ITMI20120880A1 - Condroitin 6-solfato biotecnologico a basso peso molecolare dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e suo uso nel trattamento e nella prevenzione dell'osteoartrite - Google Patents
Condroitin 6-solfato biotecnologico a basso peso molecolare dotato di attivita' antiinfiammatoria e antiartritica e suo uso nel trattamento e nella prevenzione dell'osteoartrite Download PDFInfo
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Description
“CONDROITIN 6-SOLFATO BIOTECNOLOGICO A BASSO PESO MOLECOLARE DOTATO DI ATTIVITÀ ANTIINFIAMMATORIA E ANTIARTRITICA E SUO USO NEL TRATTAMENTO E NELLA PREVENZIONE DELL’OSTEOARTRITEâ€
Riassunto dell'invenzione
La presente invenzione riguarda un condroitin solfato (CS) di peso molecolare estremamente basso (1000-5000 Dalton) prodotto mediante solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione di uno scheletro di condroitina non solfatata ottenuto mediante tecniche biotecnologiche, oppure prodotto mediante solfatazione di un polisaccaride di origine biotecnologica originariamente caratterizzato da basso peso molecolare e l’uso di questo CS nel trattamento e nella prevenzione dell’osteoartrite e di processi infiammatori acuti e cronici. In particolare l'invenzione riguarda un CS biotecnologico sostanzialmente monosolfatato, prevalentemente in posizione 6 che presenta una scarsissima o nulla quantità di 4-solfato, del tutto simile ai CS naturali per rapporto di disaccaridi mono/di-solfatati, per l’assenza di disaccaridi tri-solfatati e poli-solfatati, per densità di carica e per l’attività biologica dimostrata. Il condroitin 6-solfato (C6S) dell’invenzione presenta un più basso peso molecolare, 1000-5000 Dalton, rispetto ai condroitin solfati estratti da tessuti animali sia di origine terrestre (bovina, suina e aviaria) caratterizzati da valori di peso molecolare di 14.000-26.000 Dalton, che di origine ittica (squalo, calamaro, razza e pesci ossei) tutti di peso molecolare > 50.000 Dalton. Il C6S dell'invenzione, inoltre, presenta un peso molecolare inferiore anche ai low molecular weight CS già noti. Questa caratteristica conferisce al condroitin 6-solfato dell'invenzione una migliore biodisponibilità e quindi una maggiore efficacia.
L’impiego del condroitin 6-solfato (C6S) biotecnologico a basso peso molecolare nel trattamento e nella prevenzione dell’osteoartrite à ̈ supportato dalla verifica sperimentale della sua attività anti-infiammatoria in un modello animale noto e normalmente in uso per lo studio dell’artrite e della sintomatologia ad essa correlata. Il C6S biotecnologico a basso peso molecolare descritto evidenzia inoltre una buona tolleranza dimostrata in studi tossicologici condotti in conformità con le linee guida OECD in uso per i prodotti farmaceutici.
Background dell'invenzione
Il condroitin solfato (CS) à ̈ attualmente raccomandato dall’EULAR (European League Against Rheumatism) come farmaco sintomatico ad azione lenta (SYSADOA: Symptomatic Slow Acting Drug for Osteo Arthritis) nel trattamento dell’osteoartrite del ginocchio (Jordan KM et al., Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003), dell’anca (Jordan KM et al. Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003) e della mano (Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 66, 377, 2007) sulla base di numerose evidenze cliniche e di varie meta-analisi di studi clinici. Recenti studi clinici hanno anche dimostrato la capacità del CS di modificare le strutture extracellulari dei tessuti cartilaginei nell’uomo (Reginster JY, Heraud F, Zegels B, Bruyere O. Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Arthritis Rheum 60, 524, 2009). Inoltre, il CS à ̈ ampiamente utilizzato come nutraceutico, da solo o in combinazione con altri ingredienti (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).
Il condroitin solfato à ̈ un polisaccaride naturale appartenente alla classe dei glicosamminoglicani (GAGs) presente sia nei vertebrati che negli invertebrati, costituito da sequenze disaccaridiche formate da residui di acido glucuronico (GlcA) e di N-acetil-D-galattosamina (GalNAc) alternati, legati tra loro da legami beta 1-3 e solfatati in posizioni diverse.
Il CS à ̈ presente nei tessuti animali con funzioni strutturali e fisiologiche. Esso à ̈ costituito principalmente da due tipi di unità disaccaridiche monosolfatate, in posizione 4 o in posizione 6 di GalNAc (rispettivamente denominati disaccaride A e C) rappresentati in percentuali diverse a seconda dell’origine. Nello scheletro del CS à ̈ presente anche il disaccaride non solfatato, generalmente in piccole quantità . Disaccaridi disolfatati aventi due gruppi solfato legati attraverso l’atomo di ossigeno in varie posizioni, come in posizione 2 di GlcA e in 6 di GalNAc (disaccaride D), in posizione 2 di GlcA e in 4 di GalNac, o in posizione 4 e 6 di GalNAc (disaccaride E), possono essere presenti nello scheletro di CS in percentuali variabili a seconda delle fonti animali specifiche (Volpi N. J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N. J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006). La presenza di solfatazione in posizione 3 del GlcA à ̈ possibile sebbene in quantità estremamente piccole; tale presenza à ̈ rara nei CS di natura terrestre e più probabile in quelli molto solfatati di origine ittica (Fongmoon D et al. J Biol Chem 282, 36895, 2007).
