施例9得到的产品的2’,3’羟基的乙酰化
在室温下，将8.0g前一步骤得到的产品、40ml DMF、28.6g三乙胺、17.15g乙酸酐和96mg二甲基氨基吡啶引入到具有氯化钙阀和氮气流的250ml烧瓶中。
将得到的溶液搅拌3小时；当所述时间结束时，将150ml异丙醚加入到烧瓶中，无定形固体物沉淀。通过倾析除去水，并将100ml异丙醚加入到固体物中，并搅拌1小时。然后，将固体物过滤，并用50ml异丙醚洗涤，并在40℃真空干燥，得到8.52g产物。
实施例11：从实施例10得到的原酸酯的重排
将7.0g前一步骤得到的产物、72.8g冰乙酸和8.7ml水引入到250ml烧瓶中，得到溶液，将溶液在RT下搅拌3小时。然后，将溶液用0.6M氯化钠稀释成150ml，并将得到的溶液经5KD膜超滤而纯化。透析后，将得到的溶液真空浓缩，并得到6.7g固体产物。
实施例12：三乙酰基甲酯的硫酸化
将670mg前一步骤得到的产物引入到具有氮气流和氯化钙阀的含40ml DMF的250ml烧瓶中。
将630.44g三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000221
络合物加入到得到的溶液中，并将得到的溶液在50℃(内温)加热1小时。然后，将630.44g三氧化硫吡啶
Figure BDA0000411634440000222
络合物在同一温度下，加入到烧瓶中，并再搅拌1小时。
当所述时间结束时，将溶液冷却至RT，并将40ml3%NaHCO3在相同温度下，加入到烧瓶中，产生溶液，将溶液真空浓缩，得到2.3g与无机盐混合的固体物。将得到的产物稀释到150ml0.6M的氯化钠中，并经5KDa膜超滤。
透析后，将得到的溶液真空浓缩，并得到1.32g固体产物。
实施例13：得到硫酸软骨素
将前一步骤得到的产物引入到含有33ml0.2M苏打的100ml烧瓶中。将溶液在40℃(内温)加热2小时后，将其冷却至RT，并用1M HCl中和。
将溶液稀释到150ml0.6M的氯化钠中，并经5KDa膜超滤。透析和在真空中浓缩溶液后，得到350mg固体物。
在本实施例中得到的产物具有11KDa的分子量、47/53的4S/6S比率和0.9的电荷密度值。
实施例14：GalNAc部分4和6位羟基官能团上环状原酸酯的形成， 同时伴随多糖链的解聚
在环境温度(20-25℃)下、在氮气流中，将根据上文所述得到的软骨素四丁铵盐(4.07g；6.535mmols)在二甲基甲酰胺(101ml)中的混悬液保持搅拌。加入原乙酸三甲酯(9.03ml，71.89mmols)和樟脑磺酸(1.82g；7.84mmols)。将混悬液加热至70℃(内温)，并且仅几分钟后，观察到完全溶解。在搅拌条件下，将反应物在相同温度下保持18-20h。第二天，通过真空蒸发除去溶剂而浓缩反应物，得到13.67g浅黄色橡皮样残留物形式的产物。
消化后，残留的未保护软骨素的含量是4.6%。FTIR中相应的信号表明原酸酯的存在。
根据上文所述，将由此得到的产物用于随后的步骤中，直到得到GalNAc残基的4位或6位硫酸化的LMW-CS BIOTEC。
实施例15：软骨素环状原酸酯打开成酯，主要形成GalNAc部分的4 位或6位乙酸酯，并且同时多糖链解聚
将软骨素原酸酯(3.00g)、水(3.14ml)和乙酸(26.25g；437mmols)引入到250ml的三颈烧瓶中。将得到的混悬液在环境温度(20-25℃)加热36h。然后，加入水，以形成100ml总体积的溶液。将由此得到的溶液超滤(5KD膜)。将收集的渗余物透析成小体积(20ml)，然后真空蒸发而浓缩至干，得到相应于目标产物(三乙酰软骨素)的1.55g固体残留物。
根据上文所述，将由此得到的产物用于随后的步骤中，直到得到GalNAc残基的4位或6位硫酸化的LMW-CS BIOTEC。
实施例16：在大鼠中诱导关节炎(佐剂性关节炎，AA)，并用LMW-CS BIOTEC治疗
将40只150-190g重量的Lewis大鼠随机分成四组，每组10只动物，在维持于22±2℃温度的环境中，圈养于聚丙烯笼中，并用标准实验室饲料喂养，同时不受限制的喝水。
试验组如下：
1)未治疗的健康对照组。
2)患有佐剂诱导关节炎(AA)的未治疗对照组。
3)诱导AA后(试验的第0-28天)，以900mg/天/kg体重的剂量，用LMW-CS BIOTEC口服治疗28天的关节炎大鼠组。
4)以900mg/天/kg体重的剂量，用LMW-CS BIOTEC口服预处理组，其在根据协会章程诱导前处理14天并在诱导AA后处理28天(试验的第-14天至+28天)。
通过单次皮内注射1ml由在不完全弗罗因德佐剂中加热灭活的奶酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)构成的混合物而在大鼠中试验性诱导关节炎。
以20mg/ml的浓度，将LMW-CS BIOTEC溶解于蒸馏水中，并作为单一日剂量经管司法口服施用。
在28天治疗末，将大鼠在麻醉条件下处死，并收集血液和相关的组织，并分析，以评价研究中观察到的参数。
实施例17：通过记录形成的水肿、体重和关节炎打分，评价LMW-CS BIOTEC在大鼠AA中的作用
用适合于测量的测径器，通过观察后爪体积的增加而测量由于关节炎形成的水肿。AA诱导前和在研究的第28天，进行测量。
AA诱导前和治疗末期(第28天)，测量大鼠的体重。治疗期间，通过比较不同组的不同体重增加，评价治疗对该参数的作用。
通过就爪关节肿胀和关节周围的红斑程度打分而评价关节炎评分。对于每个动物，将关节炎评分或者关节X线照片测量为水肿(用ml，最大8分)加前爪的直径(用mm，最大5分)加平行于脊柱测量的施用奶酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)位点的结痂直径(用mm，最大5分)的总和。
实施例18：LMW-CS BIOTEC对作为AA诱导的氧化应激标志的γ-谷 氨酰转移酶活性的作用
通过测量用LMW-CS BIOTEC治疗末期，从大鼠采集的关节组织匀浆的γ-谷氨酰转移酶活性而评价氧化应激。认为γ-谷氨酰转移酶是氧化应激的标志。
