BR112014014454B1 - glicosaminoglicanos não anti-coagulativos compreendendo unidade de dissacarìdo repetida e seus usos médicos - Google Patents

Abstract

GLICOSAMINOGLICANOS NÃO ANTI-COAGULATIVOS COMPREENDENDO UNIDADE DE DISSACARÍDO REPETIDA E SEUS USOS MÉDICOS. A presente invenção refere-se a um glicosaminoglicano quimicamente modificado com uma atividade do anti -fator II inferior a 10 UI/mg, uma atividade deo anti-fator Xa inferior a 10 UI/mg e um peso molecular médio (Mw, peso médio) a partir de cerca de 4,6 a 6,9 kDa. É descrito também um método de preparar os glicosaminoglicanos modificados e seus usos médicos.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a novos glicosaminoglicanos modificados com baixa atividade anticoagulante e método para a produção dos mesmos. O método de produção é especificamente adaptado para produzir heparinas modificadas e sulfatos de heparan com alta biodisponibilidade seguinte, por exemplo, de injeção parenteral e alta estabilidade estrutural, resultando em armazenamento e propriedades de manipulação favoráveis.

Antecedentes

[002] A heparina é um polissacarídeo polidisperso de ocorrência natural que inibe a coagulação, processo pelo qual ocorre a trombose. A heparina consiste de cadeias não ramificadas de polissacarídeos, de variados comprimentos e pesos moleculares. Cadeias de peso molecular de 5.000 a mais de 40.000 daltons, representam a heparina de grau farmacêutico.

[003] A heparina, derivada de fontes naturais, principalmente intestino de suínos ou tecido de pulmão bovino, pode ser administrada terapeuticamente para a prevenção e tratamento de trombose. No entanto, os efeitos da heparina não fracionada podem ser difíceis de prever. Durante o tratamento da trombose com heparina não fracionada, os parâmetros de coagulação devem ser monitorados de perto para anticoagulação. evitar a sobre- ou sub-

[004] Várias marcas de heparinas e heparinas de baixo peso molecular (HBPM) , tais como dalteparina e enoxaparina, estão disponívei s para os tratamentos que se baseiam em suas atividades anticoagulante. Um grande número de estudos in vitro e pesquisas experimentais em animais, e até mesmo ensaios clínicos, indicam que a heparina e os seus derivados possuem propriedades benéficas além daquelas relacionadas com o seu efeito anticoagulante. No entanto, as heparinas e HBPM existentes não são adequadas para tratar outras condições médicas, devido ao risco de sangramento associado com o efeito anticoagulante. Embora HBPMs representem vantagens clínicas significativas comparadas com a heparina, esta classe de substâncias, por definição, ainda retém alta atividade anticoagulante que pode dar origem a efeitos colaterais potencialmente com risco de vida.

[005] Por ter a possibilidade de ser administrada por via subcutânea e não requerer monitoramento TTPA, a HBPM permite o tratamento ambulatorial de condições tais como a trombose venosa profunda ou embolia pulmonar, que anteriormente implicavam na hospitalização do paciente para administração da heparina não fracionada.

[006] A dalteparina HBPM tem mostrado diminuir o parto prolongado em mulheres que recebem a profilaxia para trombose venosa profunda. Acredita-se que o mecanismo envolva níveis aumentados de interleucinas induzidos por dalteparina, resultando em uma reação inflamatória favorável que promove o amadurecimento do colo do útero. Além disso, a dalteparina tem mostrado aumentar a contractilidade do útero (Acta Obstetrícia et Gynecologica, 2010; 89: 147-150).

[007] No entanto, heparina e HBPM não são adequadas para prevenir ou tratar de tais enfermidades por uma série de razões. Primeiro, heparina e HBPM possuem conhecidos efeitos anticoagulantes significativos, que restringem seus usos no final da gravidez e durante o parto, tanto para uso profilático quanto agudo, devido ao risco de sangramento. Por exemplo, o uso da dalteparina é estritamente contraindicado quando é dada anestesia epidural, uma medida frequentemente tomada durante o nascimento da criança. Em segundo lugar, a heparina tem sido associada com trombocitopenia induzida por heparina, uma grave reação imune mediada pelo fármaco, que pode ocorrer em qualquer paciente exposto à heparina. Ela é uma doença protrombótica potencialmente devastadora, causada por anticorpos dependentes da heparina que se desenvolvem ou depois de um paciente estar sob heparina por 5 ou mais dias, ou se o paciente teve exposição prévia à heparina. Outro possível efeito adverso do tratamento a longo prazo com heparina é que ela pode induzir a desmineralização dos ossos e causar osteoporose.

[008] Várias tentativas têm sido feitas para erradicar ou reduzir a atividade anticoagulante das heparinas ou heparinas de baixo peso molecular, a fim de fornecer as heparinas pouco anticoagulantes (LAHs), que visam beneficiar de outros potenciais efeitos clínicos das cadeias de heparina além do efeito anticoagulante, sem levar ao risco de efeitos adversos associados com a heparina, predominantemente hemorragias. No entanto, existem experiências clínicas limitadas deste tipo de heparinas e até agora nenhum desses produtos são permitidos para uso clínico.

[009] A patente européia 1059304 descreve a heparina enzimaticamente degradada ou oxidada, resultando em um produto com baixo efeito anticoagulante, possuindo um peso molecular médio de 9 a 13 kDa, que é sugerido para o tratamento de doenças neurodegenerativas.

[010] A patente norte-americana 4,990,502 demonstra uma maneira de tratar a heparina nativa para clivar os resíduos dos resíduos de pentassacarídeos despolimerização seguinte, que resulta em uma heparina pouco anticoagulants de baixo peso molecular, com um peso molecular médio de 5,8 a 7,0 kDa. Em US 4,990,502, métodos demorados, tal como uma diálise por cerca de 15 horas, são usados para finalizar o processo de oxidação. Tais processos podem afetar a distribuição do peso molecular do produto final. Controlar o peso molecular e o comprimento das cadeias de polissacarídeos é essencial para se obter o efeito biológico desejado do composto.

[011] A biodisponibilidade das heparinas de cadeia longa após a dose por via subcutânea é baixa e a possibilidade de indução da trombocitopenia induzida pela heparina (TIH) está também correlacionada positivamente com os comprimentos de cadeia. Para reduzir estas propriedades clinicamente indesejadas, o derivado de heparina não deve ser de comprimento total. Cadeias de heparina de determinado peso molecular, podem ser obtidas por fracionamento da heparina padrão. No entanto, a produção de derivados de heparina de peso molecular médio ou baixo por métodos de fracionamento, tais como cromatografia de filtração em gel, precipitação com álcool e de troca iônica, está associada com uma perda significativa da matéria-prima, como heparinas de alta massa molecular que são então descartadas.

[012] A presente invenção conforme descrita nas seções seguintes, descreve um novo processo em que as cadeias de polissacarídeos são encurtadas, e uma distribuição de peso molecular médio adequada será alcançada favorecendo o seu uso clínico e reduzindo o risco associado com cadeias de polissacarídeos maiores junto com uma perda mínima de matéria-prima.

Breve descrição das figuras

[013] A figura 1 mostra um esquema de síntese de uma heparina pouco anticoagulante de acordo com a invenção.

[014] A figura 2 mostra os resultados do estudo de estabilidade do fármaco.

[015] A figura 3 mostra os resultados do estudo de estabilidade em relação ao produto farmacêutico.

Sumário

[016] A presente invenção refere-se a glicosaminoglicanos quimicamente modificados, selecionados a partir de heparinas e sulfatos de heparan, com uma atividade do anti-fator II inferior a 10 UI/mg, uma atividade do anti-fator Xa inferior a 10 UI/mg e um peso molecular médio (peso médio, Mw) a partir de cerca de 4,6 a 6,9 kDa, em que: - as cadeias de polissacarídeos possuem de 2 a 20 (n na Fórmula I) unidades de polímero de dissacarídeo, correspondentes a pesos moleculares entre 1,2 e 12 kDa; -o sacarídeo que ocorre predominantemente é (Fórmula I):

em que

n é um número inteiro de 2 a 20

[017] A invenção refere-se ainda aos usos dos mesmos e método para a sua produção.

Descrição detalhada da invenção

[018] Em termos gerais, a presente invenção refere-se a heparinas quimicamente modificadas e sulfatos de heparan, que são preparados seletivamente para manter os efeitos terapêuticos a partir das cadeias de polissacarídeos e para produzir uma distribuição de tamanho ótimo das cadeias de polissacarídeos para garantir uma elevada biodisponibilidade e estabilidade, enquanto também possuem um baixo efeito anticoagulante e desta forma eliminam essencialmente o risco de sangramento.

[019] A presente invenção também irá garantir um processo de rendimento elevado, o qual pode ser aumentado para produzir um produto comercializado com um custo de mercadorias favorável. Tanto o custo de produção quanto a importantes na procura por um produto farmacêutico. A possibilidade de modificar heparinas não fracionadas em um derivado farmacologicamente aceitável, com uma distribuição de comprimento de cadeia favorável, permite a administração por via parenteral com uma elevada biodisponibilidade. Além disso, permitiria tratamentos fora do hospital, tal como o auto-tratamento, o que é benéfico do ponto de vista socioeconômico.

[020] Um número de termos e definições é usado no contexto seguinte da descrição da invenção em um contexto geral e detalhado ou experimental.