La formula dell’unità ripetuta del disaccaride del CS à ̈ qui riportata
in cui R2, R4e R6sono indipendentemente H o SO -3.
Le cariche negative dei gruppi carbossilato e solfato presenti nella unità ripetuta del disaccaride sono generalmente neutralizzati da ioni sodio.
Il significato degli acronimi più ricorrenti utilizzati per identificare i disaccaridi variamente solfatati à ̈ riportato qui sotto:
Di-0S (R2=H; R4=H; R6=H)
Di-6S (C) (R2=H; R4=H; R6= SO3-)
Di-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; R6=H)
Di-4,6diS (E) (R2=H; R4= SO3-; R6= SO3-)
Di-2,6diS (D) (R2= SO3-; R4=H; R6= SO3-)
Di-2,4diS (B) (R2= SO3-; R4= SO3-; R6=H)
Di-2,4,6triS (R2= SO3-; R4= SO3-; R6= SO3-)
I campioni di CS provenienti da diverse fonti animali sono caratterizzati anche da un’eterogeneità di peso molecolare e di densità di carica, quest’ultimo parametro essendo direttamente correlato agli specifici gruppi solfati.
La Tabella 1 illustra i principali disaccaridi presenti nel CS naturale estratto dalla cartilagine di differenti specie animali:
Parametri<CS>CS Suino CS di CS di CS di CS diBovinogallina squalo manta calamaro
Mn (kDa) 12-17 9-14 8-13 25-40 27-34 60-80 Mw (kDa) 20-26 14-20 16-21 50-70 50-70 80-120 Indice di
Polidispersità 1.8-2.2 1.4-1.8 1.6-2.0 1.0-2.0 1.2-2.5 0.8-1.3
Di-0S 6 6 8 3 3 13 Di-6S 33 14 20 44 39 15 Di-4S 61 80 72 32 43 50 Di-2,6diS ND ND ND 18 13 0 Di-4,6diS ND ND ND 2 1 22 Di-2,4diS ND ND ND 1 1 0
Densità di
0.90-0.96 0.92-0.96 0.90-0.94 1.15-1.25 1.08-1.20 1.00-1.20 Carica
Rapporto
1.50-2.00 4.50-7.00 3.00-4.00 0.45-0.90 1.00-1.40 2.50-4.00 4S/6S
Tabella 1 - Mn = peso molecolare medio numerico; Mw = peso
molecolare medio ponderale; Indice di polidispersità = Mw/Mn; la densità di
carica à ̈ il numero di gruppi solfato per unità disaccaridiche; ND = Non
individuato
I CS provenienti da animali terrestri hanno parametri di massa
molecolare simili tra loro (Mn e Mw), e diversi da quelli provenienti da specie
ittiche, queste ultime avendo valori di massa molecolare superiori. I CS di
origine terrestre presentano infatti un peso molecolare (Mw) mediamente
compreso fra 14 e 26 kDa, mentre i CS di origine ittica da calamaro, pesci
cartilaginei ed ossei presentano un peso molecolare (Mw) maggiore di
50 kDa. Inoltre i campioni di CS terrestre sono caratterizzati anche da valori
di densità di carica (CD) inferiori a 1.0, mentre i campioni di CS ittici
mostrano sempre valori di CD superiori a 1.0.
Generalmente i disaccaridi disolfatati sono presenti in tracce nel CS terrestre mentre sono più abbondanti nei CS di origine ittica. Inoltre nel CS naturale non si osservano quantità significative di disaccaridi polisolfatati (tri- e tetra-solfati).
Il CS naturale presenta inoltre un’eterogeneità tra diversi organi e tessuti anche nella stessa specie come riportato nella Tabella 2.
Ileo, rene,
Parametri<Cartilagine>Aorta Ossa di polmone, Piastrine Plasmabovinabovina storione midollo di umane umano coniglio
Mn (kDa) 12-17 ND 25-30 ND ND ND Mw (kDa) 20-26 ND 35-40 ND ND ~ 15 Indice di 1.8-2.2 ND 1.05-1.5 ND ND NDPolidispersitÃ
Di-0S 6 0 7 ND 0 40-60 Di-6S 33 95-100 55 ~ 100 Tracce 1-5 Di-4S 61 0-5 38 Tracce > 98 60-40 Di-2,6diS ND 0 0 0 0 0 Di-4,6diS ND 0 0 0 0 0 Di-2,4diS ND 0 0 0 0 0
Densità di Carica 0.90-0.96 0.98-1.02 0.90-0.95 0.98-1.02 0.98-1.02 0.40-0.60 Rapporto 4S/6S 1.50-2.00 < 0.1 0.40-0.90 < 0.1 > 45 10-50
Tabella 2 - Mn = peso molecolare medio numerico; Mw = peso molecolare medio ponderale; Indice di polidispersità = Mw/Mn; la densità di carica à ̈ il numero di gruppi solfato per unità disaccaridiche; ND = Non individuato.