在从后爪采集的组织匀浆中测定细胞γ-谷氨酰转移酶的活性，并用经Ondrejickova等人(Cardioscience1993；4：225-230)改良的Orlowski和Meister方法(Orlowski M，Meister A。γ-谷氨酰循环：氨基酸的可能转运系统(The gamma-glutamyl cycle:a possible transport system for aminoacids).Proc Natl Acad Sci USA1970；67：1248-1255)评价。用UltraTuraxTP18/10(Janke&Kunkel，德国)，以1:9(w/v)溶液，将样品在缓冲液(2.6mM NaH2PO4、50mM Na2HPO4、15mM EDTA、68mM NaCl，pH8.1)中于0℃匀化1min。分别以2.5mM和12.6mM的终浓度，将底物8.7mMγ-谷氨酰对-硝基苯胺和44mM甲硫氨酸加入到65%的异丙醇中。在37℃温孵60min后，通过加入2.3ml冷甲醇终止反应，并将测试管在5000rpm离心20min。在0.5cm比色皿中，用Specord40分光光度计(Jena，德国)在406nm测量上清液的吸光度。无底物或受体的反应混合物用作参照样品。
实施例19：通过测量血浆中促炎细胞因子(I-1，IL-6)和C-反应蛋白 (CRP)的水平而评价LMW-CS BIOTEC对AA诱导的炎症状态的作用
试验末期，从大鼠采集血液样品，并将其置于含有肝素作为抗凝剂的试管中；通过离心，将血浆从由血细胞构成的血球部分分离，并利用特定的市售试剂盒，借助ELISA技术，测试炎性细胞因子(IL-1、IL-6)。
用ELISA试剂盒(Immunology Consultant Laboratories，Inc.，ICL)，测试大鼠血浆中的C-反应蛋白。利用抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(HRP)的活性，评价生物素轭合的次级抗体与抗-大鼠C-反应蛋白抗体的反应。然后，利用Labsystems Multiskan RC读板仪，在450nm测量甲基-联苯胺与键合至免疫复合物的HRP的反应。根据ELISA试剂盒的指导，利用标准校准曲线计算结果。
实施例20：LMW-CS BIOTEC对AA诱导的吞噬性活性和中性白细胞 突发性氧化作用的影响
在评价它们的吞噬性活性和突发性氧化作用的末期，从大鼠血液中提取中性白细胞群。利用荧光素标记的受调理素作用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SPA-FITC)(Invitrogen Molecular Probes，USA)，在受控条件下，完成吞噬作用(即摄食细菌)的测量。然后，将等份的肝素锂中的外周血液用氢化乙啡啶(Invitrogen molecular probes，USA)(15.75mg的5ml二甲基甲酰胺溶液，默克，德国)在37℃下温孵15分钟。用SPA-FITC在37℃下处理15分钟后，通过将试管置于冰上而中断反应。随后用由冷氯化铵/氯化钾构成的溶菌溶液(200ml去离子水、1.658gNH4Cl、0.2g KHCO3和7.4mg Na2EDTA，pH7.2-7.4)，进行15min的红细胞溶解。吞噬细胞的平均百分数表示摄入至少一个SPA-FITC颗粒的粒细胞的百分数，并且呼吸爆发的平均百分数表示乙锭(ethidium)标记的粒细胞的百分数。

Claims (19)

1.用于制备其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-位或6-位单硫酸化的硫酸软骨素钠盐的方法，所述方法包含下述步骤：
a.将软骨素钠盐转化成其游离酸或其与选自四甲基铵、四乙基铵或四丁基铵的季铵阳离子的盐或者转化成吡啶盐或甲酯；
b.在酸催化存在下，使步骤a)中得到的化合物与其中R选自氢、甲基、乙基或苯基并且R1选自甲基或乙基的式RC(OR1)3的原酸酯反应，得到其中软骨素中存在的重复二糖单元具有式I结构的化合物，
Figure FDA0000411634430000012
其中R、R1如上文所定义；
c.在吡啶或选自三乙胺或三异丙基乙胺的有机叔碱，以及4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，通过与其中R2选自甲基、乙基或丙基的式(R2CO)2O的酸酐反应而保护前面步骤中获得的化合物的葡糖醛酸单元的2’和3’位羟基，得到其中软骨素中存在的重复二糖单元具有式II结构的化合物，
Figure FDA0000411634430000021
其中，R、R1和R2如上文所定义；
d.用水溶性有机酸使步骤c)中得到的产物中存在的原酸酯官能团重排，得到酯衍生物，在该酯衍生物中，多糖中的重复GalNAc单元由具有式IIIa或IIIb的三酰基衍生物构成；
Figure FDA0000411634430000022
其中，R和R2如上文所定义；
e.将步骤d)中得到的化合物单-硫酸化，然后除去先前步骤中得到的化合物IIIa和IIIb中存在的O-酰基基团。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)的软骨素钠盐是由大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4培养液产生的荚膜多糖K4或者大肠杆菌(E.coli)菌株DSM23644培养液产生的多糖开始而得到的。
3.权利要求1的方法，其中步骤b)用原酸酯进行，所述原酸酯选自原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯或原苯甲酸三甲酯，优选原乙酸三甲酯或原乙酸三乙酯，更优选原乙酸三甲酯。
4.权利要求1的方法，其中步骤b)的酸催化用选自樟脑磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸的酸或者用砜树脂完成，优选用樟脑磺酸或者磺酸树脂，更优选用樟脑磺酸完成。
5.权利要求1的方法，其中步骤c)用乙酸酐进行。
6.权利要求1的方法，其中步骤d)在20-40℃、优选在室温进行。
