MXPA01002022A

MXPA01002022A - Receptor para beta-(1,3-)glucano soluble acuoso, no derivado.

Info

Publication number: MXPA01002022A
Application number: MXPA01002022A
Authority: MX
Inventors: Eric M Wakshull
Original assignee: Collaborative Group Ltd
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2002-04-24
Also published as: AU749716B2; CA2341668A1; EP1105733A1; WO2000013019A1; WO2000013019A9; AU5681999A; JP2011102323A; JP2002523522A

Abstract

Se describen metodos para aislar beta(1,3)-glucano u organismos que contienen beta(1,3)-glucano en una muestra, o para detectar la presencia de beta(1,3)-glucano u organismos que contienen beta(1,3)-glucano en una muestra, utilizando un receptor proteico para beta(1,3)-glucano soluble acuoso, no derivado (por ejemplo, un receptor NR8383. Tambien se describen metodos para diagnosticar la infeccion fungal, al detectar beta(1,3)-glucano u organismos que contienen beta(1,3)-glucano. Los anticuerpos y equipos utilies en los metodos tambien se describen. Una preparacion que contiene un receptor proteico para beta(1,3)-glucano soluble acuoso, no derivado se describe adicionalmente, junto con la caracterizacion del receptor para beta(1,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. Tambien se describe los analisis para identificar los agentes que alteran el efecto de beta(1,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en la activacion de trayectorias de transduccion de senal y agentes identificados mediante estos.

Description

RECEPTOR PARA BETA-(1,3)-GLUCANO SOLUBLE ACUOSO, NO DERIVADO SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de E.U. No. de Serie 09/160,922, presentada el 22 de Septiembre de 1998, que es una continuación en parte de la Solicitud de E.U. No. 09/140,196, presentada el 26 de Agosto de 1998, las enseñanzas completas de la cual se incorporan en la presente para referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ß(1 ,3)glucano soluble acuoso, no derivado (también conocido como glucano PGG, glucano de triple hélice (TH-glucano) o Betafectin®) es un ß-glucano soluble único y nuevo fabricado a través de un proceso patentado. La actividad biológica de esta molécula es claramente distinguible de ß-glucanos particulados y otros ß-glucanos solubles. Numerosos laboratorios han reportado inducción directa de metabolitos de ácido araquidónico (Czop ef al., J. Immunol. 141(9): 3170-3176 (1988)), citoquinas (Abel and Czop, Intl. J. Immunopharmacol, 74(8^: 1363-1373 (1992); Doita ef al., J. Leuk Biol. 14(2); 173-183 (1991 )) y choque de ionización oxidativo (Cain et al., Complement 4:75-86 (1987); Gallin ef al., Int, J. Immunopharmacol f 4(2).- 173-183 (1992)) por ambas formas de ß-glucanos, particulado y soluble. En contraste, el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado no activa directamente las funciones del leucocito tales como actividad de choque de ionización oxidativo (Mackin ef al., ^ tf^g« *^^¡^^j^^ ¡ FASEB J. 8:A216 (1994)), secreción de citoquina (Putsiaka ef al., Blood 82:3695-3700 (1993)) o proliferación (Walkshull ef al., J. Cell. Biochem, suppl 18A:22) (1994)). En su lugar, ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado prepara células para la activación mediante estímulos 5 secundarios ( ackin ef al. (1994); Brunke-Reese y Mackin, FASEB J. 8:A488 (1994); y Wakshull ef al. (1994)). La actividad biológica de ß-glucanos se media a través de receptores específicos ubicados en células objetivo. Varios grupos de investigadores han descrito receptores que se unen a y median la 10 fagocitosis de preparaciones de ß-glucano particulado (por ejemplo, partículas como zimosan; Goldman (Immunology 63(2^:319-324 (1988); Exp. Cell. Res. 174(2J:481 -490 (1988); Engstad y Robersten, Dev. comp.. Immunol. 18(5) .397-408 (1 994); Muller ef al., Res. Immunol. 145:267-275 (1994); Czop, Advances in Immunol 38:361 ,398 (1986)); y han 15 caracterizado parcialmente estos receptores (Czop y Kay, J. Exp. Med. 173: 151 1 -1520 (1991 ); Szabo ef al., J. Biol. Chem. 270: 2145-2151 (1995)). El receptor complemento de leucocito 3 (CRC3, también conocido como MAC1 o CD1 1 b/CD18) se ha reportado que une tanto ß-glucanos particulados como algo solubles, así como otros polisacáridos (Thornton ef 20 al., J. Immunol, Í56: 1235-1246 (1996)). Una preparación de ß-glucano aminada soluble se ha mostrado que se une a los macrófagos peritoneales de murino(Konopski ef al. Biochim. Biphys, Acta 1221 :61 -65 (1994)), y un derivado de ß-glucano fosforilado se ha reportado que se une a líneas celulares de monocito (Muller ef al., J. Immunol. 156:3418-3425 (1996)): 25 Desafortunadamente, cada grupo ha utilizado preparaciones de ß-glucano que varían ampliamente en su fuente, método de preparación, pureza y caracterización. Además, las diferentes especies y tipos celulares, tanto líneas celulares establecidas como primarias, y diferentes lecturas al exterior funcionales se han utilizado para caracterizar la biología y bioquímica de las interacciones entre estos ß-glucanos y las células objetivo. La relación entre los diversos receptores descritos por estos investigadores, por lo tanto, no se ha definido, aunque es claro que el receptor descrito por Czop no es CR3 (Szabo ef al. (1995)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención pertenece al descubrimiento de que ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado activa específicamente un nuevo receptor ubicado en macrófagos NR8383. Como se describe en la presente, un ß(,1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado radiomarcado, se utilizó para medir la unión de este ß-glucano a receptores de membrana derivados de células NR8383 de rata. El receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado es una proteína, y muestra unión específica y saturable a membranas y es altamente selectiva para un subclase de ß-glucanos solubles. Los resultados del trabajo descrito en la presente caracterizan este receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y se diferencia claramente de receptores de ß-glucano previamente descritos para ya sea ß-glucanos particulados o solubles, mientras revela información importante acerca de los mecanismos de la actividad biológica de ß(1 , 3)-glucano soluble acuoso, no derivado. La presente invención se refiere a preparaciones aisladas que „ **. ij***it.? i ¡Jk i?c**t.. ?^ .^jj-t Af. .,.:* . contiene el receptor descrito en la presente. Además, la presente invención pertenece a métodos para aislar, concentrar o purificar ß(1 ,3)-glucanos, así como también organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano, y también a análisis para cuantificar la cantidad de ß(1 ,3)-glucanos, u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano en una muestra de prueba. La muestra de prueba puede ser un líquido o un sólido, y puede originarse de varias fuentes que incluyen fuentes animales complejas (por ejemplo, un fluido biológico, tal como sangre, suero, plasma, orina, heces, moco, esputo, bilis, fluido de ascitis, secreciones de heridas, excreciones vaginales, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, fluido de lavado peritoneal, fluido de lavado pulmonar, fluido ocular, saliva o extracto de tejido completo, alternativamente, la muestra de prueba puede ser espécimen sólido, tal como piel u otro tejido); fuentes vegetales (tejido de planta, extracto de tejido de planta, fruta o extractos frutales, semillas o extractos de semilla, savia u homogenatos), células bacteriales; células virales; células fúngales; cultivos de tejido; fuentes ambientales; fuentes alimenticias, o fuentes de proceso de fermentación. En los métodos de la invención, el receptor descrito en la presente se utiliza para capturar o purificar ß(1 ,3)-glucanos y/u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano de una muestra de prueba. El receptor de ß(1 ,3)-glucano, o la muestra de prueba, puede acoplarse o unirse a una fase sólida o una fase de fluido. La muestra de prueba se contacta con el receptor bajo condiciones que son adecuadas para la unión de cualquier ß(1 ,3)-glucano que puede encontrarse presente en la muestra de prueba al receptor; los complejos resultantes de ß(1 ,3)-glucano y el receptor -fcfeL&i s aa£fe3B¿.^^Mtl^ ;,afa,Ía,.^ ("complejos primarios") pueden entonces aislarse, con objeto de aislar ß(1 ,3)-glucano. En otra modalidad, los complejos primarios pueden detectarse, con objeto de detectar ß(1 ,3)-glucano u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano en la muestra de prueba; la presencia de 5 complejos primarios es indicativa de la presencia de ß(1 ,3)-glucano u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano. En otra modalidad, la presencia de ß(1 ,3)-glucano puede detectarse a través de un análisis de competición, en el cual el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado marcado y los receptores se incuban con la muestra de prueba; la cantidad de ß(1 ,3)- 10 glucano en la muestra de prueba es inversamente proporcional a ia cantidad de complejos de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado marcado y receptores. La presencia de ß(1 ,3)-glucano (o de organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano) en la muestra de prueba es indicativa de una infección funga! o contaminación fungal. Los anticuerpos que pueden 15 utilizarse en estos métodos y análisis, así como también ios equipos que pueden utilizarse en estos métodos y análisis, también se encuentran dentro del alcance de la invención. Esta invención también pertenece a un método para alterar (por ejemplo, activar o desactivar) las trayectorias de transducción de 20 señales, por ejemplo, a través de modulación de uno o más factores reguladores transcripcionales en células positivas de receptor, es decir, células que contienen el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. En una modalidad de la invención, la trayectoria de transducción de señales se modula o regula por uno o más factores reguladores 25 transcppcionales de las familias NF-?B y/o NF-IL6 y/o AP-1 de factores reguladores transcripcionales. Otras trayectorias de transducción de señales que pueden alterarse por los métodos de la presente invención incluyen la trayectoria ras/raf-1/MAO quinasa, la trayectoria proteína G/fosfolipasa C/proteína quinasa C, la trayectoria de no proteína G/fosfolipasa C/proteína quinasa C, la trayectoria de JAK/STAT, la trayectoria de fosfolipasa A, la trayectoria de proteína G/fosfolipasa D/ácido fosfatídico, la trayectoria dependiente de c-AMP, la trayectoria de c-Jun quinasa de terminal N (JNK, también conocida como trayectoria de quinada de proteína activada por estrés (SAPK)), la trayectoria de quinasa l?B a (IKKa), la trayectoria de quinasa de tirosina de proteína, y la trayectoria de radical de oxígeno. En cada trayectoria, un activador apropiado o indicador de la trayectoria de señal se activa al unir el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor, y ia modulación de esta unión puede alterar la transducción de señal correspondiente. De acuerdo al método de la presente invención, la actividad del receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado se activa a través de la unión de un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado o un agente que imita la actividad