[021] Deve ser notado que conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma," e "o", "a", incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[022] Além disso, o termo "cerca de" é usado para indicar um desvio de +/- 2% do valor determinado, de preferência +/- 5% e mais preferivelmente +/- 10% dos valores numéricos, onde aplicável.

[023] A heparina é um glicosaminoglicano de ocorrência natural, que é sintetizado e armazenado intracelularmente nos chamados mastócitos, em seres humanos e animais. Preparada industrialmente, principalmente a partir da mucosa intestinal de suínos, a heparina é um anticoagulante potente e tem sido usada clinicamente por mais de 6 0 anos como o fármaco de preferência para a profilaxia e tratamento de desordens tromboembólicas. Os principais efeitos potenciais adversos do tratamento com heparina são complicações hemorrágicas, causadas por suas propriedades anticoagulantes.

[024] A heparina é altamente polidispersa e composta por uma população heterogênea de polissacarídeos com pesos moleculares que variam de 5 a 40 kDa, com a média sendo aproximadamente de 15 a 18 kDa.

[025] Heparinas de baixo peso/massa molecular (HBPM) de acordo com a farmacopeia européia, são definidas como "sais de GAGs sulfatados possuindo uma massa molecular média ponderada inferior a 8 kDa e para a qual pelo menos 60 por cento da massa total possui uma massa molecular inferior a 8 kDa. Elas exibem diferentes estruturas químicas na extremidade redutora ou não redutora das cadeias de polissacarídeos. A potência não é inferior a 70 UI de atividade por miligrama do anti-fator Xa, calculada com referência à substância seca. A razão da atividade do anti-fator Xa em relação à atividade do anti-fator II, não é inferior a 1,5." As HBPMs usadas clinicamente possuem pesos moleculares variando de 3 a 15 kDa, com uma média de aproximadamente de 4 a 7 kDa. Produzidas por despolimerização controlada da heparina, as HBPMs exibem propriedades farmacológicas e farmacocinéticas mais favoráveis em comparação com a heparina não fracionada, incluindo uma menor tendência para induzir a hemorragia, maior biodisponibilidade e uma meia-vida prolongada seguinte à injeção subcutânea.

[026] Sulfato de heparano é um polissacarídeo linear, no geral com menos sulfato que a heparina, o qual pode ser preparado a partir da mucosa intestinal de suínos ou de pulmão de bovinos, a partir de frações laterais da heparina utilizando fracionamento do cloreto de cetilpiridínio e extração do sal sequencial, como descrito por Fransson et al., Estudos estruturais em sulfatos de heparan, Eur.J. Biochem.106, 59-69 (1980). O sulfato de heparano é composto por glicosamina alternada e resíduos de ácido urônico, as unidades de dissacarídeo resultantes sendo ou N-acetiladas, N-sulfatadas ou (em menor grau) N- substituídas, e dispostas principalmente na forma sensata do domínio. Alguns sulfatos de heparan possuem atividade anticoagulante dependente da presença de um pentassacarídeo anticoagulante específico, no entanto, consideravelmente menos do que a heparina.

[027] A heparina exerce a sua atividade anticoagulante principalmente através da ligação de alta afinidade com, e a ativação do inibidor de, serino- protease, antitrombina (AT) . AT, um importante inibidor fisiológico da coagulação sanguínea, neutraliza os fatores de coagulação ativados através da formação de um complexo estável com estes fatores. A ligação de um pentassacarídeo específico dentro das cadeias de polissacarídeos da heparina provoca uma alteração conformacional na AT, que aumenta drasticamente a taxa de inibição de fatores de coagulação, desta forma atenuando a coagulação sanguínea e a formação de coágulos sanguíneos.

[028] A sequência única e específica de pentassacarídeos distribuídos aleatoriamente dentro de polímeros de heparina é essencial para a ligação à AT. Várias características estruturais desta sequência têm sido mostradas serem cruciais para a interação da heparina com AT. Notavelmente, o resíduo de ácido idurônico presente nesta sequência de pentassacarídeo é consistentemente sulfatado na posição C-2; enquanto os grupos hidroxilas em ambos C-2 e C-3 do ácido glicurônico são não substituídos (Fórmula II).

[029] Variantes estruturais compatíveis com a atividade anticoagulante, incluem a substituição N- acetilada em vez de N-sulfatada da unidade GlcN em direção ao terminal não redutor e não substituído, em vez de grupos 6-O-sulfatado C6-hidroxil nos dois outros resíduos de GlcN.

[030] Através da aplicação do processo aqui descrito, a interação com a AT é desabilitada e assim, a atividade anticoagulante é essencialmente reduzida.

[031] No contexto da presente invenção, a atividade anticoagulante do glicosaminoglicano relaciona-se com a função clínica de potenciar a inibição da coagulação dos fatores Xa e lia (trombina) pela AT. Em uma modalidade não há essencialmente nenhuma atividade anticoagulante dos glicosaminoglicanos quimicamente modificados de acordo com a invenção.

[032] No processo de preparação de uma heparina pouco anticoagulante é importante evitar ou neutralizar a despolimerização não específica, isto é, os efeitos da despolimerização que não são atribuíveis aos resultados previsíveis obtidos a partir da hidrólise da beta- eliminação alcalina, a etapa de despolimerização por si só. Despolimerização não específica pode resultar na perda imprevisível de peso molecular, produtos descoloridos (com valores de absorbância instáveis), outros problemas de estabilidade e o aparecimento de resíduos não identificados e resíduos não previstos provenientes do processamento da heparina ou heparinas de baixo peso molecular. Produtos submetidos à despolimerização não específica podem obter uma distribuição de peso molecular desfavorável e instável dos polissacarídeos.

[033] Um aspecto importante da invenção é controlar a despolimerização a fim de se obter um produto com a distribuição ótima de cadeia e características de estabilidade favoráveis. Em um aspecto, a despolimerização é controlada pelo controle das condições em que o periodato e também o iodato resultante são admitidos para exercer o seu ataque oxidativo na heparina. O método de acordo com a invenção, tem sido otimizado para minimizar a despolimerização não específica, que afeta negativamente a estabilidade e distribuição da cadeia.

[034] Outros termos serão definidos em contextos relevantes na descrição seguinte.

[035] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de preparação de glicosaminoglicanos quimicamente modificados, selecionados de heparinas e sulfatos de heparan, com uma atividade do anti-fator II inferior a 10 UI/mg, uma atividade do anti-fator Xa inferior a 10 UI/mg, e um peso molecular médio (peso médio, Mw) de cerca de 4,6 a cerca de 6,9 kDa. O método compreende, geralmente, uma etapa de oxidar seletivamente a heparina não fracionada ou sulfato de heparano presente em uma solução aquosa, submetendo-o a um agente oxidante capaz de oxidar os ácidos urônicos não sulfatados e reduzir os sacarídeos oxidados resultantes. 0 método também compreende, geralmente, a despolimerização das cadeias de heparina por meio de hidrólise básica.

[036] Em um aspecto, o método compreende as seguintes etapas: - oxidação dos ácidos glicurônico e idurônicos por tratamento com periodato. - eliminar ou minimizar os efeitos da oxidação de compostos contendo iodo, - despolimerização das cadeias de polissacarídeos sob condições alcalinas (um processo de beta-eliminação), e - redução e estabilização dos grupos aldeído terminais através de uma reação com um agente redutor, tal como NaBH4 .

[037] Em um aspecto adicional, o método compreende também uma ou mais das seguintes etapas:- purificação final do produto por meio da remoção do borato (NaBH4 oxidado), remoção de pequenos fragmentos de glicosaminoglicanos, adição de contra-íons e isolamento do produto em uma forma sólida. - secagem do produto sob vácuo e calor, ou como um processo de liofilização, para permitir o armazenamento do produto a longo prazo, tampão aquosa de fosfato, ajuste do pH para 6 a 8. A adição de excipientes para a finalidade de ajustamento da tonicidade, - preenchimento asséptico do produto em frascos ou seringas, ou liofilização nos mesmos.

[038] Em um aspecto, o método é realizado na sequência de oxidação, despolimerização com hidrólise e redução, e mais especificamente compreendendo as seguintes etapas: a) oxidação de ácidos glicurônico e idurônico por tratamento com periodato, b) eliminar ou minimizar os efeitos da oxidação de compostos contendo iodo, c) despolimerização de cadeias de polissacarídeos sob condições alcalinas (um processo de beta-eliminação), e d) redução e estabilização dos grupos aldeídos terminais através de uma reação com um agente redutor, tal como NaBH4.

[039] Em um aspecto adicional, o método compreende também uma ou mais das seguintes etapas: e) purificação final do produto por meio da remoção do borato (NaBH4 oxidado), remoção de pequenos fragmentos de glicosaminoglicanos, adição de contra-íons e o isolamento do produto sob uma forma sólida, f) secagem do produto sob vácuo e calor, ou como um processo de liofilização, para permitir o armazenamento dos produtos em longo prazo, g) dissolução e formulação do produto em uma solução tampão aquosa de fosfato, ajuste do pH para 6 a 8. A adição de excipientes para a finalidade de ajustamento da tonicidade, h) preenchimento asséptico dos produtos em frascos ou seringas, ou liofilização nos mesmos.