7.权利要求1的方法，其中步骤d)在40-70℃、优选在60℃进行。
8.权利要求1的方法，其中步骤d)在水/水溶性有机酸混合物或者单独的水中进行。
9.权利要求8的方法，其中有机酸选自乙酸、甲酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸或者丙酸树脂，优选乙酸或丙酸，更优选乙酸。
10.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐具有10-30kDa的平均分子量(Mw)。
11.权利要求10的方法，其中硫酸软骨素钠盐具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。
12.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率低于1。
13.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率高于1。
14.硫酸软骨素钠盐，其根据权利要求1的方法得到。
15.生物技术来源的具有4000-9000道尔顿平均分子量的硫酸软骨素，其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-或6-位单硫酸化。
16.根据权利要求15所述的硫酸软骨素，其具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。
17.权利要求14-16的硫酸软骨素用于预防和治疗骨关节炎和/或用于维持肌肉骨骼系统的健康的用途。
18.组合物，其包含权利要求14-16中所要求保护的硫酸软骨素和一种或多种药学或营养学可接受的赋形剂。
19.权利要求18中所述的组合物，其用于预防和治疗骨关节炎和/或用于维持肌肉骨骼系统的健康。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662394A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20130117A1 (it) 2013-01-25 2014-07-26 Gnosis Spa Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato
CZ2014451A3 (cs) * 2014-06-30 2016-01-13 Contipro Pharma A.S. Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití
IT202000013618A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di un acido ialuronico da un fungo, un acido ialuronico di origine vegetale e suo uso
IT202000013633A1 (it) 2020-06-08 2021-12-08 Vivatis Pharma Gmbh Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704356A (en) * 1984-03-27 1987-11-03 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Method of diagnosing cartilage tissue abnormalities
EP1304338A1 (en) * 2001-10-22 2003-04-23 Ibsa Institut Biochimique S.A. Process for the preparation of Chondroitin sulfates from K4 Polysaccharide and obtained products
JP2003128705A (ja) * 2001-10-29 2003-05-08 Kyowa Technos:Kk 低分子キトサンおよびその製造方法
CN1789287A (zh) * 2005-12-20 2006-06-21 山东大学 一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法
WO2009149155A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Amano Enzyme Usa., Ltd. Microbial-derived chondroitin sulfate

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3405120A (en) * 1966-01-27 1968-10-08 Green Cross Corp Low molecular chondroitin sulfate and method for manufacturing the same
JPS6144822A (ja) * 1984-08-09 1986-03-04 Seikagaku Kogyo Co Ltd コンドロイチン硫酸含有抗疲労剤
JPH0699485B2 (ja) * 1984-08-14 1994-12-07 生化学工業株式会社 合成コンドロイチン多硫酸の製造法
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
JP4258856B2 (ja) * 1998-03-06 2009-04-30 ニプロ株式会社 抗癌性複合体
JP4317350B2 (ja) * 2002-06-12 2009-08-19 生化学工業株式会社 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子分泌促進剤
