ITMI20130117A1 - Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato - Google Patents

Composizioni comprendenti condroitin solfato, enzimi proteolitici e composti sulfidrilati capaci di migliorare la biodisponibilita' del condroitin solfato

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ITMI20130117A1
ITMI20130117A1 IT000117A ITMI20130117A ITMI20130117A1 IT MI20130117 A1 ITMI20130117 A1 IT MI20130117A1 IT 000117 A IT000117 A IT 000117A IT MI20130117 A ITMI20130117 A IT MI20130117A IT MI20130117 A1 ITMI20130117 A1 IT MI20130117A1
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sulfate
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Mauro Rossini
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Description

“COMPOSIZIONI COMPRENDENTI CONDROITIN SOLFATO, ENZIMI PROTEOLITICI E COMPOSTI SULFIDRILATI CAPACI DI MIGLIORARE LA BIODISPONIBILITÀ DEL CONDROITIN SOLFATOâ€
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda composizioni comprendenti condroitin solfato (CS), enzimi o miscele enzimatiche dotate di attività proteolitica, da sole o in presenza di composti sulfidrilati e al loro utilizzo nel trattamento e nella prevenzione dell’osteoartrite e dei processi infiammatori acuti e cronici correlati o come composizioni nutraceutiche per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico nell’uomo e nell’animale.
Tali combinazioni sono in grado di aumentare l’assorbimento intestinale del CS somministrato per via orale. L’effetto di tale associazione si determina su un ampio range di pesi molecolari del CS, anche su campioni costituiti da oligosaccaridi caratterizzati da pesi molecolari molto bassi (1 - 10 kDa) per i quali à ̈ già nota una biodisponibilità maggiore rispetto a campioni di peso molecolare superiore.
BACKGROUND TECNICO
Il CS à ̈ raccomandato dall’EULAR (European League Against Rheumatism) come farmaco sintomatico ad azione lenta (SYSADOA: Symptomatic Slow Acting Drug for Osteo Arthritis) nel trattamento dell’osteoartrite del ginocchio, dell’anca e della mano sulla base di numerose evidenze cliniche. Il CS à ̈ inoltre utilizzato come nutraceutico, da solo o in combinazione con altri ingredienti in composizioni che esplicano una attività antinfiammatoria sia a livello locale che sistemico.
Il condroitin solfato (CS) à ̈ un polisaccaride appartenente alla classe dei glicosamminoglicani (GAGs) presente sia nei vertebrati che negli invertebrati ed à ̈ costituito da sequenze disaccaridiche formate da un residuo di acido glucuronico (GlcA) e uno di N-acetil-D-galattosamina (GalNAc), alternati, legati tra loro da legami beta 1-3 e solfatati in posizioni diverse. I disaccaridi sono a loro volta legati tra loro da legami beta 1-4. Il CS à ̈ per la maggior parte costituito da unità disaccaridiche monosolfatate, in posizione 4 o in posizione 6 di GalNAc (rispettivamente denominati disaccaride A e C). CS A e C sono rappresentati in percentuali diverse a seconda dell’origine del polisaccaride. Nel CS, inoltre, sono presenti in misura minore e variabile a seconda delle fonti animali specifiche, anche il disaccaride non solfatato e disaccaridi disolfatati recanti due gruppi solfato legati all’atomo di ossigeno in varie posizioni: in posizione 2 di GlcA e 6 di GalNAc (disaccaride D), in posizione 2 di GlcA e 4 di GalNac, o in posizione 4 e 6 di GalNAc (disaccaride E) (Volpi N.J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N.J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006).
I CS di diversa origine animale sono anche caratterizzati da un’eterogeneità di peso molecolare.
I CS provenienti da animali terrestri, ad esempio, hanno valori di massa molecolare simili tra loro e diversi da quelli provenienti da specie ittiche, avendo queste ultime valori di massa molecolare superiori. I CS di origine terrestre presentano un peso molecolare mediamente compreso fra 14 e 26 kDa, mentre i CS di origine ittica da calamaro, pesci cartilaginei ed ossei presentano un peso molecolare medio superiore a 50 kDa.