[040] Em um aspecto preferido do método, o glicosaminoglicano quimicamente modificado é a heparina não fracionada e os ácidos idurônico não sulfatado e/ou glicurônico não sulfatado é/são oxidados seletivamente, inibindo assim o efeito anticoagulante mediado pela interação entre ATUI e o pentassacarídeo específico. A oxidação divide um ácido urônico não sulfatado com 2 hidroxilas vicinais livres, em C2 e C3 no pentassacarídeo responsável pela ligação à AT. Como um exemplo não limitante, a composição de heparina não fracionada é tratada com periodato, tal como metaperiodato, por exemplo, heparina não fracionada dissolvida em água deionizada e metaperiodato de sódio em proporções adequadas. Outros agentes de oxidação podem ser úteis, se eles possuírem o mesmo impacto químico na eficácia de oxidação e sobre os resíduos não sulfatados, sem afetar outras estruturas ou a estabilidade do produto final.

[041] De acordo com um aspecto diferente, o glicosaminoglicano quimicamente modificado de acordo com a invenção compreende os resíduos divididos de glicol, com a estrutura química (Fórmula III):

[042] Os resíduos divididos de glicol aparecem em cadeias de polissacarídeos de heparinas quimicamente modificadas, como um resultado dos processos de oxidação e de redução, tal como anteriormente discutido no contexto do método e da etapa de hidrólise específica. O resíduo dividido de glicol representado é proveniente da oxidação e redução do ácido idurônico não sulfatado e ácido glicurônico.

[043] A fim de se obter a completa oxidação, a etapa de oxidação é preferencialmente efetuada a uma temperatura acima de 10°C, preferencialmente cerca de 15 + 2 °C, e efetuada durante pelo menos 15 horas, e preferencialmente durante cerca de 18 a 24 horas.

[044] Em uma modalidade, a oxidação com periodato é realizada em uma solução com uma concentração inicial de glicosaminoglicano (por exemplo, heparina) de cerca de 10 a 20% peso/volume, preferivelmente cerca de 15% peso/volume. Esta concentração elevada de matéria-prima é contribuinte para um processo econômico favorável, uma vez que as etapas de precipitação subsequentemente realizadas no processo são baseadas nos volumes de solvente/volume do produto.

[045] Em uma modalidade específica, a etapa de oxidação é efetuada pela adição de metaperiodato, a uma temperatura de cerca de 15 ± 2°C, com uma concentração de glicosaminoglicano (por exemplo, heparina ou sulfato de heparano) de cerca de 15% e a um pH de cerca de 5 por cerca de 18 a 24 horas.

[046] O emprego da heparina não fracionada no processo é considerado geralmente vantajoso para a invenção, uma vez que contribuirá para reduzir o desperdício de material e aumentar a eficácia de custos e apoiar o fornecimento de um produto da composição com um comprimento intermediário da cadeia de polissacarídeo e biodisponibilidade favorável.

[047] Após a oxidação com periodato, os métodos de acordo com a invenção podem compreender ainda pelo menos uma etapa de oxidação terminal e eliminação do agente de oxidação remanescente. Pelo menos uma etapa de eliminação inclui remover formas reduzidas do agente de oxidação. Neste contexto, as formas reduzidas significam os agentes de oxidação transformados para formas reduzidas, contribuindo para a oxidação dos resíduos de sacarídeos alvos nos glicosaminoglicanos da invenção. Ainda neste contexto, a etapa de redução pode compreender a adição de um agente redutor, que além de reduzir o glicosaminoglicano oxidado, contribui para o consumo (redução) do agente oxidante remanescente.

[048] Por conseguinte, a invenção é geralmente direcionada para um método com as etapas de oxidar seletivamente uns glicosaminoglicanos não fracionados, tais como a heparina ou o sulfato de heparano, submetendo-os a um agente oxidante capaz de oxidar sacarídeos não sulfatados; eliminando o agente oxidante remanescente e as formas reduzidas do agente oxidante; e despolimerizando as cadeias de glicosaminoglicanos sob condição alcalina. Para estes propósitos, a etapa de eliminação pode compreender adicionar um álcool, tal como um álcool aquoso; em uma quantidade suficiente para os glicosaminoglicanos quimicamente modificados precipitarem. 0 álcool pode ser metanol, propanol, etanol ou álcoois semelhantes, e admite que os glicosaminoglicanos quimicamente modificados precipitem, enquanto o agente oxidante e as suas formas reduzidas são removidos com o álcool. A precipitação pode ser realizada uma vez ou várias vezes repetidas, a fim de otimizar a remoção. No entanto, a realização da precipitação apenas uma vez pode ser benéfica, uma vez que é menos demorada e reduz o tempo de exposição entre o iodo residual contendo os compostos e os glicosaminoglicanos.

[049] A etapa de eliminação pode incluir também a adição de um agente supressor capaz de inativar quimicamente o agente oxidante de exercer efeitos oxidantes adicionais sobre o glicosaminoglicano. Qualquer agente supressor possuindo dois grupos hidroxilas vicinais pode ser usado. Exemplos não limitantes de agentes supressores adequados são etileno-glicol e glicerol. Através da adição de um agente supressor contendo grupos dihidroxilas vicinais, o periodato é diretamente convertido em iodato menos prejudicial no final da etapa de oxidação.

[050] É considerado, geralmente pelos inventores, que a etapa do modo de eliminação descrito, ou as etapas de eliminação, contribuem para neutralizar ou minimizar a despolimerização não específica do glicosaminoglicano, isto é, os efeitos da despolimerização não atribuíveis aos resultados previsíveis do processo de despolimerização alcalina. Conforme mencionado acima, a despolimerização não específica pode resultar na redução imprevisível do peso molecular, produtos descoloridos (com o aumento da absorbância durante a armazenagem), outros problemas de estabilidade e o aparecimento de resíduos não identificados não previstos provenientes de glicosaminoglicanos, tais como heparina ou heparinas de baixo peso molecular.

[051] A introdução de uma etapa de eliminação permite um controle aperfeiçoado sobre qualquer despolimerização não específica. Outra maneira de se controlar a despolimerização não específica, aplicável a qualquer método anteriormente descrito, é a redução da temperatura significativamente para baixo da temperatura do ambiente (sala), durante a etapa prévia de precipitação, ou etapas quando se adicionar um álcool. Por exemplo, a temperatura pode ser reduzida em cerca de 5 °C a fim de prevenir reações indesejadas que resultam na despolimerização não específica.

[052] Como uma alternativa, as etapas do processo a) , b) , c) e d) são realizadas em uma sequência direta, preferencialmente sem qualquer atraso. Por "sequência direta" neste contexto, significa que as etapas são realizadas sem qualquer etapa de precipitação intermediária. Isso é particularmente importante para minimizar o tempo ocorrido desde o final da etapa de oxidação até o início da etapa de redução.

[053] Em um aspecto da invenção, as etapas do processo a) , b) , c) e d) são realizadas em uma sequência direta, preferencialmente sem qualquer atraso. Por "sequência direta" neste contexto, significa que as etapas são realizadas sem qualquer etapa de precipitação intermediária. Neste aspecto, a etapa de eliminar ou minimizar os efeitos da oxidação dos compostos de oxidação do iodo, compreende controlar o tempo de exposição para quaisquer compostos oxidantes de iodo remanescentes, para exercer qualquer efeito químico não controlado sobre os polissacarídeos entre a terminação da etapa de oxidação seletiva e o início da etapa de redução.

[054] É, portanto um aspecto da invenção, minimizar o tempo ocorrido desde o final da etapa de oxidação até o início da etapa de redução, isto é, a partir do início da despolimerização (adição de uma base), até a adição do borohidreto. Em um aspecto, o tempo ocorrido entre o final da etapa de oxidação até a adição do borohidreto é de cerca de 1 hora a cerca de 5 horas. Em outro aspecto, o tempo ocorrido entre o final da etapa de oxidação até a adição de borohidreto é de não mais do que cerca de 5 horas, preferivelmente não mais do que cerca de 4 horas, mais preferencialmente não mais do que cerca de 3 horas e o mais preferencialmente não mais do que cerca de 2 horas. O tempo mínimo necessário seria determinado pelo progresso da despolimerização, que é controlada pelo pH da reação. Em um aspecto, o tempo mínimo necessário é de cerca de 1 hora. O menor pH como descrito, por exemplo, no Exemplo 3 resultaria no tempo mais longo necessário e vice- versa para um pH mais elevado. As três etapas podem ser realizadas vantajosamente no mesmo recipiente. Este processo alternativo possui a vantagem de reduzir o tempo de exposição da heparina ou sulfato de heparano para os compostos contendo iodo, a partir do final da oxidação do periodato até eles serem eliminados pelo borohidreto redutor na etapa de redução. A adição de borohidreto irá suprimir imediatamente o periodato residual e convertê-lo nas outras formas inertes menos prejudiciais do produto, tais como iodeto e iodo. O borohidreto deve ser adicionado em uma determinada quantidade para, eficientemente, tanto suprimir o periodato residual, quanto reduzir os grupos aldeídos terminais. 0 resultado positivo da compactação do processo desta maneira está demonstrado nas Tabelas II e III.

[055] Após o término da etapa de oxidação, as cadeias de polissacarídeos são despolimerizadas sob condições alcalinas. A despolimerização é preferivelmente realizada a uma temperatura de cerca de 5 a 25°C, a fim de se obter cadeias adequadamente fracionadas com pesos moleculares desejáveis. O pH da reação de despolimerização é entre cerca de 10 a 12, para preservar os grupos 2-0- sulfato dos resíduos do ácido urônico sulfatado e prevenir o aumento da coloração amarela do produto com um pH crescente. Este último impactaria sobre a vida de prateleira do produto, uma vez que este é um indicador da qualidade/estabilidade do produto. Aplica-se o requisito degradação do produto. 0 pH deveria prefencialmente não chegar a 13 (NaOH 0,1 M ou superior), devido ao risco de dessulfatação do ácido urônico 2-O-sulfatado e ainda adicionalmente coloração do produto. 0 tempo de reação é preferencialmente cerca de 15 a 95 minutos, para se alcançar uma reação adequada com relação à clivagem suficiente dos ácidos urônicos oxidados não-sulfatados.