L’esistenza di catene di CS polisaccaridiche o oligosaccaridiche con un 100% di disaccaridi 6-solfato o 4-solfato à ̈ riportata in letteratura relativamente a diversi tessuti e organi (Sampaio L.O. et al. Biol. Chem. 256, 9205, 1981; Okayama E. et al. Blood 72,745, 1988; Ambrosius M. et al. J. Chrom. A 1201, 54, 2008; Volpi N. et al. Clin. Chim. Acta 370, 196, 2006).
Tutte queste caratteristiche mostrano l’estrema eterogeneità del CS naturale sia in termini di peso molecolare che di densità di carica, tuttavia possono essere individuati i parametri all’interno dei quali un CS può essere definito come natural-like. Un condroitin 6-solfato avente una densità di carica comparabile ai CS di origine ittica e caratterizzato dall’assenza di pattern di solfatazione anomali si presenta come strutturalmente simile al glicosamminoglicano naturale. La dimostrata attività antinfiammatoria in vivo fornisce un ulteriore supporto alla definizione di CS natural-like e permette di prevedere il suo impiego nel trattamento dei sintomi correlati alle patologie artritiche.
Sono stati intrapresi molti tentativi per trovare una via biotecnologica per la produzione di CS utilizzando microorganismi come fonte di polisaccaride precursore dotato di una struttura parzialmente simile a quella del CS e procedendo poi attraverso la solfatazione chimica per la produzione un CS simile a quello naturale.
Alcuni batteri infatti producono polisaccaridi capsulari di struttura simile ai glicosamminoglicani, Pasteurella multocida ad es., produce un polisaccaride identico alla condroitina non solfatata (De Angelis P.L., Carbohydrate Res., 337 (17), 1547, 2002). Il ceppo di Escherichia coli con sierotipo O5:K4:H4 invece, produce un polisaccaride capsulare con uno scheletro condroitinico portante un residuo di β-fruttosio legato in posizione 3 dell’unità di GlcA (polisaccaride K4).
Un esempio di produzione di CS biotecnologico a partire dal polisaccaride capsulare K4 di E. coli O5:K4:H4 à ̈ riportato in EP 1304338 che descrive un procedimento in cui il polisaccaride K4 prodotto in colture liquide viene estratto e purificato e successivamente ridisciolto e sottoposto a idrolisi acida per eliminare i residui di fruttosio legati ai residui di GlcA del polimero. Il polimero defruttosilato, identico allo scheletro non solfatato di CS, viene poi solfatato in posizione 4 o in posizione 6 del residuo GalNAc seguendo diverse vie di sintesi chimica producendo un CS del peso molecolare compreso tra 6 e 25 kDa. Il CS biotecnologico descritto in EP 1304338, tuttavia, non viene in alcun modo valutato per la sua attività antiinfiammatoria e antiartritica e il suo utilizzo nel trattamento di patologie artritiche e/o artrosiche resta solo un’ipotesi. Questo à ̈ tanto più importante dal momento che solo il 70% del polisaccaride descritto in EP 1304338 ha sicuramente la struttura di un condroitin solfato naturale essendo il restante 30% principalmente condroitina non solfatata (CH). Inoltre, non vengono presi in considerazione oligosaccaridi di peso molecolare inferiore a 5 kDa.
Una recente pubblicazione (Bedini E. et al. Angew Chem. Int. Ed Engl.
2011) descrive un procedimento in cui il polisaccaride K4 prodotto viene solfatato in posizione 4 e/o in posizione 6 del residuo GalNAc all’interno della stessa catena. Anche in questo caso, il CS biotecnologico descritto non viene valutato per l’attività antiinfiammatoria e antiartritica e non viene valutato il suo impiego nel trattamento e prevenzione di patologie artritiche e/o artrosiche e dei processi infiammatori correlati. Gli stessi autori ipotizzano la presenza di modificazioni strutturali della catena del CS biotecnologico derivanti dal loro processo di sintesi che produce un’anomala solfatazione del gruppo ossidrilico in C3 del GlcA dovuta alla scarsa protezione del gruppo stesso durante il processo di sintesi. E' noto che questa anomalia possa provocare una seria tossicità riscontrata nell’uomo in seguito a somministrazione endovenosa di eparina in cui tale CS 3-solfatato in GlcA era presente come contaminante. Sebbene tale tossicità non sia mai stata riscontrata in occasione di somministrazioni orali di CS, il rischio di effetti tossici dovuti a quel tipo di solfatazione anomala rimane e ciò à ̈ indicato anche dagli stessi autori in un’altra recente pubblicazione (Bedini E. et al. Chem. Eur. J. 2012 [Epub ahead of print]).
Inoltre, il CS biotecnologico descritto da Bedini et al. (Angew Chem Int Ed Engl. 2011) presenta un peso molecolare dell’ordine di 17 kDa, quindi presenta potenzialmente la bassa biodisponibilità che hanno i prodotti naturali di origine estrattiva. Per tutte queste ragioni il CS biotecnologico descritto da Bedini et al. ha scarsa possibilità di essere utilizzato nel trattamento e nella prevenzione dell’artrite e/o dell’artrosi.