Accanto ai CS di origine animale sono descritti alcuni CS prodotti partendo da scheletri polisaccaridici di origine batterica poi modificati per via sintetica in modo tale da ottenere polimeri analoghi ai CS naturali. Questi CS biotecnologici di origine batterico-sintetica permettono di superare alcuni inconvenienti legati all’origine animale dei CS estrattivi, quali: la possibile presenza di virus e/o prioni o di altre macromolecole potenzialmente allergeniche tra le impurezze residue; l’alto contenuto di proteine animali nel prodotto finale; la non compatibilità dei prodotti animali con restrizioni di carattere religioso o dietetico; la limitatezza delle fonti di fronte a una domanda mondiale crescente.
Esempi di CS di origine batterico-sintetica sono descritti, ad esempio, in EP 1304338 in cui il polisaccaride capsulare del ceppo O5:K4:H4 di E. coli à ̈ solfatato chimicamente dopo estrazione e idrolisi del polimero originario. Altri esempi di CS batterico-sintetica sono descritti in PCT/EP2012/058654, in PCT/EP2011/058297 o in MI2012A000880 in cui un polisaccaride capsulare batterico à ̈ solfatato chimicamente in modo tale da ottenere dei CS simili a quelli di origine animale.
Esistono, infine, esempi di CS di ridotto peso molecolare, ottenuti per depolimerizzazione sia di polisaccaridi estrattivi (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), sia di polisaccaridi di origine batterica (MI2012A000880, PCT/EP2012/058654). Le ridotte dimensioni molecolari di questi CS consentono un miglior assorbimento orale mantenendo molte delle attività riconosciute al CS naturale.
Il CS somministrato per via orale à ̈ assorbito a livello della mucosa intestinale nell’intestino tenue e nel tratto distale. Il CS viene assorbito in parte come polisaccaride ad alto peso molecolare nell’intestino tenue e in maggior parte sotto forma di oligosaccaridi a livello del cieco e del colon (Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009). Questi oligosaccaridi sono generati da una parziale depolimerizzazione del polisaccaride originale ad opera di enzimi idrolitici prodotti dalla flora intestinale presente nel tratto basso dell’apparato digerente.
Sebbene il meccanismo dell’assorbimento intestinale del polisaccaride costituente il CS non sia del tutto chiaro, si ritiene che sia quantitativamente rilevante l’assorbimento attraverso lo spazio paracellulare dell’epitelio intestinale come avviene per la maggior parte delle macromolecole, per questa via sono assorbiti anche i frammenti oligosaccaridici del CS. A questo livello sono presenti le tight junctions che costituiscono una barriera che limita l’assorbimento di molecole di grandi dimensioni il cui trasporto non prevede la mediazione di carrier molecolari specifici attraverso la mucosa intestinale.
L’assorbimento del CS ad alto peso molecolare, infatti, à ̈ stimato intorno all’1 - 5%. Come detto precedentemente, la maggior parte del CS assorbito à ̈ costituito da oligosaccaridi derivanti dalla sua digestione enzimatica ad opera di condroitinasi prodotte dalla flora microbica intestinale. Anche considerando l’assorbimento degli oligosaccaridi, tuttavia, l’uptake totale di CS da parte della mucosa intestinale non arriva a più del 20-23% del polisaccaride ingerito (Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009 -Barthe L. et al. Arzneimittelforsch./Drug Res. 2004; 54: 286-92).
In generale, l’assorbimento del CS dopo assunzione orale rimane un problema ed à ̈ di assoluta attualità qualsiasi accorgimento che sia in grado di aumentare l’assorbimento intestinale di tale glicosamminoglicano.
