JPS63503480A - ヘパリンの特異免疫検定法 - Google Patents
ヘパリンの特異免疫検定法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヘパリンの特異免疫検定法及びそれに使用される新規な試薬に関する。
発明の背景
ヘパリンは1−4結合によって結合されたD−グルコサミンとD−グルクロン酸
の交互残基から成るムコ多糖の不均質群である。ヘパリンはさまざまな哺乳動物
の組織、特にマスト細胞は勿論、肝臓、肺に見出すことができる。血漿中で、ヘ
パリンは凝固を阻害しまた血液からトリグリセリドの除去を促進することが知ら
れている。
ヘパリンは一般に抗凝血剤薬品に用いられる。ヘパリンの最も良く理解された作
用は、トロンビンの不活性化であり、これによりトロンビンのフィブリノーゲン
に対する作用を妨げる。血液はトロンビン分子と結合してそれを不活性化するア
ンチトロンビン■と称せられる天然に生じるトロンビン凪害剤を含有する。ヘパ
リンはアンチトロンビン■と結合し、トロンビンとアンチトロンビン■との間の
反応を著しく促進し、かくしてトロンビンの不活性化をひき起こす。
ヘパリンはまたアンチトロンビン■とほかの血液凝固因子、特に因子Era %
Xa %−Xla及びxnaとの結合を促進することによって凝固段階の初期
から作用する。その結果、試験された血漿又は血清中にヘパリンが存在する場合
は、すべての凝固試験の結果は悪影響をうけるであろう0
血漿及びほかの生物学的流体中のヘパリン濃度を測定するための特別の方法が、
ヘパリン濃度とその生物学的効果との間の関係を評価するため及び薬理学的研究
のために要望されている。
いくつかの種類のヘパリン測定法が現在得られている。
ウロン酸カルバゾール反応のような化学的方法は多くの異なるヘパリンを検出す
るために使用することができるが、比較的鈍感であり、しかも、定量的な結果を
得るためにしばしば精製した試料を必要とする。Jacques等(至旦江、
Biochm、 52.219−233.1973 )はトルイジンブルー溶液
による染色と結合したアガロースゲル上の試料のミクロ電気泳動を含むヘパリン
の同定と定量のだめの測定法を開示した。スポットの全光学密度がヘパリン濃度
を評価するために使用可能な程度に1適用された吸光度とヘパリン濃度との間に
直線的な関係が観察された。この測定は複雑な混合物中のヘパリンの測定を可能
にするが、日常の仕事に使用するためには余りにも鈍感でまた余りにもやっかい
であった。
ヘパリンの生物学的検定法はヘパリンの全体にわたる抗凝血剤活性、又はトロン
ビン又は凝固因子の不活性化といったいっそ5%殊な性質に基づくものである。
Yin等(土、ん虫、 Cl1n、鰺土、肚、 298−310.1973 )
はヘパリンの定量的検定法を記載している。そして、該検定法はヘパリン活性の
0.01単位(ヘパリンの0.1マイクログラムに相当する)というきわめて少
量を検出するとされている。その検定法はその血漿阻害剤、アンチトロンビン■
による活性化された因子Xの中和に対するヘパリンの加速効果に基づくものであ
った。
Te1en、 A、 N、とLie、 M、 (Thromb、 Res、 7
: 777−788、1975 )は血漿中のヘパリン活性の定量に対する五
つの凝血方法について評価を行なった。即ち、活性化部分トロンボプラスチンタ
イム(APTT ) ;カルシウムトロンビンタイム;上記Yin等の方法;ポ
リプレンによる滴定;及びDenson及びBonnar (Thromb、
Diath、 Hae−morrh、、 昌4711.1973 )についてで
ある。但し、後者はYin等の変形である(前掲書中)。
Te1en等は異なる生物学的検定で得られた値の間にはかなりのばらつきがあ
ることを報告した。これらの生物学的検定のおのおのはヘパリン分子の異なった
性質に依存するゆえに1このことは驚くべきことではない。Te1en等によっ
て研究された凝血評価分析は、それらが凝固に関する活性化因子と阻害剤の間の
平衡から生じる活性を測定している点において世界的な試験である。これらの検
定はヘパリン分子の生物学的活性を監視するのに有用である。しかしながら、ヘ
パリン処理それ自身はアンチトロンビン■のレベルを低下させる。そのうえ、病
気の進行中に、血液中のヘパリン感度が変化するかもしれない。加5るに、血小
板因子4のような血液中のヘパリン拮抗物質が増加するかもしれない。それゆえ
、全ヘパリンレベル(生物学的作用に無関係な)の客観的な定量に対して、これ
らの測定法は有効性が限定される。
上述のような生物学的検定に固有な問題点を解決することを試みて、Dawes
とPepper (Thromb、 Res、 27+ 387−396.19
82 )は外生の及び内生のヘパリンに対する拮抗的結合測定法を記述している
。この測定法において、プロタミン−セファロースに対する結合に関してヘパリ
ンは放射性的に標識をつけたヘパリンと匹敵するといわれる。この測定法は極め