[056] Os glicosaminoglicanos oxidados são tratados subsequentemente com um agente redutor, por exemplo, borohidreto de sódio para reduzir os grupos aldeídos terminais. Este processo é designado para reduzir o aldeído contendo extremidades terminais e convertê-los em álcoois primários de tal maneira que os aldeídos não seriam detectáveis por, por exemplo, análise por 13C-RMN. Este elevado grau de redução das extremidades terminais reduzidas contribui para uma elevada estabilidade do produto, uma vez que os aldeídos são inerentemente instáveis quimicamente. Outra razão para eliminar os aldeídos é que eles podem ser potencialmente tóxicos. Outros agentes redutores são concebíveis, se eles forem capazes de executar uma etapa redutora específica semelhante aos resíduos dos ácidos glicurônico/idurônico oxidados, como o borohidreto de sódio, sem desnecessariamente modificar ou destruir os grupos sulfato de outros sacarídeos. As cadeias assim reduzidas podem ser isoladas, por exemplo, por precipitação com álcool.

[057] A fim de oferecer suporte à seleção de cadeias desejáveis, o método também pode incluir uma etapa de enriquecimento da heparina ou derivados do sulfato de heparano em cadeias de polissacarídeos possuindo um peso molecular de cerca de >3 a cerca de 12 kDa. A etapa de enriquecimento inclui geralmente precipitação convencional, cromatografia, filtração ou procedimentos de peneiração moleculares, bem conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto na fabricação de biopolímero.

[058] Parâmetros para as etapas de precipitação (concentração do produto, concentração do solvente orgânico, pH, e contra-íons adicionais) foram otimizados para manter os polissacarídeos superiores a 3 kDa.

[059] Nós desenvolvemos uma nova metodologia de alto rendimento em que a despolimerização não específica é minimizada. Em um aspecto, ocorrem simultaneamente a terminação da reação de oxidação, a remoção dos compostos de iodo e a precipitação das heparinas ou sulfatos de heparan modificados. Isto é vantajoso, já que os compostos de iodo, que podem ser prejudiciais para o produto, permanecem solúveis na solução aquosa de etanol e são, dessa forma, removidos na precipitação. Isto está em contraste com os métodos anteriores, por exemplo, o método na patente norte-americana 4,990,502 em que é usado diálise ou troca iônica, que são métodos demorados. A diálise é uma técnica complicada raramente praticada. O saneamento do equipamento deverá ser abrangente para evitar a contaminação microbiana.

[060] Em um aspecto da invenção, de 4 a 15% das cadeias de polissacarídeos da heparina quimicamente modificada possuem uma massa molecular de, pelo menos, 10 kDa.

[061] Em um aspecto da invenção, de 10 a 25% das cadeias de polissacarídeos da heparina quimicamente modificada possuem uma massa molecular de, pelo menos, 8 kDa.

[062] Em um aspecto da invenção, de 22 a 45% das cadeias de polissacarídeos da heparina quimicamente modificada possuem uma massa molecular de, pelo menos, 6 kDa.

[063] Em um aspecto da invenção, pelo menos 70% das cadeias de polissacarídeos da heparina quimicamente modificada possuem uma massa molecular de, pelo menos, 3 kDa.

[064] Ao se realizar as etapas do processo de acordo com a presente invenção, uma heparina pouco anticoagulante com uma especificação de peso molecular do polissacarídeo, se enquadra na distribuição descrita na Tabela I. Tabela I. Distribuição dos polissacarídeos e suas massas moleculares correspondentes como % acumulativa do peso para vários lotes.

[065] 0 valor correspondente para o peso molecular médio ponderado, Mw, se enquadra na faixa de 4,6 a 6,9 kDa.

[066] Em um aspecto da invenção, o glicosaminoglicano quimicamente modificado possui um baixo teor controlado de resíduos de glicosaminas quimicamente modificadas, como um resultado das etapas do processo da sua fabricação.

[067] Em um aspecto da invenção, os glicosaminoglicanos quimicamente modificados compreendem glicosaminas presentes como sinais no intervalo de 5,0 a 6,5 de um espectro com a intensidade (% razão) inferior a 4% em relação ao sinal em 5,42 ppm da heparina nativa.

[068] Em um aspecto, tais sinais a partir dos sinais das glicosaminas modificadas estão presentes em 6,15 ppm e 5,95 ppm no espectro de XH-RMN.

[069] Em um aspecto da invenção, o glicosaminoglicano compreende menos glicosaminas modificadas do conteúdo total de glicosamina. Tais glicosaminas modificadas podem estar localizadas nas extremidades não redutoras das cadeias de polissacarídeos, e podem incluir uma ligação dupla C4-C5 na estrutura do resíduo. Tais glicosaminas modificadas podem produzir sinais em 5,95 ppm e 6,15 ppm em um espectro de 1H-RMN.

[070] Glicosaminas quimicamente modificadas são provenientes dos resíduos de glicose amina passíveis de modificação durante as etapas do método de produção, e podem contribuir para os fenômenos discutidos com despolimerização não específica, e características não previsíveis do produto dos glicosaminoglicanos.

[071] Como um aspecto da invenção, é fornecido um método que minimiza tanto a despolimerização não específica quanto o aparecimento de glicosaminas quimicamente modificadas, através do controle da exposição dos glicosaminoglicanos aos agentes nas etapas do processo que contribuem para modificar glicosaminas suscetíveis.

[072] Assim, os métodos inventivos contribuem para minimizar a modificação de glicosaminas suscetíveis em resíduos imprevisíveis ou desconhecidos nas cadeias de polissacarídeos. Os métodos dessa forma contribuem para gerar adequadamente produtos próximos da heparina ou heparina de baixo peso molecular, que possam cumprir com os critérios de aceitação apresentados para heparina, estabelecidos pela EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare), Conselho da Europa, 2012 (Critério de Aceitação de H-RMN).

[073] Para este propósito, um aspecto do método inventivo compreende uma etapa de eliminar ou minimizar os efeitos do agente oxidante usado para oxidar seletivamente o glicosaminoglicano. Quando o agente oxidante é o composto de periodato, a etapa de eliminação compreende remover formas reduzidas do agente oxidante (compostos de iodo).

[074] Em um aspecto, a etapa de eliminar ou minimizar os efeitos da oxidação de compostos contendo iodo pode compreender controlar o tempo de exposição a qualquer agente oxidante entre a terminação da etapa de oxidação até o início da etapa de redução.

[075] O método, assim descrito, resulta em um enriquecimento global das cadeias de polissacarídeos com uma distribuição de tamanho ótima, de modo a garantir um produto com as propriedades farmacológicas desejadas, efeitos adversos minimizados, uma elevada biodisponibilidade e estabilidade durante o manuseio e armazenamento. 0 método envolve adequadamente as condições que garantem a completa oxidação e também a produção das cadeias com uma distribuição de tamanho vantajosa que sustenta uma eficácia terapêutica desejável e considera-se melhorar o índice terapêutico comparado com as outras heparinas pouco anticoagulantes descritas (LAHs). A invenção, em termos gerais, se estende aos derivados de glicosaminoglicanos preparados com os métodos referidos.

[076] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para as heparinas ou sulfatos de heparan quimicamente modificados, com uma atividade do anti-fator II inferior a 10 UI/mg, uma atividade do anti-fator Xa inferior a 10 UI/mg e um peso molecular médio (Mw) de cerca de 4,6 a cerca de 6,9 kDa. Tais derivados são possíveis de se produzir com o método de acordo com a invenção. As heparinas ou sulfatos de heparan quimicamente modificados de acordo com a invenção são ainda caracterizados pelo fato de que: - as cadeias de polissacarídeos possuem de 2 a 20 (n na Fórmula I) unidades de dissacarídeos correspondendo a pesos moleculares entre 1,2 e 12 kDa; - O dissacarídeo que ocorre predominantemente é (Fórmula I)

n é um número inteiro de 2 a 20

[077] O dissacarídeo predominantemente possui um peso molecular de cerca de 600 Da. 0 termo "predominantemente" tem neste contexto o significado de "as mais frequentemente presentes" cadeias de polissacarídeos.

[078] Além disso, nos glicosaminoglicanos modificados de acordo com o método descrito acima, as cadeias de polissacarídeos retêm pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente, essencialmente todos os grupos sulfato dos glicosaminoglicanos nativos correspondentes. Outro atributo caracterizante é que as cadeias de polissacarídeos essencialmente carecem de sequências de pentassacarídeos intactas quimicamente, mediadoras do efeito anticoagulante quando comparadas com as cadeias dos glicosaminoglicanos nativos correspondentes.

[079] Além disso, nos glicosaminoglicanos modificados de acordo com a invenção, o tamanho predominantemente é de 6 a 12 unidades de dissacarídeos correspondentes aos pesos moleculares de 3,6 a 7,2 kDa. O termo "predominantemente" tem neste contexto o significado de "as mais frequentemente presentes" cadeias de polissacarídeos.