La bromelina à ̈ una miscela di cistein-proteasi estratta dal frutto e dal gambo dell’ananas (Ananas comosus), pianta della famiglia delle bromeliaceae. La fonte di elezione per la sua estrazione à ̈ il gambo del frutto, in cui la sua concentrazione à ̈ più alta. Di questa miscela sono distinguibili quattro distinte frazioni o, secondo una più fine caratterizzazione analitica effettuata mediante uso di spettrometria di massa, otto componenti proteolitici aventi tutte paragonabile attività proteolitica. Per questo motivo à ̈ normalmente usata la miscela nella forma naturale. La bromelina à ̈ catalogata come un’endopeptidasi appartenente alla sub-famiglia delle peptidasi C1A (nomenclatura MEROPS). L’estratto contiene oltre alla miscela di proteasi, delle perossidasi, delle fosfatasi acide e delle glicosidasi. La massa molecolare dei componenti varia tra 8 e 28.5 kDa. La concentrazione della bromelina à ̈ spesso espressa in unità proteolitiche (unità GDU o unità internazionali, I.U.) piuttosto che in unità di peso.
Per le sue caratteristiche proteolitiche la bromelina ha un’attività simile alle proteasi pancreatiche e ha pertanto il ruolo di favorire la digestione. Essa à ̈ infatti utilizzata nelle dispepsie in associazione con estratti pancreatici. La bromelina à ̈ anche in grado di scindere i grassi a lunga catena.
La bromelina, inoltre, presenta altre attività farmacologiche, tra cui, la più importante, una potente attività antinfiammatoria che la rende efficace nel trattamento degli stati infiammatori dei tessuti molli associati a traumi o a reazioni postoperatorie e delle infiammazioni localizzate. È stato dimostrato che la bromelina esprime questa sua attività incrementando la biosintesi di prostaglandine antinfiammatorie (quali le prostaglandine E2) e inibendo viceversa la biosintesi delle prostaglandine pro-infiammatorie.
Altre attività farmacologiche della bromelina comprendono un’azione antitrombotica e pro-fibrinolitica, un’attività ipotensiva e la capacità di indurre la regressione della placca aterosclerotica. Inoltre, sono descritte le sue capacità sinergiche nelle terapie antibiotiche e antitumorali.
La bromelina à ̈ caratterizzata da una buona biodisponibilità orale, stimata intorno al 40%, caratteristica rara per le proteine. Inoltre la maggior parte della bromelina non assorbita rimane integra e in grado di esprimere la sua attività enzimatica nel lume intestinale. Essa, infatti, à ̈ poco attaccata dai succhi gastrici e dalle cistatine presenti nella saliva. Le sue caratteristiche la accomunano alla papaina e alla ficina, estratti simili derivanti rispettivamente dalla papaia (Carica papaia) e dal fico (Ficus carica).
La nattochinasi à ̈ un enzima inizialmente isolato dal natto, un cibo tradizionale giapponese a base di semi di soia bolliti fermentati da una particolare varietà di Bacillus subtilis, il B. subtilis natto.
La nattochinasi à ̈ una serina-proteasi di circa 32 kDa dotata di potente attività fibrinolitica. Essa mostra un’omologia con la subtilisina superiore al 72%. La sua attività fibrinolitica comprende un’azione diretta nella fibrinolisi unita alla capacità di indurre un aumento nella produzione di urochinasi e di plasmina. La nattochinasi à ̈ caratterizzata da una relativamente alta stabilità alla temperatura e a bassi valori di pH, questa caratteristica consente alla proteina una buona resistenza all’ambiente gastrico permettendo un suo uso per somministrazione orale.
Le sue caratteristiche di relativa stabilità all’ambiente gastrico e la sua attività proteolitica ne fanno un enzima che può presentare delle analogie con la bromelina nell’utilizzo qui illustrato.
US 5679344 descrive composizioni nutrienti per l’uso nei disordini articolari contenenti glucosammina ed enzimi proteolitici aventi proprietà antiinfiammatorie. Le composizioni contengono almeno una proteasi e almeno una proteasi stabilizzata con acidi.