て敏感であるといわれるが(その文献は10 nV−というきわめて低い濃度で
のヘパリンの検出を報告している)、結合のためだけに少なくとも16時間のイ
ンキュベーション時間を要する。そのうえ、妨害性物質を除去して分析できる試
料を生じさせるために、試験する生物学的流体をプレダイジェストするための時
間を必要とする。所要時間が長いこと及びグレダイジエスションが必要なことの
ためにこの測定法は臨床的使用に対し不適当とされ1だ非臨床的応用でのヘパリ
ンレベル測定に使用する゛ことを煩雑にしている。さらに、この測定はまたヘパ
ラン硫酸塩のようなさまざまの別の硫酸化多糖を認識するゆえに特異なものでは
ない。
Be5sos、 H,(Thromb、 Res、 35+ 267−27L
1984 )はさまざまの化学的方法でヘパリン及びヘパラン硫酸塩を崩壊する
方法、及びDawe s及びPepperの拮抗結合測定法で崩壊生成物を測定
する方法を記述した。亜硝酸による処理はヘパラン硫酸塩よりもヘパリンの方を
迅速かつ広範囲に崩壊することがわかった。崩壊生成物の測定はDawes及び
Pepperの拮抗測定の特異性の欠乏を修正することに使用できるはずである
。しかしながら、Daw・es及びPepperの測定法をこのように修正する
と、測定手順をいっそう長くしかもいっそう複雑にし、かくして日常の実験室の
使用に対して不適当となる。
それゆえ、いっそう迅速な、特異的な、敏感な、しかも分子のどの生物学的作用
にも無関係なヘパリンを検出するシステムを提供することが当技術界で必要とさ
れている。そのような測定法の有用性は多様である。たとえば、その測定は、活
性測定と一緒に使用することで所定の抗血栓症のレベルを得るために必要なヘパ
リンの量を決定することができるはずであり、それによって臨床医はヘパリンの
使用量の上昇又は低下の危険性をより正確に見積ることになるであろう。それは
またさまざまな細胞及び組織内及び内皮の又はヘパリンで凝血防止した合成表面
のような固体マトリックス内のヘパリンの存在に対する生物学的グローブ、人工
心臓及び心臓弁等のアテローム性動脈硬化の及び非トロンボゲン的表面の分野に
おいて増大している重要性な話題として使用することができる。最後に、ヘパリ
ンと関連したグリコサミノグリカンを区別する測定に対する要求もある。
本発明者等は生物学的流体中のヘパリンに対する迅速な、敏感なかつ特異的な測
定法を発明した。この応用に使用されるように、生物学的流体は血漿、尿、細胞
懸濁液、組織抽出物及びヘパリンを含みうる別の体内及び生理的流体を含むがこ
れに限定されるものではない。この測定及びここに使用された試薬は薬理学的使
用に対するヘパリンの商業スケールの単離及び精製を通じて有用であり、また組
織内のヘパリンの存在に対するプローブとしても有用である。
発明の目的
本発明は下記のいくつかの目的、即ち、生物学的流体中のヘパリンの濃度を測定
するための正確な、敏感なかつ特異的な方法を提供すること、伝統的な生物学的
及び/又は化学的方法の上述の欠点を解決するヘパリン用の新しい測定法を提供
すること、ほかの関連した多糖類及びプロテオグリヵンスと交差反応性を示さな
く、日常の診断及び患者管理の実験室の試験及び研究に使用しうるヘパリン用の
敏感な、再現性のある結合測定法を提供すること、
ヘパリンの阻害剤として又はヘパリンな検出するために有用な正に荷電したポリ
カルボジイミド化合物を提供すること、
前記ポリカルボジイミド阻害剤と結合したヘパリンと結合するアンチヘパリン抗
体を提供すること、及びポリカルボジイミド阻害剤を用いるヘパリンの精製のた
めの方法を提供すること、
を包含するがこれに限定されない。
本発明のこれらの及びほかの目的は本明細書、添付クレーム及び添付図面に徴し
て当技術に精通している者には明白になるであろう。
図面の簡単な説明
第1図は試料中のヘパリンの濃度に対する4 92 nmの吸光度のプロットで
ある。
発明の要約
本発明の一つの態様は生物学的流体中に存在するヘパリンの濃度を測定する方法
に向けられており、この方法は
□検出できるヘパリン/阻害剤錯体を形成するために前記ヘパリンをヘパリン阻
害剤に結合すること、□このように形成された錯体の量を測定すること及び前記
の量を参照することによってヘパリンの濃度を引き出すこと、を含んでいる。
本発明のもう一つの態様は生物学的流体中に存在するヘパリンの量を測定するた
めの測定法に向けられており、この測定法は
一固定化しメチル化したポリカルボジイミドヘパリン阻害剤の存在下に前記流体
試料をインキュベートし、それによって前記試料中に含まれているヘパリンを前
記阻害剤に結合して固定化したヘパリン−阻害剤錯体を形成することをひき起し
、
一未結合試料を排除し、
□ヘパリンー阻害剤錯体を第1の抗体と共にインキュベートし、前記第1の抗体
は前記ヘパリン−阻害剤錯体と免疫化学的に反応的なアンチ−ヘパリン抗体であ
り、それによって前記第1の抗体は前記ヘパリン−阻害剤錯体と結合して固定化