[080] Em um aspecto da invenção, o glicosaminoglicano quimicamente modificado é essencialmente livre de ácidos idurônico e/ou glicurônico não sulfatados intactos. Essencialmente livre neste contexto, significa não detectável em um espectro de 13C-RMN. Tipicamente, o limite de detecção é definido como 0,1%.

[081] É também preferido que os glicosaminoglicanos quimicamente modificados sejam derivados da heparina e que as cadeias sejam essencialmente livres dos ácidos idurônico não sulfatado e/ou glicurônico não sulfatado, preferencialmente do ácido D-glicurônico, resultando na supressão dos pentassacarídeos intactos quimicamente mediadores do efeito anticoagulante, quando comparadas com as cadeias das heparinas nativas correspondentes.

[082] É também preferível que os glicosaminoglicanos quimicamente modificados compreendam cadeias com extremidades terminais redutoras alternativas R', tal como descrito na figura 1. Os terminais não redutores são predominantemente glicosaminas sulfatadas GlcN.

[083] É também preferível que as glicosaminoglicanas quimicamente modificadas possuam pelo menos 70% das cadeias de polissacarídeos com um peso molecular superior a 3 kDa. É adequado também que menos de preferencialmente menos do que 1% das cadeias de polissacarídeos, tenham um peso molecular acima de 15 kDa.

[084] Preferencialmente, as heparinas sulfatadas quimicamente modificadas da invenção, possuem pesos moleculares médios que são estáveis por pelo menos 36 meses a 5 °C como uma solução tampão aquosa de fosfato, preferencialmente por pelo menos 48 meses, e mais preferencialmente por pelo menos 60 meses. O peso molecular médio permanece estável quando armazenado como um pó por pelo menos 5 anos a uma temperatura de 25 °C. Detalhes adicionais sobre as características de estabilidade podem ser encontrados no Exemplo 2.

[085] A presente invenção também se refere aos glicosaminoglicanos quimicamente modificados, produzidos com o método descrito acima.

[086] A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas úteis para tratar as complicações mencionadas e modalidades terapêuticas preferidas, compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes dos glicosaminoglicanos quimicamente modificados descritos e um veículo terapeuticamente aceitável. Tais composições podem ser administradas sistemicamente através de administração por via parenteral, tal como por injeção subcutânea ou intravenosa. As composições farmacêuticas também podem ser administradas através de administração por via oral. Para administração por via parenteral, os compostos ativos podem ser incorporados em uma solução ou suspensão, que contém também um ou mais adjuvantes, tais como diluentes estéreis tais como água para injeção, soro fisiológico, óleos fixos, polietilenoglicol, glicerol, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos, agentes antibacterianos, antioxidantes, agentes quelantes, tampões e agentes para ajustar a osmolalidade. A preparação parenteral pode ser entregue em ampolas, frascos, seringas descartáveis ou como regimes de infusão, também para a autoadministração.

[087] Os glicosaminoglicanos modificados de acordo com a invenção são bem adaptados para a administração por via subcutânea e assim com as ferramentas adequadas para autoadministração, tais como injetores, uma vez que possuem uma distribuição de peso molecular favorável para a reabsorção por um depósito subcutâneo, e desta forma se assemelham às heparinas de baixo peso molecular disponíveis comercialmente.

[088] Além disso, devido à distribuição favorável do peso molecular, os glicosaminoglicanos modificados de acordo com a invenção são bem adequados para administração por via tópica, incluindo a penetração nas membranas mucosas tais como, mas não limitadas à administração vaginal, retal, intrauterina e nasal.

[089] A presente invenção também se refere aos glicosaminoglicanos quimicamente modificados, como descritos acima, para uso em tratamentos médicos não dependentes de um efeito anticoagulante.

[090] A presente invenção refere-se ainda ao uso de um glicosaminoglicano quimicamente modificado de acordo com a invenção, para a fabricação de um medicamento para os tratamentos médicos não dependentes de um efeito anticoagulante.

[091] Exemplos não limitantes de tais tratamentos médicos são a prevenção e tratamento do parto prolongado (distócia), e extravasamento de proteínas na, por exemplo, síndrome de Gorham Stout. O extravasamento de proteínas a partir dos revestimentos endoteliais ou epiteliais também ocorre em desordens como sepse e enteropatia perdedora de proteínas. Os glicosaminoglicanos quimicamente modificados de acordo com a invenção são administrados ao paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[092] HBPM, assim como a heparina pouco anticoagulante, aumenta a oxitocina indutora da contractilidade miometrial, tanto in vitro quanto in vivo em mulheres grávidas. A adição de HBPM ou heparina pouco anticoagulante de acordo com a invenção para a cultura de células cervicais originadas a partir de biópsias humanas cervicais amostradas do parto normal aumenta a síntese da interleucina -6 e -8. Esta descoberta apoia a HBPM e a heparina pouco anticoagulante na indução do amadurecimento cervical. Assim, HBPM e heparina pouco anticoagulante possuem uma ação inflamatória no colo do útero, em oposição ao seu efeito anti-inflamatório documentado em outros órgãos. Assim, o GAG quimicamente modificado de acordo com a invenção pode ser utilizado para a prevenção e tratamento de parto prolongado.

[093] Tem sido admitido como hipótese que a administração da heparina pouco anticoagulante a um paciente irá diminuir a capacidade de proteínas atravessarem a barreira celular e, desse modo, tratar ou prevenir o extravasamento de proteínas dos revestimentos endoteliais ou epiteliais. É ainda admitido como hipótese, que a heparina pouco anticoagulante tal como definida acima se liga a fatores tais como as citocinas e fatores de crescimento (tais como VEGF) e, desse modo, modula a atividade destes fatores. Outro desses fatores, a proteína de ligação à heparina (HBP, azurocidina) está envolvida no extravasamento endotelial e foi sugerida recentemente para ser o marcador principal da sepse precoce. Dado o fato de que HBPs parecem estar envolvidas tanto no processo angiogênico patológico, por exemplo, síndrome de Gorham- Stout, quanto em condições com vasos com extravasamentos (HBP) , e que a perda de sulfato de heparano pode levar ao extravasamento de proteínas sobre o epitélio intestinal, é admitido como hipótese que fornecer uma heparina pouco anticoagulante de acordo com a invenção, em conjunto com mais terapias convencionais seria benéfico e que a heparina iria retardar o processo. (Acta PdBdiãtrica 2011 100, pp 1448-1453).

[094] Em resumo, o efeito in vivo dos glicosaminoglicanos quimicamente modificados de acordo com a invenção deriva de uma combinação da distribuição do peso molecular adequado e propriedades polianiônicas fortes. 0 processo inventivo tem sido otimizado, ampliado e produzido de acordo com as GMP, permitindo que o produto seja administrado a seres humanos.

[095] A invenção será agora melhor descrita nos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos Descrição detalhada do processo de fabricação de uma heparina quimicamente modificada de acordo com a invenção

[096] A substância é preparada a partir de heparina sódica. A preparação envolve a oxidação seletiva dos resíduos de ácido urônico não sulfatados em heparina por periodato, incluindo a porção de ácido glicurônico na sequência de pentassacarídeo que se liga a AT. 0 rompimento da estrutura deste resíduo aniquila a interação de alta afinidade com a AT e, consequentemente, o efeito anticoagulante (medido como a-FXa ou a-FIIa) é essencialmente suprimido. 0 tratamento alcalino subsequente, a reação de beta-eliminação, resulta na clivagem do polímero em sítios de ácidos urônicos não sulfatados que tiverem sido oxidados por periodato. Juntas, estas manipulações levam a uma perda da atividade anticoagulante juntamente com a despolimerização adequada da cadeia de heparina.

[097] Além disso, a extremidade terminal redutora resultante no local de clivagem é reduzida por NaBH4, que converte os aldeídos terminais nos dióis correspondentes que são mais estáveis. Subsequentemente, aditivos, impurezas e subprodutos são removidos por precipitações repetidas com etanol, filtração e centrifugação. Depois disso, a substância é obtida na forma de pó por secagem a vácuo e calor. O fármaco irá ser dissolvido em um tampão aquoso estéril para produzir o produto farmacêutico, que é destinado para administração intravenosa ou subcutânea.

[098] Os processos até agora descritos geralmente incluem as etapas de oxidação, clivagem do polímero (hidrólise alcalina) e redução. Os processos de acordo com a presente invenção são desenvolvidos a fim de neutralizar ou eliminar qualquer tipo de despolimerização não específica das cadeias de heparina. Polimerização não específica neste contexto significa geralmente tal despolimerização que não está relacionada com a reação de beta-eliminação específica. Despolimerização não específica resulta em instabilidades estruturais do produto que podem resultar em despolimerização adicional e descoloração durante a armazenagem do produto purificado. Além disso, ela pode contribuir para o aparecimento de espécies atípicas que aparecem nos espectros de RMN, não encontradas normalmente na heparina.

[099] Os processos descritos e exemplificados na seção seguinte incluem diferentes aspectos de neutralizar ou eliminar a despolimerização não específica.

Exemplo 1 Oxidação do ácido glicurônico não-sulfatado e idurônico (resíduos), supressão do pentassacarídeo de ligação à AT e da atividade anticoagulante

[100] Uma quantidade de cerca de 3 000 gramas de heparina é dissolvida em água purificada para se obter uma solução de 10 a 20% peso/volume. 0 pH desta solução é ajustado para 4,5 a 5,5. O metaperiodato de sódio (NaI04) é subsequentemente adicionado à solução do processo; quantidade de periodato de 15 a 25% do peso da heparina. O pH é novamente ajustado para 4,5 a 5,5. A reação é protegida da luz. A solução do processo é reagida durante as 18 a 24 horas, com manutenção da temperatura de 13 a 17 °C com agitação constante, enquanto a temperatura é reduzida para 5°C durante as últimas duas horas.