de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, mediante el cual el proceso de transducción de señal se activa de manera que uno o más factores reguladores transcripcionales (por ejemplo, de las familias NF-?B, NF-IL6 y/o AP-1 ) se activan. La activación de estos factores reguladores transcripcionales o de las enzimas en la trayectoria de activación del factor de transcripción (referido en la presente como "enzimas de trayectoria") puede utilizarse para medir la , ? A - ,A *, ¿sá**- activación de la trayectoria de transducción de señal asociada. La activación del receptor puede comprender, entre otros, una alteración en la confirmación del receptor, formación de un complejo de ligante-receptor, o alteración del complejo de ligante-receptor. La actividad del receptor puede iniciarse por un agente que imita la capacidad de activación y de unión de un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, tal como otro conformador del glucano. En una modalidad particular, el factor regulador transcripcional se activa como un resultado de la unión de ligante. En otra modalidad, la actividad del factor regulador transcripcional se reduce, ya sea parcialmente o totalmente, por la unión de un agente al receptor (y de esta manera excluye el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado), pero carece de la capacidad de activar el receptor. La invención también pertenece a un análisis para identificar agentes que alteran (por ejemplo, incrementan o reducen) la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor. El análisis comprende combinar ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado radiomarcado, el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y un agente a probarse, bajo condiciones adecuadas para unir el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor. El grado de unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor en la presencia del agente a probarse se determina y compara con el grado de unión en la ausencia del agente a probarse; una diferencia en el grado de unión indica que el agente altera la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor. Un incremento en el grado de unión en la presencia del agente indica que el agente aumenta, es decir, prolonga o incrementa, la unión o es un agonista del receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. Una reducción en el grado de unión en la presencia del agente indica que el agente disminuye, es decir, acorta o reduce, ia unión o es una antagonista del receptor para ß(1 ,3)-glucano 5 soluble acuoso no derivado. La invención también se refiere a agentes identificados por análisis descritos en la presente, y de acuerdo con lo anterior, se refiere a agonistas y antagonistas de la actividad de ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado. La presente invención también pertenece a un nuevo análisis 10 para identificar los agentes que alteran (por ejemplo, incrementa o reducen) el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en trayectorias de transducción de señal celular, tal como la activación de factores reguladores transcripcionales. El análisis comprende combinar ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, el receptor para ß(1 ,3)- 15 glucano soluble acuoso no derivado y un agente a probarse bajo condiciones en las cuales la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor ocurre (es decir, las condiciones adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado). La unión de ß(1 ,3)-glucano 20 soluble acuoso, no derivado a su receptor activa el receptor, el cual a su vez activa una transducción de señal como se ejemplifica o mide por una modulación de uno o más factores reguladores transcripcionales tales como aquellos de las familias NF-?B, NF-IL6 y/o AP-1 o las enzimas en las trayectorias de transducción de señal respectivas de las trayectorias 25 reguladoras transcripcionales. El grado de activación del factor regulador t*JtM Á&m,A-^ , .- , i „ ,J.Í.~JSáj?*t f Üfr - " --»-• - . , ,.j>a,tl.»««ata¿k?a a¿E,atAÁMb transcripcional, o enzima de trayectoria, en la presencia de un agente a probarse se determina y compara con el grado de activación del factor regulador transcripcional seleccionado, o enzima de trayectoria, en la ausencia del agente a probarse; una diferencia en el grado de activación indica que el agente altera el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria. Un incremento en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria en la presencia del agente indica que el agente aumenta, es decir, prolonga o incrementa, la activación. Una reducción en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria en la presencia del agente indica que el agente disminuye, es decir, acorta o reduce, la activación. Los análisis y métodos de la presente invención pueden utilizarse para identificar los agentes y medicamentos para utilizarse en el tratamiento de enfermedad infecciosa, inflamación, enfermedades autoinmunes, lesión de reperfusión por isquemia, cáncer, asma y desordenes de hipersensibilidad. El análisis y métodos descritos en la presente también pueden utilizarse para identificar medicamentos que prolongan o imitan el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y por lo tanto pueden utilizarse en cualquier aplicación terapéutica o profiláctica en la cual el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado puede utilizarse, tal como para inmunomodulación, hematopoyesis, prevención y tratamiento de enfermedad infecciosa, producción de plaquetas, movilización de la célula precursora sanguínea, periférica y curación de heridas. Estos agentes o medicamento actúan para aumentar los efectos j ¡ § JittrttaBt.t it de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al, por ejemplo, prolongar la unión del glucano a su receptor o los efectos del mismo. La presente invención también se refiere a agentes o medicamentos, tales como, pero no limitándose a, péptidos o moléculas orgánicas pequeñas designadas con referencia al sitio de unión para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en el receptor paraß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. En una modalidad, tales agentes o medicamentos puede diseñarse para imitar la actividad del sitio de unión del receptor en que unen ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, reduciendo así la cantidad del ß(1 ,3)-glucano que se encuentra disponible para unirse al receptor y reduciendo la activación de eventos aguas abajo tal como transducción de señal. La presente invención también pertenece a un agonista o imitación de ia actividad de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado con respecto a su unión y activación del receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, tal como otra conformación de glucano. Alternativamente, el medicamento o agente puede diseñarse para unir el sitio de unión del receptor, convertirlo en no disponible para unir ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado; la presente invención también se refiere a antagonistas de la actividad de unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. El trabajo descrito en la presente tiene aplicación a muchas áreas. Por ejemplo, puede utilizarse en el monitoreo del proceso de fabricación de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y caracterización del producto para liberación comercial, para medir ß-glucanos en fluidos, para valorar y determinar las relaciones de estructura- actividad de agentes que interactúan con el receptor para el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. Adicionalmente, este trabajo tiene aplicación al suministro objetivo de varios agentes, incluyendo medicamentos y moléculas pequeñas, a células positivas de receptor tales como leucocitos 5 polimorfonucleares periféricos, monocitos, macrófagos y células epiteliales. Los resultados descritos en la presente también pueden utilizarse en esquemas de purificación para enriquecer tanto las células positivas de receptor como las células negativas de receptor, así como también en la generación de anticuerpos anti-receptores para propósitos 10 de diagnóstico. Además, los métodos y análisis de la invención permiten la detección altamente sensible, específica de ß(1 ,3)-glucanos en una muestra de prueba, facilitar el diagnóstico de fungemias y la detección de contaminación fungal, sin requerir equipo costoso o personal capacitado. 15 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación gráfica de unión dependiente de dosis de 3H-TH-glucano a células NR8383. Círculos sólidos, unión total; círculos abiertos; unión específica; cuadrados sólidos; unión no específica. 20 La Figura 2A es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a células NR8383, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano de bajo peso molecular competidor sin marcar. Círculos sólidos, TH-glucano; cuadrados abiertos; glucano de bajo peso molecular 25 (LMW).

La Figura 2B es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a células NR8383, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano de peso molecular muy alto competidor sin marcar. Círculos sólidos, TH-glucano; cuadrados abiertos; glucano de peso molecular muy elevado (VHMW). La Figura 2C es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a células NR8383, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano de competidor sin marcar, escleroglucano. Círculos sólidos, TH-glucano; cuadrados abiertos; escleroglucano. La Figura 3A es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano competidor sin marcar, glucano LMW. Círculos cerrados, TH-glucano; cuadrados abiertos; glucano-LMW. La Figura 3B es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano competidor sin marcar, glucano VHMW. Círculos cerrados, TH-glucano; cuadrados abiertos; glucano-VHMW. La Figura 3C es una representación gráfica de selectividad de ß-glucano de la unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida, determinada por los análisis de unión de competición utilizando varias concentraciones de ß-glucano competidor sin marcar, escleroglucano. Círculos cerrados, * * •« <- TH-glucano; cuadrados abiertos; escleroglucano. Los objetos anteriores y otros, características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción más particular de modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos acompañantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención pertenece al descubrimiento de que ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado (ver No. de Serie de E.U. 07/934,015, presentada el 21 de Agosto de 1992, las enseñanzas de la cual se incorporan en la presente para referencia) específicamente se une a un nuevo receptor ubicado en macrófagos NR8383 de rata. ß(1 ,3)-glucanos solubles acuosos, no derivados también se describen en los Nos. de Serie de E.U. 08/400,488, 08/432,303, 07/934,015 y 08/469/233 y las patentes de E.U. Nos. 5, 322,841 , 5,488,040, 5,532,223 y 5,783,569 (las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia). Los resultados del trabajo descrito en la presente caracterizan este receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado (también conocido como TH-glucano) y claramente lo diferencia de receptores de ß-glucano 0 previamente descritos, mientras revela información importante acerca del mecanismos de la actividad biológica de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. El receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado se ubica principalmente en macrófagos NR8383 de rata, particularmente 5 macrófagos alveolares. Como se utiliza en la presente, "receptor" se * **~ , ...... . ... .. 