US8455458B2 (en) * 2002-10-16 2013-06-04 Arthrodynamic Technologies, Animal Health Division, Inc. Composition and method for treating connective tissue damage
JP4567942B2 (ja) * 2002-12-27 2010-10-27 生化学工業株式会社 破骨細胞形成抑制剤
JP4914594B2 (ja) * 2005-09-29 2012-04-11 ユニテックフーズ株式会社 関節痛改善用食品組成物
CN101883794B (zh) * 2007-10-01 2012-11-07 生化学工业株式会社 低分子化硫酸软骨素及其用途
US8394782B2 (en) * 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having increased longevity
JP5435538B2 (ja) * 2008-09-25 2014-03-05 国立大学法人鳥取大学 コンドロイチン硫酸の低分子化物の製造方法
IT1402871B1 (it) * 2010-11-11 2013-09-27 Ibsa Inst Biochimique Sa Processo per ottenere condroitina solfatata in posizione 4 o 6 dei residui di n-acetil-galattosammina

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704356A (en) * 1984-03-27 1987-11-03 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Method of diagnosing cartilage tissue abnormalities
EP1304338A1 (en) * 2001-10-22 2003-04-23 Ibsa Institut Biochimique S.A. Process for the preparation of Chondroitin sulfates from K4 Polysaccharide and obtained products
JP2003128705A (ja) * 2001-10-29 2003-05-08 Kyowa Technos:Kk 低分子キトサンおよびその製造方法
CN1789287A (zh) * 2005-12-20 2006-06-21 山东大学 一种多硫酸化硫酸软骨素及其制备方法
WO2009149155A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Amano Enzyme Usa., Ltd. Microbial-derived chondroitin sulfate

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEATHER DESAIRE等: "Evidence of Block and Randomly Sequenced Chondroitin Polysaccharides: Sequential Enzymatic Digestion and Quantification Using Ion Trap Tandem Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 73, no. 15, 1 August 2001 (2001-08-01) *
NICOLA VOLPI: "Analytical Aspects of Pharmaceutical Grade Chondroitin Sulfates", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES》, vol. 96, no. 12, 31 December 2007 (2007-12-31), XP055034388, DOI: doi:10.1002/jps.20997 *
NICOLA VOLPI: "Influence of charge density, sulfate group position and molecular mass on adsorption of chondroitin sulfate onto coral", 《BIOMATERIALS》, vol. 23, no. 14, 31 December 2002 (2002-12-31) *
SINTAD M.T. D’ARCY等: "Preliminary investigation into the purification,NMR analysis, and molecular modelling of chondroitin sulphate epitopes", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》, vol. 255, 31 December 1994 (1994-12-31) *
唐英章: "《保健食品中功效成分及危害物质的分析》", 31 December 2004, article "降血脂类保健食品" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662394A (zh) * 2019-03-05 2020-09-15 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用
CN111662394B (zh) * 2019-03-05 2022-11-04 中国医学科学院药物研究所 硫酸软骨素多糖半合成制备方法和应用

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Publication number Publication date
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