Terminação da reação de oxidação e remoção dos compostos contendo iodo

[101] Etanol (95 a 99,5%) é adicionado à mistura reacional ao longo de um período de 0,5 a 1 hora, com agitação cuidadosa e a uma temperatura de 5 a 25 °C. O volume de etanol a ser adicionado está no intervalo de 1 a 2 volumes de etanol por volume da solução do processo. A heparina oxidada é então deixada para precipitar e sedimentar por 15 a 20 horas, após as quais a solução mãe é decantada e descartada.

[102] Em seguida, o sedimento é dissolvido em água purificada para se obter uma concentração de 15 a 3 0% peso/volume na solução do processo. O NaCl é adicionado para se obter uma concentração de 0,15 a 0,30 mol/litro na solução do processo. A agitação continua por mais 0,5 a 1 hora, enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25°C. Subsequentemente, 1,0 a 2,0 volumes de etanol (95 a 99,5%) por volume da solução do processo são adicionados a esta solução com agitação, durante um período de 0,5 a 1 hora. Isto precipita o produto da solução.

Despolimerização de cadeias de polissacarídeos por um processo de eliminação beta alcalino

[103] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é misturado em aproximadamente 7 litros de água até estar completamente dissolvido, a concentração da solução é então de 15 a 30%. Enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25°C, a solução de NaOH 4 M é adicionada lentamente até ser obtido um pH de 10,5 a 12. A reação é iniciada e prossegue por 15 a 95 minutos. Neste momento, o pH da solução é registrado e o HC1 4 M é adicionado lentamente até ser obtido um pH de 5,5 a 7.

Redução de extremidades terminais redutoras

[104] Enquanto se mantém a temperatura de 13 a 17°C, o pH da solução é ajustado para 5,5 a 6,5. Uma quantidade de 130 a 150 gramas de borohidreto de sódio é então adicionada à solução enquanto o pH irá aumentar imediatamente para 10 a 11, a reação é continuada durante 14 a 20 horas. Depois deste tempo reacional, um ácido diluído é adicionado lentamente, a fim de ajustar o pH para um valor de 4, o que degrada o borohidreto de sódio restante. Após se manter um pH de 4 por 45 a 60 minutos, o pH da solução é ajustado para 7 com uma solução diluída de NaOH.

[105] A purificação continua de acordo com o exemplo 5.

Exemplo 2 Oxidação do ácido glicurônico e idurônico (resíduos), supressão da atividade anticoagulante

[0106] Uma quantidade de cerca de 3 000 gramas de heparina é dissolvida em água purificada para se obter uma solução 10 a 20% peso/volume. 0 pH desta solução é ajustado para 4,5 a 5,5. 0 metaperiodato de sódio (NaIÜ4) é subsequentemente adicionado à solução do processo; quantidade de periodato de 15 a 25% do peso da heparina. 0 pH é novamente ajustado para 4,5 a 5,5. A reação é protegida da luz. A solução do processo é reagida durante as 22 a 2 6 horas, com manutenção da temperatura de 13 a 17 °C com agitação constante, enquanto a temperatura é reduzida para 5°C durante as últimas duas horas. O pH do final do período reacional é medido e registrado.

Terminação da reação de oxidação e remoção dos compostos contendo iodo

[107] Etanol (95 a 99,5%) é adicionado à mistura reacional ao longo de um período de 0,5 a 1 hora, com agitação cuidadosa e a uma temperatura de 5 a 25°C. 0 volume de etanol a ser adicionado está no intervalo de 1 a 2 volumes de etanol por volume da solução do processo. A heparina oxidada é então deixada para precipitar e sedimentar por 15 a 20 horas, depois das quais a solução mãe é decantada e descartada.

Despolimerização de cadeias de polissacarídeos por um processo de eliminação beta alcalino

[108] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é misturado em aproximadamente 7 litros de água até ele aparentar visualmente estar completamente dissolvido.

[10 9] Enquanto se mantém a temperatura de 20 a 25°C, o NaOH 4 M é adicionado lentamente até ser obtido um pH de 10,5 a 12, e a reação então iniciada é deixada prosseguir por 15 a 95 minutos. Neste momento, o pH da solução é registrado e o HC1 4 M é adicionado lentamente até ser obtido um pH de 5,5 a 7.

Redução de extremidades terminais redutoras

[110] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é dissolvido por adição de água purificada até ser obtida uma concentração da solução do processo de 15 a 30% peso/volume. Enquanto se mantém a temperatura de 13 a 17 °C, o pH da solução é ajustado para 5,5 a 6,5. Uma quantidade de 130 a 150 gramas de borohidreto de sódio é então adicionada à solução e dissolvida, o pH aumentará imediatamente para um pH de 10 a 11, a reação é continuada durante 14 a 20 horas. O pH da solução é registrado tanto antes, quanto depois deste período de reação. Depois deste tempo reacional, um ácido diluído é adicionado lentamente, a fim de ajustar o pH para um valor de 4, o qual degrada o borohidreto de sódio restante. Após se manter um pH de 4 por 45 a 60 minutos, o pH da solução é ajustado para 7 com uma solução diluída de NaOH.

[111] A purificação continua de acordo com o Exemplo 5.

Exemplo 3 Oxidação do ácido glicurônico e idurônico (resíduos), supressão da atividade anticoagulante

[112] Uma quantidade de cerca de 3000 gramas de heparina é dissolvida em água purificada para se obter uma solução 10 a 20% peso/volume. O pH desta solução é ajustado para 4,5 a 5,5. O metaperiodato de sódio (NalOí) é subsequentemente adicionado à solução do processo, a quantidade de periodato de 15 a 25% do peso da heparina. 0 pH é novamente ajustado para 4,5 a 5,5. O reator é protegido da luz. A solução do processo é reagida durante as 18 a 24 horas, com manutenção da temperatura de 13 a 17°C com agitação constante, enquanto a temperatura é reduzida para 5°C durante as últimas duas horas.

Despolimerização de cadeias de polissacarídeos por um processo de eliminação beta alcalino

[113] Enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25°C, a solução de NaOH 4 M é adicionada lentamente até ser obtido um pH de 10,5 a 12. A reação é iniciada e prossegue por 15 a 95 minutos. Neste momento, o pH da solução é registrado e o HC1 4 M é adicionado lentamente até ser obtido um pH de 5,5 a 7.

Redução de extremidades terminais redutoras

[114] Enquanto se mantém a temperatura de 13 a 17°C, o pH da solução é ajustado para 5,5 a 6,5. Uma quantidade de 130 a 200 gramas de borohidreto de sódio é então adicionada à solução enquanto o pH aumentará imediatamente para 10 a 11, a reação é continuada durante 14 a 20 horas. Depois deste tempo reacional, um ácido diluído é adicionado lentamente, a fim de ajustar o pH para um valor de 4, o que degrada o borohidreto de sódio restante. Após se manter um pH de 4 por 45 a 60 minutos, o pH da solução é ajustado para 7 com uma solução diluída de NaOH.

Precipitação do produto reduzido e remoção inicial de compostos contendo iodo

[115] Etanol (95 a 99,5%) é adicionado à mistura reacional ao longo de um período de 0,5 a 1 hora, com agitação cuidadosa e a uma temperatura de 5 a 25 °C. O volume de etanol a ser adicionado está no intervalo de 1 a 2 volumes de etanol por volume da solução do processo. A heparina oxidada é então deixada para precipitar e sedimentar por 15 a 20 horas, após as quais a solução mãe é decantada e descartada.

[116] Em seguida, o sedimento é dissolvido em água purificada para se obter uma solução do processo 15 a 30% peso/volume. O NaCl é adicionado para se obter uma concentração de 0,15 a 0,30 mol/litro na solução do processo.

[117] A purificação continua de acordo com o Exemplo 5.

Exemplo 4 Oxidação do ácido glicurônico e idurônico (resíduos), supressão da atividade anticoagulante

[118] Uma quantidade de cerca de 3000 gramas de heparina é dissolvida em água purificada para se obter uma solução 10 a 20% peso/volume. O pH desta solução é ajustado para 4,5 a 5,5. O metaperiodato de sódio (NaIO4) é subsequentemente adicionado à solução do processo, a quantidade de periodato de 15 a 25% do peso da heparina. O pH é novamente ajustado para 4,5 a 5,5. O reator é protegido da luz. A solução do processo é reagida durante as 18 a 24 horas, com manutenção da temperatura de 13 a 17°C com agitação constante, enquanto a temperatura é reduzida para 5 °C durante as últimas duas horas. Em seguida, é adicionado glicerol para suprimir a reação, isto é, para converter o periodato residual a iodato, 150 a 200 ml da solução de glicerol 85% é adicionada e reagida por 30 a 40 minutos enquanto agita-se.

Precipitação do produto removido de compostos contendo iodo e produtos supressores/reacionais

[119] Etanol (95 a 99,5%) é adicionado à mistura reacional ao longo de um período de 0,5 a 1 hora com agitação cuidadosa e a uma temperatura de 5 a 25qC. O volume de etanol a ser adicionado está no intervalo de 1 a 2 volumes de etanol por volume da solução do processo. A heparina oxidada ê então deixada para precipitar e sedimentar por 15 a 20 horas, após as quais a solução mãe é decantada e descartada.