Esistono, per contro, esempi di CS a basso peso molecolare per l’uso del trattamento dell’artrite (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), ma sono tutti ottenuti per depolimerizzazione di CS di origine animale e per i quali quindi la presenza di virus, prioni e altri agenti infettivi trasmissibili non può essere esclusa.
Descrizione dell'invenzione
Si à ̈ ora trovato che un condroitin solfato (CS) di basso peso molecolare, compreso tra 1000 e 5000 Dalton, o preferibilmente tra 2000 e 4000 Dalton, prodotto mediante solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione di uno scheletro di condroitina non solfatata ottenuto mediante tecniche biotecnologiche, ha un'attività antiinfiammatoria paragonabile a quella dei CS naturali, una migliorata biodisponibilità e un favorevole profilo di sicurezza. Il CS descritto à ̈ sostanzialmente monosolfatato, prevalentemente in posizione 6 con scarsissima solfatazione in posizione 4 e con rapporto disaccaridi mono/di-solfatati e densità di carica simili ai CS naturali.
Il CS dell'invenzione presenta tutte le caratteristiche di un CS naturale e più specificamente dei CS di origine ittica. Esso infatti presenta analoghe percentuali relative di disaccaridi mono- e di- solfatati, analoga distribuzione dei disaccaridi di-solfatati e, conseguentemente, analoga densità di carica (CD) associate a un basso rapporto 4-solfato/6-solfato.
Inoltre il CS biotecnologico dell’invenzione, possiede le seguenti caratteristiche peculiari: un peso molecolare molto basso (compreso tra 1000 e 5000 dalton, o preferibilmente tra 2000 e 4000 Dalton); una percentuale di disaccaridi 6-solfati particolarmente alta; una pressoché totale assenza di disaccaridi tri-solfatati; la sostanziale assenza di solfatazione in posizione 3 del residuo di GlcA. In particolare la presenza di disaccaridi sia tri-solfatati che solfatati in 3 al GlcA caratterizza i CS sintetici noti e spesso rappresenta la causa di effetti indesiderati nella loro applicazione terapeutica.
La tabella 3 mostra le caratteristiche chimico-fisiche del condroitin 6-solfato biotecnologico dell’invenzione.
Tabella 3
Biotechnological CS physico-chemical characteristics
Molecular mass (MWw) 1000 - 5000 Da
Disaccharides:
∆ Di-0S < 15%
∆ Di-6S ≥ 65%
∆ Di-4S < 1%
∆ Di-2,6diS < 20%
∆ Di-4,6diS < 5%
∆ Di-2,4diS < 1%
Charge Density 1 - 1.25
4S / 6S ratio < 0.1
Secondo un particolare aspetto dell’invenzione il C6S può essere
ottenuto dal processo di sintesi chimica come descritto in
PCT/EP2011/058297 applicato al polisaccaride capsulare K4 prodotto
naturalmente dal ceppo di E. coli O5:K4:H4 (WO 01/02597) precedentemente
defruttosilato per idrolisi termoacida in accordo alle tecniche note (Rodriguez
e Jann, Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988) oppure ad un qualsiasi
altro polisaccaride avente la struttura della condroitina non solfatata.
Alternativamente la condroitina non solfatata (CH) di partenza può essere
ottenuta dalla coltura del ceppo di E. coli DSM23644 descritto in
WO 2012004063, che, in virtù di una mutazione indotta nel gene KfoE
responsabile della fruttosilazione del K4, produce un polisaccaride identico
alla CH naturale non solfatata. Secondo questo aspetto dell'invenzione, il
polisaccaride à ̈ sottoposto a solfatazione chimica, preferibilmente secondo il
metodo descritto in PCT/EP2011/058297.
Brevemente, il processo di sintesi che porta alla solfatazione delle unitÃ
disaccaridiche à ̈ il seguente:
a) La condroitina sale sodico ottenuta dopo defruttosilazione del polisaccaride K4 à ̈ desalificata su resina a scambio cationico e risalificata con un gruppo alchilammonio idrossido, preferibilmente con tetrabutilammonio idrossido, aggiunto in quantità stechiometrica fino a un pH di 7 - 7,5 ed essiccata per liofilizzazione o spray drying.
b) Ad una soluzione costituita da un solvente polare aprotico, preferibilmente dimetilformammide (DMF), mantenuto a una temperatura compresa tra 0 e 30°C, si aggiunge la CH sale di tetrabutilammonio dello stadio a) sotto agitazione, si aggiunge il complesso solfatante in un rapporto molare compreso tra 2 e 5 con la CH mantenendo costanti temperatura e agitazione.
c) Al termine viene aggiunta una quantità di sodio bicarbonato in rapporto molare stechiometrico col solfatante o in eccesso alzando nel contempo la temperatura a 65°C per evaporare il solvente. Viene quindi aggiunta acqua e si distilla nuovamente. La soluzione finale viene ultrafiltrata e dializzata. Infine il CS sale sodico viene filtrato ed essiccato sotto vuoto fino a un’umidità residua inferiore al 10%.