した(ヘパリン−阻害剤)アンチ−ヘパリン錯体を形成することをひき起こし、
□未結合の第1の抗体を捨て、
□前記ヘパリンー阻害剤−アンチーヘパリン錯体を前記第1の抗体と免疫化学的
に反応的な第2の抗体と共にインキュベートし、前記第2の抗体は定量的に検出
されうるものであり、それによって固定化したヘパリン−阻害剤−アンチ−ヘパ
リン−(第2の抗体)錯体を形成し、
□未結合の第2の抗体を排除し、及び
□前記固定化した第2の抗体の量を定量する、という段階を含んでいる。
さらに本発明のもう一つの態様は、ヘパリン阻害剤として有用な、1−エチル−
3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの正に荷電した(たとえば
、アルキル化した、好ましくはメチル化した)重合体に向けられている。本発明
の重合体は約7.000〜約10,000ドルトンの平均分子量を有し、1−エ
チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の中和、重合
及びメチル化によって合成される。本発明のメチル化した重合体の仮定された構
造は、
式中Rはエチル、ジメチルアミノプロピル、及びトリメチルアミノプロピルから
成る群から選ばれる。
さらに本発明のもう一つの態様はヘパリンの精製方法に向けられており、その方
法は
同じ緩衝液で平衡させられた固定化した重合性のヘパリン阻害剤を含むクロマト
グラフィーのカラムに不純なヘパリンとイオン性緩衝液を含む混合物を充填し、
増大したイオン強度を有する緩衝液でカラムを洗浄し、IMの塩化ナトリウムイ
オンを含む緩衝液で前記カラムを溶出する、
という段階を含んでいる。
発明の詳細な記述
本発明を、好ましい具体例を参照して以下に記述する。
しかしながら、本発明の範囲はこれらの具体例に限定されないことは理解できる
であろう。
本発明は生物学的流体中のヘパリンを測定するための迅速な、敏感なかつ特異的
な測定法に向けられる。この測定法は予備処理なしに生物学的試料に対して直接
性なうことができる。加うるに1この測定が大いに選択的でありしかもほかの交
差反応的な化合物を全く検出しないという点において、使用できる試料に全く制
限がない。
このことは貴重な時間を節約するだけでなく、測定の精度を減少するかも知れな
い試料の過度の取扱いをも避ける。生物学的試料としては全血液、血液血清、血
漿、尿、脳を髄液、涙、培養基、細胞抽出物などを挙げることができるがこれに
限定されない。
本測定は典型的にDawe sとPepperの分析に必要とする時間の50%
以下、たとえば8時間又はそれ以下で結果を出す。この分析は、もし試料が少な
くとも100 nシーのヘパリンを含有していることがわかっており、そして使
用されるアンチヘパリン抗体の濃度を増大することによって(下記参照)4〜5
時間内に成し遂げることができる。このことによって全ヘパリン濃度の正確な測
定を必要とするときはいつでも本測定を使用することが好適(そして好都合に)
になる。そのことは外科患者の管理及び精密度が必要な別の臨床的応用の補助ζ
して本測定を臨床的に使用することも可能にする。
本測定は(ヘパラン硫酸塩のような)ほかのグリコサミノグリカンスはほかのヘ
パリン関連基質を全く認識しないことにおいて特異的である。少なくとも約5〜
10ng/−というきわめて低いヘパリンの濃度を測定することができることに
おいても極端に敏感である。
最後に、本測定は生物学的測定ではなく、かくしてヘパリンの測定のための凝血
測定の不利を持たない。一つの好ましい具体例においては、本測定は酵素結合免
疫吸着測定(ELISA )の−変形である。もう一つの好ましい具体例におい
ては、本測定法は放射線免疫検定法(RIA)の−変形である。
本発明者等は下記の一般式に相当すると信じられる新規のメチル化重合体を発見
し、そして合成した。
式中Rはエチル、ジメチルアミノプロピル、及びトリメチルアミノプロピルから
成る群から選ばれる。この重合体は下記の単量体の一つ又は両方の重合体のメチ
ル化によって得られる。
又は
式中DAPはジメチルアミノプロピルでア’)、Etはエチルである。
これらの化合物は効果的なヘパリン阻害剤でありそしてイオン性相互作用による
高い親和性と特異性によってヘパリンと結合する。
本発明の重合体は下記のように都合よくしかも安価に合成することができる。
1)炭酸ナトリウムによる1−エチル−3−(3−ジメチルアミンプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩の中和。
2)好ましくは室温(22℃)で少なくとも約2日(そして好ましくは約2週間
)又は高温(100℃)で約2〜5時間の重合。
3)単量体1モル当りヨウ化メチル2モル用いる22℃で夜通しのヨウ化メチル
によるメチル化。
この合成の詳細は下記の実施例3に示されている。メチル化は重合体に正の電荷
を与えるための好ましい方法である。
本発明のヘパリン阻害剤はマイクロタイター板(Costar。