US 5888514 descrive composizioni contenenti cartilagine, enzimi proteolitici, glucosammina solfato e condroitin solfato oltre a vitamine ed estratti vegetali per l’uso nel trattamento dell’infiammazione delle ossa e delle giunture.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Si à ̈ ora trovato che l'associazione del CS con la bromelina e la contemporanea presenza di un enhancer dell'attività di quest’ultima rappresentato ad esempio dalla cisteina, dalla metionina, dal glutatione o da altri composti sulfidrilati permette di incrementarne l'assorbimento a livello dell'intestino tenue.
Si à ̈ inoltre trovato che la nattochinasi ha un effetto ancora più sorprendente sulla biodisponibilità del CS, che viene incrementata fino a oltre il 250%.
Oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione comprendente condroitin solfato e una o più proteasi e opzionalmente un composto sulfidrilato a condizione che quando la proteasi à ̈ diversa da nattochinasi il composto sulfidrilato sia presente.
Preferibilmente il condroitin solfato ha peso molecolare compreso tra 1 e 95 kDa, più preferibilmente tra 4 e 50 kDa.
Il condroitin solfato preferibilmente à ̈ di origine estrattiva animale. Il CS può essere ottenuto per solfatazione chimica del polisaccaride capsulare K4 di E. coli dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi come descritto in EP 1304338, in PCT/EP2011/058297 e in PCT/EP2012/058654 oppure per solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione acida o radicalica del polisaccaride capsulare K4 di E. coli dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi come descritto in MI2012A000880 e PCT/EP2012/058654. Alternativamente, il CS può essere ottenuto per solfatazione chimica del polisaccaride capsulare di un ceppo di E. coli geneticamente modificato (es. DSM23644), in cui, il polisaccaride, à ̈ originariamente privo di residui di fruttosio (PCT/EP2011/059069). Anche il CS così ottenuto può successivamente essere ridotto nelle dimensioni molecolari per depolimerizzazione acida o radicalica come in MI2012A000880.
La proteasi à ̈ preferibilmente scelta tra bromelina, papaina, ficina e nattochinasi.
Per composto sulfidrilato s’intende un amminoacido naturale o sintetico, o un piccolo peptide o altro composto che comprenda almeno un gruppo sulfidrilico. preferibilmente il composto sulfidrilato à ̈ scelto tra metionina, cisteina, omocisteina, S-adenosilmetionina, acetil-cisteina, glutatione ridotto o ossidato.
Preferibilmente nelle composizioni dell’invenzione il rapporto condroitin solfato/proteasi/ composto sulfidrilato à ̈ 1.0/0.05-0.8/0.001-0.05.
Le composizioni dell’invenzione possono contenere inoltre uno o più principi attivi utilizzati nella prevenzione o nel trattamento di stati infiammatori acuti e cronici e/o una o più sostanze nutraceutiche utilizzate per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico nell’uomo e nell’animale.
I principi attivi possono per esempio essere scelti nel gruppo costituito da glucosammina cloridrato, glucosammina solfato, N-acetil-glucosammina, acido ialuronico, amminoacidi, collagene, collagene idrolizzato, acidi grassi polinsaturi, cheratina, metilsulfonilmetano, folati, folati ridotti, vitamine, vitamine del gruppo B, S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o manganese ascorbato.
Inoltre le composizioni possono contenere ulteriormente uno o più eccipienti farmaceuticamente o nutraceuticamente accettabili.
Tali preparazioni possono inoltre essere addizionate di tutti quei componenti che normalmente sono associati con il condroitin solfato, quali glucosammina, metilsulfonilmetano (MSM).
Eccipienti farmaceuticamente o nutraceuticamente accettabili sono per esempio: cellulosa microcristallina, acido stearico, magnesio stearato, silice colloidale, etilcellulosa, metilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, sali acquosi di shellac, sodio alginato, amido, amidi modificati, copolimeri degli acidi metacrilici, maltodestrine, polioli.