Le dimensioni molecolari del CS ottenuto vengono quindi ridotte mediante un processo di depolimerizzazione effettuato secondo le tecniche note di depolimerizzazione radicalica (Volpi N. et al., Carb. Res., 279, 193-200, 1995) o di depolimerizzazione acida controllando il processo in modo da ottenere la distribuzione di pesi molecolari voluta.
La depolimerizzazione acida à ̈ eseguita risospendendo il CS in acqua, acidificando la soluzione con l'aggiunta di HCl fino alla concentrazione di 1 M e riscaldando alla temperatura di 60°C.
Il controllo del peso molecolare degli oligosaccaridi generati dalla depolimerizzazione à ̈ effettuato prelevando a tempi ravvicinati campioni della soluzione, determinando il peso molecolare degli oligosaccaridi mediante analisi SEC-HPLC condotta su due colonne Agilent Bio Series SEC<©>-5 (hydrophilic neutral polymeric monolayer) di 5 µm, rispettivamente da 300 e 150 Ã…, in serie. La reazione viene interrotta tramite neutralizzazione con NaOH o sodio bicarbonato, fino a portare il pH a 6 - 8 una volta raggiunti i valori di massa molecolare desiderati.
Alternativamente la depolimerizzazione può essere ottenuta per idrolisi radicalica controllando il peso molecolare finale degli oligosaccaridi che ne derivano come descritto precedentemente.
Il CS viene risospeso in acqua, il pH corretto a 7,5 con aggiunta di una soluzione di acido cloridrico o di sodio idrossido al 10% a seconda che sia necessario rispettivamente acidificare o basificare la soluzione di CS. Una soluzione di acqua ossigenata (H2O2) al 9% viene aggiunta alla soluzione mantenuta a 60°C. Il raggiungimento del peso molecolare voluto viene controllato in SEC-HPLC come descritto precedentemente. La reazione viene interrotta raffreddando la soluzione a temperatura ambiente (20 - 25°C) e abbassando il pH a 6,0.
La tabella 4 riporta i valori di peso molecolare tipici di un oligosaccaride analizzato in SEC-HPLC durante le fasi della reazione fino a fine depolimerizzazione.
Tabella 4
Tempo MWw (kDa) Indice di MWw relativo (minuti) Polidispersione (% dell’iniziale)
0 77.3 0.2 100.0
60 73.6 0.2 95.3
120 81.9 0.2 106.0
180 76.3 0.3 98.7
330 45.7 0.4 59.1
390 39.7 0.4 51.4
510 28.6 0.5 37.0
660 25.5 0.6 33.0
780 20.5 0.6 26.5
840 18.7 0.6 24.2
900 18.1 0.6 23.4
1020 14.0 0.6 18.1
1200 10.2 0.6 13.2
1440 3.7 0.6 9.96
Il C6S dell'invenzione può anche essere ottenuto per solfatazione
chimica secondo le procedure precedentemente indicate usando come
substrato la frazione a basso peso molecolare del polisaccaride K4 derivante
dal processo fermentativo del ceppo di E. coli O5:K4:H4. In questo caso, il
brodo di coltura viene trattato a fine fermentazione scaldando a 80°C per 60
minuti allo scopo di inattivare il microorganismo e quindi centrifugato e
ultrafiltrato come in EP 1304338, il surnatante che ne risulta viene caricato su
una colonna per gel-filtrazione e le frazioni vengono raccolte controllando per
ciascuna di esse il contenuto di acidi uronici con le tecniche note. Riunendo
poi le frazioni positive al test degli acidi uronici à ̈ possibile isolare due
distinti pool: un primo pool contenente K4 ad alto peso molecolare (40 - 70
kDa), corrispondente al polisaccaride noto e quantitativamente corrispondente al 80% dei saccaridi totali e un secondo pool, nettamente separato dal primo in base al volume di eluizione e contenente K4 di peso molecolare basso, con bassa dispersione intorno al valore medio, compreso tra 1500 e 6000 Dalton. l’identità degli oligosaccaridi contenuti in questo secondo pool a basso peso molecolare con il K4 à ̈ dimostrata dalla contemporanea risposta positiva al dosaggio degli acidi uronici e dalla digeribilità con condroitinasi ABC accompagnata dalla comparsa di unità disaccaridiche.
Questa frazione di oligosaccaride K4, che rappresenta quantitativamente il 20% dei saccaridi totali, Ã ̈ poi sottoposta al processo di defruttosilazione e solfatazione chimica descritto in PCT/EP2011/058297 fino ad ottenere un CS nel range 1000 - 5000 Dalton di peso molecolare finale.
Alternativamente, il C6S biotecnologico a basso peso molecolare può essere ottenuto con procedimento analogo a quelli precedentemente descritti dalla solfatazione della frazione a basso peso molecolare dell’oligosaccaride K4-d naturalmente defruttosilato recuperata dalla fermentazione del ceppo di E. coli DSM23644 descritto in WO 2012004063.