1 *...»&.. ..*. á.,^! ., .-^j.^,,^. , _^ ...»>i.^. «&"-*--«-— ** - propone para incluir una molécula receptora tradicional así como un sitio de unión; tal sitio de unión puede tener un efecto en su propiedad o puede inducir o activar una segunda molécula o sitio de unión para producir un efecto (también conocido como "desenmascaramiento" de un segundo sitio; Sandberg ef al., Infecí. Immun. 63(7):2625-2631 (1995)). Como se utiliza en la presente, "receptor" también se propone para incluir compuestos que tienen una afinidad para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado; estos compuestos pueden ser imitaciones del receptor o análogos del receptor, y puede aislarse de una fuente que ocurre de manera natural o pueden producirse químicamente o sintéticamente. Los términos, "receptor NR8383", "receptor en células NR8383", y "receptor de células NR8383", se refieren a un receptor como se define arriba, que tiene ciertas características del receptor identificado en células NR8383 como se describe abajo, tal como una composición proteica, una asociación con una membrana, una cierta afinidad de unión, sensibilidad a temperatura, selectividad de ß-glucano, sensibilidad a tripsina, y/o activación de factores de transcripción. El receptor (también referido como un "receptor de proteína" o "receptor proteico") puede estar presente en células NR8383, así como en otros tipos de células, y también puede aislarse (es decir, separarse de células). Para células NR8383, ver, por ejemplo, Helmke, R.J. et al., In Vitro Cell Bevelop. Biol. 23:567-574 (1987); Helmke, R.J. ef al., In Vitro Cell Develop, Biol, 25:44-48 (1989). La unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado en la conformación de triple hélice al receptor en células NR8383 fue específica, saturable y se ajustó por un modelo de dos sitios, con t J .. { .trihA ..J| H «.. . ..«.. jrtaj.Aaj.tjk . „ h^?* .* _¿._^_^-fc_ afinidades de 45 pM y 170 pM. En adición, el enlace de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor en células NR8383 ocurrió ya sea a 4°C o 37°C. ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado (TH-glucano) compitió con glucano de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 8,000-120,000 daltones) y glucano de peso molecular muy elevado (VHMW) (aproximadamente>1 ,000,000 daltones), así como para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, no marcado en ia conformación de triple hélice, para unirse al receptor NR8383, mientras que el escleroglucano no. La unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor en células NR8383 se destruyó por el pre-tratamiento de células con tripsina, y la recuperación de la actividad de unión dependió de la síntesis de proteína, indicando que el receptor NR8383 es una proteína. En células NR8383, LMW-glucano y VHMW-glucano (pero no escleroglucano) indujo la activación de un factor como NF-?b; ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado estimuló para actividad de quinasa de proteínas de JNK quinasa MAO y la señal de algo de IKKa quinasa, pero no de las quinasas MAP ERK1 /2 o p38. Estas características del receptor en células NR8383 difieren en afinidad de unión, sensibilidad a temperatura, selectividad de ß-glucano, y sensibilidad a tripsina, de otros receptores de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado previamente identificados, como se describe abajo en los Ejemplos. De esta manera, el receptor en las células NR8383 representa un receptor previamente identificado para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. Por lo tanto, la invención pertenece a preparaciones aisladas que contienen el receptor proteico descrito en la presente, que se une (por ejemplo, específica y selectivamente, a un ligante que es un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, tal como ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en una conformación de triple hélice. Los métodos ahora se encuentran disponibles para capturar, concentrar o purificar ß(1 ,3)-glucanos, incluyendo levadura o ß(1 ,3)- glucanos solubles fúngales, levadura o ß(1 ,3)-glucanos insolubles fúngales, así como para capturar, concentrar o purificar organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano, utilizando el receptor de las células NR8383. Además, los análisis para cuantificar la cantidad de ß(1 ,3)-glucano en una muestra de prueba se describen en la presente; estos análisis pueden utilizarse para diagnosticar infecciones fúngales. Los equipos útiles en los análisis y métodos también se describen. Los métodos, análisis y equipos toman ventaja de la afinidad del receptor de ß(1 ,3)-glucano, como se describe arriba, para ß(1 ,3)-glucanos solubles, tal como ß(1 ,3)-glucano y otras confirmaciones de glucano (por ejemplo, LMW-glucano, HMW- glucano y -VHMW-glucano). De acuerdo con los métodos de la invención, se obtiene una muestra conocida por contener o piensa contener, hongos u organismo que contienen ß(1 ,3)-glucano. La muestra de prueba puede ser un líquido o un sólido, y puede originarse de varias fuentes, incluyendo fuentes animales complejas (por ejemplo, tejidos o células de mamífero), tejidos o células vegetales, células bacteriales, células virales, células fúngales, cultivo de tejido, fuentes ambientales, fuentes alimenticias, o fuentes del proceso de fermentación. Por ejemplo, si la muestra de prueba es de una fuente animal, la muestra de prueba puede ser un fluido biológico, tal como * ***?«. . *¿*j. } ma fejüfcaü» „-,, . , , . ... ^ ...^. ^^^^.^^^a?. * '-*--• sangre (sangre total, suero de sangre total o plasma de sangre total), orina, heces, moco, esputo, bilis, fluido de ascitis, secreciones de heridas, excreciones vaginales, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, fluido de lavado peritoneal, fluido de lavado pulmonar, fluido ocular, saliva o extracto de tejido completo, alternativamente, la muestra de prueba puede ser espécimen sólido, tal como piel u otro tejido. Si un individuo que se sospecha que tiene una infección fungai se inmunocompromete, la muestra de prueba preferida es una muestra de orina. Si la muestra es de una fuente vegetal, puede ser un espécimen sólido o fluido, tal como tejido de planta, extracto de tejido de planta, fruta o extractos frutales, semillas o extractos de semilla, savia u homogenatos de planta. La muestra de prueba también puede ser una fuente ambiental tal como agua, suelo o extractos de suelo, o una fuente alimenticia tal como alimentos preparados, que pueden contaminarse de manera fungal. Alternativamente, la muestra de prueba puede ser una muestra de un proceso de fermentación, tal como caldo de fermentación. Si la muestra de prueba es rica en proteína, una etapa de desproteinación, tal como métodos estándar de precipitación de ácido perclórico o ácido tricloroacético, o precipitación utilizando un método de precipitación del 70% de etanol estándar puede llevarse a cabo antes de ejecutar el análisis de la invención (Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification (Deutscher, M.P. Ed., Academic Press, Inc, San Diego CA, 1990), Capítulo 22, pp. 285-306). Sin embargo, tal etapa no es necesaria para ejecutar los métodos de la invención. En un método de la invención, el receptor proteico como se .. ., ,ü * «Mlfc»» ..»»>. ít* **. .- *^¡í.^* _ _ . . _ , , »a,,,A¡),fei.>.> .^a describe en la presente se utiliza para capturar o purificar ß(1 ,3)-glucanos y/u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano de una muestra de prueba. En una modalidad de este método de la invención, el receptor puede acoplarse a una fase sólida (por ejemplo, filtro, membrana tal como 5 celulosa o nitrocelulosa, plástico (por ejemplo, placa microconcentración, varilla para medir la profundidad), vidrio (por ejemplo, portaobjeto), perla (por ejemplo, perlas de látex), partículas, resina orgánica u otras fase sólida orgánica y no orgánica) o una fase fluida (por ejemplo, regulador TRIS o regulador de fosfato). El acoplamiento del receptor al sólido o fase 10 fluida puede llevarse a cabo mediante métodos estándar, incluyendo, por ejemplo, secado al aire, secado por calor, o reacción química. En esta modalidad del método, la muestra de prueba se contacta con un receptor acoplado a una fase líquida o sólida, bajo condiciones que son adecuadas para unir cualquier ß(1 ,3)-glucano (u organismos que contienen ß(1 ,3)- 15 glucano) que pueden presentarse en la muestra prueba al receptor, ß(1 ,3)- glucano o un organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano que se une a un receptor se refiere en la presente como un "complejo primario". La formación de complejos primarios indica que ß(1 ,3)-g ?cano o un organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano, se ha "capturado" de la muestra de 20 prueba. ß(1 ,3)-glucano o un organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano que se ha "capturado" de la muestra de prueba es el ß(1 ,3)-glucano o el organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano que se une a un receptor. En otra modalidad de este método, la muestra de prueba puede unirse (por ejemplo, absorberse, revestirse, acoplarse, unirse 25 covalentemente, unirse por unión de afinidad) a un soporte sólido, tal como rttM miA. ? ,nñv ifr -Hr"- - - • -»> - - .>.».¿j¡it??^.A.iéAi ., al hundir el soporte sólido en la muestra de prueba, mediante aplicación gota a gota de una muestra de prueba fluida con el soporte sólido, o al embarrar una muestra de prueba sólida sobre el soporte sólido. Si se desea, la muestra de prueba puede mezclarse con un líquido tal como salina o cualquier otro regulador apropiado, antes de la unión al soporte sólido, tal como, por ejemplo, en el caso de muestras de prueba sólidas. Después de que la muestra de prueba se une a un soporte sólido (formando una "muestra de prueba unida"); un receptor se contacta con la muestra de prueba unida, bajo condiciones que son adecuadas para unir cualquier ß(1 ,3)-glucano que puede estar presente en la muestra de prueba unida al receptor. El receptor que se une a cualquier ß(1 ,3)- glucano u organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano en la muestra de prueba unida también se refiere en la presente como un "complejo primario". En cualquier modalidad de este método, cualquiera de los complejos primarios que se han formado pueden aislarse, con objeto de obtener, aislar, concentrar o purificar el ß(1 ,3)-glucano (u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano) de la muestra de prueba. Los complejos primarios pueden obtenerse o aislarse utilizando métodos estándar, tal como por inmunoprecipitación u otros medios, que dan como resultado complejos primarios purificados o concentrados, de los cuales ß(1 ,3)- glucano purificado o concentrado (u organismos que contienen ß(1 ,3)- glucano) pueden separarse utilizando métodos estándar (ver Current Protocols in Molecular Biology, Vol. II, Ch. 10 (Ausubel, F. ef al. , eds. , John Wiley & Sons, 1 997). En otra modalidad de la invención, los complejos primarios pueden detectarse, en un análisis para determinar si ß(1 ,3)-glucano (u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano) se presenta en la muestra de prueba. Además, la cantidad de complejos primarios puede determinarse: la concentración de los complejos primarios se correlaciona positivamente con la cantidad de ß(1 ,3)-glucano (u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano) presente en la muestra de prueba. Una variedad de métodos pueden utilizarse para detectar, y/o determinar la cantidad de, ß(1 ,3)-glucano, incluyendo la detección del ß(1 ,3)-glucano utilizando un agente que une selectivamente el complejo primario, tal como anticuerpos anti-ß-glucano (monoclonales o policlonales) o fragmentos del anticuerpo; detección de reacción enzimática precipitada por ß(1 ,3)-glucano, tal como por lisato de amebocito Limulus o análisis del Factor G de lisato Limulus (Mori, T. , et al., Eur. J. Clin. Chem. Biochem. 