[120] Em seguida, o sedimento é dissolvido em água purificada para se obter uma solução do processo 15 a 30% peso/volume. 0 NaCl é adicionado para se obter uma concentração de 0,15 a 0,30 mol/litro na solução do processo. A agitação continua por mais 0,5 a 1 hora, enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25 °C. Subsequentemente, 1,0 a 2,0 volumes de etanol (95 a 99,5%) por volume da solução do processo são adicionados a esta solução com agitação, durante um período de 0,5 a 1 hora. Isso precipita o produto a partir da solução.

Despolimerização de cadeias de polissacarídeos por um processo de eliminação beta alcalino

[121] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é misturado em aproximadamente 7 litros de água até ele aparentar visualmente estar completamente dissolvido.

[122] Enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25°C, o NaOH 4 M é adicionado lentamente até um pH de 10,5 a 12 ser obtido e a reação então iniciada, é deixada para prosseguir por 60 a 95 minutos. Neste momento, o pH da solução é registrado, e o HC1 4 M é adicionado lentamente até ser obtido um pH de 5,5 a 7.

Redução de extremidades terminais redutoras

[123] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é dissolvido por adição de água purificada até ser obtida uma concentração da solução do processo de 15 a 30% peso/volume. Enquanto se mantém a temperatura de 13 a 17 °C, o pH da solução é ajustado para 5,5 a 6,5. Uma quantidade de 130 a 150 gramas de borohidreto de sódio é então adicionada à solução e dissolvida, o pH aumentará imediatamente para um pH de 10 a 11, a reação é continuada durante 14 a 20 horas. O pH da solução é registrado tanto antes, quanto depois deste período de reação. Depois deste tempo reacional, um ácido diluído é adicionado lentamente, a fim de ajustar o pH para um valor de 4, o que degrada o borohidreto de sódio restante. Após se manter um pH de 4 por 45 a 60 minutos, o pH da solução é ajustado para 7 com uma solução diluída de NaOH.

[124] A purificação prossegue de acordo com o Exemplo 5.

Exemplo 5 Purificação do produto Remoção de aditivos do processo e impurezas, adição de contra-íons e filtração

[125] As soluções do processo de acordo com os Exemplos 1 a 4, provenientes da etapa final de modificação química de reduzir as extremidades terminais por borohidreto, são trabalhadas de acordo com as metodologias esboçadas abaixo.

[126] Um volume da solução do processo é então adicionado em 0,5 a 2,5 volumes de etanol (95 a 99,5%), seguido por centrifugação a >2000 G, a <20°C por 20 a 30 minutos, depois que o sobrenadante é decantado e descartado.

[127] A pasta do produto obtida por centrifugação é então dissolvida em água purificada, para se obter uma concentração de produto 10 a 20% peso/volume. Depois, o NaCl é adicionado para se obter uma concentração de 0,20 a 0,35 mol/litro. Em seguida, 1,5 a 2,5 volumes de etanol (95 a 99,5%) são adicionados por volume de solução do processo, o que precipita o produto da solução. Segue-se à centrifugação conforme descrita acima.

[128] Em seguida, é adicionada água purificada à pasta restante para dissolvê-la. A concentração do produto estaria então no intervalo de 10 a 20% peso/volume. 0 pH da solução do produto é então ajustado para 6,5 a 7,5. A solução é então filtrada para remover quaisquer partículasEntão, para um volume da solução do processo é adicionado 1,5 a 2,5 volumes de etanol (95 a 99,5%) . A centrifugação segue-se a >2000 G e a <20°C por 20 a 30 minutos depois que o sobrenadante é decantado e descartado.

Desidratação da pasta de precipitado e redução do tamanho da partícula

[129] Um reator é preenchido com etanol, o volume cerca de 2 litros. Enquanto se agita o etanol, a pasta de precipitado é adicionada. A agitação mecânica solidifica a pasta e substitui a água presente no etanol, dando uma suspensão de partículas homogêneas. A agitação é descontinuada após 1 a 2 horas depois que as partículas são deixadas para sedimentar. Após a remoção do líquido excessivo, as partículas são passadas através de uma peneira ou um moinho, para obter partículas menores e de tamanho uniforme.

Secagem do produto

[130] O produto é distribuído equilibradamente sobre bandejas e colocado em uma câmara de vácuo.

[131] O vácuo é aplicado e o aquecimento é realizado em 35 a 40°C. A corrente de nitrogênio é passada através do secador neste momento, enquanto se mantém a pressão baixa no secador. Quando um peso constante é obtido do produto, isto é, nenhuma evaporação adicional é notada, a secagem é considerada completa. O produto é embalado e protegido da umidade.

Exemplo 6 Oxidação do ácido glicurônico e idurônico (resíduos), supressão da atividade anticoagulante

[132] Uma quantidade de cerca de 3000 gramas de heparina é dissolvida em água purificada para obter uma solução 10 a 20% peso/volume. O pH desta solução é ajustado para 4,5 a 5,5. O metaperiodato de sódio (NaIO4) é subsequentemente adicionado à solução do processo, a quantidade de periodato de 15 a 25% do peso da heparina. O pH é novamente ajustado para 4,5 a 5,5. O reator é protegido da luz. A solução do processo é reagida durante as 18 a 24 horas, com manutenção da temperatura de 13 a 17 °C com agitação constante, enquanto a temperatura é reduzida para 5°C durante as últimas duas horas.

Despolimerização de cadeias de polissacarídeos por um processo de eliminação beta-alcalino

[133] Enquanto se mantém a temperatura de 5 a 25°C, NaOH 4 M é adicionado lentamente, até um pH de 10,5 a 12 ser obtido, e a reação então iniciada é deixada para prosseguir de 15 a 95 minutos. Neste momento, o pH da solução é gravado e HC1 4M é adicionado lentamente até um pH de 5,5 a 7 ser obtido.

Redução de extremidades terminais redutoras

[134] Depois que a solução mãe tiver sido decantada e descartada, o sedimento é dissolvido por adição de água purificada até ser obtida uma concentração da solução do processo de 15 a 30% peso/volume. Enquanto se mantém a temperatura de 13 a 17°C, o pH da solução é ajustado para 5,5 a 6,5. Uma quantidade de 130 a 200 gramas de borohidreto de sódio é então adicionada à solução e dissolvida, o pH aumentará imediatamente para um pH de 10 a 11, a reação é continuada durante 14 a 20 horas. 0 pH da solução é registrado tanto antes, quanto depois deste período de reação. Depois deste tempo reacional, um ácido diluído é adicionado lentamente, a fim de ajustar o pH para um valor de 4, o que degrada o borohidreto de sódio restante. Após se manter um pH de 4 por 45 a 60 minutos, o pH da solução é ajustado para 7 com uma solução diluída de NaOH. A água purificada é então adicionada à solução, até uma condutividade de 15 a 20 mS/cm ser obtida da solução de reação.

Purificação do produto por Cromatografia de Troca Aniônica

[135] Uma coluna com um diâmetro de 500 mm é preenchida com meio DEAE-Sepharose ou QAE-Sepharose, a um volume de 25 a 3 0 litros, correspondendo a uma altura do leito de 10 a 15 cm. A cromatografia é realizada em 3 a 4 ciclos para consumir todo o produto.

[136] Os seguintes tampões são preparados: Tampão de equilíbrio, Tampão A, 15 mM de fosfato, 150 mN! de NaCl Tampão de eluição, Tampão B, 2 M de solução de NaCl Tampão de saneamento, 0,5 M de NaOH

[137] A etapa de cromatografia é realizada de 15 a 25°C, a um caudal de <200 cm/hora ou aproximadamente 350 litros/hora.

[138] A coluna é equilibrada com o tampão de equilíbrio até o eluente possuir uma condutividade de 15 a 20 mS/cm. Em seguida, a solução de heparina oxidada é bombeada na coluna. A quantidade de produto bruto a ser aplicado corresponde a <40 g/litro de meio cromatográfico.

[139] Uma lavagem isocrática segue com o tampão de equilíbrio e é descontinuada quando o UV 210 a 254 nm tiver atingido uma linha de base. Tipicamente, 5 volumes de leito do tampão são necessários para atingir a linha de base. Produtos químicos adicionados ao processo e produtos formados destes são removidos.

[140] Em seguida, a força iônica do tampão aplicada na coluna é linearmente aumentada, pela realização de uma eluição de gradiente. 0 tampão A diminui de 10 0% a 0%, substituído por 100% do tampão B ao longo de 5 volumes do leito. O produto eluído é recolhido quando a absorbância de UV é >0,1 UA e é descontinuado quando o sinal é <0,1 UA. O saneamento da coluna ê então realizado depois que é novamente preparado para o próximo ciclo de cromatografia. Os eluatos de todas as corridas são combinados e armazenados de 15 a 25°C.

Dessalinização do produto

[141] Um volume dos eluatos combinados da etapa anterior é adicionado a 3 volumes de etanol de 95 a 99,5%, 15 a 25°C, sob agitação constante. Isso precipita o produto fora da solução. O produto é deixado para sedimentar por >3 horas. Em seguida, o sedimento é dissolvido em água purificada para uma concentração de 15 a 25%. A solução é então adicionada a etanol 95 a 99,5% frio (<-5°C), tipicamente 5 volumes de etanol por um volume da solução do produto são consumidos. Em seguida, segue-se a centrifugação em um modo contínuo, >2000 G, depois disso a pasta do produto é recolhida e preparada para a secagem.