Il C6S a basso peso molecolare così ottenuto à ̈ stato valutato per la sua efficacia in un modello animale di artrite sperimentale (Adjuvant Arthritis: AA) nel ratto e i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli relativi al CS naturale di origine estrattiva di grado farmaceutico utilizzato nello stesso modello sperimentale (Bauerova K. Et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011) dopo trattamento giornaliero di 900 mg/kg, per via orale.
L’AA à ̈ stata indotta da una singola iniezione intradermica di Mycobacterium butyricum in adiuvante incompleto di Freund. Lo studio prevedeva un gruppo di animali sani (HC), uno di animali artritici non trattati (AC) e due gruppi di animali artritici trattati secondo due diversi schemi. Un primo schema di trattamento prevedeva un pretrattamento consistente nella somministrazione di 900 mg/kg di C6S biotecnologico al giorno per 14 giorni prima dell'induzione dell’artrite proseguendo poi per i 28 giorni successivi all’induzione dell’AA (PT). Un secondo schema di trattamento prevedeva la somministrazione di 900 mg/kg di C6S biotecnologico al giorno esclusivamente durante i 28 giorni successivi all’induzione della AA (T).
L’aumento fisiologico di peso corporeo nei ratti à ̈ risultato molto ridotto negli animali artritici non trattati (AC) arrivando a circa il 40% rispetto al controllo sano alla fine della durata dello studio. Il pretrattamento con C6S biotecnologico (gruppo PT) à ̈ stato in grado di limitare questa riduzione mostrando un aumento di peso corporeo pari al 73% del controllo sano. Il solo trattamento (T) si à ̈ mostrato altrettanto efficace sul ripristino del peso corporeo seppure in misura inferiore (aumento del 54% rispetto al controllo sano) (Fig. 1). Ciò à ̈ da attribuire al ruolo antinfiammatorio a livello sistemico del C6S biotecnologico a basso peso molecolare. Un effetto di questa entità sull’incremento di peso corporeo degli animali à ̈ superiore a quanto riscontrato nello studio di Bauerova et al. condotto con un CS ad alto peso molecolare di origine bovina allo stesso dosaggio (Bauerova K. Et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011). Questo dato conferma il maggior assorbimento intestinale del C6S biotecnologico dell’invenzione.
La gravità dell’artrite à ̈ stata quantificata sulla base dei livelli crescenti del gonfiore a livello degli arti (edema), l’edema sviluppato nella zampa posteriore diminuiva significativamente negli animali pretrattati (PT) (Fig. 2). Il pretrattamento con il C6S biotecnologico riduceva significativamente l’edema per la durata dell’intero esperimento rispetto ai controlli non trattati (Fig. 3).
Il pretrattamento si à ̈ dimostrato inoltre efficace nel ridurre lo score artritico complessivo, un parametro che tiene conto di una somma di fattori clinici comprendenti l’eritema periarticolare, l’edema sviluppato e il diametro della crosta nel sito di iniezione dell’adiuvante alla base della coda. In una scala di valutazione dello score artritico che attribuisce un punteggio compreso tra 6 e 31, il controllo artritico (AC) ha raggiunto un valore di 23, mentre il gruppo PT ha raggiunto un valore di 19 contro un valore di 12 per il controllo sano (HC) (Fig. 4). Inoltre, il pretrattamento à ̈ risultato efficace durante l’intera fase subacuta, dal giorno 1 fino al giorno 28 successivi all’induzione dell’AA (Fig. 5). Il gruppo di solo trattamento (T) non ha influito significativamente sullo score artritico nel tempo dello studio.
Il C6S dell’invenzione, inoltre, à ̈ stato testato per la sua safety tossicologica nell’animale e su colture cellulari secondo diversi protocolli disegnati per valutare la potenziale genotossicità a livello cellulare e la tossicità orale acuta nel ratto. I test utilizzati erano tutti validati ed eseguiti secondo le linee guida OECD per i prodotti farmaceutici.
Il C6S biotecnologico à ̈ stato sottoposto a test di mutagenesi in cellule batteriche (Bacterial reverse mutation, Prot. OECD 471) in cui à ̈ stata indagata la capacità del prodotto di indurre la comparsa di mutanti revertenti in ceppi auxotrofi di E. coli e Salmonella tiphimurium. Nessun aumento significativo nella mutagenicità batterica à ̈ stato osservato.
La genotossicità del C6S biotecnologico à ̈ stata inoltre esaminata in altri due test su colture cellulari eucariotiche, e precisamente il test per le aberrazioni cromosomiche (Chromosome aberrations in chinese hamster ovary cells in vitro, Prot. OECD 473) e un test di mutagenicità su cellule di linfoma murino (Mutation in L5178Y TK<+/+>mouse lymphoma cells, Prot. OECD 476). Nessun aumento significativo della tossicità genetica à ̈ stato rilevato nei due studi citati fino alla concentrazione di C6S più alta utilizzata (5000 µg/piastra e 5000 µg/ml rispettivamente).