35(7) .553-560 (1997); Hossai, M.A. et al., J. Clin. Lab. Anal. 11:73-77 (1997); Obayashi, T. et al., J. Med. Vet. Mycology 30:275-280 (1992), las enseñanzas totales de cada una de las cuales se incorporan en la presente para referencia); uso de enzimas que reaccionan con ß-glucanos; u otros medios. En una modalidad preferida, se utiliza el análisis de Factor G de lisato Limulus. En otra modalidad del método, los complejos primarios pueden detectarse a través del uso de una marca detectable en el receptor, tal como un radionucleótido (por ejemplo, radioinmunoanálisis), tinte, compuesto fluorescente, biotina o estreptavidina. Si se desea, la cantidad de complejos primarios puede compararse con una curva estándar generada con un ß(1 ,3)-glucano estándar conocido. En otra modalidad de la invención, un análisis de competición puede utilizarse para determinar la cantidad de ß(1 ,3)-glucano (u organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano) que se encuentra presente en la muestra de prueba. Por ejemplo, ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado marcado (por ejemplo, con radionucleótidos, tintes o marcas 5 fluorescentes) u otro ß(1 ,3)-glucano soluble, tal como glucano de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 8,000-120,000 daltones, como se determina por MALLS), glucano de peso molecular elevado (HMW) (aproximadamente>210,000-<1 ,000,000, como se determina por MALLS) o glucano de peso molecular muy elevado (VHMW) (aproximadamente 10 >1 , 000, 000 daltones, como se determina por MALLS), se incuba con el receptor proteico descrito en la presente y la muestra de prueba, bajo condiciones adecuadas para unir ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su agente de unión. Subsecuentemente, se determina la cantidad de complejos primarios que contienen ß(1 ,3)-glucano soluble 15 acuoso, no derivado, marcado. Esta cantidad se compara con la cantidad de complejos primarios generada por la incubación de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado con el receptor en una muestra de control (es decir, una muestra que tiene una cantidad conocida de ß(1 ,3)- glucano sin marcar) o una serie de muestras de control (por ejemplo, una 20 curva estándar). La cantidad de ß(1 ,3)-glucano en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de complejos primarios que contienen ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado. La detección y cuantificación de la presencia de ß(1 ,3)- glucano, o de organismos que contienen ß(1 , 3)-glucano, es útil en el 25 diagnóstico de fungemias o contaminación fungal. Para diagnosticar la - ¿*ÍW*m» - - * . *. ± **AX~ -.. I. ***»**... . -. ,_ ., .. . ..aAam... **M?*»táí?~ , . ^ . .._, . 4 infección fungal en un individuo, por ejemplo, una muestra, tal como una muestra de fluido biológica, se obtiene del individuo. La muestra se analiza para la presencia de ß(1 ,3)-glucano, como se describe en detalle arriba. La presencia de ß(1 ,3)-glucano en la muestra de prueba es indicativa de la presencia de un componente de paredes celulares fúngales, y por lo tanto es indicativa presencia fungal, contaminación o infecciones. De manera similar, la presencia de ß(1 ,3)-glucano en una muestra de una fuente ambiental, o una fuente alimenticia, es indicativa de presencia fungal o contaminación. Además, la cuantificación de la cantidad de ß(1 ,3)-glucano, o de organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano, puede proporcionar información cµje considera la severidad de la infección o contaminación. Los métodos y análisis de la invención proporcionan identificación específica y exacta de la presencia de ß(1 ,3)-glucanos en una muestra de prueba, facilitando así el diagnóstico y tratamiento de contaminación e infección fungal. Además, como un resultado del trabajo descrito en la presente, es posible monitorear el proceso de fabricación de ß(1 ,3)-glucano soluble, acuoso, no derivado y caracterizar el producto. Es decir, las muestras de prueba pueden incluirse en un análisis de unión del receptor de competición estándar para permitir la caracterización de la molécula en términos de afinidad relativa para el receptor. Esta caracterización producirá información con respecto a alguna o todas de las siguientes características; calidad de carga a carga, identificación de producto como un ß(1 ,3)-glucano de una conformación particular y pureza del producto. Las muestras de prueba también pueden incluirse en análisis kAtd : ;» ««¿w.. * -?Hritf de competición o captura estándar y compararse con una muestra estándar para elucidar las relaciones de estructura-actividad. Alternativamente, la unión de muestra de prueba puede probarse directamente después del radiomarcado. Las muestras también pueden probarse en un análisis mediado por el receptor de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado para probar la inhibición o estimulación de estas funciones. Por ejemplo, tales análisis pueden utilizarse en el desarrollo de polímero o agonistas de receptor de molécula pequeña o desarrollar un antagonista de receptor para inhibir un inmunoaumento inapropiado, tal como para prevenir un rechazo de implante que puede ocurrir como un resultado de una infección fungal oportunística durante la terapia inmunosupresora. Los descubrimientos descritos en la presente también pueden utilizarse para dirigir el suministro de varios agentes a las células positivas de receptor. Por ejemplo, varios agentes pueden conjugarse (por ejemplo, conjugarse químicamente, degradarse o unirse covalentemente) a ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado para producir una molécula conjugada que puede dirigirse a células positivas de receptor tales como macrófagos. Tal sistema de suministro objetivo puede utilizarse para aumentar el suministro de agentes tales como antimicrobiales para patógenos intracelulares resistentes (por ejemplo, micobacterio, leishmania, malaria), citotoxinas para leucemias positivas de receptor, genes para terapia de gen (por ejemplo, producción de citoquina aumentada o reemplazo de enzimas disfuncionales), o antígenos para producción y presentación mejorada de anticuerpos específicos o activación de la célula T. La especificad de unión del ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor proporcionar un método para purificar tanto células positivas de receptor como negativas de receptor (es decir, células que no contienen el receptor); por ejemplo, ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado puede unirse a una matriz sólida y utilizarse como una matriz de afinidad para seleccionar positivamente células positivas de receptor o para seleccionar negativamente células negativas de receptor. De manera similar, los anticuerpos anti-receptor pueden utilizarse en lugar del ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado, inmovilizado. Las células que se purifican por este método pueden expandirse subsecuentemente para utilizarse en terapia celular. Además, la presente invención hace posible la generación de anticuerpos anti-receptores par propósitos de diagnóstico. Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden producirse utilizarse preparaciones de receptor enriquecidas o purificadas mediante técnicas estándar. De esta manera, la presente invención también se refiere a anticuerpos que unen el receptor para ß(1 , 3)-glucano soluble acuoso, no derivado. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen al receptor descrito se encuentran dentro del alcance de la invención. Un mamífero, tal como un ratón, hámster, cabra o conejo, pueden inmunizarse con una forma inmunogénica del receptor (es decir, una porción antigénica del receptor que es capaz de producir una respuesta de anticuerpo). Las técnicas para conferir inmunogenicidad incluyen, por ejemplo, conjugación a vehículos u otras técnicas bien conocidas en la materia. El antígeno puede administrarse en la presencia de un adyuvante, y el progreso de inmunización puede monitorearse mediante la detección de concentraciones de anticuerpo en plasma o suero. ELISA estándar u otros inmunoanálisis pueden utilizarse con el inmunogen como antígeno para valorar los niveles de anticuerpo. Los anticuerpos para el receptor proteico descrito en la presente pueden producirse mediante técnicas 5 estándar tales como, por ejemplo, aquellas descritas en Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, 1997). Tales anticuerpos pueden utilizarse para identificar alteraciones el poblaciones de célula negativas de receptor o positivas de receptor que reflejan patología de enfermedad (por ejemplo, respuesta a leucemia o infección fungal críptica). 10 Esta invención también pertenece a un método para alterar (por ejemplo, activar o desactivar) las trayectorias de transducción de señal, por ejemplo, a través de la modulación de factores reguladores transcripcionales o enzimas de transducción de señal (enzimas de trayectoria) en células positivas de receptor, es decir, células que 15 contienen el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado descrito en la presente. En una modalidad de la invención, el factor regulador transcripcional es de las familias NF-?B y/o NF-IL6 y/o AP-1 de factores reguladores transcripcionales. Por ejemplo, el factor de transcripción puede ser NF-?B, NF-IL6 o AP-1 . 