Cambridge、 MA )又はヘパリンの精製のためのセファロース4B
ビーズ(下記実施例1参照)のような、固体基体上に結合させることによって固
定化することができる。
阻害剤は室温で約1〜約2(好ましくは1.75)時間インキュベートすること
によって5まく基体であるマイクロタイター板に結合する。未結合阻害剤は、好
ましくは0.14 Mのトリス緩衝生理的食塩水(pH7,5)で洗浄され、そ
して標準の生理的食塩水のもとで4℃で約6週間まで貯蔵することができ、又は
好1しくは使用するまで乾燥貯蔵してもよい。
好ましい具体例において、使用に先立って、阻害剤連行(bearing )基
体を洗浄し、そして試料の緩衝液溶液を添加する。このウェル(wells )
を少なくとも約5(好tL<G!約5〜7)時間インキュベートしそして未結合
試料を緩衝液で洗浄する。25 ng/m1以上のヘパリンを含有している試料
を測定するときはいっそう短いインキュベーション時間を使用することができる
。より低い精度の測定でかまわないならばいっそう短いインキュベーション時間
も可能である。
ヘパリンに対して出現させられ(下記の実施例4参照)そして阻害剤に結合され
たヘパリンを認識し5る第1の抗体を含有している(たとえニ、トウイーンを含
有するPH3中の)調製品を各ウェル(well)中に導入し、そして室温で約
1〜3時間、好ましくは2時間インキュベートする。
抗体溶液を洗浄によって取り除きそして第2のアンチ−Iρ−抗体調製品をウェ
ル(well)中へ導入する。
第2の抗体は固定されたヘパリン−阻害剤錯体にすでに結合されたアンチヘパリ
ン抗体を認識しそして結合する。
第2の抗体は検出することができ、たとえば、発色団化合物の活性化を導く酵素
のような露出物質(revealingsubstance ) 、フルオレ七
インのような螢光性物質と接合することができ、又は1251のような放射性同
位体で標識を付けることができる。さらに露出剤としてペルオキシダーゼと連合
して使用することができる露出物質としては、下記の2.2′−アジノージ(3
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)−6アンモニウム塩、オルソ−シアニジ
・ジン、5−アミノサリチル酸、3 、3’−ジメチルオキシベンジジン及びパ
ラクレゾールが挙げられるがこれに限定されない。加うるに当技術においてよく
知られているアンチ−■ρ−アルカリ性ホスファターゼ/パラ−ニトロフェニル
リン酸塩のような別の組合せも存在する。
しかる後に露出(第2の)抗体の量は測定することができそして相当するヘパリ
ンの濃度は当技術においてよく知られている標準測定を参照することによって決
定することができる。
代替の具体例においては、メチル化したカルボジイミド阻害剤(最終濃度0〜4
00ng/+d)及びアンチ−ヘパリン抗体(マイクロタイター板に結合した阻
害剤に結合した最大の半分結合するヘパリンを生じるように選ばれた濃度、すな
わち50〜1oong/+y)をヘパリン含有試料と混合する。混合物の一部分
50−を阻害剤がマイクロプレートに結合した固定化したヘパリン−阻害剤錯体
を含有しているマイクロタイター板のウェル(well)に添加して室温で2〜
3時間、好ましくは25時間反応させる。反応混合物を除去し、そして洗浄及び
検出段階は好ましい具体例のそれと同一である。
この技術を用いることによって、阻害剤と結合したヘパリンで被覆されたウェル
(well)に対するアンチヘパリン抗体の結合を阻害する能力によってヘパリ
ンを定量することができる。
アンチヘパリン抗体は下記の実施例40手順に従って調製することができる。
本発明は特殊の実施例について以下に更に記述するが、これは例示することを意
図するものであって範囲を限定するものではない。
実施例 1@定の準備
濃度1.0〜125μg/ゴの014Mのトリスで緩衝した標準の生理的食塩水
中のメチル化したカルボジイミドヘパリンに害剤(実施例4に従って調製した)
50μlをマイクロタイター板のウェル(wells )に添加し、そして室温
で1.75時間インキュベートした。このウェル(wells )を0.14
Mのトリスで緩衝した標準の生理的食塩水(pH7,5)でよく洗浄し、そして
好ましくは乾燥状態で又は各ウェル(wells )について100μlの標準
の生理的食塩水と共に4℃で6週間まで貯蔵した。
使用する前に、このつx # (wells )を200 ttlの0.3M
NaC1,0,03M、 ホスフェート(pH7,2)、及び0.05%トウイ
ーン20(トウィーン緩衝液)で2回洗トウイーン緩衝液中(又は血漿中)のヘ
パリン含有試料50又は100μlを各ウェル(well)に添加し、そして4
℃で夜とおし又は好ましくは室温で5時間インキュベートした。試料を取り除き
そしてウェル(wells )を200μlのトウイーン緩衝液で5回洗浄した
。トウィーン緩衝液中のアンチヘパリン抗体の稀薄溶液(下記の実施例5参照)
