JPS59108959A - ヒスタミン定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 身体または実験液体中のヒスタミンを決定するための受
容体基礎の臨床または研究競合阻害検定法が開示される
。検定されるべき検体中のヒスタミンの量と結合するた
めの過剰の受容体を提供するのに充分な量のヒスタミン
受容体、およびヒスタミン検体とヒスタミン受容体との
反応後に存在する生成未結合ヒスタミン受容体と反応す
るのに充分な量のヒスタミン−指示薬結合体からなる本
方法を遂行するためのキットがまた記載される。

技術領域 本発明は、ヒスタミンの検定法に関する。更に詳しくは
、本発明は、身体または実験液体中のヒスタミンを定量
するための受容体基礎競合阻害検定に関する。他の態様
においては、本発明は、本発明の方法において有用なキ
ットに関する。更に他の態様においては、本発明は、本
発明の方法における使用のための新規ヒスタミン−指示
薬結合体に関する。

背景技術 ヒスタミンは多くの生物系中に見出さｆ′１５、そして
アレルギー性および炎症性疾病の庁状の発生において主
要な役割を果たしている。ヒスタミンは免疫応答に、胃
酸の分泌に、そして神経系の機能に含まれることが知ら
れている。ヒスタミンは組織マスト細胞（ｔｉｓ８ｕｅ
　　ｍａｓｔ　　ｃｅｌ’ｌｓ　）および循環好塩基球
（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　　ｂａｅｏｐｈｉｌｓ　）
中に含有される顆粒から放出される。ヒスタミンは、し
ばしば抗体とアレルゲンとのそのような細胞の表面上で
の結合のための反応である。放出されたヒスタミンは、
多くの身体組織と相互反応して、数数の疾病の症候であ
る変化を誘導する。放出されたヒスタミンの量はある種
の疾病の存在および重篤さの優れた指標であることがよ
く確定されている。たとえば、アレルゲンによって生じ
るヒスタミン放出の情は、アレルギー性に対するアレル
ギー感受性の程度の優れた指標である。アレルゲンによ
る攻撃に対する応答において放出さり、るヒスタミンの
量の測定は、現在使用さイ１．ているヒスタミンの定量
法の不完全さの故に、診断方法として普通使用さね７て
いない。

ヒスタミンの定量的測定のためには、先行技術において
役立ちうる広い範囲の方法がある。しかしながら、臨床
実験室における日常使用に充分な役立ちうる方法はない
。最も広く使用さｆｑ、る検定は、オルトーフタールア
ルデヒド結合検定の変法である。この方法において、体
液たとえば血液または尿中のヒスタミンは一連の有機−
無機層抽出と同時のＰＨの移動により他の生理的アミン
から分離サレる。罹離されたヒスタミンはついでオルト
ーフタールアルヂヒドと反応して、蛍光生成物を提供し
、それは定量される。この方法は労働集約的であり、そ
して自動化するとき、大きな資本投資および堝大な装置
の設備を必要とする。

別途のヒスタミン検定法、ラジオアイ・戸トープ標識を
ヒスタミンに、メ壬ルトランスフエラーゼの存在におい
て、ラジオアイ・戸トーフ０欄繊アデノシルメチオニン
により結合させる酵素アイ・戸トープ検定である。この
検定はまた抽出操作を必要とする。そイ１．は時間がか
かり、労働集約的であり、そしてラジオアイ・アトーデ
の使用と結ひ付いた運営の問題を提供する。

普通に使用さｆｌ、ることのより少ないヒスタミン検定
法は、蛍光アミン結合ヒル吃タミンの高圧液体クロマト
グラフィ、各種のがスクロマトグラフィ検定、および薄
層クロマトグラフィ検定を包含する。それらの方法は研
究実験室においては多かれ少なかれ有用であるけれども
、臨床実験室検定法に必要なたとえば正確さ、速さ、操
作の容易さ、低い費用および高容量のような特徴は何も
結び付いていない。

受容体基礎検定が、この技術分野において知られている
。米国特許第３，８１７．８３７号は、ヒスタミンであ
りうる配位子の存在を決定するための検定法に関する。

配位子は酵素眞結合し、そして酵素結合配位子は受容体
と結合するとき酵素活性における著しい減少を蒙むるた
めに必要とされる。

対照的（（、本発明の好ましいヒスタミン−指示薬結合
体は、受容体と結合するときその活性を維持し、あるい
は活性の刺激さえも受ける。

唯一の商業的に入手しうる受容体基礎検定はパ０　　　
　　　■ イオセデトーＧ　（ＢｉｏｃｅＤｔ　−Ｇ　）　（ワン
ポール、ラゼラトリーズ（Ｗａｍｐｏｌｅ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　）、デストリクト、デビジョン、オ
プ、カーター、ウォーレス、インコーポレーテソ（ｓ’
　（Ｄｉｓｔ、　　Ｄｉｖ、ｏｆＣ！ａｒｔｅｒ　−Ｗ
ａｌ、１ａｃｅ　、　　■ｎｃ、’）、クランバリー（
０ｒａｎｂｕｒｙ　）、二ニーシャーシー（Ｎ、Ｊ、）
）であると信じら拘、る。バイオセデトーＧＯは、たと
えばラット果実または牛黄体の（ね、のような動物細胞
からの血漿膜の製剤に対する血清中におけるヒトの絨毛
ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の特異結合に基づく妊娠試験
である。

発明の要約 手短かに云えば、本発明はヒスタミン受容体およびヒス
タミン−指示薬結合体ケ使用し、液体試験検体中のヒス
タミンの定量的測定のための競合阻害方法を提供し、こ
の方法は次の工程からなる：１）測定さね、る量の試験
検体を過剰のヒスタミン受容体と接触させ、 ２）試験検体をヒスタミン受容体とインキュベートし、
そして反応させ、その反応は更に結合のために役立ちう
る未結合ヒスタミン受容体を残留し、３）ヒスタミン−
指示薬結合体を全未結合ヒスタミン受容体と結合させる
のに充分な量のヒスタミン−指示薬結合体を結合および
未結合ヒスタミン受容体と接触させ、 ４）ヒスタミン−指示薬結合体を未結合ヒスタミン受容
体とインキュベートし、そして反応させ、５）ヒスタミ
ン受容体に結合したヒスタミン−指示薬結合体の借を測
定するために、もしも必要ならば、未結合ヒスタミン−
指示薬結合体を除去し、６）ヒスタミン受容体に結合し
たヒスタミン−指示薬結合体の量を測定し、そして、 ７）標準曲線との比較により試験検体中のヒスタミンの
量を決定する。