20 De acuerdo al método de la presente invención, la actividad del receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado se activa a través de unir un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, mediante el cual una trayectoria de transducción de señal (por ejemplo, que consiste de una cascada de enzimas) se activa y regula así por un factor regulador 25 transcripcional (por ejemplo, de las familias NF-?B, NF-IL6 o AP-1 ) se activa. La activación del receptor puede comprender, entre otros, una alteración en la conformación del receptor, formación de un complejo ligante-receptor, o alteración del complejo ligante-receptor. Alternativamente, la actividad del receptor puede activarse por un agente que imita la capacidad de activación y unión de un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado (por ejemplo, otra conformación de glucano). En una modalidad particular, el factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria se activa como un resultado de la unión de ligante. En otra modalidad, la actividad del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria se reduce, ya sea parcialmente o totalmente, por la unión de un agente que une el receptor (y de esta manera excluye el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado), pero carece de la capacidad para activar el receptor. Otras trayectorias de transducción de señal que pueden alterarse por los métodos de la presente invención incluyen ras/raf-1 /MAO quinasa, la trayectoria proteína G/fosfolipasa C/proteína quinasa C, la trayectoria de no proteína G/fosfolipasa C/proteína quinasa C, la trayectoria de JAK/STAT, la trayectoria de fosfolipasa A, la trayectoria de proteína G/fosfolipasa D/ácido fosfatídico, la trayectoria dependiente de c-AMP, la trayectoria de c-Jun quinasa de terminal N (JNK, también conocida como trayectoria de quinada de proteína activada por estrés (SAPK)), la trayectoria de quinasa l?B a (IKKa), la trayectoria de quinasa de tirosina de proteína, y la trayectoria de radical de oxígeno. En cada trayectoria, un indicador o activador apropiado de la trayectoria de seña se activa al unir el ß(1 , 3)-glucano soluble acuoso , no derivado y la modulación de esta . > * k . *í%.t. k*... . ^y¡ £^¿ unión puede alterar el evento de transducción correspondiente. La presente invención también pertenece a un nuevo análisis para identificar agentes que alteran el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en trayectorias de transducción de señal, tal como la 5 activación de factores reguladores transcripcionales o enzimas de trayectoria. Este análisis comprende combinar ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y un agente a ser probado bajo condiciones en las cuales la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor ocurre (es decir, condiciones adecuadas para unir ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado). La unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a su receptor activa el receptor, que a su vez activa una trayectoria de transducción de señal como se muestra por los factores reguladores transcripcionales tales como 5 aquellos de las familias NF-?B, NF-IL6 o AP-1 . El grado de activación del factor regulador transcripcional seleccionado o enzima de trayectoria en la presencia de un agente a probarse se determina (por ejemplo, utilizando oligonucleótidos de ADN radiomarcados específicos para el factor regulador transcripcional, como en los Ejemplo) y se compara con el grado 0 de activación del factor regulador transcripcional seleccionado o enzima de trayectoria en la ausencia del agente a probarse; una diferencia en el grado de activación indica que el agente altera el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria. Un incremento en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria en la presencia de arntuse . , « t .-..^«.¿^.¿. . , „ , . „ Aai,..^., ,.*, ..........^.^^^.^...^. ..» ••"*--- A- •*•• - ; un agente indica que un agente aumenta, es decir, prolonga o incrementa, la activación. Una reducción en la activación del factor regulador transcripcional o enzima de trayectoria en la presencia del agente indica que el agente disminuye, es decir, acorta o reduce, la activación. Los equipos útiles en los métodos y análisis descritos arriba también se contemplan en la invención. Tal equipo comprende principalmente los componentes y reactivos descritos para los métodos y análisis, tal como una fase sólida, marcas detectables, aglutinante de ß(1 ,3)-glucano y/o ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado. En una modalidad, el equipo comprende el receptor descrito en la presente como un aglutinante de ß(1 ,3)-glucano. En una modalidad preferida, el aglutinante de ß(1 ,3)-glucano se une a un soporte sólido, tal como un filtro, una membrana tal como celulosa o nitrocelulosa, un soporte plástico (por ejemplo, placa microconcentración, varilla para medir la profundidad), un soporte de vidrio (por ejemplo, portaobjeto), perla (por ejemplo, perlas de látex), partículas, una resina orgánica u otras fase sólida orgánica y no orgánica). Los siguientes Ejemplos se ofrecen para el propósito de ilustrar la presente invención y no se construyen para limitar el alcance de esta invención. Las enseñanzas de todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente para referencia. EJEMPLO 1 Materiales y Métodos A. Materiales Medio de cultivo de tejido F-12 de Ham se compro de Life Technologies (Grand Island, NY); suero de bovino fetal (fes) y , ^^ülti..» .j lt..„.„>.,,.?. ,.,^^t., ?,..* . .. lipopolisacárido (LPS, serotipo 0128:B12) se compró de Sigma (St. Louis, MO); TH-glucano, glucano de bajo peso molecular (LMW-glucano, aproximadamente 8,000-120,000 daltones), glucano de peso molecular elevado (HMW-glucano, aproximadamente >210,000-<1 ,000,000 daltones), 5 glucano de peso molecular muy elevado (VHMW-glucano, aproximadamente >1 , 000, 000 daltones) se prepararon en Alpha-Beta Technology, Inc, de acuerdo a métodos descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,622,939, 5,783,569 y 5,817,643; Escleroglucano (ACTIGUM™) se obtuvo de Sanofi Bio-lndustries (Paris, Francia). Escleroglucano utilizado 10 para los análisis en este reporte se modificó mediante hidrólisis de ácido fórmico suave, neutralización y fracción de tamaño en cromatografía de permeación de gel para lograr el volumen hidrodinámicamente equivalente como TH-glucano. Todas las muestras de ß-glucano se probaron negativas para la contaminación de endotoxina por análisis de lisato de amoebocito 15 Limulus. Todos los materiales de grado de reactivo se compraron de ya sea Sigma o Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN). Las proteínas de fusión GST ATF-2, ELK-1 , c-jun se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA); anticuerpos anti-ERK1 /2, p-38, -JNK, e IKKa, así como proteína de fusión GST l?Ba, se compraron de Santa Cruz Biotechnology, 20 Inc. (Santa Cruz, CA). Para células N8383, ver, por ejemplo, Helmke, R.J . ef al., In Vitro Cell Develop. Biol. 23:567-574 (1 987); Helmke, R.J . ef al., In Vitro Cell Develop. Biol. 25:44-48 (1989). Los pesos moleculares se determinaron por MALLS. S. Preparación de 3H-TH-glucano 25 TH-glucano (Alpha-Beta Technology, Worcester, MA) se incubó con NalO4 (10 mg/ml; Sigma) en agua libre de pirogen estéril (SPF) durante 72 horas a temperatura ambiente. El peryodato se enfrió por la adición de 0.5 rnl de glicol de etileno. El TH-glucano oxidado se dializó contra agua SP F, y después se marcó reductivamente con 100 mCi de NaB3H4 (New England Nuclear, Boston, MA). 3H-TH-glucano se separó de productos de degradación de bajo peso molecular concentrado mediante diálisis y ultrafiltración. La pureza del producto marcado se valoró por cromatografía de permeación de gel. C. Análisis de unión de célula completa NR8383 Las células NR8383 se desarrollaron en medio F-12 de Ham que contiene 1 5% de suero de bovino fetal (F-12/fcs) utilizando técnicas de cultivo de tejido estándar. Las células se cultivaron en una densidad celular de aproximadamente 3x105 células/ml por rascamiento y centrifugación (400 x g, 5 minutos, temperatura ambiente). Las células se resuspendieron en PBS y combinaron con 3H-TH-glucano (1 µg/ml final) y ya sea salina o competidor como se indica en las figuras. La concentración celular fue 0.25-1 .0x106 células/cavidad/200 µl. La reacción de unión se dejó proceder durante 60 minutos a 37°C. Al final del periodo de incubación, las células se enjuagaron 2 x 250 µl PBS mediante centrifugación, se solubilizaron con 0.1 N NaOH, y la radioactividad se cuantificó mediante recuento de escintilaciones líquidas. La dependencia de dosis de 3H-TH-glucano que se une a célula NR8383 se valoró al incubar 3.3 x106 células NR8383/ml con concentraciones crecientes (como se indica en la Figura 1 ) de 3H-TH-glucano con (unión no específica) o sin (unión específica) TH-glucano .. I fe.jtaa?.« .. ***&* *. . .. . ,.,«di¿ _ „__, _ . , ... _«_.->. . *£*$-»_>.-_..... 1000 veces en exceso en 350 µl de salina regulada de Hank (Ca .+*++/ #M»*g-. +1 + libre; HBSS") durante 60 minutos a 4°C. Las células se enjuagaron dos veces en HBSS" mediante centrifugación, las pastillas celulares se solubilizaron y la radioactividad se cuantificó mediante recuento de 5 escintilaciones Ilíquidas. Los experimentos preliminares indicaron que los niveles de unión de equilibrio se alcanzaron por 60 minutos. La temperatura de incubación de 4°C en estos experimentos se utilizaron para inhibir el proceso de internalización de ligante/receptor con objeto de facilitar el análisis de datos de unión de equilibrio. Las muestras del 10 medio de incubación se salvaron al final de la incubación para la determinación de 3H-TH-glucano libre. La unión específica se calculó como la diferencia entre la unión total y la unión no específica. Los datos se ajustaron a un modelo de doble sitio/doble afinidad mediante análisis de regresión lineal (Kalcidagráfica, Sinergia, Lectura, PA) de acuerdo a la 15 ecuación Bt=S{Bmax1 L/(L+Kd1)]+Bmax2[L/(L+Kd2)] en donde Bt representa la cantidad total unión de ligante marcado, L representa la concentración de ligante marcado, Bmaxn representa la capacidad de unión máxima de sitio n, y Kdm es la constante de disociación aparente de sitio n. D. Tripsinización de células NR8383 20 Las células se cultivaron como se describe arriba y se resuspendieron en PBS estéril que contiene 5 mM de EDTA. Las células se alicuotaron en tubos separados, recentrifugaron y después se resuspendieron en 1 ml de PBS/EDTA con o sin 0.25% de tripsina (p/v). Las células se incubaron a 35°C durante 45 minutos. Al final del periodo 25 de incubación , 0.5 ml de inhibidor de tripsina de semilla de soya (0.25% , ***¡¿¡ *** , -"--- - - . i, A.**ií*J A*?*** Ma*£lmt. ... ..-.. . , _ ... -.-«t^^,. ,... 11 t p/v) se agregaron, seguidos por 10 ml de F-12/fcs. Las células se centrifugaron como arriba y se resuspendieron en ya sea 0.7 ml de PBS para el análisis inmediato de actividad de unión, o en 10 ml F-12/fcs con o sin ciclohexamida (1 µg/ml) y cultivaron por un adicional de 24 horas. Para análisis de actividad de unión, las células se recontaron en un hemocitómetro y los números celulares se igualaron. Las células analizaron entonces como se describe arriba excepto que la reacción de unión se hizo a 4°C en la presencia o ausencia de 100 µg/ml de TH-glucano marcado. Las células se procesaron y la radioactividad se cuantificó como se describe. E. Unión a Lactosilceramida La unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida se midió como se describe previamente (solicitud de Patente de E.U. No. 08/990, 1 25, no. de registro de abogado ABY97-04, presentada el 12 de Diciembre de 1997; las enseñanzas completas de la cual se incorporan en la presente para referencia). Brevemente, la lactosilceramida (Sigma Chemical Co.) se disolvió en etanol a 1 mg/ml. Las alícuotas (20 µl) se aplicaron en triplicado a las cavidades de una placa de poliestireno de 96 cavidades (Costar) y se secaron con aire. Las placas se bloquearon mediante incubación con 300 µl de 1 % de gelatina (p/v) en PBS a 37°C durante 1 -2 horas. Las placas se enjuagaron entonces con PBS (2x200 µl). Cincuenta microlitros de ya sea PBS o polisacárido sin marcar se agregaron a cada cavidad, las placas se equilibraron a 37°C, después se agregó 3H-TH-glucano (1 µg/ml, 100 µl final). Las placas se incubaron por 1 -2 horas a 37°C, después se enjuagaron dos veces con 200 µl de PBS. La .