Le composizioni dell’invenzione sono preferibilmente somministrate oralmente in forma ad esempio di capsule, capsule soft gel, compresse, granulati, bevande in forma liquida o bevande in polvere da ricostituire. La dose giornaliera di CS può variare tra 400 mg e 3600 mg in ambito nutraceutico, la dose giornaliera usuale come farmaceutico à ̈ di 1200 mg.
PARTE SPERIMENTALE
La permeabilità del CS à ̈ stata verificata in un modello in vitro in cui della mucosa intestinale di ratto à ̈ stata excisa dall'animale immediatamente dopo il sacrificio e posta in una camera di Ussing immersa in un tampone opportuno all'interfaccia di due compartimenti con il lato della mucosa originariamente esposto al lume intestinale verso un compartimento detto donatore e la parte basale verso l'altro compartimento, detto accettore.
Il CS à ̈ stato posto nel compartimento donatore in presenza o meno degli altri componenti dell'associazione e la presenza di polisaccaridi à ̈ stata determinata nel compartimento accettore dopo un periodo di incubazione durante il quale il CS à ̈ permeato nel compartimento accettore attraverso la membrana costituita dalla mucosa intestinale di ratto.
Viene ora descritta più nel dettaglio la tecnica sperimentale che ha permesso di valutare la permeabilità intestinale del CS nelle sue varie associazioni. Ratti Lewis del peso di 150 - 170 g sono stati sacrificati per inalazione di CO2, l’intestino tenue à ̈ stato immediatamente exciso, lavato e montato in una camera di Ussing riempita con un medium costituito da sodio cloruro (NaCl) 125 mM, magnesio solfato (MgSO4) 1.3 mM, cloruro di potassio (KCl) 5 mM, glucosio 20 mM e carbonato di sodio (NaHCO3) 25 mM. Il pH della soluzione à ̈ stato aggiustato a 7.4 con HEPES. Gli studi di permeazione sono stati condotti alla temperatura di 37°C in atmosfera composta per il 95% di O2e per il 5% di CO2. Il test di permeazione à ̈ stato effettuato non oltre 15 minuti dopo l’excisione della mucosa intestinale.
I campioni di CS usati nel test erano diversi per la natura e per le dimensioni molecolari. Sono stati infatti sottoposti al test di permeazione intestinale nelle varie associazioni sia campioni di CS di origine bovina che di origine biotecnologica (batterico-sintetica). Inoltre, i campioni di CS usati erano caratterizzati da diversi pesi molecolari in un range compreso tra 1 e 95 kDa o, preferibilmente, tra 4 e 50 kDa.
Il condroitin solfato à ̈ stato aggiunto al compartimento donatore a una concentrazione del 3% (massa/volume). Per gli studi di permeazione in presenza di bromelina, questa à ̈ stata aggiunta alla soluzione di CS a una concentrazione del 1,5%. Alternativamente, insieme alla bromelina à ̈ stato aggiunto anche un composto sulfidrilato scelto tra metionina, cisteina, omocisteina, S-adenosilmetionina, acetil-cisteina, glutatione ridotto o ossidato alla concentrazione dello 0,075%. Per gli studi di permeazione in presenza di nattochinasi, l’enzima à ̈ stato aggiunto alla soluzione a una concentrazione del 1,5% al pari della bromelina.
Il periodo di incubazione totale era di tre ore durante il quale campioni di 100 µl sono stati prelevati ogni 30 min dal compartimento accettore rimpiazzando il volume prelevato con medium fresco. I campioni prelevati sono stati analizzati per la presenza dei disaccaridi componenti il CS in HPLC con il metodo descritto di seguito, dopo digestione del polisaccaride con condroitinasi ABC (attività specifica: 0.5 U/ml).