50μlを各ウェル(well)中に配置し、そして室温で約2時間インキュベ
ートした。
溶液の抗体含量はアンチ−ヘパリン抗体の活性に依存するが、IgO分別抗体標
本を用いるとき一般に約100〜約2001g/−の範囲内になるであろう。こ
の段階でインキュベーションの時間を短縮するためには、約1尿膚の濃度が好ま
しい。
抗体溶液を取り除き、ウェル(wells )を200μlのトウイーン緩衝液
で5回洗浄する。トウィーン緩衝液中のヤギ抗−ウサギエρペルオキシダーゼ5
0μlを各ウェル(well)中に配置し、そして室温で1時間インキュベート
する。それから抗体を取り除きそしてウェル(wells )を200μlのト
ウイーン緩衝液で4回、200μlの0.1 Mリン酸塩/クエン酸塩緩衝液、
pH5゜0 (60,75−の0.1Mクエン酸、128.75−の二塩基性リ
ン酸ナトリウム及び水を250−になるよう混合して調製した)で2回洗浄する
。リン酸塩/クエン酸塩緩衝液中に過酸化水素(0,015%)とオルソ−フェ
ニレンジアミン(0,05w/v%) (Sigma Chemical Co
、、 St、 Louis、 MO)を含有する100μlの溶液を各ウェル(
well)中に配置し、そして10〜20分間色を発現させる。
反応を50μlの4N硫酸を添加して停止させる。100μlのこの混合物を0
.9艷の水に添加し、そして492nmの光学密度を測定する。又、この光学密
度は、マイクロクイター板を読みとるために特別に設けた分光光度計から直接読
み取ることもできる。
1−エチル−3−(3−ジメチルアミノフ゛ロビル)カルボジイミド塩酸塩(S
igma Chemical Co、から市販されている)を炭酸ナトリウムの
10%溶液中で中和した。
カルボジイミド単量体をメチレンクロライドで抽出し、固体水酸化カリウム上で
乾燥し、減圧下に溶媒を除去して単離した。単離した遊離アミンを暗所に、好ま
しくは1〜2週間貯蔵することによって、又は100℃に数時間加熱することに
よって重合させた。2gの白色半固体の反応混合物を全ての未重合のカルボジイ
ミドを取り除くために過剰の脱イオン水で洗浄した。得られた重合体は水性媒体
に比較的に不溶性であり、これを濾過によって分離し、そして減圧下に乾燥した
ところ1りの白色の固体を生じた。
100−の無水ジエチルエーテ/l/ (Fisher ChemicalCo
、、 Fairfield、 NJ )中の500m9の重合体をヨウ化メチ/
l/ (Fisher Chemical Co、 ) 500 m9と混合し
、そしてこの反応混合物を室温で夜とおし撹拌した。得られた白色沈殿な瀞過に
よって分離し、500rnlの無水ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥し
たところ400m9の白色固体を生じた。この白色固体はメチル化したカルボジ
イミド重合体の阻害剤である。それは比較的に水溶性でありセファデックスG−
100及びG −50(Pharmacia、 Piscataway、 NJ
)のゲルク0マドグラフィー及びAm1con UM 10 珍Hの部分保持
によって測定した場合s、oooの平均分子量を有する。これは、約1:1重量
対重量比でヘパリン抗凝固因子活性を阻害した。
実施例 4 抗体の調製
ヘパリンは天然に生じるムコ多糖体であるがゆえに、単純な免疫感作手順は実質
的なアンチヘパリン結合活性を引き出さない。このことが全く事実であることは
人間の抗凝固因子として使用された牛又は豚のいづれかから誘導したヘパリンに
対する抗原応答に関する報文がほとんど全く欠けていることによって示唆されて
いる。
非免疫原的物質に対する抗体を引き出すために使用されてきた技術は、免疫原と
してメチル化した牛の血清アルブミン(BSA)による沈殿を使用するものであ
る。
この手順を用いるならば、DNAフラグメント、ポリリボヌクレオチド及びポリ
−D−グルタミン酸(全て貧弱な免疫原)に対して向けられた特異性を持つ抗原
が得られてきた。この技術は本発明のアンチヘパリン抗体を得るために使用され
た。
カルボジイミド修飾したヘパリンを認識するアンチヘパリン抗体は既に記述され
た( Gitel、 S、 N、、等、Blood。
乙902−911.1985 )。これらは水溶性の(単量体の)カルボジイミ
ドとの反応によって得られたタンパク質−ヘパリン錯体でウサギを免疫すること
によって発生した。
しかしながら、ウサギを免疫するために使用した錯体及び生じた抗体は両方とも
本発明のものとは異なる。本発明の抗体はいっそう効果的であり(すなわち、い
っそう高いヘパリン中和タイターを有する)そしてヘパリン−メチル化ウシ血清
アルブミン錯体に対して発生させられ、Gitel等(前掲書中に)におけるよ
うなカルボジイミド修飾ヘパリンに対してではない。
ウシ血清アルブミy (U、 S、 Biochemicals、 Pitts
burgh。
PA )を5ueok、 N、とCheng、 T、 Y、 (J、 Mo1.