別途に、ヒスタミンおよびヒスタミン−指示薬結合体は
ヒスタミン受容体と同時にインキュベートできる。

１態様においては、酵素刺激検定法、上記方法は、ヒス
タミン−指示薬結合体として新規ヒスタミン−酵素結合
体、たとえばヒスタミン−アルカリ性ホスファターゼを
合体することが採用さイ１１、その結合体はヒスタミン
部分を通して受容体と結合するとき、酵素に対する刺激
効果を提供する。

本発明の酵素刺激検定法は、受容体が固体基質に結合す
ることを必要としないで自由浮動しえ、即ちそれは均一
な検定系でありうる点において直前に示した方法と弄っ
ている。そのような場合、本方法は工程５、未反応ヒス
タミン−指示薬結合体の除去工程を取り除くことによる
利点を提供する。

上記方法は、キット形で提供さイ９．る成分で利用でき
、キットはアレルゲン感受性の決定に特に有用である。

本出願において「重用される： ゛ヒスタミン受容体″は、各種の型の細胞の外部表面上
の天然に生成する構造である生化学的実体を意味し、そ
の受容体はヒスタミンと特異的に結合する。生化学的実
体は組成物における部分的蛋白質であり、そして抗体お
よびレフ千ンを除去；”定量的″は、検体たとえば血液
、尿、唾液、組織培養液、脳を髄液またはバッファー溶
液中の細胞１　ｍｌ当り０．１ナノグラムはどの小計が
確実に測定できることを意味し； ゛競合ヒスタミン阻害検定″は、臨床的才たは実験室的
試験におけるヒスタミンの定量的決定において、遊離ヒ
スタミンがヒスタミン受容体に対し標識ヒスタミンと競
合することを意味し；“標識（１ａｂｅｌｅｄ　）″は
、物理的または化学的手段により検出しうるもの、たと
えばラジオアイ・戸トープ、酵素、蛍光化合物、染料、
または常磁性共鳴を生じる物質を意味し； ゛不拘−検定系″は、受容体が基質と結合している系を
意味し； “均−検定系″は、すべての受容体が自由浮動し、そし
て基質に結合していない系を意味し；”刺激効果″は、
酵素がヒスタミンと結合し、そしてヒ２タミノを通して
受容体と結合するとき、酵素の増加した活性を意味する
。

詳細な記述 本発明は、次の工程からなり、ヒスタミン受容体および
ヒスタミン−指示薬結合体を使用する、液体試験検体中
のヒスタミンの量を決定する方法を提供する： １）測定される量の液体試験検体を過剰のヒスタミン受
容体と接触させ、 ２）該試験検体を該ヒスタミン受容体とインキュベート
し、そして反応させ、その反応は次の結合に役立ちうる
未結合ヒスタミン受容体を残留し、６）ヒスタミン−指
示薬結合体を未結合ヒスタミン受容体と結合させるのに
充分な量の該結合体を結合および未結合ヒスタミン受容
体と接触させ、４）該ヒスタミン−指示薬結合体を未結
合ヒスタミン受容体とインキュベートシ、そして反応さ
せ、５）ヒスタミン受容体に結合したヒスタミン−指示
薬結合体の量を測定するために、もしも必要ならば、未
結合ヒスタミン−指示薬結合体を除去し、６）該ヒスタ
ミン受容体に結合したヒスタミン−指示薬結合体の量を
測定し、そして、 ７）標準曲線との比較九より、該試験棒体中のヒスタミ
ンの量を決定する。

本発明においては、任意の起源から得られるヒスタミン
のための受容体が使用できへる。動物起源、特に哺乳動
物起源からの受容体が好ましい。ヒトおよび動物起源、
たとえばマウス、ラット、モルモットおよび家兎起源が
有用でありそして容易に入手しうる。ヒスタミン受容体
は、マスト細胞、ある種の平滑筋細胞およびある種の神
経細胞の外部表面に見出される。好ましくは、ヒスタミ
ン受容体の起源は、たとえばＴまたはＢ　ＩＪンパ球の
ような培地中のリッパ球細胞である。より好ましくは、
起源はリンパ芽球細胞ライン、更により好ましくはスピ
ンナー（５ｐｉｎｎｅｒ　）フラスコ懸濁液培地中に生
育しうるリンパ芽球細胞ラインである。

ヒスタミン受容体は、それらの起源から、水性溶媒たと
えばホスフェート緩衝化食塩水、食塩水、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、または他の水性等張溶液
のような水性溶媒中の長時間インキュベーションにより
取り出される。細胞の死が生じたとき、受容体は溶媒中
に流し出される。

別途に、細胞は、同様な水性溶媒中、約４６°Ｃで、受
容体が流し出されるまで最低４５分間熱衝撃に付しうる
。

本発明の検定法において使用されるヒスタミン受容体は
、新たなまたは保存された細胞上に存在しまたは結合し
え、溶液中において自由にリポゾーム担体の外部表面上
に合体しえ、固体粒子に結合しえ、連続固体層に粘着し
え、あるいは乳剤の表面に粘着しうる。

ヒスタミン受容体が溶液中にあると去、溶液は、たとえ
ば細胞死亡後または熱衝撃後に細胞により流し出された
受容体を分離することによって得られる粗製のものであ
りえ、あるいはそれは受容体がたとえば分子篩上のクロ
マトグラフィにより、ゲル排除またはアフィニティクロ
マトグラフィにより精製または濃縮されたより精製され
た溶液でありう“る。

ヒスタミン受容体を固定するθ）に有用な適当な固体層
支持体は、ポリス千しン、がラス、ナイロン、ボリフ０
口ぎレン、アルブミンピーズ、ラテックスビーズおよび
リボ・戸−ムを包含し、そして好ましくは９６−ウェル
、マイクロタイター、プレート　（９６−ｗｅｌｌ’　
　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　　ｐｌａｔｅ　　）である。

受容体を固体支持体に結合すると永、結合は各種の方法
で行われ、その多くは、処理または未処理固体表面への
蛋白質実体の直接結合、あるいは表面への共有結合を包
含し、この技術分野においてよく知られている。処理さ
れた固体表面は化学的または物理的のいずれかで処理さ
れうる（米国特許第４，２１０，７２２号中に開示され
た如く、固体表面のコロナ放電活性化およびエポキシ化
ポリブタジェンのジメチルアミン付加物での処理を包含
する）。化学的共有付着は、この技術分野において熟練
している者には知られている如く、同種二官能性（たと
えば、ゲルタールアルデヒド）または異種二官能性（た
とえば、カルボジイミド、臭化シアンおよびトリニトロ
ベンゼンスルホネート）でありうる二官能性薬剤による
交叉結合または単純結合を包含しうる。

好ましくは、本発明の検定、そして特に本発明の物品ま
たはキットは、固体支持体に固定したヒスタミン受容体
を使用する。

一般的に、アレルギー感受性の臨床診断検定としての使
用のためには、ヒスタミンを検定さね、るべき検体は血
液の検体、あるいは他の起源の好塩基球またはマスト細
胞である。検体はアレルゲンで処理して、ヒスタミン含
有細胞たとえば好塩基球および（または）マスト細胞か
らヒスタミンの放出を生じさせる。加えるアレルゲンの
量は一般的に、被験者の感受性を測定することが望まれ
る典型的アレルゲンの所定量でありうる。使用されうる
アレルケゞンの例は、アレルゲンに対する被１験者の個
々の感受性がこの技術分野においてよく知られている如
く、広範囲で変化するので、殆んど非限定的である。典
型的には、そイ１．らア１／ルｒンは、植物起源たとえ
ば花粉；動物起源たとえば毛髪、毛皮、ふけ、唾液含有
血清蛋白質；あるいは有機性または無機性の両方である
各種の化学物質たとえば煙、家のほこり、食物、医薬品
または産業化学品でありうる。上記の物質の多くのもの
の抽出物はアレルケゞンである。若干の場合において、
Ｏ■ 検定は、たとえば、ハイパツク　（Ｈｙｐａｑｕｅ　　
）、〔ウィンスロップ、゛ラボラトリーズ（Ｗｉｎｔｈ
ｒｏｐＬａｂｏｒａｔｏｒｉθ日）、ニューヨーク市、
ニューヨーク州〕のような放射造影剤による非特異刺激
を測定するのに適合しうる。

試験検体中のヒスタミンを結合することが埋にカ）なっ
て期待さ′！１．るよりも過剰量のヒスタミン受容体が
存在して、引続き加えられるヒスタミン−指示薬分子の
結合部位を役立ちうるようにする。

過剰の受容体は予め確定さ１１５だ標準曲線により保証
される。ヒスタミン検体は、ヒスタミンの量が標準曲線
の検出限界内に入るように希釈により調節される。好ま
しくは、５係以上であるが９５係以下のヒスタミン受容
体が検体からの遊離ヒスタミンと結合するようになる。

遊離ヒスタミンと受容体との反応は室温で進行しえ、あ
るいは別途に、反応速度は温妾を変化させること如より
減少または増加しうる。反応のインキュベーションは、
身体環境を刺激するために正常体温またはその付近で行
うことができる。必要とさね、るインキュベーションの
時間は比較的短いけれども、そイ９．は選択されたアレ
ルゲンおよび受容体に依存して若干変化しうる。時間は
一般的に１時間もしくはそれ以下、そして好ましくは１
５分間もしくはそれ以下でありうる。

本発明の方法において有用なヒスタミン−指示薬は、ヒ
スタミン−蛍光標識、放射標識ヒスタミン、ヒスタミン
−染料、あるいは好ましクホヒスタミンー酵素結合体で
ありうる。ヒスタミン−指示薬結合体は試験検体／受容
体混合物に添付しえ、あるいは随意に、工程２の生成物
はヒスタミン−指示薬結合体を加える前と分離または精
製しうる。

たとえば、もしも受容体が固体支持体に結合しているな
らば、支持体はアレルゲンの溶液または懸濁液、あるい
は生物学的液体から除去しえ、あるいは別途に、アレル
ゲンの溶液および生物学的液体は固体支持体からフラッ
シュ除去しうる。

工程３は、ヒスタミン−指示薬結合体を受容体と接触さ
せることを含む。もしも受容体がヒスタミンと既に結合
しているならば、ヒスタミン−指示薬結合体との反応は
遮断される。過剰の受容体が本方法において必要とされ
そして計画さ札ているので、過剰の受容体はヒスタミン
−指示薬結合体のヒスタミン部分と反応する。好ましく
％−１，９５チ以下そして５％以上の受容体が未結合で
あり、そしてヒスタミン−指示薬結合体と反応する。、
この反応は、天然環境を刺激するために、正常体温また
は付近でインキュベートにより再び普通に行ｈ　ｈ、　
ル。インキュベーションの時間は一１Ｊｉ１時間もしく
はそれ以下、そして好ましくは１５分間もしくはそれ以
下でありうる。

本発明の方法において、ヒスタミン−指示薬は好ましく
はヒスタミン−酵素結合体であり、そして広く各種の公
知のまたは容易に製造される結合体から選択できる。酵
素は好ましくは商業的に入手しえ、あるいは製造および
県離に費用がかからず、よい安定性、高水鵠の活性、お
よび商業的な実験室的試験における使用に必要な自明の
性質を有する。

適当な酵素は、容易に入手しうる基質と反応して役立て
うる分析方法により検出可能でありそして容易に決定さ
れる生成物を導くものであり、そしてアルカリ性ホスフ
ァターゼ、ワサビの７ぐ−オキシダーゼ、そして１配の
基準をみたし、加えて高い回転率（生成物形成の速度）
を有し、安定でありそして製造が経済的である他のもの
を包含する。

ヒスタミン−酵素結合体のための好ましい酵素は、アル
カリ性ホスファターゼおよびワサビのｙｓ。

−オキシダーゼである。アルカリ性ホスファターゼは１
−王手ルー３−（３−ジメ千ルアミノゾロぎル）カルぜ
ジイミド−ヒスタミンとの反応により容易に結合しうる
ので適当である。１−王手ル−３−（３−ジメ千ルアミ
ノプロピル）カルボジイミドは、当モル量のヒスタミン
に加えられて、ヒスタミンおよびカルボジイミドの結合
体の実質的ＶＣ１００％収率な提供する０゜当モル量の
アルカリ性ホスファターゼの添加は、１：１モル比にお
けるヒスタミン−酵素結合体を提供する。結合体は、＠
意に（そして好ましくは）、たとえばセファデックス０
Ｇ−２００〔ファルマシア、インコーポレーション（Ｉ
Ｆ’ａｒｍａｃｉａ、　　工ｎｃ、）から人手しうるデ
キストランｒル〕上のクロマトグラフィにより精製しう
る。ワサビのパーオキシダーゼは同様にゲルタールアル
デヒドおよびヒスタミンと共反応することにより結合さ
れる。

受容体は、工程２において、測定されるべ去ヒスタミン
、たとえばアレルゲンによる枚重に応答して検体の細胞
により放出されるヒスタミンと部分的に反応する。つい
て未反応受容体の残部をま、過剰のヒスタミン−指示薬
結合体を添加することにより完全に反応する。ヒスタミ
ン−指示薬と未結合ヒスタミン受容体との反応の後、受
容体含有検体は完全に反応したヒスタミン受容体を含有
する。引続いて、異種性検定系においては、未反応の過
剰ヒスタミン−指示薬結合体は適当な溶媒、一般にホス
フェート緩衝化食塩溶液で洗浄除去する。ついで、存在
する指示薬の量を決定する。たとえば、もしも指示薬が
酵素であるならば、酵素と反応する基質を加え、そして
反応させる。たとえば、アルカリ性ホスファターゼでは
基質はｐ−ニトロフェニルホスフェ−）ｔたはウンベリ
フェロンホスフェートでありえ；ワサビのパーオキシダ
ーゼでは基質はＯ−フェニレンジアミンと過酸化水素、
あるいはアミノアンチゾリンと過酸化水素でありうる。

酵素および基質は、それら反応の生成物が容易に検出し
うるように選択される。たとえば、アルカリ性ホスファ
ターゼ−ヒスタミン結合体と反応されるべき基質は、パ
ラ−ニトロフェニルホスフェートでありうる。反応の生
成物、ｐ−ニトロフェノールは可視的にまたは分光光度
計により容易に検出しうる黄色の化合物である。

特定量の反応時間の後、酵素−基質反応を、この場合緩
和な塩基たとえば工Ｎ水性水酸化す）　ＩＪウムで停（
ヒさせる。誘導さね、た着色を分光光度計により定量的
に測定する。存在する酵素の量は、たとえば既知量の酵
素および基質での図形曲線またはコンピューター生成分
析との比較により決定する。

有用である他の指示薬はまた、公知の標準方法により容
易に検出しうる。放射活性同位元素を合体したヒスタミ
ンまたはヒスタミン結合体は、放射検出手段により容易
に検出される。ヒスタミンに結合した常磁性物質はＮＭ
Ｒ分析により容易に検出される。蛍光指示薬および染料
は、それらのスにクトル性質により、たとえば蛍光光度
計によって検出さね、る。

最後眞、受容体と反応するヒスタミンの量は、差により
容易に計算される。たとえば、もしも受容体の８０係が
ヒスタミン−指示薬結合体により占有されていたならば
、２０係はヒスタミンと反応している。均一な検定系に
おいて、遊離ヒスタミンおよびヒスタミン−指示薬は、
受容体に対し、分散液中におけるそれらの存在に比例し
て競合する。すべての場合において、実験検定における
と同様にヒスタミン標準品で検定を行うことが必要であ
る。

アルカリ性ホスファターゼの酵素活性は、その結合体が
受容体と結合しているヒスタミン−アルカリ性ホスファ
ターゼ指示薬結合体中のヒスタミンに結合しているとき
に高められることが見出された。この酵素活性の刺激は
、濃度依存性であり、遊離ヒスタミンにより阻害可能で
あり、そして全細胞上、溶液中、または固層支持体上の
いずれかにおいてヒスタミン−酵素結合体が受容体と結
合した後に生じる。この刺激効果は、酵素の高められた
活性が受容体に結合したヒスタミン−アルカリ性ホスフ
ァターゼでのインキュベーションの前に、ヒスタミンを
受容体製剤に加えることにより阻害されることを示すこ
とにより特異的にヒスタミン受容体として確認された。

そのような結果は、酵素への実体の結合が一般に酵素、
たとえば・ミツ）ｏ（Ｋｍｉｔｏ）　（シバ、カンパニ
ー（５ｙｖａ　Ｃｏ、　）の活性を阻害するので、異常
である。しかしながら、ロートマン（Ｒｏｔｍａｎ　。

Ｍ、Ｂ、）等〔アンチボディーメジエーテソＶ、アク千
ベーション、オプ、ア、ヂフエクテイプ、β−Ｄ−がラ
クトシヂイス、エキストラクチラド、ン　ト　（Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　　　　ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ　　　　ｏｆ　　　ａｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　　　
β−Ｄ　−ｇａｌａｃｔｏｓｉｎａｓｅ　　　ｅｘｔｒ
ａｃｔｅｃｌｆｒｏｍ　　ａｎ　　Ｅｅｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ　　ｍｕｔａｎｔ　）　）　（プロシ
ーデイングズ、オプ、ナショナル、アカデミ−、オプ、
４カイエンス、ニー、ニス、ニー（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　）　６　
ｏ、６６０（１９６８））は、酵素−配位子結合体が抗
体により結合されたとき刺激されたことを報告した。こ
の後者結合体は受容体に結合せず、そしてβ−Ｄ−がラ
クトシダーゼの変異株細菌起源に独特である。

本発明のヒスタミン検定法は、臨床的および実験室的試
験応用における有用性につき、不均一および均−検定系
において有用である。均一層検定において、ヒスタミン
受容体に結合したヒスタミン−アルカリ性ホスファター
ゼの骨は、そのような結合の陣中じる酵素カイネ千ツク
スの刺激を基礎として定量化される。従って、結合およ
び未結合ヒスタミン−酵素の両者を有する検体１！の酵
素活性が測定され、そしてこの値が既知量のヒスタミン
を使用して確定された標準曲線と比較される。

本発明のこの態様は、未結合ヒスタミン−アルカリ性ホ
スファターゼ指示薬が分析さｔｚる検体から除去されな
い、通常の不均一層検定よりはむしろ均一層検定の選択
のための基礎を提供する。ヒスタミン受容体に結合した
相対量のヒスタミン−酵素が酵素力イネチツクスの刺激
の相対量により指示されるので、分離はこの均一層検定
においては必要ではない。

競合阻害検定および酵素刺激検定のためのキットは、ア
レルゲン感受性の決定のために特に有用である。本キッ
トは、動物起源のヒスタミン含有細胞であるマスト細胞
または好塩基球からのヒスタミンの放出を誘導する各種
アレルゲンまたは薬剤を含有しうる。

本発明の方法が日常的に実施しうるキットまたは物品を
提供するとき、使用者に対し検定系の成分を提供するの
が有用である。本発明の方法を遂行するためのキットは
、その最も簡単な形において次のものを包含する： （１）　　検定されるべき検体中のヒスタミンと結合す
るための過剰量を提供するのに充分な量におけるヒスタ
ミン受容体、および、 （２）検体ヒスタミンとヒスタミン受容体との反応の後
に存在する生成した未結合ヒスタミン受容体と反応する
のに充分な量におけるヒスタミン−指示薬結合体。

ヒスタミン受容体は、随意に、粒子状または連続的な支
持体に結合しうる。キットは更に、指示薬基質、もしも
適当ならば、アレルゲン、および実験測定と比較される
べき標準曲線または結果の生成のためのヒスタミン検体
を包含しうる。たとえば、キットは複数個の容器、たと
えば試験管またはマイクロタイタープレートを含有しう
る。何個の容器は次のものを含有しうる：ヒスタミン受
容体（不均一検定の場合には容器の内部表面に付着しう
る）；ヒスタミン−指示薬結合体、加えて適当な緩衝化
塩；酵素のまたは化学蛍光の指示薬が使用されるとき妃
は、適当な基質、そして別の容器中の反応停止剤、キッ
トがアレルゲンに対する臨床的感受性の検定としての使
用を意図される場合には、正確に定量化された量の各種
の疑がわしいアレルゲン；標準曲線の確定において使用
されるべき既知量のヒスタミンの１定部分；そして上記
容器のいくつかはまた、好塩基球またはマスト細胞の予
め形成されたヒスタミン貯蔵の最大放出を生じるのに充
分であることが知られている予め測定された量の薬剤を
含有しうる。随意に、キットは更に、１部分のヒスタミ
ン受容体および１部分のヒスタミン−指示薬結合体と混
合されるヒスタミン標準を包含しうる。

本発明の目的および利点を次の実施例により更に説明す
るが、それらの例中に示した特定の物質およびそれらの
量、そしてまた他の条件および項目は本発明を不当に限
定するものと解釈してはならない。

例　　１ ヒトのＴリンホゾラストイド細胞ライン、ＭＯＬＴ−４
Ｆを、組織培養培地（ＲＰＭＩ　１６４０、グランド、
アイランド、バイオロジカル、カンパニー（Ｇｒａｎｃ
ｌ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、　）
グランド、アイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　）
　＝ニーヨーク州〕、グルタミン、１０％熱不活性化ウ
シつ児血清、および１ゴ当り１００単位のベンーストレ
ツノ（Ｐｅｎ−８ｔｒｅｐ　）中、６７°Ｃ１湿度１０
０％および５％二酸化炭素で、標準組織培養技術により
生育させた。

ヒスタミン受答体乞細胞壁から遊離させるために、細胞
をホスフェート緩衝化食塩水で６回洗滌し、ホスフェー
ト緩衝化食塩水中１−当り１Ｘ１０７細胞の一度におい
て再懸濁し、セして４°０で６日間貯蔵するかまたは４
６°Ｃで９０分間インキュベートするかした。細胞をつ
いて１０００　ｘａで１０分間遠心分離した。脱落した
ヒスタミン受容体を含有する上置液を吸引により除去し
、そして細廁球を捨てた。

例　　２ ルの検体をポリスチレンマイクロタイタープレートの谷
くぼみに蛋白質前処理として加え、そして血清含Ｍプレ
ートを２５°Ｃで１５分間インキユペートシた。各くぼ
みをついでホスフェート緩衝化食塩水で２回洗滌した。

各くぼみに、ボスフェート緩衝化食塩水中の１ミリモル
トリニトロベンゼンスルホ＊−）２０’０マイクロリッ
トルヲ加え、そしてプレートを６７℃で６０分間インキ
ュベートした。各くほみをついでホスフェート緩衝化食
塩水で６回洗滌した。各くばみに、ついで例１の方法に
従い製造したホスフェート緩衝化食塩水中のヒスタミン
受容体２００マイクロリツトルを加えた。プレートラつ
いで２５°Ｃで６０分間インキュベートした。インキュ
ベートの後、各くぼみをホスフェート緩衝化食塩水で６
回洗滌し、そしてグレート乞２５℃で約１６時間空気乾
燥し、ついで４″Ｃで貯蔵した。

例　　６ 製造 ｐＨ７，２の０．０１　Ｍホスフェート緩衝化食塩水１
０ｄ中のヒスタミン塩酸塩３．９　Ｘ　１０−’　ＩＱ
の溶液に、ホスフェート緩衝化食塩水１０ｍ７！中の１
−エチル−６−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
シイミド塩酸塩５．６　Ｘ　１０−３１ダを加えた。

２・５　’Ｏで３０分間混合した後、ホスフェート緩衝
化食塩水１０７！中のアルカリ性ホスファターゼ■型（
Ｔｙｐｅ　、ｉ　）　（ジグｆｆ（Ｓｉｇｍａ　）　〕
１０ｍｓ；ｌを加えた。混合物を２５°Ｃで２時間緩和
に混合し、ついで４°Ｃでホスフェート緩衝化食塩水に
対し透析した。透析液をついでセファデックス■（）−
２００〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）スエー
デン〕のカラム上クロマトグラフィした。ヒスタミンお
よび酵素活性の両方を含有するピークを分離し、そして
９１つ蛋白質４０ｒｎ９の濃度に希釈した。この蛋白含
有物質は結合体ヒスタミン−アルカリ性ホスファターゼ
であった。

例　　４ ヒスタミン−ワサビパーオキシダーゼ結合体の製造 Ａ部 ０．１　Ｍ水性ホスフェートバッファー（ｐＨ６−８）
１ゴ中のヒスタミン５ｍｇおよびワサビパーオキシダー
ゼ１２〜の溶液を製造した。この攪拌した溶液に、１％
ゲルタールアルデヒド溶液０．．０５ｒｎ１．’＆滴下
し、そして溶液を２時間攪拌した。生成した溶液をホス
フェート緩衝化食塩溶液２２に対し、４℃で１６時間透
析した。透析液を４°Ｃにおいて２０．００　Ｏｒｐｍ
で６０分間遠心分離して粒状物を除去し、そしてワサビ
パーオキシダーゼ−ヒスタミン結合体を提供した。結合
体の安定性を、１部分を４℃で６ケ月間貯蔵することに
より決定した。

証明しつるほどに安定であることが認められた。

Ｂ　部 酵素基質としての使用のための過酸化水素を次の如く製
造した：６０チ過酸化水素１＋＋＋ｌをガラス蒸留水（
ｇｌａｓｓ　ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ　）で全
量１０〇−に希釈した。この溶液１−を更に０．２　Ｍ
　’）ン酸バッファー（ｐＨ７，０）　５０−で希釈し
て０．００１７Ｍ過酸化水素の濃度を提供した。

０部 分光分析的に検出しつる指示薬としての使用のための４
−アミノアンチピリンを次の如く製造した：水４〇−中
のフェノール８１０■の溶液を製造した。この溶液に４
−アミノアンチピリン２５ｍｇを加えた。溶液をついで
水で全量５０−に希釈した。４−アミノアンチピリンの
最終濃度は０．００２５　Ｍであった。

Ｄ部 ヒスタミンの決定のための参照グラフを得るために、次
の方法を使用した： ヒスタミン受容体で被覆したマイクロタイタープレート
に、例２の方法を使用して、６つ組で、ヒスタミンのく
ぼみ当りＯ（盲験Ｌ　　２５．５０．７５および１００
マイクログラムの濃度を加えた。

各くぼみを、ツイーン２０界面活性剤０．０５％を含有
するホスフェート緩衝化食塩水で最終容量１００マイク
ロリットルに希釈した。この溶液を室温で１５分間振盪
し、そしてホスフェート緩衝化食塩水で６回洗滌した。

この溶液に、Ａ部で製造したワサビパーオキシダーゼ−
ヒスタミン結合体６０マイクロリツトル９を加えた。く
ぼみの各々を、ついで全量１００マイクロリツトルに希
釈した。溶液を６０分間振盪し、ついで各くぼみを空に
し、そしてホスフェート緩衝化食塩水で６回洗滌した。

各くぼみのヒスタミン受容体のすべ′てはヒスタミンま
たはワサビパーオキシダーゼ−ヒスタミン結合体のいず
れかと反応した。

各くぼみに、ついで０．００１７Ｍ過酸化水素溶液１０
０マイクロリツトルおよび０．００２５　Ｍ　４−アミ
ノアンチビリン溶液１００マイクロリツトルを加えた。

溶液を６７°Ｃで１０分間インキユベートシ、ついで１
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液の添加により反応を停止させ
た。複製Ｚ貯蔵し、そして吸収をベックマン分光光度計
で５１０　ｎｍにおいて読んだ。結果を次の表１に示す
二 表　　　■ ０　　０．４００ ２５　　　０．３１０ ５０　　　０．２８５ ７５　　　０．２０５ １００　　　０．１２５ 背景　　　　　　　　　０．０９５ 未知検体中のヒスタミン水準を測定するために、ヒスタ
ミン受容体で被覆したマイクロタイタープレートのくぼ
みを、ヒスタミンを含有する検体と反応させ、ワサビパ
ーオキシダーゼ−ヒスタミン結合体、ついで過酸化水素
および４−アミノアンチピリンと順次反応させた。水酸
化ナトリウム溶液での反応の停止および吸収の測定は、
上記値と比較した値を提供し、そして外挿法を行ってヒ
スタミン濃度の測定を提供した。

例５ 例１に記載した如く生成させたヒ）　Ｔ　ＩＪンホプラ
ストイド細胞、ＭＯＬ　Ｔ　−４Ｆをホスフェート緩衝
化食塩水で６回洗滌し、そして１％ウシ血清アルデミン
および０．０５％ツイーン２０を含有するホスフェート
緩衝化食塩水中に１−当りｌＸ１０’細胞において再懸
濁した。細胞１００マイクロリツトル中に、例６に記載
した如くに製造したカラム精製ヒスタミン−アルカリ性
ホスファターゼ結合体の希釈１０マイクロリツトルを加
えた。ヒスタミン−酵素希釈１：２．１：４．１°８お
よび１：１６を使用した検体を使用した。検体を６７℃
で６０分間インキュベートし、ついで１０００ｘｏで遠
心分離し、そして細胞粒子を分離し、そして次の組成を
有するｐＨ９，８のバッファー　中Ｋ　ｐ−二トロフェ
ニルホスフエート１ｒｎｌ当す１１Ｖ’ａ＝含有するパ
ラーニトロフェニルホスフェート水溶ｔｌｆｆｌＩｍＪ
中に再懸濁した：　０．０５　Ｍ炭酸ナトリウム、０．
９重量多塩化ナトリウムおよび１ｍＭ塩化マグネシウム
。懸濁液を６７°Ｃで１時間インキユペートシ、ついで
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液ビ加えて酵素反応ケ停止さ
せた。検体を１０００ＸＧで１０分間遠心分離し、上澄
液を傾斜し、そして上澄液のＡ４□。の吸収（４１０ｎ
ｍにおける吸収）をベックマン分光光度計で読んで形成
した生成物の量を決定した。結果を表Ｈに示す。

表　　■ 非希釈　　　　　　　０．２９０ １　：　２　　　　　　　０．１３３ １　：　４　　　　　　　０．０８７ １　：　８　　　　　　　０．０５８ １　：　１６　　　　　　０．０４２ 例　　６ 検定の感度の実証 ヒスタミン検定の感度を決定するために、阻害剤として
０．０１　Ｍホスフェート緩衝化食塩水中のヒスタミン
を有する全細胞ケ使用して阻害検定を行った。ヒスタミ
ン”ｖ　ｉ　ｘ　ｉ　ｏ’細胞と６０分間インキュベー
トした。未結合阻害剤を洗滌し、そしてヒスタミン−酵
素を加え、そして６０分間インキュベートした。未結合
指示薬を洗滌した後、酵素Ｍ質、ｐ−ニトロフェニルホ
スフエートヲ加え、そして６７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。

酵素反応を１Ｎ水性水酸化ナトリウムで停止させ、そし
てＡ４１０の吸収をペックマン分光光度計から読んだ。

形成した生成物の量は、細胞に結合した遊離ヒスタミン
の量に逆比例した。この阻害検定の結果を表Ｉに示し、
それは臨床的に有意のヒスタミンのｎ、）７１水準が検
出されることを説明する。

表　　　■ ０ｇ６９ ｙ４５ ５００　　ｎｇ　　　　　　　　　　　　　３２５０　
　ｎｇ　　　　　　　　　　　　　２４５ｎ、９　　　
　　　　　　　　　　１４５００　　ｐｇ　　　　　　
　　　　　　　７例　　７ 例１に記載した如くに製造した細胞表面ヒスタミン受容
体を、マイクロタイタープレートのくぼみに、プレート
の蛋白前処理（例２参照）、引続く例２に記載した如き
１　ｍＭ　）リニトロベンゼンスルホネートでの表面活
性化により固着させた。

阻害検定は、固体支持体に付着した受容体を使用し、検
定の感度乞実証するために行った。ホスフェート緩衝化
食塩水中の各積置のヒスタミンを、受容体と数通りでイ
ンキュベートした。プレートをホスフェート緩衝化食塩
水で洗滌した後、ヒスタミン−アルカリ性ホスファター
ゼ指示薬を加え、そしで６０分間インキュベートした。

未結合指示薬ｖ洗Ｍした後、パラーニトロフェニルホス
フエートヲ加え、そして６７°Ｃで１時間インキュベー
トした。酵素反応を１Ｎ水性水酸化ナトリウムで停止さ
せ、セしてＡ４１０の吸収をベックマン分光光度計から
読んだ。表に示す結果は、１検体当りヒスタミン１　ｎ
ｇ以下の検定感度を示す。

表　　ＩＶ ５７９ ０７２ ６５ ６０ Ｄ・５５２ ［１，２５４６ ０，１４０ ０，０５３０ 例　　８ 例６および７に記載した方法ケ使用して、抗凝血化した
ヒト全血液中に溶かしたヒスタミンの検定の感度を測定
した。表Ｖのデータは、検定の感度が１検体当りヒスタ
ミンＩ　ｎ、９の水準において受答しつるものであった
ことを示す。

表　　Ｖ ５９１ ０７９ ７０ ４９ 例　　９ 素刺激 ヒスタミンアルカリ性ホスファターゼ１０マイクロリツ
トル＆１ｘ１０６細胞と６０分間インキユベートシ、未
結合指示薬をついで洗滌し、そし１＋１１１Ｄｗ酵素基
質、パラニド・ロフェニルホスフエートと６０分間イン
キュベートした。反応’Ｙ１Ｎ水性水酸化す）　ＩＪウ
ムで停止させ、そして形成した生成物を分光分析的に定
量した。ヒスタミンー酵素の希釈物１０マイクロリツト
ルを酵素基質と６０分間インキユペートシ、反応Ｙ１Ｎ
水性水酸化ナトリウムで停止させ、そして形成した生成
物を定量することにより、総酵素活性を決定した。

データを表Ｖｆに示す。

表　　Ｖｌ 活性の刺激％ −９ １：２　　　　　　　　　　　８ １：４　　　　　　　　　　　２４ １：８　　　　　　　　　　　５４ １：１６　　　　　　　　　１１６ １：３２　　　　　　　　　１９０ １　：　６４　　　　　　　　　４８５１：１２８　　
　　　　　　７５７ １：２５６　　　　　　　１４４１ 受容体に結合した後のヒスタミン−酵素の刺激がヒスタ
ミン部分の特異結合に基くものであるかどうかを決定す
るために、阻害検定を例９に記載した如くに行った。ホ
スフェート緩衝化食塩水中でウシ血清アルブミンに結合
したヒスタミンを阻害剤として使用し、そしてヒスタミ
ン−酵素の１＝１２８希釈を指示薬として使用した。表
■の結果は、刺激が遊離ヒスタミンにより実際に阻害し
え、かぐしてヒスタミンに特異的であることを示す。

表■ 全細胞に結合したヒスタミン−酵素のヒスタミン阻害ヒ
スタミン−ウシ血清アルブミン　　酵素活性の阻害チロ
０　ｎｇ　　　　　　　　　　６７ ６　μ９　　　　　　　　　　６４ ６００　　ｎｇ　　　　　　　　　　’４５６０　　ｎ
ｇ　　　　　　　　　　３５６ｒＪ　　　　　　　　　
　　２６ 例１０ クスの刺激 例６の方法に従い１：１の比率で製造したヒスタミン−
アルカリ性ホスファターゼの結合体を、２ｍｇ／ｌｎｌ
の濃度で使用した。ヒスタミン受容体は、例１の方法に
従い、ＭＯ，ＬＴ　−４Ｆ細胞から熱衝撃放出方法によ
り製造した。受容体製剤は凍結乾燥し、そして−２０°
Ｃで貯蔵した。再構成（ホスフェート緩衝化食塩水）受
容体の０．１１ｎ１部分を、酵素バッファー中のヒスタ
ミン−アルカリ性ホスファターゼｏ、ｉ　ｍｌに加えた
。更に、受容体希釈物を、表ｖＩｌｌに指示した如くに
製造した。２５℃で５分間のインキュベーションの後に
、酵素基質、ハラ−ニトロフェニルホスフェ−）１７’
＆加えた。検体のＡ４１０における増加を、記録分光光
度計で追跡した。結果を時間による吸収の増加の相対勾
配として表■に示す。

表■ 受容体：バッファ−１希釈　　勾　配　　勾配の増加チ
ー６２．５　　　− １　　：、　１　　　　　　７６．０　　　２１．６１
　　：　　２　　　　　　７２．０　　　１５．３１　
：　４　　　　　　　６５．５　　　　　４．８ｉ：ａ
　　　　　　　　６５．０　　　　　４．０１：１６　
　　　　　６１．０　　　　　０表Ｖ■のデータは、所
定量のヒスタミン−酵素結合体の増加する割合が受容体
により結合し、酵素触媒反応のカイネチック活性が増加
したこと７示す。結合体のヒスタミン部分の結合は、酵
素のカイネチック活性の刺激を生じた。

例１１ ヒスタミン−指示薬としての放射活性ヒスタミン水中の
２　、５−３Ｈ−ヒスタミン塩酸塩の溶液’）ｒ、１ｍ
ｍｏｚ当り９キユリーの比活性および１マイクロリット
ル当り１マイクロキユリーの濃度を有する標識ヒスタミ
ンを使用して製造した。

この３Ｈ−標識−ヒスタミンをついで、１％ウシ血清ア
ルブミンおよび０．０５　％ツイーン２０’に含有する
ホスフェート緩衝化食塩水で５０対１に希釈した。

この溶液（１〈ぼみ当り２００マイクロリツトル）ヲ、
マイクロタイタープレートのくぼみに入れた。各くほみ
は、例２に記載した如く製造したヒスタミン受容体Ｚ含
有した。溶液を６７℃で６０分間インキユベートシ、つ
いで１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％ツイーン
２０’に含有するホスフェート緩衝化食塩水でくぼみを
洗滌して未結付物質を除去した。

３Ｈ−標識ヒスタミンが指示薬として使用できることを
実証するために、それをくぼみからメタノールで２回抽
出した。メタノール洗滌液の放射活性を、アクアゾル■
（Ａｑｕａｓｏｌ、■）〔ニュー、イングランド、ニュ
ーフレア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ　）
　中、ベックマンシンチレーションカウンターで計数し
た。結果を次の表■に示す二表　　■ 受容体くぼみ　　　　　　　　　　　　　７９６８対照
くぼみ　　　　　　　　　　　１１７２表■のデータは
、放射活性カウントが非特異結合のために補正されなけ
ればならないことを示す。

更に、例１１は、本例の指示薬系が検体中のヒスタミン
濃度を決定するために使用できることを示す０ 例１２ ヒスタミン指示薬としての螢光染料標識ヒスタミ０−ダ
ミン、螢光染料の検体をヒスタミンと反応させて、染料
標識指示薬暑提供した。ヒスタミン−指示薬結合がヒス
タミンに特異的であるかどうかを決定するために、この
指示薬ｔ１全細胞上、ヒスタミン受容体と溶液において
反応させた。この反応は以下に記載する如く競合反応と
して行った： ヒスタミンをウシ血清アルブミンと反応させて、ヒスタ
ミン−ウシ血清アルブミンの結合体を提供した。ホスフ
ェート緩衝化食塩水１ゴ当り１．６４■の濃度における
この結合体５０マイクロリツトルに、１襲ウシ血清アル
ゾミンおよび０．０５％ツイーン２０を含有するホスフ
ェート緩衝化食塩水１　ｍｌ当りＩ　Ｘ　１０７細胞の
濃度におけるヒトＴリンホゾラストイド細胞、ＭＯＬＴ
　−４Ｆ　１００マイクロリツトルを加えた。混合物を
６７°Ｃで３０分間インキュベートした。細胞をついで
ホスフェート緩衝化食塩水で６回洗滌し、そして１％ウ
シ血清アルブミンおよび０．０５％ツイー７２０を含有
するホスフェート緩衝化食塩水１００マイクロリツトル
中に再懸濁した。この懸濁液に、ヒスタミン−ローダミ
ン指示薬５０マイクロリツトルを加え、そして懸濁液を
６７°Ｃで６０分間インキユベートシた。懸濁液をつい
で１０００ＸＧで１０分間遠心分離した。上澄液を吸引
により除去し、そして細胞粒子を分離した。細胞粒子を
、１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％ツイーン２
０ケ含有するホスフェート緩衝化食塩水１００マイクロ
リツトル中に再懸濁した。ヒスタミン特異細胞結合指示
薬の存在を螢光検鏡により決定し、そして結果を表Ｘに
示す゛ 表　　Ｘ ヒスタミン−ローダミン　　アリ　　　　　　　　　　
ナシバッファー　　　　　　　ナシ　　　　　　　　ナ
シこの定量的実験は、ヒスタミン−染料指示薬たとえば
ヒスタミン−ローダミンが検体のヒスタミン濃度の定量
測定に使用できることを実証する。

本発明の各種の変形および変更は、本発明の範囲および
精神から逸脱することなしに、この技術分野において熟
練している者には明らかであり、そして本発明はここに
示した説明のだめの態様に不当に限定されるべきでない
ことは理解されねばならない。

代理人　　浅　村　　　皓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ヒスタミン受容体およびヒスタミン−指示薬
   結合体を使用して液体試験検体中のヒスタミンの量を測
   定する方法であって、 ａ、測定される量の試験検体を過剰のヒスタミン受容体
   と接触させ、 ｂ、試験検体をヒスタミン受容体とインキュベートし、
   そして反応させ、この反応は未結合のヒスタミン受容体
   をさらに結合するのに用いられるよう残留せしめ、 Ｃ１全未結合ヒスタミン受容体と結合するのに充分な量
   のヒスタミン−指示薬結合体を結合および未結合ヒスタ
   ミン受容体と接触させ、ｄ、ヒスタミン−指示薬結合体
   を未結合ヒスタミン受容体とインキュベートし、そして
   反応させ、ｅ、ヒスタミン受容体に結合したヒスタミン
   −指示薬結合体の量を測定するために、もしも必要なら
   ば、未結合ヒスタミン−指示薬結合体を除去し、 ｆ、ヒスタミン受容体に結合したヒスタミン−指示薬結
   合体の量を測定し、そして、 ｇ、標準曲線との比較により試験検体中のヒスタミンの
   量を測定することからなる方法。 （２）試験検体およびヒスタミン−指示薬結合体をヒス
   タミン受容体と同時に接触させそしてインキュベートす
   る、特許請求の範囲第１項に従う方法。 （３）　　ヒスタミン−指示薬結合体がヒスタミン−酵
   ・緊結合体である、特許請求の範囲第１項または第２項
   のいずれか一つに従う方法。 （４）　　ヒスタミン受容体の起源が（ａ）哺乳動物細
   胞および（ｂ”ｌ動物細胞からなる群から選択され、細
   胞がヒト、マウス、ラット、モルモットおよび家兎から
   選択される、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
   一つに従う方法。 （５）　　ヒスタミン受容体が溶液中に遊離しており、
   あるいはａ）細胞およびｂ）固体層支持体から選択され
   る物質に結合している、特許請求の範囲第１項〜第４項
   のいずわ２か一つに従う方法。 （６）方法が酵素刺激検定であり、そのヒスタミン−指
   示薬結合体がヒスタミン−アルカリ性ホスファターゼで
   ある、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一つに
   従う方法。 （力　特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれが一つの
   ヒスタミン検定方法において使用するためのキットであ
   って、 （ａ）　　試験検体中のヒスタミンのすべてを結合する
   のに必要な量より過剰な量におけるヒスタミン受容体、 （ｂ）試験検体とヒスタミン受容体との反応の後に残留
   する全未結合ヒスタミン受容体と反応するのに充分な量
   のヒスタミン−指示薬結合体、（Ｃ）場合により、ヒス
   タミン受容体の１部分および引続いてまたは同時にヒス
   タミン−指示薬結合体の１部分と混・合される標準ヒス
   タミン、および、 （ｄ）　　場合により、ヒスタミン受容体と合体される
   、アレルギー的に感受性の哺乳動物の好塩基球またはマ
   スト細胞からのヒスタミン放出を刺激するのに充分な量
   のアレルギー性からなるキット。 （８）受容体が溶液中に遊離し、あるいはａ）細胞およ
   びｂ）固体表面から選択される物質に結合している、ヒ
   スタミンの定量のための酵素刺激検定法において有用な
   、特許請求の範囲第７頂に従うキット。 （９）固体層支技体に結合したヒスタミン受容体からな
   る物品。 （１０）５％より多いが９５係より少ない受容体をヒス
   タミンと反応させ、そして９５係より少ないが５係より
   多い受容体をヒスタミン−指示薬結合体と反応させた、
   特許請求の範囲第９項に従う物品。