JPH01274065A - アミンオキシドを含有する免疫化学的アツセイ用の試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的物質中における被分析物質を免疫化学
的に検出および測定するための、アミンオキシドを含有
する試薬に関する。

知られた免疫化学的アッセイ系はタンパク質、多糖類お
よび／または界面活性剤を添加する必要があり、これら
は免疫化学的反応には関与しないがかかる反応の結果に
好ましい影響を及ぼすのには適する。

西ドイツ特許公開３，６３８．７６７号にはラクトフェ
リン、ウシ胎児血清、ポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ［Ｆ］）
２０）および緩衝塩を含有する固相免疫化学的アッセイ
用のインキュベーション培地が記載されている。

ヨーロッパ特許Ａ−２１５．４５７号にもポロキサマー
（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）群例えばプルロニック（ｐｌｕ
ｒｏ−ｎｉｃ■）Ｒ６８、およびボロキサミン（ｐｏｌ
ｏｘａｍｉｎｅ）群例えばテトロニック（Ｔｅｔｒｏｎ
ｉｃ”）　７０７および１１０７から選ばれた界面活性
剤の添加が記載されており、ここにあげた３種の化合物
はツイーン２０に比較して好都合であることが強調され
ている。

今驚くべきことに、アミンオキシドが免疫化学的反応に
好ましい影響を与えるのにさらに適し、それにより検体
としても呼ばれうる生物学的物質中に含有される被分析
物質の検出および測定の感度が高められることが見出さ
れた。

さらに、アミンオキシドはアッセイのために検体を調製
する場合にかかる試薬の成分として特に適当であること
も判明した。

それゆえ本発明は式Ｉ □ Ｒ，−Ｎ−Ｏｌ Ｒコ ［式中、 ａ）　　Ｒ１はそのアルカノイルまたはアルケノイル部
分が８〜１８個の炭素原子を含有するｌ−アルカノイル
またはアルケノイル−アルミノプロピル基、またはそれ
らの混合物であり、そしてＲ２およびＲ３はメチル、エ
チルまたはプロピル基またはそれらの混合物であるか、
または ｂ）　　Ｒ１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキ
ルまたはアルケニル基、またはそれらの混合物であり、
そして Ｒ２およびＲ３はメチル、エチルまたはプロピル基また
はそれらの混合物であるか、またｃ）　　Ｒ，は８〜１
８個の炭素原子を含有するアルキルまたはアルケニル基
、またはそれらの混合物であり、そして Ｒ２はメチル、エチルまたはプロピル基でありそして Ｒ１はヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基、
またはそれらの混合物であるか、または ａ）　　Ｒ１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキ
ルまたはアルケニル基、またはそれらの混合物であり、
そして Ｒ２およびＲ５はヒドロキシエチルまたはヒドロキシプ
ロピル基であるか、または ｅ）　　Ｒ，は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキ
ルまたはアルケニル基またはそれらの混合物、およびオ
キシエチルまたはオキシプロピル基、またはそれらの重
縮合物であり、そしてＲ２およびＲ１はメチル、エチル
、プロピルまたはヒドロキシエチルまたはヒドロキシプ
ロピル基、またはそれらの混合物であるか、まｌこ　（
ま ｆ）　　Ｒ１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルカ
ノイルまたはアルケノイル基、またはそれらの混合物、
およびオキシエチルまたはオキシプロピル基、またはそ
れらの重縮合物であり、そして Ｒ２およびＲ３はメチル、エチル、プロピルまたは七ド
ロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基、またはそれ
らの混合物であり、ここでＲＩ、Ｒ２およびＲ８はアミ
ド基またはフェノール基を含有しうるものとする］ を有するアミンオキシド、および その少なくとも１種が被分析物質と反応できる免疫化学
的反応体、 を含有する生物学的物質中の被分析物質の検出および測
定のための試薬に関するものであり、ここでこれら反応
体はこの試薬上または中に同じに存在するか、またはそ
れらの一部分または全部が他の試薬上または中に存在す
ることができるものとする。

免疫化学的反応体および／または生物親和性結合相手を
含有する試薬は多数知られている。

これら試薬は一般にそれらが用いられる免疫化学的方法
に従い名づけられる。

本発明で意味する試薬とは、沈澱を分散液としてまたは
ゲル中にまたは粒子の凝集物中に生成させるかまたはそ
の非存在を惹起させるもの、または免疫化学的反応のよ
りカラーシグナルまたは照射を産生させるかまたは阻止
するものを指す。

後者試薬のうちでは、固相免疫化学的アッセイに用いら
れるものが好ましく、酵素基質から発色または照射が生
成される場合はＥＬＴＳＡＣエンザイムリンクトイムノ
ソルベントアツセイ）またはシンチレーションアッセイ
と呼ばれ、放射性標識されたアイソトープにより照射が
産生される場合は固相ラジオイムノアッセイと呼ばれ、
または蛍光源により蛍光が産生される場合は固相蛍光ア
ッセイと呼ばれる。

診断剤は反応体としての抗原、抗体またはこの両者、な
らびに反応体または被分析物質に対し生物学的親和性を
有する他の結合相手例えばレクチン、補体、タンパク質
ＡまたはＧ１そしてまた誘導体化されたビオチンおよび
アビジンを含有でき、ここで少くとも１種の反応体は標
識されていることができるしそして場合によりその標識
を検出するだめの試薬を含有しうる。

それに加え反応体の１種は固相として存在することもで
きる。

本発明で意味する固相とは１種またはそれ以上の反応体
が結合された水不溶性の担体を指す。

担体の例をあげれば、ラテックス粒子、１１状、膨潤性
またはＩＰ膨潤性物質、球体、チューブ内側、チューブ
の配列特定の態様としてのマルチウェルプレート、吸収
性マトリックスとも呼ばれる多孔性物質である。

本発明による試薬の１構成分は、検体を受容するための
装置例えば検体受容用の容器、またはいわゆる「ドライ
ケミカル」アッセイ系での検体受容ゾーン例えば吸収性
マトリックスであることができる。これら構成分は、緩
衝塩および場合によりタンパク質または多糖類のような
安定化性添加剤を被分析分質をも同様に安定化させる物
質として含有する水溶液であることもでき、アミンオキ
シドは２〜８０ｇ／Ｑ、好ましくハ５〜５０ｇ／Ｑ、特
ニ好マシくハｌＯ〜４０ｇ／Ｑノ濃度で含有される。

アミンオキシドは免疫化学的反応が行われる装置中にお
いて診断剤の構成分として含有されることもできる。

被分析物質を含有し、検体とも呼ばれる生物学的物質の
例をあげれば生検または剖検組織、血液細胞、血清また
は血漿、分泌物、体液、炎症性および非炎症性組織から
の血液、組織の事故による産物、および代謝排泄物であ
る。

本発明はさらに被分析物質を場合により水溶液中でアミ
ンオキシドと混合しそして得られた混合物を免疫化学的
に測定することからなる、生物学的物質中に含有される
被分析物質の免疫化学的測定法にも関する。

本発明はさらに免疫化学的アッセイにおけるアミンオキ
シドの使用にも関する。

生物学的物質をアミンオキシドと混合することにより、
その混合物中に含有される被分析物質がその免疫化学的
性質を変えることなく比較的長時間にわたり貯蔵されう
る。

生物学的物質をアミンオキシドを含有する水溶液中に懸
濁させるかそして／または溶解させるかモして／または
かかる溶液で希釈しそしてこの状態で比較的長時間にわ
たり貯蔵できる。

この懸濁、溶解そして／または希釈された状態でそれ以
上処理することなくこれらは被分析物質の免疫化学的検
出または免疫化学的測定に使用される。アミンオキシド
を含有する水溶液は粒調な検体物質例えば痰と混合する
場合に、粘液の液化にすでに利用されていた溶液である
アセチルシスティンおよびバンクレアチンの水溶液より
も速やかに検体物質を液化し、従って検体物質のピペッ
ト操作がより容易になるという好都合な性質を有する。

反応体の１つが固相に存在する免疫化学的方法が好まし
く、その場合光に記載したようにして処理された物質を
、場合により固相の反応体と並んで他の免疫化学的反応
体および被分析物質を検出するための試薬と共に固相と
混合し、次に固相を液相から分離しそして固相でまたは
液相中における被分析物質を測定する。

実施例　１ ７．２５ミリモル／ｕ）Ｎａ、ＨＰＯイ２．７２ミリモ
ル／ＱのＫＨｚＰＯイ１４０ミリモル／ＱのＮａ（ｊ２
および３ミリモル／ＱのＮａＮ　、を含有するｐ＋（７
，２の燐酸塩緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）中に下記化合物
を１０ｇ／　４（ａ）および４０ｇ／１２（ｂ）の濃度
で溶解させた（表中これらは添加物として表示）。

アミンオキシドＷＳ３５： １−アルカノイノレアミノ−３−ジメチルアミノ−プロ
パン−３−Ｎ−オキシドであるＧｏｌｄｓ−ｃｈｍｉｄ
ｔ社製品。アルカノイル基はＣ６〜Ｃ＋ａの鎖長さを有
する脂肪酸の混合物から誘導される； 式 ％式％ （ここでＲ１はココヤシ油から得られ、鎖長さＣ。

〜Ｃ＋ａを有するアルキル基である）を有するココヤシ
ジメチルアミンオキシド； テトラデシルジメチルアミンオキシド；ココヤシ−ビス
−（２−ヒドロキシエチル）−アミンオキシド（ここで
ココヤシはココヤシ油から得られ、鎖長さ０８〜ＣＩ８
を有するアルキル基である）。

プルロニックＦ６８ ボロキサマー群の化合物の商標名、またはテトロニック
７０７およびテトロニック１１０７ポロキサミン群（エ
チレンジアミンにエチレンオキシドおよびプロピレンオ
キシドを付加した生成物）の化合物の商標名。

ヘルペスシンプレックスウィルス（ＨＳＶ）　金含有す
る膿庖液プールの一部分６μＱを前記した溶液のそれぞ
れ１．２ｍｆｆずつと混合した。そこで得られる検体を
２０〜２５°０で２１目間主で貯蔵しｌこ　。

第０，７．１４および２１日目に１５０μａを採取しそ
してＨＳＶの測定を行った。

測定は固相両サイド性免疫科学的方法（サンドイッチＥ
ＬＩＳＡ）により行われた。このＥＬｒＳＡのために下
記物質を調製した。

ｉ、ｉ、　　Ｈ５ＶＩおよび２に対する抗体で被覆され
たマルチウェルプレート マルチウェルプレート、すなわち丸底イムノプレートｎ
　９６Ｆ　（Ｎｕｎｃ製、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、　Ｄｅｎ
ｍａｒｋ物品Ｎｏ、　２６２１６２）をヤギの抗−ＨＳ
Ｖ　ｌおよび２イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）で被覆し
た。この目的にはＩｇＧをｐＨ９，６の１００ミリモル
／１２重炭酸ナトリウム中に２０＋ＩＩｇ／Ｑとなるま
で希釈した。マルチウェルプレートの各くぼみにこの希
釈物１００μαずつを移した。かくして充填されたアッ
セイブレ−トを２０°Ｃで１８時間放置し、そこでウェ
ル中の溶液を吸引により除去し、燐酸塩緩衝した生理食
塩溶液（ｐＨ７，４）中のツイーン２０の１ｇ／４溶液
２００μＱを用い、ウェルに充填し吸引により除去する
操作を反復することによりウェルを３〜４回洗浄し、次
にアッセイプレートをシリカゲルで２０°Ｃで乾燥した
。

１．２．抗−ｕｓｖｉｓよび２１ｇＧ−ペルオキシダー
ゼ接合体 Ｈ３Ｖ　１およびＨ３Ｖ　２に対するものであるマウス
のモノクローナルＩｇＧをＴａｎａｍｏｒ　ｉ他により
１９８３Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、６２．１
２３−１３１に記載されるようにしてＮ−ガンママレイ
ミドブチリルオキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ）と反応
させた。２−イミノチオラン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ社製品
、カタログＮｏ、Ｉ　　６２５６）をＫｉｎｇ他の１９
７８Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７．１４９９〜１５０６に記
載されるようにしてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
製、カタログＮｏ、４１３４７０）と反応させた。ＣＭ
ＢＳ−ＩｇＧ接合体およびイミノチオラン−ＰＯＤ接合
体からＴａｎａｍｏｒｉの記載のようにしてＩｇＧ−Ｐ
ＯＤ接合体を調製した。

得られるＩｇＧ−ＰＯＤ接合体の溶液はタンパク質含量
り、２ｍｇ／ｍＱであった。ＰＯＤ対１ｇＧの比率は２
．５と測定されＩ；。次にこの溶液をＰＢＳ中の５０ｍ
１２／＋２ウシ胎児血清、５ｇ／Ｑツイーン２０の溶液
で６μり／　ｍＱ　ＩｇＧ　−ＰＯＤとなるまで希釈し
そして抗−Ｈ３Ｖ−ＰＯＤと称した。

１．３．　　ＴＭＢ基質調製 抗−Ｈ３Ｖ−ＰＯＤを測定するために２種の原液から調
製される、過酸化水素とテトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）を含有する基質系または基質調製物を用いた。原液
１．：ＴＭＢで塩酸塩を再蒸留水中に５ｇ／Ｑすなわち
１６ミリモル／Ｑの濃度で撹拌下に溶解させ、５Ｎ塩酸
を用いてｐＨ１，５に調製した。この溶液にペニシリン
Ｇを撹拌下に最終濃度２００ｍｇ／１２すなわち０，５
６ミリモル／Ｑとなるように添加した。原液２：再蒸留
水９００ｍＱ中に氷酢酸り、４ｍＱ、　　Ｉ　Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ１，５ｍ１２ＧよびＨ２Ｏ２２５０ｍｇすなわち
３ミリモルを尿素／過酸化水素付加物として加えた。こ
れら化合物完全に溶解したのち再蒸留水を加えて容量１
ａとなした。

ＴