BR112014028904B1

BR112014028904B1 - 6-sulfato de condroitina biotecnológico e composição que compreende o mesmo

Info

Publication number: BR112014028904B1
Application number: BR112014028904-2A
Authority: BR
Inventors: Niccolò Miraglia; Davide Bianchi; Ermanno Valoti; Antonella Trentin; Antonio Trilli; Immacolata Busiello; Marco Agostinetto; Paola Bazza; Marco Valetti
Original assignee: Gnosis S.P.A.
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2022-09-20
Also published as: CY1117636T1; US20160074429A1; EA032748B8; EP2852437A1; DK2852437T3; UA113005C2; CA2874216C; SI2852437T1; IL235803B; MX2014014115A; JP6273264B2; CN104411363A; WO2013174847A1; AU2013265350A1; KR20200006625A; MX368965B; GEP201606585B; US20150152198A1; AU2013265350B2; JP2015517602A

Abstract

6-SULFATO DE CONDROITINA BIOTECNOLÓGICO DE BAIXO PESO MOLECULAR PARA PREVENÇÃO DE OSTEOARTRITE. A presente invenção refere-se a um sulfato de condroitina (CS) de baixo peso molecular (1000 a 5000 daltons) produzido pela sulfatação química e subsequente despolimerização de um arcabouço de condroitina não sulfatado obtido por técnicas de biotecnologia. O CS descrito é substancialmente monosulfatado, principalmente na posição 6, com muito pouca sulfatação na posição 4 e com uma proporção de mono/dissacarídeo e densidade de carga similares aquelas de CS natural. O dito 6-sulfato de condroitina biotecnológico (C6S) é útil no tratamento e prevenção da osteoartrite e em processos inflamatórios agudos e crônicos.

Description

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um sulfato de condroitina (CS) com um peso molecular extremamente baixo (1000 a 5000 daltons) produzido pela sulfatação química e subsequente despolimeriza- ção de um arcabouço de condroitina não sulfatado, obtido com técnicas de biotecnologia ou produzido pela sulfatação de um polissacarídeo de origem biotecnológica, originalmente caracterizado pelo baixo peso molecular e o uso do dito CS no tratamento ou prevenção de osteoartrite e processos inflamatórios agudos e crônicos. Em particular, a invenção se refere a um CS biotecnológico que é substancialmente monosulfatado, principalmente na posição 6, possui pouco ou nenhum 4-sulfato e é idêntico ao CS natural em termos de proporção de dissacarídeo mo- no/disulfatado, a ausência de dissacarídeos tri-sulfatados e polisulfata- dos, a densidade da carga e a atividade biológica exibida. O 6-sulfato de condroitina (C6S) de acordo com a invenção apresenta um peso molecular menor (1000 a 5000 daltons) do que sulfatos de condroitina ex-traídos de tecidos animais de origem terrestre (bovinos, porcinos e aves), caracterizados pelos valores do peso molecular de 14.000 a 26.000 daltons e de origem marinha (tubarão, lula, arraia e peixes ósseos), todos com um peso molecular > 50.000 daltons. O C6S de acordo com a invenção também tem um peso molecular até menor do que de tipos conhecidos de CS de baixo pero molecular. Essa característica dá ao 6-sulfato de condroitina de acordo com a invenção, melhor bio- disponibilidade e consequentemente maior eficiência.

[002] O uso de 6-sulfato de condroitina (C6S) biotecnológico de baixo peso molecular no tratamento e prevenção da osteoartrite é apoiado pela verificação experimental de sua atividade anti-inflamatória em um modelo animal bem conhecido usado normalmente para o estudo da artrite e dos sintomas associados. O C6S biotecnológico de baixo peso molecular descrito também exibe boa tolerância, como demonstrado em estudos toxicológicos conduzidos de acordo com as normas de OEDC para produtos farmacêuticos.

Antecedentes da invenção

[003] O sulfato de condroitina (CS) é recomendado atualmente pelo EULAR (a Liga Europeia contra o Reumatismo) como um fármaco sintomático de ação lenta para a osteoartrite (SYSADOA) no tratamento da osteoartrite do joelho (Jordan KM et al., Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003), quadril (Jordan KM et al. Ann. Rheum. Dis. 62, 1145, 2003) e mão (Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 66, 377, 2007) com base em numerosos achados clínicos e várias meta-análises de testes clínicos. Testes clínicos recentes também demonstraram que CS modifica as estruturas extracelulares do tecido cartilaginosos humano (Reginster JY, Heraud F, Zegels B, Bruyere O. Mini Rev Med Chem 7, 1051, 2007. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Arthritis Rheum 60, 524, 2009). CS também é amplamente usado como um nutracêutico, isolado ou combinado com outros ingredientes ((McAlin- don TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009).

[004] O sulfato de condroitina (CS) é um polissacarídeo natural que pertence à classe dos glicosaminoglicanos (GAG), presente em ambos vertebrados e invertebrados, que consiste em sequências de dissacarídeo formados pelos resíduos alternativos de ácido glicurônico (GlcA) e N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) ligados um ao outro pelas ligações beta 1-3 e sulfatados em diferentes posições.

[005] CS está presente em tecidos de animais, com funções estru turais e fisiológicas. Ele consiste principalmente em dois tipos de unidade de dissacarídeo monosulfatado na posição 4 ou 6 de GalNAc (cha- mados de dissacarídeos A e C, respectivamente), presentes em diferentes percentuais dependendo de sua origem. O arcabouço de CS também contém dissacarídeo não sulfatado, geralmente em pequenas quantidades. Dissacarídeos disulfatados que possuem dois grupos sulfato ligados através do átomo de oxigênio em várias posições, tais como a posição e de GlcA e a posição 6 de GalNAc (dissacarídeo D), a posição 2 de GlcA e a posição 4 de GalNac ou as posições 4 e 6 de GalNAc (dissacarídeo E), podem estar presentes no arcabouço de CS em percentagens variáveis, dependendo das fontes animais específicas (Volpi N. J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N. J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006). A presença de sulfatação na posição 3 de GlcA é possível, mas em quantidades extremamente pequenas; a dita presença é rara em CS de origem terrestre e mais provável em tipos altamente sulfatados de origem marinha (Fongmoon D et al. J Biol Chem 282, 36895, 2007).

[006] A fórmula da unidade de dissacarídeo de repetição de CS é como a seguir:

em que R2, R4 e R6 são independentemente H ou SO3-;

[007] As cargas negativas dos grupos carboxilato e sulfato na uni dade de dissacarídeo de repetição são geralmente neutralizadas pelos íons de sódio.

[008] Os significados dos acrônimos mais comumente usados pa ra identificar os vários dissacarídeos sulfatados estão descritos abaixo:

[009] Amostras de CS que se originam de fontes animais diferen tes também são caracterizadas pelos pesos moleculares e densidades de carga diferentes, esse último parâmetro sendo diretamente correlacionado com os grupos sulfatados específicos.

[0010] Tabela 1 mostra os dissacarídeos principais encontrados no CS natural extraído da cartilagem de várias espécies de animais:

Tabela 1 - Mn = peso molecular numérico médio; Mw = peso molecular ponderado médio; índice de polidispersividade = Mw/Mn; a densidade da carga é o número de grupos sulfato por unidade de dissacarí- deo; ND = não identificado

[0011] Os vários tipos de CS derivados de animais terrestres pos suem parâmetros de massa molecular (Mn e Mw) similares, embora eles sejam diferentes daqueles das espécies marinhas, que possuem valores de massa molecular mais altos. CS de origem terrestre tem um peso molecular médio (Mw) entre 14 e 26 kDa, enquanto que CS de origem marinha, obtido de lula, peixe cartilaginoso e peixe ósseo, tem um peso molecular (Mw) que excede 50 kDa. Amostras de CS terrestre também são caracterizadas pelos valores de densidade da carga (CD) abaixo de 1,0, enquanto que as amostras marinhas sempre têm valores de CD que excedem 1,0.

[0012] Dissacarídeos disulfatados são geralmente presentes em resíduos de CS terrestre e mais abundantes em CS de origem marinha. Além disso, quantidades significativas de dissacarídeos polisulfatados (tri e tetra-sulfatos) não são observados em CS natural.

[0013] CS natural também apresenta diferenças entre diferentes órgãos e tecidos, até na mesma espécie, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 - Mn = peso moecular numérico médio; Mw = peso molecular ponderado médio; índice de polidispersividade = Mn/Mw; a densidade da carga é o número de grupos sulfato por unidade de dissacarí- deo; ND = não identificado.

[0014] A existência de cadeias de polissacarídeo ou oligossacarí- deo de CS com 100% de dissacarídeos 6-sulfato ou 4-sulfato é relatada na literatura para vários tecidos e órgãos (Sampaio L.O. et al. Biol. Chem. 256, 9205, 1981; Okayama E. et al. Blood 72,745, 1988; Ambrosius M. et al. J. Chrom. A 1201, 54, 2008; Volpi N. et al. Clin. Chim. Acta 370, 196, 2006).

[0015] Todas essas características demonstram a extrema hetero- geneidade de CS natural em termos de peso molecular e densidade de carga; entretanto, os parâmetros de acordo com os quais um CS pode ser definido como “similar ao natural" podem ser identificados. Um 6- sulfato de condroitina que tem uma densidade de carga comparável com aquele de CS de origem marinha e é caracterizado pela ausência de padrões de sulfatação anormais se apresenta como estruturalmente similar ao glicosaminoglicano natural. Sua atividade anti-inflamatória comprovada in vivo fornece um suporte adicional para a definição de CS semelhante ao natural e suporta seu uso no tratamento de sintomas correlacionados com distúrbios artríticos.

[0016] Várias tentativas têm sido feitas para encontrar um método biotecnológico para a produção de CS usando micro-organismos como uma fonte precursora de polissacarídeo que possui uma estrutura parcialmente similar àquela de CS e depois usando a sulfatação química para produzir um CS similar ao do tipo natural.

[0017] Algumas bactérias produzem polissacarídeos capsulares com uma estrutura similar a glicosaminoglicanos; por exemplo, Pasteu- rella multocida produz um polissacarídeo idêntico a condroitina não sulfatada (De Angelis P.L., Carbohydrate Res., 337 (17), 1547, 2002). Entretanto, a cepa de Escherichia coli com o sorotipo O5:K4:H4 produz um polissacarídeo capsular com um arcabouço de condroitina que carrega um resíduo de β-frutose ligado na posição 3 da unidade GlcA (polissa- carídeo K4).

[0018] Um exemplo de produção de CS biotecnológico que começa com um polissacarídeo K4 capsular de E. coli O5:K4:H4 está relatado em EP 1304338, que descreve um processo, no qual o polissacarídeo K$, produzido em culturas líquidas, é extraído e purificado, depois re- dissolvido e submetido à hidrólise ácida para eliminar os resíduos de frutose ligados a resíduos de GlcA do polímero.

[0019] O polímero defrutosilado, idêntico ao arcabouço não sulfata do de CS (CH) é então sulfatado na posição 4 ou 6 do resíduo de Gal- NAc de acordo com vários métodos de síntese química, para produzir um CS com peso molecular entre 6 e 25 kDa. Entretanto, o CS biotec- nológico descrito em EP 1304338 não foi avaliado de modo algum quanto a sua atividade anti-inflamatória e anti-artrite e seu uso no tratamento da artrite e/ou da osteoartrite permanece uma mera hipótese. Isso é particularmente importante já que apenas 70% do polissacarídeo descrito em EP 1304338 tem, definitivamente, a estrutura de um sulfato de condroitina natural, os 30% restantes sendo principalmente condroi- tina não sulfatada (CH). Além disso, oligossacarídeos com um peso molecular de menos do que 5 kDa não são considerados.

[0020] Uma publicação recente (Bedini E. et al. Angew Chem. Int. Ed Engl. 2011) descreve um processo em que o polissacarídeo K4 produzido é sulfatado na posição 4 e/ou na posição 6 do resíduo de Gal- NAc na mesma cadeia. Mais uma vez. O CS biotecnológico descrito não é avaliado quanto a atividade anti-inflamatória ou anti-artrite e seu uso no tratamento e prevenção da artrite e/ou osteoartrite e os processos inflamatórios correlacionados não está avaliado. Os mesmos autores postulam a presença de modificações estruturais para a cadeia de CS biotecnológico que deriva de seu processo de síntese, o que produz a sulfatação anormal do grupo hidroxila em C3 de GlcA, devido à baixa proteção desse grupo durante o processo de síntese. Essa anomalia é conhecida por causar séria toxicidade em humanos depois da administração intravenosa de heparina, em que o dito CS 3-sulfatado em GlcA estava presente como um contaminante. Embora essa toxicidade não tenha sido observada nunca em relação à administração oral de CS, o risco de efeitos tóxicos devido a esse tipo de sulfatação anômala permanece; isso também está indicado pelos mesmos autores em outra publicação recente (Bedini E. et al. Chem. J. 2012 [Epub antes da impressão]).

[0021] Além disso, o CS biotecnológico descrito por Bedini et al. (Angew Chem Int Ed Engl. 2011) tem um peso molecular em torno de 17 kDa e portanto, exibe potencialmente a baixa biodisponibilidade de produtos naturais de origem extrativista. Por todas essas razões, o CS biotecnológico descrito por Bedini et al. é improvável de ser usado no tratamento e na prevenção de artrite e/ou osteoartrite.

[0022] Exemplos de tipos de baixo peso molecular de CS para uso no tratamento de artrite existem (Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000), mas eles são todos obtidos pela despolimerização de CS de origem animal, o que significa que a presença de vírus, príons e outros agentes infecciosos transmissíveis não pode ser descartada.

Breve Descrição das figuras

[0023] Figura 1: Aumento no peso corporal de ratos que sofrem de Artrite Adjuvante (AA) depois do tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular: Chave: HC, controle saudável; AC, controle artrítico; T, grupo tratado com C6S (dias 0 a 28); PT, grupo pré-tratado com C6S (dias -14 a 28). Valores expressos em g ± SEM.

[0024] Figura 2: Avaliação do edema nas patas traseiras de ratos que sofrem de Artrite Adjuvante (AA) depois do tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular. Chave: HC, controle saudável; AC, controle artrítico; T, grupo tratado com C6S (dias 0 a 28); PT, grupo pré-tratado com C6S (dias -14 a 28). Percentual de aumento: medida efetuada como aumento em volume(ml), cálculo da percentagem: [(Di- an/Diao) x 100] - 100. Valores expressos como % ± SEM.

[0025] Figura 3: Progressão do estado edematoso durante o estu do em ratos que sofrem de Artrite Adjuvante (AA) depois do tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular. Chave: HC, controle saudável; AC, controle artrítico; T, grupo tratado com C6S (dias 0 a 28); PT, grupo pré-tratado com C6S (dias -14 a 28). Avaliação do percentual de aumento em volume 0, 7, 14, 21 e 28 dias depois da indução de AA. Valores expressos como %.

[0026] Figura 4: Escore da artrite em ratos que sofrem de Artrite Adjuvante (AA) depois do tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular. Chave: HC, controle saudável; AC, controle artrítico; T, grupo tratado com C6S (dias 0 a 28); PT, grupo pré-tratado com C6S (dias -14 a 28). Escore: edema periarticular e eritema das patas diantei- ras (1 - 5), edema periarticular e eritema das patas traseiras (1 - 8), diâmetro da cicatriz na base da cauda (1- 5). Os valores são expressos em unidades ± SEM.

[0027] Figura 5: Progressão do escore da artrite durante o estudo em ratos que sofrem de Artrite Adjuvante (AA) depois do tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular. Chave: HC, controle saudável; AC, controle artrítico; T, grupo tratado com C6S (dias 0 a 28); PT, grupo pré-tratado com C6S (dias -14 a 28). Avaliação do escore 0, 7, 14, 21 e 28 dias depois da indução de AA. Valores expressos em unidades.

Descrição da invenção

[0028] Foi descoberto agora que o sulfato de condroitina (CS) com baixo peso molecular, entre 1000 e 5000 daltons ou preferivelmente entre 2000 e 4000 daltons, produzido pela sulfatação química e subsequente despolimerização de um arcabouço de condroitina não sulfatado obtido pelas técnicas biotecnológicas, tem uma atividade anti- inflamatória comparável com aquela de CS natural, biodisponibilidade aperfeiçoada e perfil de segurança favorável. O CS descrito é substancialmente monosulfatado, principalmente na posição 6, com muito pouca sulfatação na posição 4 e com uma proporção de dissacarídeo mo- no/disulfatado e densidade de carga similares aquelas de CS natural.

[0029] O CS de acordo com a invenção apresenta todas as caracte rísticas de um CS natural e, mais especificamente de CS de origem marinha. Ele tem percentuais relativos similares de dissacarídeos mono e disulfatados, distribuição similar de dissacarídeos disulfatados e consequentemente uma densidade de carga (CD) similar associada com uma proporção baixa de 4-sulfato/6-sulfato.

[0030] O CS biotecnológico de acordo com a invenção tem as se guintes características especiais: um peso molecular muito baixo (entre 1000 e 5000 daltons ou preferivelmente entre 2000 e 4000 daltons); um percentual particularmente alto de dissacarídeos 6-sulfatados; e uma ausência quase total de dissacarídeos trisulfatados; ausência substancial de sulfatação na posição 3 do resíduo de GlcA. Em particular, a presença de dissacarídeos trisulfatados e dissacarídeos sulfatados na posição 3 de GlcA caracteriza os tipos conhecidos de CS sintético e geralmente causa efeitos adversos em sua aplicação terapêutica.

[0031] A Tabela 3 mostra as características físico-químicas do 6- sulfato de condroitina biotecnológico de acordo com a invenção. Tabela 3

[0032] DE ACORDO COM UM ASPECTO PARTICULAR DA INVENÇÃO, C6S PO de ser obtido pelo processo da síntese química descrito no PCT/EP2011/058297 aplicado ao polissacarídeo capsular K4 produzido naturalmente pela cepa de E. coli O5:K4:H4 (WO 01/02597) previamente desfrutosilado pela hidrólise termoácida de acordo com técnicas conhecidas (Rodriguez and Jann, Eur.J.Biochem. 117, 117-124, FEBS 1988) ou com qualquer outro polissacarídeo com a estrutura de condroi- tina não sulfatada. Alternativamente, a condroitina não sulfatada de partida (CH) pode ser obtida a partir de culturas da cepa de E.coli DSM23644 descrita no WO 2012004063 que, devido a uma mutação induzida no gene KfoE responsável pela frutosilação de K4, produz um polissacarídeo idêntico a CH não sulfatada natural. De acordo com esse aspecto da invenção, o polissacarídeo sofre sulfatação química, preferi-velmente de acordo com o método descrito no PCT/EP2011/058297.

[0033] Resumidamente, o processo de síntese que leva à sulfata- ção das unidades de dissacarídeo é como a seguir: a) A condroitina não sulfatada, isolada como sal de amônia ou como qualquer um dos sais de metal alcalino e particularmente como sal de sódio ou como sal de potássio ou como sal de lítio obtido depois da desfrutosilação do polissacarídeo K4 é dessalinizada em resina de troca de cátion e ressalinizada com um grupo hidróxido de alquilamônia, preferivelmente com hidróxido de tetrabutilamônia adicionado em uma quantidade esteoquiométrica de até um pH de 7 - 7,5 e seca por liofilização ou secagem por pulverização. b) O sal de tetrabutilamônia de CH descrito na etapa a) é adicionado sob agitação a uma solução que consiste de um solvente polar aprótico, preferivelmente dimetilformamida (DMF), mantido em uma temperatura entre 0 e 30°C; o complexo de sulfatação é então adicionado em uma proporção molar entre 2 e 5 para a CH, mantendo a temperatura constante e com agitação. c) Finalmente, uma quantidade de bicarbonato de sódio é adicionada em uma proporção molar estequiométrica para o agente de sulfatação ou em excesso, ao mesmo tempo aumentando a temperatura para 65°C para evaporar o solvente. A água é adicionada, seguida pela redestilação. A solução final é ultrafiltrada e dialisada. Finalmente, o sal de sódio de CS é filtrado e seco sob vácuo até uma umidade residual abaixo de 10%.

[0034] As dimensões moleculares do CS obtido são então reduzi das pelo processo de despolimerização de acordo com a despolimeri- zação de radical conhecida (Volpi N. et al., Carb. Res., 279, 193-200, 1995) ou as técnicas de despolimerização ácida, controlando o processo de modo a obter a distribuição de peso molecular requerida.

[0035] A despolimerização ácida é realizada pela resuspensão do CS em água, acidificando a solução com a adição de HCl até uma con-centração de 1M e aquecendo a 60°C.

[0036] O peso molecular dos oligossacarídeos gerados pela despo- limerização é calculado retirando amostras da solução em curtos intervalos, determinando o peso molecular dos oligossacarídeos pela análise SEC-HPLC realizada em duas colunas Agilent Bio Series SEC© -5 (monocamada polimérica neutra hidrofílica) de 300 e 150 Á, respectivamente, em série. A reação é interrompida pela neutralização com NaOH ou bicarbonato de sódio, tal que o pH é ajustado para 6-8 quando os valores da massa molecular desejada são alcançados.

[0037] Alternativamente, a despolimerização pode ser obtida pela hidrólise radical, controlando o peso molecular final dos oligossacarí- deos resultantes como previamente descrito.

[0038] O CS é resuspenso em água e o pH é corrigido para 7,5 pe la adição de ácido hidroclórico 10% ou solução de hidróxido de sódio, dependendo se a solução de CS necessita ser acidificada ou basificada. Uma solução 9% de peróxido de hidrogênio (H2O2) é adicionada à solução mantida a 60°C. SEC-HPLC é realizada como previamente descrito para verificar se o peso molecular desejado foi alcançado. A reação é interrompida pelo resfriamento da solução até a temperatura ambiente (20-25°C) e diminuindo o pH para 6,0.

[0039] A Tabela 4 mostra os valores do peso molecular típicos de um oligossacarídeo analisado com SEC-HPLC durante as etapas de reação até o final da despolimerização. Tabela 4

[0040] O C6S DE ACORDO COM A INVENÇÃO TAMBÉM PODE SER OBTIDO pela sulfatação química de acordo com procedimentos previamente indicados, usando como substrato a fração de baixo peso molecular do polissacarídeo K4 que deriva da fermentação da cepa de E.coli O5:K4:H4. Nesse caso, o caldo de cultura é tratado no final da fermentação pelo aquecimento a 80°C por 60 minutos para desativar o microrganismo e é então centrifugado e ultrafiltrado como no EP 1304338; o sobrenadante resultante é então carregado sobre uma coluna de filtração em gel e as frações são coletadas, avaliando o conteúdo de ácido urônico de cada uma pelas técnicas conhecidas. Pela combinação das frações que são positivas para o teste de ácido urônico, dois pools separados podem ser isolados: um primeiro pool que contém K4 de alto peso molecular (40 a 70 kDa), que corresponde ao polissacarídeo conhecido e corresponde quantitativamente que corresponde a 80% dos sacarídeos totais e um segundo pool, claramente separado do primeiro com base no volume de eluição e que contém K4 de baixo peso molecular, com baixa dispersão em torno do valor médio, entre 1500 e 6000 daltons. A identidade dos oligossacarídeos contidos no dito segundo pool de baixo peso molecular com K4 é demonstrada pela resposta po- sitiva simultânea ao ensaio do ácido urônico e digestibilidade com a condroitinase ABC, acompanhada pelo aparecimento de unidades de dissacarídeo.

[0041] A dita fração de oligossacarídeo K4, que representa quanti tativamente 20% do total de sacarídeos, é então submetida à desfrutosi- lação e ao processo de sulfatação química descrito no PCT/EP2011/058297 até que um CS com um peso molecular final na faixa de 1000 a 5000 daltons é obtido.

[0042] Alternativamente, um C6S biotecnológico de baixo peso mo lecular pode ser obtido por um processo similar aquele previamente descrito, que envolve a sulfatação da fração de baixo peso molecular do oligossacarídeo K4-d desfrutosilado naturalmente recuperado da fermentação da cepa de E.coli DSM23644 descrita no WO 2012004063.

[0043] O C6S de baixo peso molecular assim obtido foi avaliado quanto à eficácia em um modelo experimental de artrite em animal (Artrite Adjuvante: AA) no rato e os resultados obtidos foram comparados com aqueles que se relacionam com CS farmacêutico de grau natural de origem extrativa usado no mesmo modelo experimental (Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011) depois do tratamento oral diário com 900 mg/kg.

[0044] AA foi induzida com uma única injeção intradérmica de Mycobacterium butyricum em adjuvante incompleto de Freund. O estudo envolveu um grupo de animais saudáveis (HC), um grupo de animais com artrite não tratada (AC) e dois grupos de animais artríticos tratados com dois regimes diferentes. O primeiro regime de tratamento envolvia o pré-tratamento que consistiu na administração de 900 mg/kg de C6S biotecnológico por dia por 14 dias antes que a artrite fosse induzida, continuando por 28 dias depois da indução de AA (PT). O segundo regime de tratamento envolveu a administração de 900 mg/kg de C6S bio- tecnológico por dia durante os 28 dias depois da indução de AA (T).

[0045] O aumento fisiológico no peso corporal dos ratos foi muito pequeno nos animais artríticos não tratados (AC), correspondendo a cerca de 40% daquele dos controles saudáveis no final do estudo. O pré-tratamento com C6S biotecnológico (grupo PT) limitou essa redução: o aumento no peso corporal correspondeu a 73% daquele dos controles saudáveis. O tratamento sozinho (T) também se mostrou eficaz na restauração do peso corporal, embora em menor extensão (um aumento de 54% comparado com os controles saudáveis) (Figura 1). Isso é atribuível ao papel anti-inflamatório do C6S biotecnológico de baixo peso molecular a nível sistêmico. Esse efeito sobre o aumento no peso corporal dos animais é maior do que aquele encontrado no estudo de Bauerova et al., conduzido com um CS de alto peso molecular de origem bovina na mesma dose (Bauerova K. et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 1373, 2011). Esse achado confirma a maior absorção intestinal do C6S biotecnológico de acordo com a invenção.

[0046] A severidade da artrite foi quantificada com base nos níveis crescentes de aumento de volume das patas (edema); o edema que se desenvolveu na pata traseira foi significativamente reduzido nos animais pré-tratados (PT) (Figura 2). O pré-tratamento com C6S biotecnológico reduziu significativamente o edema ao longo do estudo comparado com os controles não tratados (Figura 3).

[0047] O pré-tratamento também se mostrou eficaz na redução do escore total da artrite, um parâmetro que leva em consideração um conjunto de fatores clínicos que compreendem o edema periarticular, edema desenvolvido e o diâmetro da cicatriz no sítio de injeção do adjuvante na base da cauda. A escala de avaliação da artrite atribui um escore entre 6 e 31; o grupo de controle com artrite (AC) obteve um valor de 23, enquanto que o grupo PT alcançou um valor de 19 contra 12 para os controles saudáveis (HC) (Figura 4). Além disso, o pré-tratamento provou ser eficaz ao longo da fase subaguda do dia 1 ao dia 28 depois da indução de AA (Figura 5). O grupo só com tratamento (T) não influenciou signifi-cativamente o escore da artrite durante o período de estudo.

[0048] O C6S de acordo com a invenção também foi testado quanto a sua segurança toxicológica em animais e em culturas celulares de acordo com vários protocolos designados para avaliar sua potencial ge- notoxicidade a nível celular e toxicidade oral aguda no rato. Todos os testes usados foram validados e conduzidos de acordo com as normas de OECD para produtos farmacêuticos.

[0049] O C6S biotecnológico foi submetido a testes de mutagêne- se em células bacterianas (mutação bacteriana reversa, Ref. OECD 417) que testou a habilidade do produto em induzir o aparecimento de mutantes reversos em cepas auxotróficas de E. coli e Salmonella typhimurium. Não foi observado nenhum aumento significativo na mu- tagenicidade.

[0050] A genotoxicidade de C6S biotecnológico também foi exami nada em dois outros testes em culturas de células eucarióticas, a saber o teste para aberrações cromossômicas em células de ovário de hamster chinês in vitro (OECD, Ref. 473) e um teste de mutagenicidade em células de linfoma de murino (Mutação em células L5178Y TK+/+ de lin- foma de camundongo, Prot. OECD 476). Nenhum aumento significativo na toxicidade genética foi encontrado nos dois estudos citados até na concentração mais alta de C6S usada (5000 μg/placa e 5000 μg/ml respectivamente).

[0051] Finalmente, a toxicidade aguda depois da administração oral foi examinada em ratos Sprague-Dawley até a dose de 2000 mg/kg de peso corporal. Depois de observar durante 14 dias depois da administração, os ratos não mostraram quaisquer sinais clínicos de sofrimento e nenhuma mortalidade ocorreu. Além disso, a autópsia realizada no final do estudo não indicou quaisquer sinais de toxicidade nos tecidos e órgãos examinados.

[0052] Para os usos terapêuticos e de saúde propostos, o C6S de acordo com a invenção será usado como ingrediente ativo de medicamentos, suplementos dietéticos e aditivos alimentícios, possivelmente combinado com outros ingredientes ativos tais como hidrocloreto de gli- cosamina, sulfato de glicosamina, N-acetilglicosamina, ácido hialurôni- co, aminoácidos, colágeno, colágeno hidrolisado, ácidos graxos polinsa- turados, queratina, dermatina, metil-sulfonilmetano (MSM), folatos, fola- tos reduzidos, vitaminas, vitaminas do grupo B, S-adenosilmetionina (SAMe), ácido ascórbico ou ascorbato de manganês.

[0053] Exemplos de formulações de acordo com a invenção inclu em cápsulas, cápsula de gelatina macia, comprimidos, bebidas em forma líquida e bebidas em pó para serem reconstituídas.

[0054] As doses do C6S de acordo com a invenção estarão entre 100 e 3000 mg/dia, preferivelmente entre 1000 e 2000 mg/dia e mais preferivelmente entre 1250 e 1750 mg/dia.

[0055] A invenção será descrita agora em mais detalhes nos se guintes exemplos.

Exemplo 1: indução de artrite (Artrite Adjuvante, AA) em ratos e tratamento com C6S biotecnológico de baixo peso molecular

[0056] 40 ratos Lewis machos pesando entre 150 e 190 g foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de 10 animais cada, abrigados em gaiolas de polipropileno em um ambiente mantido na temperatura de 22 ± 2°C e alimentados com uma dieta de laboratório padronizada com acesso ilimitado a água.

[0057] Os grupos experimentais eram os seguintes: 1) Um grupo de controle saudável não tratado (HC) 2) Um grupo de controle não tratado com artrite induzida por adjuvante (AC). 3) Um grupo de ratos artríticos oralmente tratados com C6S biotecnológico na dose de 900 mg/dia por kg de peso corporal por 28 dias depois da indução de AA (dias 0 a 28 do experimento) (T). 4) Um grupo oralmente pré-tratado com C6S biotecnológico na dose de 900 mg/dia por kg de peso corporal por 14 dias que precedem a indução de AA, e por 28 dias depois da indução de AA (dias -14 a 28 do experimento) (PT).

[0058] A artrite foi induzida experimentalmente nos ratos no dia 0 por uma única injeção intradérmica na base da cauda de 1 ml de uma mistura que consiste em Mycobacterium butyricum inativado pelo calor em adjuvante incompleto de Freund.

[0059] O C6S da invenção foi dissolvido em água destilada na con centração de 20 mg/ml e administrado oralmente como uma dose única diária por gavagem.

Exemplo 2: efeitos de C6S biotecnológico sobre a avaliação de AA em ratos pelo monitoramento do peso corporal

[0060] O peso corporal dos ratos foi medido antes da indução de AA (dia 0 nos dias 7, 14 e 21 e no final do tratamento (dia 28)). O efeito do tratamento sobre esse parâmetro foi avaliado pela comparação dos aumentos de peso dos diferentes grupos durante o período de tratamento.

[0061] Os valores encontrados estão relatados na Tabela 5: Tabela 5

SEM: Erro Padrão da Média

Exemplo 3: efeitos de C6S biotecnológico sobre a avaliação de AA em ratos pela monitoração do edema desenvolvido

[0062] O edema que se desenvolveu como uma consequência da artrite foi medido pela observação do aumento no volume da pata traseira com um paquímetro adequado para a medida. As medidas foram realizadas antes da indução de AA (dia 0) e nos dias 7, 14, 21 e 28 do estudo.

[0063] Os dados foram expressos como percentual do

[0064] As datas foram expressas conforme o aumento percentual no edema calculado com a seguinte fórmula: [(Dian/Dia0) x 100] -100, Dia0 sendo a medida no dia inicial e Dian a medida no dia considerado.

[0065] Os valores encontrados estão relatados na Tabela 6: Tabela 6

SEM: Erro Padrão da Média

Exemplo 4: efeitos de C6S biotecnológico sobre a avaliação de AA em ratos pelo monitoramento do escore da artrite

[0066] O escore da artrite foi avaliado pela alocação do escore para a observação do aumento de volume da articulação da pata (edema), a extensão do eritema periarticular e o diâmetro da cicatriz no sítio da injeção do adjuvante na base da cauda. O escore da artrite ou artrograma foi medido como a soma total do edema (em ml, escore de 1 a 8), mais o diâmetro da pata da frente (em mm, escore max de 1 a 5), mais o diâmetro da cicatriz no sítio da aplicação de Mycobacterium butyricum medido em paralelo com a coluna vertebral (em mm, escore max. 1 a 5) para cada animal.

[0067] Os valores encontrados estão relatados na Tabela 7: Tabela 7

Claims

1. Sulfato de condroitina que apresenta um peso molecular que varia entre 1000 e 5000 daltons, caracterizado pelo fato de que compreende: um percentual de 6-monosulfato de dissacarídeo igual ou maior do que 65%, um percentual de 4-monosulfato de dissacarídeo < 1%, um percentual de 2,6-disulfato de dissacarídeo menor ou igual a 20%, um percentual de 4,6-disulfato de dissacarídeo < 5%, um percentual de 2,4-disulfato de dissacarídeo < 1%, um percentual de dissacarídeo não sulfatado < 15% e um valor de densidade de carga que varia entre 1 a 1,25.

2. Sulfato de condroitina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtido pela sulfatação química e subsequente despolimerização ácida ou de radical do polissacarídeo capsular K4 de E. coli depois da remoção dos resíduos de frutose por meio de hidrólise.

3. Sulfato de condroitina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtido pela sulfatação química da fração natural de baixo peso molecular do polissacarídeo capsular K4 de E. coli depois da remoção dos resíduos de frutose por meio de hidrólise.

4. Sulfato de condroitina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtido pela sulfatação química e subsequente despolimerização ácida ou de radical do polissacarídeo capsular originalmente livre de resíduos de frutose (K4-d), produzido pela cepa DSM23644 de E. coli.

5. Sulfato de condroitina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtido pela sulfatação química da fração natural de baixo peso molecular do polissacarídeo capsular origi- nalmente livre de resíduos de frutose (K4-d), produzido pela cepa DSM23644 de E. coli.

6. Sulfato de condroitina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção e tratamento de condições inflamatórias agudas ou crônicas e/ou para a preservação da saúde musculoesquelética em humanos e animais.

7. Sulfato de condroitina de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a condição inflamatória é a osteoartrite.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende sulfato de condroitina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, como ingrediente ativo, para uso em combinação com ex- cipientes farmaceuticamente e nutraceuticamente aceitáveis e opcionalmente com outros ingredientes ativos.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os outros ingredientes ativos são selecionados dentre hidrocloreto de glicosamina, sulfato de glicosamina, N- acetilglicosamina, ácido hialurônico, aminoácidos, colágeno, colágeno hidrolisado, ácidos graxos polinsaturados, queratina, dermatina, metil- sulfonilmetano (MSM), folatos, folatos reduzidos, vitaminas, vitaminas do grupo B, S-adenosilmetionina (SAMe), ácido ascórbico ou ascorba- to de manganês.

10. Composição de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ca-racterizada pelo fato de que está na forma de cápsulas, cápsula de gelatina macia, comprimidos, bebidas em forma líquida e bebidas em pó para serem dissolvidas.