Secagem do produto

[142] O produto é distribuído equilibradamente sobre bandejas e colocado em uma câmara de vácuo.

[143] O vácuo é aplicado e o aquecimento é realizado em 35 a 4 0°C. A corrente de nitrogênio é passada através do secador neste momento, enquanto mantendo a pressão baixa no secador. Quando um peso constante é obtido do produto, isto é, nenhuma evaporação adicional é notada, a secagem é considerada completa. O produto é moído e homogeneizado, em seguida embalado e protegido da umidade.

Exemplo 8

[144] A heparina pouco anticoagulante produzida de acordo com os exemplos 1 e 3 foi submetida à análise de 1H- RMN e comparada com o espectro de heparina nativa.

[145] A tabela II demonstra sinais no intervalo de 5,00 ppm a 6,50 ppm, não presentes na heparina nativa gerada a partir das glicosaminas insaturadas com extremidade não-redutora. Os resultados da tabela II mostram que é possível reduzir a presença de tais compostos não previstos de estarem presentes no espectro de heparina nativa para níveis baixos. Em comparação, o limite atual aplicável ao controle de qualidade de heparina, monografia 7 da EDQM, é <4% em comparação com o sinal a 5,42 ppm para qualquer sinal na região 5,70 a 8,00 ppm. Tabela II. Resultados qualitativos de uma heparina pouco anticoagulante em relação a sinais incomuns. A intensidade do sinal para os sinais de 6,15 e 5,95ppm nos espectros de 1H-RMN:

[146] Além disso, a presença de glicosaminas insaturadas com extremidade final não redutora também foi quantificada por 1H-RMN combinado e avaliação dos espectros de 13C-RMN (HSQC) , e demonstrada como % molar do total de glicosaminas (ver Tabela III).

[147] Além disso, a amostra foi analisada seguindo o método de RMN bidimensional (2D), o método envolvendo o uso combinado de próton e espectroscopia de RMN de carbono (HSQC) como anteriormente descrito (ver Guerrini M., Naggi A., Guglieri S, Santarsiero R, Torri G. Anal Biochem 2005; 337, 35-47).

[148] A tabela III demonstra a fração (%) de glicosaminas modificadas comparadas com a quantidade total de glicosaminas da heparina pouco anticoagulante, conforme se apresentam em sinais a 5,95 ppm e 6,15 ppm no espectro de H-RMN1.Tabela III: Resultados da determinação quantitativa dos sinais incomuns 5,95ppm, 6,15ppm do total de glicosamina:

Exemplo 9

[149] O produto fabricado de acordo com qualquer um dos exemplos acima pode ser preparado como um produto farmacêutico por um processo asséptico convencional, tal como uma solução que compreende 150 mg/ml de produto ativo e de fosfato de Na a 15 mM, pH 6 a 8. O produto farmacêutico assim obtido é destinado principalmente para a administração subcutânea, mas adequado para administração intravenosa.

[150] O produto resultante é uma forma despolimerizada de heparina com um peso molecular médio projetado de 4,6 a 6,9 kDa e com, essencialmente, nenhuma atividade anticoagulante.

[151] O produto possui uma distribuição por tamanhos dos polímeros de polissacarídeos, com um intervalo para n de 2 a 20, correspondendo aos pesos moleculares de 1,2 a 15 kDa. O tamanho predominante é 6 a 16 unidades de dissacarídeos correspondentes aos pesos moleculares de 3,6 a 9,6 kDa.

[152] O peso molecular foi determinado por GPC- HPLC realizada com uma TSK 2000 e colunas TSK 3 000 SW em série. 0 índice de refração foi usado para avaliação. Foi usada a primeira calibração internacional para HBPM.

[153] Abaixo é apresentada a distribuição de massa molecular e a parte correspondente da porcentagem acumulativa do peso total.Tabela IV. Distribuição de polissacarídeos e suas massas moleculares correspondentes como % acumulativa do peso para vários lotes:

[154] O valor correspondente para o peso molecular médio ponderado, Mw cai no intervalo 4,6 a 6,9 kDa.

Exemplo 10

[155] Foi estudada a estabilidade da substância do fármaco (pó) e dos produtos do fármaco dissolvidos em solução tampão aquosa de fosfato, de um GAG quimicamente modificado produzido de acordo com o método inventivo. Os resultados estão descritos na fig 2 e fig 3.

Exemplo 11 Administração subcutânea

[156] Heparina quimicamente modificada marcada com trítio, produzida pelo método descrito no exemplo 1, foi administrada a ratos e cães Sprague-Dawley.

Resultados:

[157] Após a administração subcutânea de 2, 8 e 24 mg de heparina/kg/dia no rato e 3, 15 e 45 mg de heparina/kg/dia no cão, a absorção foi rápida e os níveis plasmáticos máximos foram geralmente atingidos dentro de 0,5 e l,5h no rato e cão, respectivamente. A biodisponibilidade subcutânea foi de cerca de 90% tanto no rato e no cão. Interessantemente, a biodisponibilidade correspondente para a heparina é de cerca de 10%.

[158] Embora determinadas modalidades tenham sido aqui divulgadas em detalhe, isto foi feito por via de exemplo para fins de ilustração apenas e não se destina a ser limitante no que diz respeito ao escopo das reivindicações anexas que seguem. Em particular, é contemplado pelo inventor que várias substituições, alterações e modificações podem ser feitas à invenção sem afastamento do âmbito e do escopo da invenção como definido pelas reivindicações.

Claims (11)

1. Glicosaminoglicano quimicamente modificado caracterizado pelo fato de que o glicosaminoglicano é selecionado do grupo que consiste em heparina quimicamente modificada e sulfato de heparano quimicamente modificado, e em que glicosaminoglicano quimicamente modificado tem: i) uma atividade do anti-fator IIa inferior a 10 UI/mg; ii) uma atividade do anti-fator Xa inferior a 10 UI/mg; e iii) um peso médio de peso molecular (Mw) de 4,6 (±10%) a 6,9 (±10%) kDa; e em que: iv) o sacarídeo de ocorrência predominante do glicosaminoglicano quimicamente modificado é de (Fórmula I):

n é um número inteiro de 2 a 20, de modo que as cadeias de polissacarídeos tem de 2 a 20 unidades de dissacarídeos correspondendo a pesos moleculares entre 1,2 e 12 KDa; e v) as cadeias de polissacarídeos são essencialmente livres de ácidos idurônicos e/ou glicurônicos não sulfatados intactos das sequências de pentasacarídeos mediando o efeito anticoagulante; e vi) o glicosaminoglicano quimicamente modificado têm uma distribuição de polissacarídeos e seus pesos moleculares correspondentes expressos como % acumulativa de peso de acordo com a tabela:

2. Glicosaminoglicano quimicamente modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as cadeias de polissacarídeos de ocorrência predominante possuem entre 6 e 12 unidades de dissacarídeos com pesos moleculares de 3,6 a 7,2 kDa.

3. Glicosaminoglicano quimicamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende glicosaminas insaturadas com extremidade não redutora apresentadas como sinais no intervalo de 5,0 a 6,5 ppm em um espectro 1H-RMN, com uma intensidade (% razão) inferior a 4% em relação ao sinal em 5,42 ppm da heparina nativa.

4. Glicosaminoglicano quimicamente modificado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as glicosaminas modificadas estão presentes como sinais em 5,95 ppm e 6,15 ppm em um espectro de 1H-RMN.

5. Glicosaminoglicano quimicamente modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o glicosaminoglicano quimicamente modificado é heparina quimicamente modificada.

6. Método de preparação de um glicosaminoglicano sulfatado quimicamente modificado, tendo uma atividade do anti-fator IIa inferior a 10 UI/mg, uma atividade do anti- fator Xa inferior a 10 UI/mg e uma média de peso de peso molecular (Mw) de 4,6 (±10%) a 6,9 (±10%) kDa, em que heparina ou sulfato de heparano é quimicamente modificado(a), o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de: (a) oxidação dos ácidos glicurônico e idurônico por tratamento com periodato; (b) eliminação ou minimização dos efeitos de compostos oxidantes que contêm iodo; (c) despolimerização de cadeias de polissacarídeos sob condições alcalinas; e (d) redução e estabilização dos grupos aldeído terminais através de uma reação com um agente redutor, em que o tempo entre o final da etapa a) e o início da etapa d) é de 1 (±10%) hora a 6 (±10%) horas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a oxidação com periodato é realizada: (i) a uma temperatura acima de 10°C; (ii) em uma solução com uma concentração inicial de glicosaminoglicano de 10 (±1)% a 20% (±2)% peso/volume; (iii) por pelo menos 15 horas; e/ou (iv) a uma temperatura de 15 ± 2°C, com uma concentração de glicosaminoglicano de 15% (±1,5%)e com um pH de 5 (±10%) por 18 (±10%) a 24 (±10%) horas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a oxidação com periodato é realizada por 18 (±10%) a 24 (±10%) horas.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a despolimerização é realizada a uma temperatura acima de 20 (±10%)°C.

10. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de glicosaminoglicanos sulfatados quimicamente modificados conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um carreador terapeuticamente aceitável.

11. Uso de um glicosaminoglicano quimicamente modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento ou composição farmacêutica para o tratamento e prevenção de uma condição selecionada a partir do grupo que consiste em distocia e sepse.

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