Biol、 4゜161〜172.1962.参考資料に組み込んだ)の周知
の方法によってメチル化した。メチル化したBSA−ヘパリン沈殿を、脱イオン
水中で等容のメチル化BSA(5mp/d)とへバリア (1m9 / m/
、等級1 、 Sigma ChemicalCo、 )を混合することによっ
て得た。得られた沈殿をペレット化し、脱イオン水で洗浄して室温で減圧下に乾
燥した。
アンチヘパリン抗体を引き出すために3種の異なる免疫化管理を使用した。
1、雌のニューシーラント白ウサギを、1rnlの0.t、iMトリス生理的食
塩水溶液に懸濁した2mノのメチル化したBSA−ヘパリン沈殿を一回だけ静脈
注射することによって免疫した。最初の注射後20.50及び80日後に類似し
た促進免疫化を与えた。血液試料を各免疫化後4日目に得た。
2第2組のウサギを、完全なフロイントのアジュバント中の200μgのメチル
化したBSA−ヘパリン沈殿を皮肉注射し、及び、1.4.8及び111日目2
00μlの0.14 M NaC1溶液に懸濁した50μgの上記沈殿を静脈注
射して免疫した。2ケ月の休眠後、これらのウサギを上記のようにして再免疫し
た。血液試料を各組の免疫化の完結後4日目に取得した。
3、第3組のウサギを、完全なフロイントのアジュバント中の200μgのメチ
ル化したBSA−ヘパリン沈殿を皮肉注射し、及び、1,8及び144日目20
0μlの0.14M)リス生理的食塩水溶液中の50μgの沈殿を静脈注射して
免疫した。20日及び400日目、これらのウサギに200μlの0.14M)
リス生理的食塩水溶液中の100μgの上記沈殿を静脈注射した。最初の免疫化
計画の完了後2ケ月目に100μgの上記沈殿を促進静脈注射した。血液試料を
188日目注射後4日目に得た。
血液試料をシトラード中に収集しそして血漿を遠心分離によって得た。この血漿
を56℃で20分加熱し、生じた沈殿を遠心分離によって取り除いた。■ρ画分
を周知の硫酸アンモニウム沈殿手順によって分離した。この工ρ画分は上記のよ
うにその後のヘパリン測定に使用することができ、又、抗体の部分的に精製した
プールは当技術において周知であるヘパリン−セファロースに関するアフイニテ
イクロマトグラフイーによって得ることができる。これらのあとの抗体はヘパリ
ン測定においていツソウ低いバックグラウンドを生じさせる。
上記免疫化計画を用いて得た■ρ抗体タイターを下記第1表に示す。
表 1
免疫されたウサギのアンチ−ヘパリン抗体タイターv5 1:20 1:100
#2
V7 <1:10 1:5000 #2V8 <1:10 1:5000 #2
V9 <1:10 1:4000 #2VIO<1:10 1:1600 #3
Vll <1:10 1:2500 #3V12 <1:IO’ 1:2500
#3V13 <1:10 1:600 $1V14 <1:10 1:400
11V15 <1:10 1 :5500 #IV16 <1:10 1:6
00 #1*タイターは酵素免疫検定法において最大色発現の半分を得るために
必要ときれる加熱した血漿試料の稀釈度である。
各免疫化計画は、計画#1(表I)を使用して免疫した一匹のウサギ(V15)
について得られた最高のタイターとともに、アンチヘパリン抗体の生産を上昇さ
せた。
アンチヘパリン抗体はヘパリンを沈殿させなくまたヘパリン抗凝固因子も阻害し
ない。その上、これらの抗体は単にメチル化したカルボジイミド重合体に結合し
たヘパリンを認識するだけで溶けやすいヘパリンな認識しない。
添加された溶けやすいヘパリンは免疫測定において抗体の結合を阻害しないが、
メチル化したカルボジイミド重合体がヘパリンと共に添加されたときは、抗体の
結合は阻害された。
実施例 5 生物学的試料のヘパリン含量の測定ヘパリン(等級1 、、Sig
ma Chemical Co、 )溶液をトウイーン緩衝液又はヒト血漿中に
稀釈し、メチル化したポリカルボジイミド重合体で被覆したマイクロタイターウ
ェル(wells )中に置き、夜どおし吸着させた。このウェル(wells
)をアンチ−ヘパリン抗体で、次いで上述のヤギー抗つサギーIgGペルオキ
シダーゼ(SigmaChemical Co、、 St、 Louis、 M
O)で処理した。過酸化水素/オルソ−フェニレンジアミン溶欲の添加後発現し
た4 92 nmの吸光度を測定し、そしてヘパリンの測定法のための代表的な
標定曲線を第1図に示す。
この測定法は、最小、トワイーン緩衝液中の50g/−のヘパリン及び血漿中の
20〜25 ng/++/のヘパリンまで感知する(第1図)。商業上のヘパリ
ンの場合、それぞれ8 X 10−’ U/*及び3.5 X 10−’ U/
−に等しいこれらの濃度は特異的な凝固又は色原体の基質に基づく測定のいづれ
かを用いて得ることができる濃度より1次数の量低い。
代表的な免疫測定を7種の異なる既知濃度のヘパリンの試料を用いて行なった。
試料を10又は25Dg/−のいづれかの最終濃度を生じるようにPBSで稀釈
し、測定は上記のように行なった。二つの異なるマイクロプレートを使用し、そ
して(第1図におけるように、標定曲線の発生に対して)標準ヘパリン溶液の稀
釈とともに、おのおのは同一の試料を含有させた。加5るに、吸光度の各測定を
3回行なった。データを下記の表Bに示す。
ヘパリン濃度 ng/m/!
8M 10 10.7±0.7 25 23.7±0.68M10 9.8±0
.8 25 23.0±0.38M 10 10.5±1.0 25 23.0
±i、。
20 10 9.6±0.2 25 21゜0:l:0.524 10 9.6
±0.6 25 20.5±0.2.5U 10 10.5±0.5 25 2
Zl±1.2.5D 10 10.0±0.6 25 211±0.62U 1
0 10.0±0.3 25 22.3±0.42D 10 10.Of:0.
2 25 23.0±1.2*個々の各測定値は3回の独立した測定の平均上標
準偏差である。
プレート■
ヘパリン濃度 ng/d
ヘパリン試料 現実 測定値 現実 測定値SNi 1o s、s±Z2 25
23.7±2.08M 10 9.5±0.4 25 20.2±0.48M
10 10.0±0.8 25 21.8±0.420 10 8.0±0.
6 25 18.2±1.824 10 8.6±1.2 25 21.2±3
.0.50 10 9.2±0.6 25 21.0±0.4.5D 10 8
.4±1.0 25 20.7±0.42U 10 9.2±0.6 25 1
7.5±1.42D 10 7.2±0.2 25 21.7±1.6上記のデ
ータはこの免疫検定の正確さを実証している。
10又は25Dg/−のどちらかにおいて、大部分の試料はその現実の値の10
%以内で正確に測定されており、そして異なるマイクロタイター板について同じ
試料に対して得られた値にほとんど変動はなかった(表n)。
免疫検定はヘパラン硫酸塩(Miles Laboratories。
Elkhart、 IN )、ヒアルロン酸(Sigma Chemical
Co、 )、ケラタン硫酸塩(Sigma Chemical Co、 )、デ
ルマタン硫酸塩(Sigma Chemical Co、)及びデルマタン硫酸
塩(Martin Mathews博士、シカゴ大学、Chicago、 IL
から得た)等の他のグリコサミノグリカンを含有している試料を用いて行なった
。この検定においてこれらのグリコサミノグリカンはどれもヘパリンと交差反応
をしなく、厳密な特異性を証明した。加うるに上記のグリコサミノグリカンはど
れも同時に添加されたときに免疫検定においてヘパリンと競争(compete
) Lなかった。
上記かられかるように、ヘパリン阻害剤はいったん基質と結合すれば、たくさん
の測定は同時に1都合よくそして安価になしとげることができる。
ヘパリンに対する高い親和性と特異性によって、重合性のヘパリン阻害剤はヘパ
リンの単離及び精製のための試薬として使用することができる。これをなしとげ
るために、この重合体は周知の臭化シアン共役反応(P、 Cua−1reca
sas等、Proc、 Nat’l Acad、 Sci、 USA 61.6
36〜643、1968 、参考として引用する)によってセファロース4Bビ
ーズ(Pharmacia、 Piscataway、 NJ )のような適当
な支持マトリックスに結合されるであろう。ヘパリン含有試料は標準のトリス生
理的食塩水(0,14M NaC1)と結合することができ、そしてこのヘパリ
ンは0.5〜IMの変化度のNaC1の添加によって溶出することができる。大
半のヘパリンはNaC1の濃度が約IMのとき溶出するであろうということが予
想される。好ましくは、ヘパリン含有試料は0.5 M NaC1で最初に結合
し、そして0.5〜IMの変化度のNaC71で溶出することができる。
いっそう少ない非特異的結合をより高い塩濃度で生じさせるであろうという理由
から後者が好ましい。
本発明は好ましい具体例を参照して上記に記述してきた。しかしながら、多くの
付加、削除及び変形が請求の範囲に記載の本発明の範囲からはずれることなく本
記述に徴して当技術に通常に精通した者に明白であると理解される。
国除調査報告
PCT/US877’01242
X、CLASSXF工CATION OF 5o=J=c: MATTER[C
0NTINUEDIH,FIELDS 5EARCHED fcONTINUE
Dl
Claims (30)
- 1.生物学的流体中に存在するヘパリンの量を測定する測定法において、 −固定化したヘパリン阻害剤化合物の存在下に前記流体の試料をインキユベート し、それによつて前記試料中に含まれているヘパリンを前記阻害剤に結合しそし て固定化したヘパリン−阻害剤錯体を形成することをひき起こし、 −未結合試料を排除し、 −ヘパリン−阻害剤錯体を第1の抗体と共にインキュベートし、前記第1の抗体 は前記ヘパリン−阻害剤錯体と免疫化学的に反応性であるアンチヘパリン抗体で あり、それによつて前記第1の抗体を前記ヘパリン−阻害剤錯体と結合させて固 定化したヘパリン−阻害剤アンチヘパリン錯体を形成することをひき起こし、− 未結合の第1の抗体を排除し、 −前記ヘパリン−阻害剤−アンチヘパリン錯体を前記第1の抗体と免疫化学的に 反応性である第2の抗体と共にインキュベートし、前記第2の抗体は定量的に検 出されうるものであり、それによつて固定化したヘパリン−阻害剤−アンチヘパ リン−(第2の抗体)錯体を形成し、 −未結合の第2の抗体を排除し、及び 前記固定化した第2の抗体の量を定量する、という段階を含むことを特徴とする 測定法。
- 2.前記ヘパリン阻害剤が正に荷電した1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ プロピル)カルボジイミドの重合体を含む請求の範囲第1項記載の方法。
- 3.前記未結合試料は0.3Mの塩化ナトリウム、0.3Mのリン酸ナトリウム 、及び0.05%のトクイーン20、pH7.2を含む緩衝液で洗浄することに よつて排除される請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.前記試料は、約5〜約7時間インキュベートされる請求の範囲第1項記載の 方法。
- 5.前記試料は、約5時間インキュベートされる請求の範囲第1項記載の方法。
- 6.前記未結合の第1の抗体は、0.3Mの塩化ナトリウム、0.03Mのホス フアート及び0.05%のトウイーン20、pH7.2を含む緩衝液で洗浄する ことによつて排除される請求の範囲第1項記載の方法。
- 7.前記第1の抗体は、ウサギIgGである請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.前記未結合の第2の抗体は、初め0.3MNaCl/0.03Mホスフアー ト/0.05%トクイーン20のpH7.2を有する緩衝液で、次いでpH5. 0を有する0.3Mホスフアート/シトラート緩衝液で洗浄することによつて排 除される請求の範囲第1項記載の方法。
- 9.前記第2の抗体は、ヤギ抗ウサギIgGである請求の範囲第1項記載の方法 。
- 10.前記第2の抗体は、露出物質で接合される請求の範囲第1項記載の方法。
- 11.前記露出物質は、ベルオキシダーゼ、フルオレセィン、アルカリ性ホスフ アターゼ、及び125Iを含む群から選ばれる請求の範囲第10項記載の方法。
- 12.前記第2の抗体は、放射性同位体で接合される請求の範囲第1項記載の方 法。
- 13.前記露出物質は、ペルオキシダーゼであり、前記方法は、前記第2の抗体 錯体に過酸化水素及びオルソーフエニレンジアミンを付加すること、色が発現す るのを待つこと、及び光学的手段によつて前記結合した第2の抗体の量を測定す ることを更に含む請求の範囲第11項記載の方法。
- 14.前記結合した第2の抗体の量は、放射能のシンチレーション計数によつて 測定される請求の範囲第12項記載の方法。
- 15.ヘパリンの存在を検定するための診断キットであつて、 ヘパリン阻害剤化合物、前記ヘパリン阻害剤に結合したヘパリンを認識する抗体 、前記第1の抗体に対して向けられた抗体及び前記検定の使用のための指示を含 むことを特徴とする診断キット。
- 16.前記ヘパリン阻害剤化合物は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプ ロピル)カルボジイミドのメチル化した重合体である請求の範囲第14項記載の キット。
- 17.1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドのメチ ル化した重合体。
- 18.約7,000〜約10,000ドルトン分子量を有する請求の範囲第17 項記載の重合体。
- 19.前記カルボジイミドを重合しそして前記重合体をメチル化することによつ て合成された請求の範囲第17項記載の重合体。
- 20.白色であり、比較的に水に溶けやすくそしてヘパリン活性を中和しうるこ とをさらに特徴とする請求の範囲第17項記載の重合体。
- 21.前記マイクロプレートのウエル(wells)に結合したメチル化した重 合体のカルボジイミドヘパリン阻害剤を含有しているマイクロタイター板。
- 22.メチル化した重合性のカルボジイミドヘパリン阻害剤に結合したヘパリン と免疫化学的に反応性であるアンチヘパリン抗体。
- 23.ヘパリンの精製のための方法であつて、同じ緩衝液で平衡させられた固定 化メチル化した重合性のヘパリン阻害剤を吸収剤として含むクロマトグラフィー のカラムに不純なヘパリンとイオン性緩衝液とを充填すること、 増大したイオン強度を有する緩衝液でカラムを洗浄しそれによつて不純物を溶出 するが前記カラムに結合した前記ヘパリンを残留させること、及び 1Mの塩化ナトリウムイオンを含む緩衝液で前記ヘパリンを溶出すること、 という段階を含むことを特徴とする精製方法。
- 24.前記第1のイオン性緩衝液は、0.5M塩化ナトリウムを含む請求の範囲 第24項記載の方法。
- 25.前記第1のイオン性緩衝液は、0.14M塩化ナトリウムを含む請求の範 囲第24項記載の方法。
- 26.前記増大したイオン強度の緩衝液は、0.5M塩化ナトリウムを含む請求 の範囲第26項記載の方法。
- 27.セフアロース4Bビーズ及びポリビニルビーズから成る群から選ばれた材 料に共有結合したメチル化した重合性のカルボジイミドヘパリン阻害剤。
- 28.試料中に存在するヘパリンの濃度を測定する方法において、前記試料中の ヘパリンをヘパリン阻害剤に結合させて検出できるヘパリン−阻害剤錯体を生成 すること、前記錯体の量を検出し、そして前記錯体の検出した量を参照すること によつて前記ヘパリンの量を決定することを含むヘパリンの濃度を測定する方法 。
- 29.前記阻害剤は、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボ ジイミドの正に荷電した重合体である請求の範囲第29項記載の方法。
- 30.生物学的流体中に存在するヘパリンの量を測定するためのコンペテイテイ プ測定法において、固定化したヘパリン阻害剤/ヘパリン錯体を用意すること、 前記錯体に、前記ヘパリン阻害剤を前記試料に含まれたヘパリンに結合するため に十分以上過剰の量だけ含みしかも阻害剤−ヘパリン錯体と免疫化学的に反応性 であつて検出できるアンチヘパリン抗体を所定の割合の前記固定化した錯体に結 合するために十分な量だけ含むヘパリン含有試料をさらすこと、 流体中の前記ヘパリンが流体中の前記阻害剤と反応し及び前記抗体が固定化した ヘパリン−阻害剤錯体に結合することを待つこと、 未結合の流体、阻害剤及び抗体を洗浄すること、及び結合した検出できる抗体の 量を測定すること、及び前記固定化した錯体の前記抗体の結合の阻害を参照する ことによつて前記流体中のヘパリンの濃度を決定すること、 という段階を含むことを特徴とするヘパリンの量を測定するためのコンペテイテ イプ測定法。
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