Il metodo HPLC utilizzato prevedeva l’uso di una colonna a scambio anionico forte (SAX) e un eluente a base di acqua acidulata a pH 4, e un gradiente lineare con NaCl 1.2 M da 0% a 100% in 25 min dopo una prima eluizione isocratica in sola acqua acidulata di 5 min. il flusso usato era di 1,0 ml/min e la rivelazione dei disaccaridi era effettuata a 232 nm con detector UV.
La quantità di CS nel compartimento accettore à ̈ stata calcolata usando una curva di calibrazione di otto punti di condroitin solfato standard, corrispondenti a un range compreso tra 0,78% e 100% della concentrazione iniziale C del CS. Gli standard di condroitin solfato erano precedentemente incubati con condroitinasi ABC, diluiti nello stesso medium usato per gli esperimenti. Sulla base del CS trovato nel compartimento accettore à ̈ stato calcolato il coefficiente di permeabilità apparente (Papp) secondo la formula Papp(cm/sec) = Q/AxCxt in cui Q à ̈ la quantità totale di CS permeato (µg), A à ̈ l’area di diffusione della camera di Ussing (cm<2>), C à ̈ la concentrazione iniziale di CS nel compartimento donatore (µg/cm<3>) e t à ̈ il tempo di incubazione (30-180 min). Il rapporto incrementale R à ̈ stato calcolato sul Pappcome (PappCS proteasi) / (PappCS da solo). Pappà ̈ stata calcolata ad ogni prelievo, cioà ̈ a 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min. È stata quindi calcolata la media dei diversi Pappottenuti a questi punti per ottenere un coefficiente di permeabilità medio di ogni campione nell’intero esperimento. I dati di permeazione del CS sono stati espressi come media dei picchi di concentrazione dei disaccaridi ∆di-0S, ∆di-6S e ∆di-4S misurati separatamente.
Il valore statistico dei dati à ̈ stato analizzato con il test t di Student con p < 0.05 come minima significatività.
La validità di questo modello sperimentale à ̈ confermata dal fatto che tre campioni di CS di diverso peso molecolare, rispettivamente 9, 20 e 40 kDa, mostrano una permeabilità alla membrana intestinale che à ̈ funzione del peso molecolare stesso analogamente a quanto avviene in vivo. Ciò à ̈ mostrato in un grafico in cui à ̈ rappresentato il trasporto cumulativo di CS a tutti gli intervalli di tempo considerati all’interno dei 180 min dell’esperimento (Figura).
Campioni di CS di origine non animale a basso (9 kDa) e alto (40 kDa) peso molecolare sono quindi stati usati nel test di permeabilità in presenza o meno delle proteasi, e, nel caso della bromelina, dell’aggiunta del composto enhancer o meno.
Sono stati acquisiti i risultati della permeazione nel tempo dei campioni di CS, in assenza di altri adiuvanti o in presenza di: bromelina, bromelina e metionina, nattochinasi.
Sebbene sia nota la capacità della bromelina di favorire la permeazione paracellulare di molte macromolecole, capacità associata alla sua capacità di indebolire le tight junctions (Grabovac et al., Int. J. Pharm. 326, 153-159, 2006), in questo test il suo solo apporto senza l’intervento di altri fattori, non ha incrementato l’assorbimento del CS a basso peso molecolare. Ciò à ̈ visibile nel confronto tra i valori di Pappmedi riscontrati, riportati nella tabella 1. Un incremento à ̈ invece apprezzabile per l’associazione tra CS a basso peso molecolare, bromelina e metionina. Un sorprendente aumento nella permeabilità della mucosa intestinale à ̈ stato osservato anche nel caso dell’associazione del CS a basso peso molecolare con la nattochinasi (Tabella 1). I rapporti incrementali R, infatti, hanno valori superiori a 1 per l’associazione CS/bromelina/metionina, decisamente superiore a 1 per l’associazione CS/nattochinasi mentre R à ̈ inferiore a 1 per l’associazione CS/bromelina (Tabella 2). La metionina dunque mostra un sorprendente effetto positivo sull’azione della bromelina come enhancer per la permeabilità intestinale del CS, mentre, ancora più sorprendentemente, la nattochinasi senza l’intervento di altri fattori, quasi raddoppia la permeabilità intestinale del CS a basso peso molecolare. È interessante notare come un CS a basso peso molecolare che à ̈ già più biodisponibile del corrispondente polisaccaride di grandi dimensioni possa vedere ancora aumentata la propria biodisponibilità grazie alle associazioni descritte.