Infine, la tossicità acuta dopo somministrazione orale à ̈ stata esaminata in ratti Sprague-Dawley fino alla dose di 2000 mg/kg di peso corporeo. Dopo un’osservazione di 14 giorni successivi alla somministrazione i ratti non hanno mostrato alcun segno clinico di sofferenza e non si à ̈ verificata mortalità . Inoltre, l’esame necroscopico effettuato alla fine dello studio non ha evidenziato segni di tossicità a carico dei tessuti e degli organi esaminati.
Per i previsti impieghi terapeutici o salutistici, il C6S dell’invenzione sarà utilizzato come componente attivo di medicamenti, supplementi dietetici o additivi alimentari, eventualmente in associazione con altri ingredienti attivi quali ad esempio glucosammina cloridrato, glucosammina solfato, N-acetil-glucosammina, acido ialuronico, amminoacidi, collagene, collagene idrolizzato, acidi grassi polinsaturi, cheratina, dermatina, metil-metansulfonato, folati, folati ridotti, vitamine, vitamine del gruppo B, S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o manganese ascorbato.
Esempi di formulazioni secondo l’invenzione comprendono capsule, capsule soft gel, compresse, bevande in forma liquida o bevande in polvere da ricostituire.
I dosaggi del C6S dell’invenzione saranno compresi tra 100 e 3000 mg /die, preferibilmente tra 1000 e 2000 mg/die e più preferibilmente Tra 1250 e 1750 mg/die.
L’invenzione sarà ora descritta in maggior dettaglio nei seguenti esempi.
Esempio 1: induzione dell’artrite (Adjuvant Arthritis, AA) nei ratti e trattamento con C6S biotecnologico a basso peso molecolare
40 ratti Lewis maschi del peso compreso tra 150 - 190 g sono stati suddivisi in modo casuale in quattro gruppi da 10 animali ciascuno, stabulati in gabbie di polipropilene in un ambiente mantenuto alla temperatura di 22 ± 2°C e nutriti con dieta standard da laboratorio e acqua ad libitum.
I gruppi sperimentali erano i seguenti:
1) Un gruppo di controllo sano non trattato(HC).
2) Un gruppo di controllo con artrite indotta da adiuvante non trattato (AC).
3) Un gruppo di ratti artritici trattato oralmente con C6S biotecnologico alla dose di 900 mg/giorno per kg di peso corporeo per 28 giorni a partire dall’induzione della AA (giorni 0 - 28 dell’esperimento) (T).
4) Un gruppo pretrattato oralmente con C6S biotecnologico alla dose di 900 mg/giorno per kg di peso corporeo per 14 giorni precedenti l’induzione della AA e per i successivi 28 giorni dopo l’induzione della AA (gg. -14 - 28 dell’esperimento) (PT).
L’artrite sperimentale à ̈ stata indotta il giorno 0 nei ratti mediante una singola iniezione intradermica di 1 ml una miscela composta da Mycobacterium butyricum inattivato al calore in adiuvante incompleto di Freund alla base della coda.
Il C6S dell'invenzione era disciolto in acqua distillata alla concentrazione di 20 mg/ml e somministrato oralmente come singola dose
giornaliera tramite gavage.
Esempio 2: effetti del C6S biotecnologico sull’assessment della AA nei
ratti mediante controllo del peso corporeo
Il peso corporeo dei ratti era controllato prima dell’induzione della AA
(giorno 0), nei giorni 7, 14, 21 e alla fine del trattamento (giorno 28).
L’effetto del trattamento su questo parametro à ̈ stato valutato confrontando gli
incrementi ponderali dei diversi gruppi nell’arco del periodo di trattamento.
I valori riscontrati sono riportati in Tabella 5:
Tabella 5
Change in body weight: ∆(dayn- day0) Day (dayn) 0 7 14 21 28 Healthy Control (HC) 0,0 98,19 120,93 135,37 148,33 SEM 0,0 1,76 2,01 1,99 2,47 Arthritic Control (AC) 0,0 74,73 76,77 51,93 57,57 SEM 0,0 4,06 7,02 6,05 5,71 LMW-C6S Treatment
(T) 0,0 85,19 89,19 68,39 79,78 SEM 0,0 3,03 5,63 7,52 8,86 LMW-C6S Pre-Treatment (PT) 0,0 92,96 107,26 93,39 108,63 SEM 0,0 2,94 6,48 8,65 8,29
SEM: Standard Error of the Mean
Esempio 3: effetti del C6S biotecnologico sull’assessment della AA nei
ratti mediante controllo dell’edema sviluppato
L’edema sviluppato in conseguenza dell’artrite era misurato osservando
l’aumento del volume della zampa posteriore mediante un calibro adatto alla
misurazione. Le misure sono state effettuate prima dell’induzione della AA (giorno 0) e nei giorni 7,14,21 e 28 dello studio.
I dati sono stati espressi come incremento percentuale dell’edema
calcolato con la seguente formula: [(Dayn/Day0) x 100] - 100, essendo Day0la
misura del giorno iniziale e Daynquella del giorno considerato.
I valori riscontrati sono riportati in Tabella 6:
Tabella 6
Change in hind paw swelling: [(Dayn/Day0) x 100] -100 (%)
Day (dayn) 0 7 14 21 28
Healthy Control (HC) 0,0 17,6 19,3 24,8 29,1
SEM 0,0 1,5 1,4 1,8 2,0
Arthritic Control (AC) 0,0 8,6 31,0 56,7 59,3
SEM 0,0 1,2 4,6 6,5 6,1
LMW-C6S Treatment (T) 0,0 13,1 34,5 62,8 61,4
SEM 0,0 1,0 6,4 8,1 7,1
LMW-C6S Pre-Treatment
(PT) 0,0 15,4 26,7 46,5 49,7
SEM 0,0 1,5 4,9 6,9 7,1
SEM: Standard Error of the Mean
Esempio 4: effetti del C6S biotecnologico sull’assessment della AA nei
ratti mediante controllo dello score artritico
Lo score artritico à ̈ stato valutato attribuendo un punteggio
all’osservazione del rigonfiamento articolare della zampa (edema), dell’entitÃ
dell’eritema periarticolare e il diametro della crosta nel sito di iniezione
dell’adiuvante alla base della coda. Lo score artritico o artogramma viene
misurato come la somma totale tenendo conto dell’edema (in ml, punteggio da
1 a 8), più il diametro della zampa anteriore (in mm, max. punteggio da 1 a 5),
più il diametro della crosta nel sito di applicazione del Mycobacterium butyricum misurata parallelamente alla colonna vertebrale (in mm, max.
punteggio da 1 a 5) per ogni animale.
I valori riscontrati sono riportati in Tabella 7:
Tabella 7
Arthritic score
Day (dayn) 0 7 14 21 28 Healthy Control (HC) 10,0 10,0 10,2 11,4 12,0 SEM 0,0 0,0 0,1 0,3 0,0 Arthritic Control (AC) 10,0 11,0 16,9 22,4 23,2 SEM 0,0 0,4 1,2 1,4 1,3 LMW-C6S Treatment (T) 10,0 10,0 18,1 22,7 23,0 SEM 0,0 0,0 1,7 1,9 1,3 LMW-C6S Pre-Treatment
(PT) 10,0 10,1 13,1 15,8 19,0 SEM 0,0 0,1 0,8 1,3 1,7
SEM: Standard Error of the Mean
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Un condroitin solfato di peso molecolare compreso tra 1000 e 5000 Dalton dotato di attività biologica antiinfiammatoria e antiartritica caratterizzato da una percentuale di disaccaride 6-monosolfato uguale o superiore al 65%, una percentuale di disaccaride 4-monosolfato < 1%, una percentuale di disaccaride 2,6-disolfato inferiore o uguale al 20%, una percentuale di disaccaride 4,6-disolfato < 5%, una percentuale di disaccaride 2,4-disolfato < 1%, una percentuale di disaccaride non solfatato < 15%, un valore di densità di carica compreso tra 1 e 1,25.
- 2. Un condroitin solfato secondo la rivendicazione 1 ottenuto per solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione acida o radicalica del polisaccaride capsulare K4 di E. coli dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi.
- 3. Un condroitin solfato secondo la rivendicazione 1 ottenuto per solfatazione chimica della frazione naturale a basso peso molecolare del polisaccaride capsulare K4 di E. coli effettuata dopo rimozione dei residui di fruttosio mediante idrolisi.
- 4. Un condroitin solfato secondo la rivendicazione 1 ottenuto per solfatazione chimica e successiva depolimerizzazione acida o radicalica del polisaccaride capsulare originariamente privo di residui di fruttosio (K4-d) prodotto dal ceppo batterico di E. coli DSM23644.
- 5. Un condroitin solfato secondo la rivendicazione 1 ottenuto per solfatazione chimica della frazione a basso peso molecolare di polisaccaride capsulare originariamente privo di residui di fruttosio (K4-d) prodotto dal ceppo batterico di E. coli DSM23644.
- 6. Condroitin solfato delle rivendicazioni 1-5 per l’uso nella prevenzione e nel trattamento di stati infiammatori acuti e cronici e/o per il mantenimento del benessere muscolo-scheletrico nell’uomo e nell’animale.
- 7. Condroitin solfato secondo la rivendicazione 6 in cui lo stato infiammatorio à ̈ osteoartrite.
- 8. Composizioni comprendenti il condroitin solfato delle rivendicazioni 1-5 come ingrediente attivo, in associazione con eccipienti farmaceuticamente e nutraceuticamente accettabili ed eventualmente con altri attivi.
- 9. Composizioni secondo la rivendicazione 8 in cui gli altri attivi sono scelti fra glucosammina cloridrato, glucosammina solfato, N-acetil-glucosammina, acido ialuronico, amminoacidi, collagene, collagene idrolizzato, acidi grassi polinsaturi, cheratina, dermatina, metil-metansulfonato, folati, folati ridotti, vitamine, vitamine del gruppo B, S-adenosilmetionina (SAMe), acido ascorbico o manganese ascorbato
- 10. Composizioni secondo la rivendicazione 8 o 9 in forma di capsule, capsule soft gel, compresse, bevande in forma liquida o bevande in polvere da ricostituire.
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