-^AJÜi AA Í ^ÜÍ. __2&2 f ¡^^^fe* radioactividad se solubilizó con 150 µl de Solvable™ (DuPont NEW Wilmington, DE9 y se recontó. F. Análisis de inmunoprecipitación/quinasa Las células NR8383 se incubaron en F-12 + 0.1 % de fes durante la noche en 5x106 células/ml x 2ml en placas de 6 cavidades. Las células se incubaron entonces con ya sea LPS (1 µg/ml) o TH-glucano (3 µg/ml) para los tiempos indicados a 37°C. Las células se colocaron en hielo, rascaron de las cavidades y se agregaron a 10 ml de PBS frío. Las células se centrifugaron a 400xg durante 5 minutos a 4°C, se resuspendieron después en 1 ml de PBS a 4°C. Las células se centrifugaron una vez más y después se resuspendieron en regulador de lisis (20 mM Tris pH 7.4, 137 mM de NaCI, 2 mM EDTA, 25 mM b-hlicerofosfato, 2 mM pirofosfato de Na, 10% de glicerol, 1 % Tritón X-100) que contiene 1 µg/ml de leupeptina, aprotinina, pepstatina, 1 mM de NaVO , 1 Mm PMSF, incubaron durante 10 minutos a 4°C, después se centrifugaron a 15,000 x g durante 20 minutos. El contenido de proteína se determinó por el análisis Bradford (Pierce). Las cargas de proteína iguales (100-500 µg) se agregaron a las perlas de sefarosa de proteína A (Pierce) preunidas con anticuerpo específico de quinasa (ver figuras) como se describe abajo. Las mezcla de reacción de inmunoprecipitación se incubó durante 2-4 horas con rotación a 4°C. Las perlas se enjuagaron entonces con 3 x 1 ml de regulador lisis y 1 x 1 ml con regulador de reacción de quinasa (25 mM HEPES pH 7.4, 25 mM b-glicerofosfato, 25 mM MgCI2, 2 M NaVO4) y finalmente se resuspendieron en 50 µl de regulador de reacción de quinasa que contiene 2 mM de DTT. La reacción A ?'i de quinasa se inició entonces al combinar 20 µl de perlas, 22 µl de mezcla de reacción (20 µl de regulador de reacción de quinasa, 1 µl de 1 mM ATP, 1 µl/10 µCi g-32P-ATP), 0.5 µl de 2 µg/ml de substrato de quinasa. La reacción procedió durante 15-20 minutos a temperatura ambiente y al reacción se detuvo por la adición de 10 µl 4x regulador de Laemmli e hirvió durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron y una alícuota de la mezcla de reacción pasó en un 10% de SDS-PAGE seguido por autoradiografía. Los anticuerpos específicos de quinasa se pre-unieron a las perlas de sefarosa de proteína A como sigue: las perlas se enjuagaron dos veces en 1 ml de regulador lisis, centrifugaron (15,000 x g durante 30 segundos) y resuspendieron en 0.5 volúmenes de regulador lisis. Veinte microlitros de suspensión de perla se alicuotaron en tubos de microfuga y 2 µl de anticuerpo (aproximadamente 0.4 µg) se agregaron. La mezcla de perla/anticuerpo se dejó incubar durante 20-30 minutos en hielo antes de la adición de lisatos celulares. G. Análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) EMSA se llevó a cabo esencialmente como se describe en Adams, ef al., J. Leuk. Biol. 60(6):865-873 (1 997). En resumen: Estimulaciones Celulares LPS (1 µg/ml), TH-glucano (3 µg/ml), glucano de bajo peso molecular (LMW-glucano; 3 o 30 µg/ml), glucano de peso molecular elevado (VHMW-glucano, 3 µg/ml), o escleroglucano (3 µg/ml) se agregaron al medio y 37°C de incubación continuó durante 0.5-1 .0 hr. Después de que las células de estimulación se rascaron en PBS frío, se . ... i . * ** .. ** „ *<**, >.. -^ K-tt.' ,.._...... ....._,.. •***,. . . enjuagaron una vez con PBS, después se utilizaron para extracciones nucleares. PMN se preparó de sangre de donador anti-coagulada con dextrosa de citrato ácido. Siguiendo la sedimentación en 1 .5% de dextrano (p/v), las células se centrifugaron (400 x g, 7 minutos) y resuspendieron en plasma autólogo. Las células se recubrieron entonces sobre un gradiente Ficoll (Medio de Separación de Linfocito, Órgano Teknika, Durharn, NC) y centrifugaron (400 x g, 30 minutos). Las células recuperadas de la pastilla se Usaron hipotónicamente para remover RBC residual. Las células restantes fueron >95% de neutrofilis como se juzga por criterio morfológico, y se estimularon entonces como se describe arriba antes de la preparación de extractos nucleares. Extracciones Nucleares Las extracciones nucleares de EMSA se prepararon como se describe previamente (Adams, ef al., 1997) utilizando 1 .0x2.0 x 107 células por muestra. Todos los reguladores se suplementaron frescamente con DTT (0.5 mM), cocktail de inhibidor de proteasa) y cocktail de inhibidor de fosfatasa. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis Bradford (Pierce) contra un estándar BSA. Análisis de Cambio de Movilidad Electroforética (EMSA) Las activaciones del factor de transcripción se analizaron utilizando un EMSA como se describe previamente (Adams, ef al., 1997). La sonda doble sintética de consenso de NF-?B fue como se describe (Adams, ef al., 1997); ver también Lenardo, M.J. y Baltimore, D., Cell 58:227-229 (1 989)). Las sondas dobles 32-P marcadas se prepararon con quinasa de polinucleótido. La sonda marcada (0.5 pmol) se mezcló con 3 µg de proteína de extracto nuclear en una solución que contiene 10 mM de Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% de glicerol, 0.02% de ß-mercaptoetanol, 0.1 -10 µg de poli(dl/dC) (Pharmacia). Las reacciones se incubaron a 25°C durante 20 minutos se electroforesaron entonces bajo condiciones de no desnaturalización a través de 4% de geles de poliacrilamida en 0.5X regulador TBE. Las bandas se visualizaron mediante autoradiografía. EJEMPLO 2 Unión de 3H-TH-glucano a células NR8383 intactas. A. Unión dependiente de dosis de 3H-TH-glucano a células NR8383. Las células NR8383 se incubaron con 3H-TH-glucano en concentraciones crecientes en la presencia (no específica) o ausencia (total) de TH-glucano sin marcar en exceso de 1000 veces por 60 minutos a 4°C. Al final de la incubación total, la radioactividad sin unir se removió mediante lavado, y la cantidad de la radioactividad asociada de la célula se determinó como se describe arriba. La unión específica se determinó al sustraer no específica de la radioactividad total. Los resultados se muestran en la Figura 1 ; la curva de unión específica se ajustó por un análisis de regresión no lineal de un modelo de dos sitios como se describe arriba. Los datos en la Figura 1 demuestran que 3H-TH-glucano que se une a las células NR8383 fue dependiente de dosis a medida que la concentración de ligante se incrementó (total). La adición de TH-glucano sin marcar a la mezcla de incubación inhibió la cantidad de 3H-TH-glucano asociado con las células (no específicas). Después de la substracción de . » ^ ?^M***^ ***^**^*^***^ , "*"" ' ' J--- unión no específica de la unión total, se encontró que la unión específica fue saturable a aproximadamente 30 fm/106 células. El análisis de regresión no lineal de la curva de unión específica se ajusta a un modelo de unión de dos sitios, con constantes de disociación aparentes Kd1 y Kd2 de 45 pM y 170 pM, respectivamente. El número de sitios de unión fue 3,200/célula y 18,000/célula para los sitios de alta y baja afinidad, respectivamente. La actividad de unión se observó a 4°C para las células NR8383 contrasta con aquella observada para lactosilceramida, que muestra actividad sin unión a 4°C (datos no mostrados). B. Selectividad de unión de 3H-TH-glucano a células NR8383 y lactosilceramida La selectividad de unión de ß-glucano al sitio de unión de 3H-TH-glucano en células NR8383 se determinó por los análisis de unión de competición. En estos análisis, las células NR8383 se co-incubaron con 3H-TH-glucano y varias concentraciones de ß-glucano competidor sin marcar (LMW-glucano, VHMW-glucano; o escleroglucano) durante 60 minutos a 37°C. La radioactividad sin unir se removió y la radioactividad asociada a la célula se determinó como se describe arriba. Los resultados de este tipo de experimento se muestran en la Figuras 2A-C (Fig. 2A: LMW-glucano; Fig. 2B: VHMW-glucano; Fig. 2C: escleroglucano). Los puntos de datos representan la unión del % de control promedio + % de coeficiente de variación; TH-glucano se incluyó como un control positivo en cada experimento. El TH-glucano sin marcar, LMW-glucano y VHMW-glucano fueron capaces de competir por la unión de 3H-TH-glucano, mientras que escleroglucano no fue un competidor eficaz en el rango de ^^ ... . ?..* ... J i . . Ü¡a>._ ...^t ^^.^... ¿..^i. u^^^^ Éát tiJ i?uÉÉ concentración probado. La lactosilceramida se ha identificado como el receptor de TH-glucano en neutrofilis humana (solicitud de Patente de E.U. número 08/990, 1 25, no. de registro de abogado ABY97-04, presentada el 12 de Diciembre de 1997; las enseñanzas totales de la cual se incorporan en la presente para referencia). La capacidad de estos mismos ß-glucanos para competir por la unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida por lo tanto se investigó. La lactosilceramida se revistió en placas de 96 cavidades como se describe arriba, y se incubó con 3H-TH-glucano (1 µg/ml) en la presencia de varias concentraciones de ß-glucanos (LMW-glucano, VHMW-glucano; o escleroglucano) durante 60-90 minutos a 37°C. Las cavidades se enjuagaron y la radioactividad restante se midió como se describe arriba. Los resultados se muestran en las Figuras 3A-C (Fig. 3A: LMW-glucano; Fig. 313: VHMW-glucano; Fig. 3C: escleroglucano). El TH-glucano sin marcar y VHMW-glucano fueron competidores eficaces de la unión de 3H-TH-glucano a lactosilceramida. En contraste a los resultados obtenidos con células NR8383, LMW-glucano no fue capaz de competir por la unión , mientras que se encontró que escleroglucano fue un competidor eficaz. Estos datos indican claramente que el receptor NR8383 tiene diferente selectividad de ß-glucano que lactosilceramida. C. Sensibilidad a tripsina de actividad de unión de 3H-TH-glucano de célula NR8383 El receptor de 3H-TH-glucano en células NR833 se encontró que es sensible a tripsinización. Se condujeron experimentos en los cuales las células NR8383 se incubaron con tripsina antes de medir la _^^ ^^^¿ *.?***j> i.*?A¿ É. i* *-* ** L.. Jj>?"-" — actividad de unión de 3H-TH-glucano. La Tabla 1 muestra los resultados de los experimentos. Los números celulares se normalizaron para el análisis de unión, y la unión específica (unión total - unión no específica) se normalizó a valores de control respectivos en los puntos de tiempo de 0 y 24 horas. El pre-tratamiento con tripsina eliminó 96% de unión específica relativa a células de control sin tratar. Cuando las células se incubaron en medio normal durante 24 horas después de la tripsinización, la actividad de unión se recuperó a casi 50% más allá de los niveles de control. Esta recuperación se inhibió por la ciclohexamida inhibidora de síntesis de proteína (1 µg/ml). De manera interesante, cuando cicioheximida se agregó a células de control sin tratar, la actividad de unión se redujo al 94%. Esto sugiere que una proteína lábil es necesaria para la expresión continua de actividad de unión de 3H-TH-glucano. Esto podría representan el receptor per se, o una proteína que estabiliza ya sea la proteína o su mARN. Sin embargo, estos resultados indican fuertemente que el receptor NR8383 es una proteína, y no un glicosfingolípido.