Tabella 1
Papp(cm sec<-1>) Condroitin solfato LMW 2,13x10<-7>± 6,07x10<-8>Condroitin solfato LMW Bromelina Metionina 2,65x10<-7>± 1,36x10<-7>Condroitin solfato LMW Bromelina 1,41x10<-7>± 7,57x10<-8>Condroitin solfato LMW Nattochinasi 3,56x10<-7>± 3,95x10<-9>
Valori di Papp medi determinati per la permeazione di condroitin
solfato a basso peso molecolare (LMW) e per lo stesso in associazione con:
bromelina; bromelina metionina; nattochinasi
Tabella 2
Rapporto incrementale (R) Condroitin solfato LMW Bromelina
<1,25 ± 0,18>Metionina/ Condroitin solfato LMW
Condroitin solfato LMW Bromelina/ Condroitin
solfato LMW<0,66 ± 0,35>Condroitin solfato LMW Nattochinasi/ condroitin
solfato LMW<1,67 ± 0,20>
Rapporti incrementali delle associazioni verso condroitin solfato a
basso peso molecolare (LMW) stand alone
Un effetto paragonabile à ̈ stato osservato relativamente all’assorbimento
di CS ad alto peso molecolare (40 kDa) anch’esso di origine non animale
(Tabelle 3 e 4). In questo caso l’effetto enhancer delle associazioni à ̈ ancora più
evidente, arrivando fino quasi a triplicare l’assorbimento del solo CS e
indicando che l’effetto enhancer ha luogo anche nel caso del polisaccaride di
grandi dimensioni per cui l’assorbimento à ̈ più critico.
Tabella 3
Papp(cm sec<-1>) Condroitin solfato HMW 5,26x10<-8>± 2,51x10<-8>Condroitin solfato HMW Bromelina Metionina 1,27x10<-7>± 8,01x10<-8>Condroitin solfato HMW Nattochinasi 1,57x10<-7>± 1,10x10<-7>
Valori di Papp medi determinati per la permeazione di condroitin
solfato ad alto peso molecolare (HMW) e per lo stesso in associazione con:
bromelina; bromelina metionina; nattochinasi
Tabella 4
Rapporto incrementale (R) Condroitin solfato HMW Bromelina
<2,42 ± 0,36>
Metionina/Condroitin solfato HMW
Condroitin solfato HMW Nattochinasi/Condroitin
<2,86 ± 1,64>solfato HMW
Rapporti incrementali delle associazioni verso condroitin solfato ad
alto peso molecolare (HMW) stand alone
Anche un campione di CS di origine animale (peso molecolare: 15-20
kDa) à ̈ stato sottoposto al test di permeabilità in assenza o presenza del cocktail
costituito da bromelina e metionina confermando la capacità dell’associazione
di incrementare la permeabilità del CS di qualsiasi fonte (Tabella 5).
Tabella 5
Papp(cm sec<-1>) Condroitin solfato reference 1,34x10<-7>± 1,24x10<-7>Condroitin solfato reference Bromelina Metionina 1,45x10<-7>± 4,48x10<-8>
Valori di Papp medi determinati per la permeazione di condroitin
solfato bovino e per lo stesso in associazione con bromelina metionina Si riportano di seguito alcuni esempi di composizioni secondo l’invenzione.
Esempio 1
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato bovino,
600 mg di bromelina,
30 mg di L-metionina.
Esempio 2
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato bovino,
600 mg di nattochinasi.
Esempio 3
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 9 kDa, 600 mg di bromelina,
30 mg di L-metionina.
Esempio 4
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 9 kDa, 600 mg di nattochinasi.
Esempio 5
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 40 kDa,
600 mg di bromelina,
30 mg di L-metionina.
Esempio 6
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 40 kDa,
600 mg di nattochinasi.
Esempio 7
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 9 kDa,
600 mg di nattochinasi,
30 mg di L-metionina.
Esempio 8
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato biotecnologico di peso molecolare 40 kDa,
600 mg di nattochinasi,
30 mg di L-metionina.
Esempio 9
È stata preparata una composizione mescolando:
1200 mg di condroitin solfato bovino,
600 mg di nattochinasi,
30 mg di L-metionina.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente condroitin solfato e una o più proteasi e opzionalmente un composto sulfidrilato, a condizione che quando la proteasi à ̈ diversa da nattochinasi sia presente il composto sulfidrilato.
  2. 2. La composizione secondo la rivendicazione 1 in cui il condroitin solfato ha peso molecolare compreso tra 1 e 95 kDa.
  3. 3. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 in cui il condroitin solfato à ̈ di origine estrattiva animale.
  4. 4. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 in cui il condroitin solfato à ̈ ottenuto per solfatazione chimica del polisaccaride capsulare K4 di E. coli dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi.
  5. 5. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 in cui il condroitin solfato à ̈ ottenuto per solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione acida o radicalica del polisaccaride capsulare K4 di E. coli dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi.
  6. 6. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 in cui il condroitin solfato à ̈ ottenuto per solfatazione chimica del polisaccaride capsulare di un ceppo di E. coli geneticamente modificato, in cui, detto polisaccaride, à ̈ originariamente privo di residui di fruttosio.
  7. 7. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 in cui il condroitin solfato à ̈ ottenuto per solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione acida o radicalica del polisaccaride capsulare di un ceppo di E. coli geneticamente modificato, in cui detto polisaccaride à ̈ originariamente privo di residui di fruttosio.
  8. 8. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui la proteasi à ̈ scelta tra bromelina, papaina, ficina e nattochinasi.
  9. 9. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui il composto sulfidrilato à ̈ scelto tra metionina, cisteina, omocisteina, S-adenosilmetionina, acetil-cisteina, glutatione ridotto o ossidato.
  10. 10. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui il rapporto condroitin solfato/proteasi/composto sulfidrilato à ̈ 1.0/0.05-0.8/0.001-0.05.
  11. 11. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 10 contenente inoltre uno o più principi attivi utilizzati nella prevenzione o nel trattamento di stati infiammatori acuti e cronici e/o una o più sostanze nutraceutiche utilizzate per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico nell’uomo e nell’animale.
  12. 12. La composizione secondo la rivendicazione 11 in cui uno o più principi attivi sono scelti nel gruppo costituito da glucosammina cloridrato, glucosammina solfato, N-acetil-glucosammina, acido ialuronico, amminoacidi, collagene, collagene idrolizzato, acidi grassi polinsaturi, cheratina, metilsulfonilmetano, folati, folati ridotti, vitamine, vitamine del gruppo B,S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o manganese ascorbato.
  13. 13. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 12 contenente ulteriormente uno o più eccipienti farmaceuticamente o nutraceuticamente accettabili scelti tra cellulosa microcristallina, acido stearico, magnesio stearato, silice colloidale, etilcellulosa, metilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, sali acquosi di shellac, sodio alginato, amido, amidi modificati, copolimeri degli acidi metacrilici, maltodestrine, polioli.
  14. 14. La composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni da 1 a 13 per l’uso nella prevenzione e nel trattamento di stati infiammatori acuti e cronici e/o per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico nell’uomo e nell’animale.
  15. 15. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni precedenti in formulati solidi orali comprendenti capsule, capsule soft gel, compresse, granulati, bevande in forma liquida o bevande in polvere da ricostituire. Milano, 25 gennaio 2013
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