Tabla 1 : Efecto de Tripsina y Cicioheximida en Unión de 3H-TH-glucano a Células NR8383 EJEMPLO 3 Eventos de Transducción de Señal iniciados por TH-glucano en células NR8383. A. Activación de un factor de transcripción como NF-kB 5 La transducción de señal inducida por TH-glucano a través de lactosilceramida en PMN humano y macrófagos BMC2.3 de murino se ha mostrado que activa un factor de transcripción nuclear como NF-?B (solicitud de Patente de E.U. número 08/990, 125, no. de registro de abogado ABY97-04, presentada el 12 de Diciembre de 1997; las 10 enseñanzas totales de la cual se incorporan en la presente para referencia). La capacidad de TH-glucano, LMW-glucano, VHMW-glucano y escleroglucano para activar la actividad de unión de ADN como NF-?B en células NR8383 y PMN humano se comparó utilizando Análisis de Cambio de Movilidad Electroforética (EMSA). Las células se incubaron con los ß- 15 glucanos (control; LPS; 1 µg/ml; TH-glucano; 3 µg/ml; escleroglucano, 3 µg/ml; LMW-glucano, 3 µg/ml o 30 µg/ml, VHMW-glucano, 3 µg/ml). Los extractos nucleares se prepararon para la determinación de activación de NF-?B mediante EMSA como se describe arriba. En células NR8383, TH- glucano, VHMW-glucano y LMW-glucano inducen la actividad de unión de 20 ADN como NF-?B, pero el escleroglucano no (datos no mostrados). En PMN, el TH-glucano y escleroglucano inducen la actividad de unión de ADN como NF-?B, mientras que LMW-glucano no (datos no mostrados: VHMW-glucano no se probó en estas células). De esta manera, la transducción de seña inició por estos diversos ß-glucanos en células 25 NR8383 de rata y PMN humano se correlaciona con su habilidad para competir por la unión de 3H-TH-glucano. B. Activación de Quinasas de Proteína Finalmente, los casos de transducción de señal temprana inducidos por TH-glucano en células NR8383 se investigaron. En particular, la inmunoprecipitación acoplada a los análisis de quinasa de proteína se utilizaron para determinar que cascadas de quinasa se incluyen en señalización de TH-glucano. Las células NR8383 se incubaron con LPS (1 µg/ml, control positivo), TH-glucano (3 µg/ml), o sin la adición durante 30 minutos a 37°C. Las células se usaron, inmunoprecipitaron con anticuerpo específico de quinasa, y un análisis de quinasa se llevó a cabo como se describe arriba. Las cantidades ¡guales de proteína se utilizaron para las inmunopreparaciones dentro de cada experimento. TH-glucano no activa la quinasa regulada por mitogeno extracelular de quinasas MAP (ERK1 /2) (substrato de quinasa fue ATF-2-GST), o p38 (substrato de quinasa con ELK-1 -GST (datos no mostrados). En contraste, TH-glucano activa rápida y transitoriamente la quinasa MAP c-Jun quinasa de terminal N (JNK, también conocida como quinasa de proteína activada por tensión o SAPK; substrato de quinasa fue c-jun-GST (datos no mostrados). TH- glucano también activa rápida y transitoriamente la alfa quinasa l?B (IKKa, substrato de quinasa fue l?Ba-GST), la quinasa que fosforila l?Ba, conduciendo a la activación de factores de transcripción como NF-?B (datos no mostrados). EJEMPLO 4 Comparación de TH-glucano y sus Conformadores en un Modelo de Infección A. Materiales y Métodos TH-glucano y Conformadores TH-glucano (Alpha-Beta Technology) y ciertos conformadores se utilizaron en estudios de su efecto en un modelo de infección. La Tabla 2 ilustra los pesos moleculares de TH-glucano y los conformadores utilizados en este estudio. Debido a que el peso molecular de los conformadores puede cambiar con la temperatura en la columna GPC, los conformadores separados a temperatura ambiente (25°C) y a una temperatura más elevada (37°C) se probaron. 10 Tabla 2 Pesos Moleculares de TH-glucano y Conformadores 15 Los pesos moleculares promedio se midieron por una cromatografía de 20 permeación de gel/dispersión de luz láser multi-ángulo (GPC/MALLS). HTH y LTH se prepararon al fraccionar las muestras de TH-glucano. Animales Las ratas Wistar libres del anticuerpo de virus se compraron de Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, MA). Los animales 25 se alojaron de acuerdo a las reglas de los Institutos Nacionales de Salud y se proporcionaron con alimentos y agua ad libitum. Las ratas se aislaron durante 7 días antes de introducirse en experimentos. Los pesos corporales de las ratas variaron de 160 g a 210 g en el momento de experimentación. Administración de Medicamento TH-glucano y conformadores, así como las partículas de glucano completas (WGP), se dosificaron intramuscularmente (IM) utilizando una aguja de medida 25 en 1 mg/kg a 48 h, 24 h y 4 h antes de la competición bacterial y en 4 h después de la competición bacterial. Además, como un control positivo, WGP también se dio intraperitonealmente (IP) en una dosis de 5 mg/kg a 24 h y 4 h antes de la competición bacterial. WGP se hizo como una suspensión con salina estéril y se puso en vórtice vigorosamente antes de cada inyección. Bacteria Un aislamiento clínico resistente a antibiótico múltiple de S. aureus se eligió para utilizarse en estos estudios. Onderdonk, A. B. , ef al., Infect. Immun. 60: 1642-1647 (1992). Las bacterias se expandieron en Caldo Nutriente (NB; Bifco Laboratories, Detroit, Ml) por 8 h a 37°C. El glicerol estéril se agregó en una concentración final de 20% y las alícuotas almacenadas se congelaron a -80°C hasta que se utilizaron. Para determinar la viabilidad de bacteria almacenada, una muestra almacenada congelada se derritió, diluyó serialmente, y 40 µl de muestras se colocaron en placas de Agar Nutriente (NA, Difco Laboratories, Detroit, Ml). Las placas se cultivaron a 37°C durante 24 h, las colonias bacteriales se recontaron , y el número de unidades de formación de colonia bacterial yj¡¿j¡¡* iii?í?™ (CFU) por ml de almacén se calculó. Para preparar inoculo bacterial para estudios in vivo, los cultivos almacenados se diluyeron al número deseado de CFU/ml en Salina Regulada de Fosfato (PBS; Gíbco Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene 1 % de sulfato de dextran y una concentración final de 5% de sulfato de bario (peso/vol). Una alícuota de 0.5 ml de la bacteria apropiadamente diluida se colocó asépticamente en cápsulas de gelatina de 2 cm de largo x 0.5 cm de diámetro (Eli-Lilly Inc. , Indianápolis, IN) y las cápsulas se implantaron en la cavidad peritoneal de ratas como se describe abajo. Cirugía Las ratas se anestesiaron por inyección im de un cocktail anestésico mezclado que consiste de Ketamina (Ford Dodge Laboratories Inc, Ford Dodge, LA), PromAce (Ayerst Laboratories Inc. , Rouses Point, MY), Xilazina (Phoenix Scientific Inc. , St. Joseph, MO) y salina (750 mg, 10 mg, 100 mg y salina a 20 ml) utilizando una aguja de medida 25. La anestesia se ajustó para cada rata en base al peso corporal al administrar 0.0019 ml/g de peso corporal. Después de administrar la anestesia, el abdomen de cada rata se rasuró, limpió con solución de yodo, y una incisión de línea media anterior de 1 .5 cm se hizo a través de la pared abdominal y el peritoneo. La cápsula de gelatina que contiene 108 de S. aureus CFU se colocó inmediatamente en la cavidad peritoneal y la incisión se cerró con 3-1 0 suturas de seda interrumpidas. La duración total de la cirugía fue de menos de 2 minutos. Después de la cirugía, los animales se alojaron cinco por caja y monitorearon cada 1 5 min por las primeras 2 h, cada 30 minutos por la siguiente h , y después tres veces por . .. .. .... .l ia.,-.,. .. .«.JH. - día por la duración del experimento. Análisis y Muestra de Sangre Los animales se anestesiaron con O2:CO2 (1 : 1 ) y 2 ml de sangre se obtuvo mediante punción cardiaca utilizando un jeringa de 3 ml con aguja de medida 20. inmediatamente después de que la sangre se recolectó, aproximadamente 1 .5 ml se expelió en un tubo centrífugo Eppendofr de 1 .7 ml que contiene 5 unidades de heparina (Elkins-Sinn Inc. , Cherry Hill, NJ). Cada animal se mato entonces humanamente con CO2. Para obtener los niveles de CFU de sangre exactamente cuantificables, dos concentraciones de sangre de cada animal, 1 : 10 dilución y sangre no diluida se cultivaron. Veinte ml de Agar de Soya Tríptica 50°C (EJecton Dickinson Microbiology Systems, Cockesvielle, MD) se colocaron en una placa de Petri estéril y una alícuota de 0.5 ml de sangre diluida o sangre sin diluir inmediatamente se agregó a la placa y se mezcló completamente en el agar al remolinar la placa. Una vez que el agar se solidifica, las placas se incubaron a 37°C durante 48 h, y después la placa que contuvo 20-200 colonias se seleccionó para la enumeración de colonias. Los datos de CFU sanguíneo se expresan como log CFU/ml de sangre. La sangre restante de cada muestra se utilizó para recuentos de células sanguíneas. Los recuentos de glóbulo blanco total (WBC), el glóbulo rojo (RBC), y la plaqueta (PLT) se llevaron a cabo en un Analizador de Hematología Sistema 9010+ (Biochem Immunosystems, Inc., Allentown, PA). Análisis Estadístico Los resultados se expresan en el promedio + error estándar del promedio (SEM) de datos obtenidos de experimentos replicados (2-6 experimentos, que contienen 20-80 animales). Las pruebas t impares (Grupo de tratamiento vs. salina) se llevaron a cabo utilizando software de EXCEL 5.0 (Microsoft Corporation, Redmond, WA) y las diferencias se consideraron significativas en p<0.05. B. Resultados Efectos de TH-glucano y Conformadores en Niveles de CFU de Sangre A las ratas se les administró TH-glucano, un conformador, o WPG y los niveles de CFU de sangre se determinaron en 48 h después de la competición con S. aureus. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Efecto de TH-glucano y Conformadores en Niveles de CFU de sangre Como puede observarse, las ratas tratadas con TH-glucano, así como otros materiales probados en estos estudios, mostraron niveles de CFU de sangre significativamente inferiores que las ratas tratadas con salina en 48 h después de la competición bacterial (P < 0.05). La mayor reducción en niveles de CFU de sangre se observó en las ratas tratadas con IM e IP WGP insoluble (P < 0.001 y p < 0.01 ). Efecto de TH-glucano y Conformadores en Recuentos de Célula Sanguínea Periférica Los recuentos de célula sanguínea se llevaron a cabo a 48 h después de la competición de S. aureus. Los recuentos de WBC totales se elevaron en las ratas probadas con TH-glucano y todos los conformadores, así como WGP, aunque el significado estadístico podría solamente observarse en las ratas tratadas con TH-glucano, HTH 25°C, LTH 25°C y LTH 37°C. Aunque TH-glucano no tuvo efecto en recuentos de PLT, las ratas tratadas con VHMW, HTH 25°C o HTH 37°C (es decir, conformadores con pesos moleculares mayores a 190,000), o WGP (IM) o WGP (IP) mostraron recuentos de PLT periféricos significativamente incrementados. Los valores de RBC no cambiaron excepto por elevaciones ligeras en ratas tratadas con HTH 25°C, LMW y WGP (IP). Estos resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Efecto de TH-glucano y Conformadores en Recuentos de r- "— ' - ^fa¿**^*fc*. .^.^, .l^.,. „fe .

Célula Sanguínea Periférica por ciento de cambio vs. salina ** prueba t, p<0.05 vs. salina Efecto de TH-glucano y Conformadores en Mortalidad La dosis de S. aureus utilizada en estos estudios fue una dosis ineficaz 50% letal. Aunque todos los animales se mataron el día 2 para CFU y las evaluaciones de la célula sanguínea, una mortalidad significativamente inferior se observó en las ratas tratadas con WGP (IP) (p<0.01 ) y LMW (p<0.05) en comparación con las ratas tratadas con salina. La mortalidad ligeramente inferior también se observó en las ratas tratadas con WGP (IM) (31 % vs. salina 48%) y LTH 25°C (31 % vs. salina 48%). Una mortalidad ligeramente elevada (63% vs. salina 48%) se observó en el grupo de tratamiento con LTH 37°C. sin embargo, estas diferencias no : •¿. i- t**?.i ._ ., a¿. * * -"" - "- * ' -a-aH .*-».. alcanzan significado estadístico. Estos experimentos demostraron que TH-glucano, así como los conformadores (agentes que imitan la actividad de TH-glucano), pueden utilizarse para aumentar las defensas huésped, y de esta manera pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades. Fue interesante observar que aunque los pesos moleculares del conformador cambiaron hasta aproximadamente 100 veces (por ejemplo, VHMW o LMW), la actividad anti-ineficaz permaneció constante. Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a las modalidades preferidas de la misma, se entenderá por aquellos expertos en la materia que varios cambios en forma y detalles pueden hacerse en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. j - - — ' >,*****. J .

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método para aislar ß(1 ,3)-glucano de una muestra, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra que contiene ß(1 ,3)-glucano con un 5 receptor proteico, bajo condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano al receptor para formar complejos primarios de ß(1 ,3)-glucano unido al receptor; b) aislar los complejos primarios; y c) obtener ß(1 ,3)-glucano de los complejos primarios. 10 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el receptor proteico se acopla a una fase sólida. 3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque la fase sólida se selecciona del grupo que consiste de: filtros, membranas, perlas, partículas, resina orgánica, placas de 15 microconcentración y portaobjetos. 4. Un método para aislar organismos que contienen ß(1 ,3)- glucano de una muestra, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra que contiene organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano con un receptor proteico, bajo 20 condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)- glucano al receptor para formar complejos primarios de ß(1 ,3)-glucano unido al receptor; b) aislar los complejos primarios; y c) obtener organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano de los 25 complejos primarios. 5. Un método para detectar la presencia ß(1 ,3)-glucano en una muestra, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra a probarse para la presencia de ß(1 ,3)-glucano con un receptor proteico, bajo condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano al receptor para formar complejos primarios de ß(1 ,3)-glucano unido al receptor; b) detectar los complejos primarios formados en la etapa (a), en donde la presencia de complejos primarios es indicativa de la presencia de ß(1 ,3)-glucano en la muestra. 6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque el receptor proteico se une a una fase sólida. 7. El método según la reivindicación 6, caracterizado porque la fase sólida se selecciona del grupo que consiste de: filtros, membranas, perlas, partículas, resina orgánica, placas de microconcentración y portaobjetos. 8. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la muestra se une a una fase sólida. 9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la fase sólida se selecciona del grupo que consiste de: filtros, membranas, perlas, partículas, resina orgánica, placas de microconcentración y portaobjetos. 10. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la muestra es de una fuente animal. 1 1 . El método según la reivindicación 10, caracterizado * ,A***. .* Mái .í.. _ . «..._.. — i - •" -ny - porque la m uestra es un fluido biológico. 12. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la m íuestra es de una fuente vegetal. 13. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la muestra es de una fuente ambiental. 14. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la rrjuestra es de una fuente de alimentos. 15. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la rrjuestra es de una fuente de fermentación. 16. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque los Complejos primarios se detectan con una marca detectable. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de radionucledtidos, tintes, compuestos fluorescentes, biotina y estreptavid na. 18. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque los (complejos primarios se detectan con un anticuerpo. 19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo para ß(1 ,3)-glucano. 20. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo para el receptor. 21 . Un método para detectar la presencia de organismos que contienen ||5(1 ,3)-glucano en una muestra, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra a probarse para la presencia de organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano con un receptor proteico, bajo condiciones que son adecuadas para la unión .. L**«L.¿?..j?1fif.. de ß(1 ,3)-glucano, al receptor para formar complejos primarios de organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano unidos al receptor, y b) detectar los complejos primarios formados en la etapa (a), en donde la presencia de complejos primarios es indicativa de la presencia de organismos que contienen ß(1 ,3)-glucano en la muestra. 22. Un método para cuantificar la cantidad de ß(1 ,3)-glucano en una muestra , que comprende las etapas de: a) contactar una muestra a probarse con un receptor proteico, bajo condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano al receptor para formar complejos primarios de ß(1 ,3)-glucano unido al receptor; b) aislar los complejos primarios formados en la etapa (a); y c) cuantificar los complejos primarios, en donde la cantidad de ß(1 ,3)-glucano en la muestra se correlaciona con la cantidad de complejos primarios. 23. Un método para cuantificar la cantidad de ß(1 ,3)-glucano en una muestra, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra a probarse con un receptor proteico y un ß-(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, marcado bajo condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano al receptor para formar complejos primarios de ß(1 , 3)-glucano soluble acuoso, no derivado unido al receptor; b) determinar la cantidad de complejos primarios formados en JdUi?íJ, tsi „ „ ..-.,» .. ... ... , .^.g... ^ tá?&. . .^t¿fc. la etapa (a), en donde la cantidad de ß(1 ,3)-glucano en la muestra se relaciona de manera inversa a la cantidad de complejos primarios. 24. Un método para diagnosticar infección por un organismo 5 que contiene ß(1 ,3)-glucano en una individuo, que comprende las etapas de: a) contactar una muestra del individuo con un receptor, bajo condiciones que son adecuadas para la unión de ß(1 ,3)- glucano al receptor para formar complejos primarios de 10 ß(1 ,3)-glucano unido al receptor; y b) detectar los complejos primarios formados en la etapa (a), en donde la presencia de complejos primarios es indicativa de infección por un organismo que contiene ß(1 ,3)-glucano. 25. Un equipo útil para detectar la presencia de ß(1 ,3)- 15 glucano, que comprende un receptor proteico y un anticuerpo para ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado. 26. Un análisis para identificar un agente que tiene una afinidad para un receptor proteico para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, que comprende las etapas de: 20 a) combinar ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado radiomarcado, receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y un agente a probarse, bajo condiciones adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado a un receptor proteico para 25 ß(1 , 3)-glucano soluble acuoso, no derivado; , ***?lf*K4't*,*?~*. a .- .* *.*?,í...¡*^. **.»* ..„_..._* „, ..,,. . . .. b) determinar el grado de unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado; y c) comparar el grado de unión determinado en la etapa (b) con el grado de unión en la ausencia del agente a probarse bajo condiciones adecuadas para la unión de ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, en donde una reducción en el grado de unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado indica que el agente tiene la afinidad para el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 27. Un análisis según la reivindicación 26, caracterizado porque el receptor es un compuesto que tiene una afinidad para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 28. Un análisis según la reivindicación 27, caracterizado porque el compuesto es un análogo del receptor o una imitación del receptor. 29. Un método para suministrar un agente a una célula que contiene un receptor proteico para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, que comprende las etapas de: a) conjugar un agente a suministrarse a un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado para producir una molécula conjugada; y b) administrar la molécula conjugada bajo condiciones • '<* iJa *-*.*?i?^ adecuadas para la unión del ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado de la molécula conjugada al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, mediante el cual el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado se une a un receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en una célula que contiene un receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, suministrando así el agente de la molécula conjugada a la célula. 30. Un método según la reivindicación 29, caracterizado porque el receptor es un compuesto que tiene una afinidad para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 31 . Un método según la reivindicación 30, caracterizado porque el compuesto es un análogo del receptor o una imitación del receptor. 32. Un análisis para identificar un agente que altera el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, en la activación de una trayectoria de transducción de señal, dicho análisis comprendiendo las etapas de: a) combinar ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, receptor proteico para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado y un agente a probarse, bajo condiciones adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado; b) determinar el grado de activación de una trayectoria de transducción de señal, y ^ül^^ll^^ c) comparar el grado de activación determinado en la etapa (b) con el grado de activación en la ausencia del agente a probarse bajo condiciones adecuadas para la unión de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado al receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado, en donde una diferencia en el grado de activación de la trayectoria de transducción de señal indica que el agente altera el efecto de ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado en la activación de una trayectoria de transducción de señal. 33. Un análisis según la reivindicación 32, caracterizado porque si el grado de activación es mayor en la presencia del agente que en la ausencia del agente, el agente aumenta el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso , no derivado en la activación de una trayectoria de transducción de señal. 34. Un análisis según la reivindicación 32, caracterizado porque si el grado de activación es menor en la presencia del agente que en la ausencia del agente, el agente reduce el efecto de ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado en la activación de una trayectoria de transducción de señal. 35. Un análisis según la reivindicación 32, caracterizado porque la activación de la trayectoria de transducción de señal se mide por la modulación de al menos un factor regulador transcripcional. 36. Un análisis según la reivindicación 35, caracterizado porque el factor regulador transcripcional se selecciona del grupo que consiste de miembros de las familias NF-?B y/o NF-IL6 y/o AP-1 . 37. Un análisis según la reivindicación 32, caracterizado porque la etapa (b) se lleva a cabo por 32P-oligonucleótidos de ADN marcados para el facto regulador transcripcional. 38. Un agente identificado por el análisis de la reivindicación 5 32. 39. Un análisis según la reivindicación 32, caracterizado porque el receptor es un compuesto que tiene una afinidad para ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado. 40. Un análisis según la reivindicación 39, caracterizado 10 porque el compuesto es un análogo del receptor o una imitación del receptor. 41 . Un método para activar una trayectoria de transducción de señal en una célula que contiene un receptor proteico para ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado que comprende; contactar una célula 15 que un receptor proteico para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado con un agente que se une al y activa el receptor para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso , no derivado, mediante el cual el receptor para ß(1 ,3)- glucano soluble acuoso, no derivado se activa, activando así una trayectoria de transducción de señal. 20 42. Un método según la reivindicación 41 , caracterizado porque la activación de la trayectoria de transducción de señal se mide por la modulación de al menos un factor regulador transcripcional. 43. Un método según la reivindicación 42, caracterizado porque el factor regulador transcripcional se selecciona del grupo que 25 consiste de miembros de las familias NF-?B y/o NF-IL6 y/o AP-1 . 44. Un método según la reivindicación 41 , caracterizado porque el agente es ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 45. Un método según la reivindicación 41 , caracterizado porque el receptor es un compuesto que tiene una afinidad para ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 46. Un método según la reivindicación 45, caracterizado porque el compuesto es un análogo del receptor o una imitación del receptor. 47. Una preparación aislada que contiene un receptor proteico que se une a un ligante que es un ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado. 48. Una preparación según la reivindicación 47, caracterizada porque el receptor se une específica y selectivamente al ligante. 49. Una preparación según la reivindicación 47, caracterizada porque el ß(1 ,3)-glucano soluble acuoso, no derivado es una conformación de triple hélice.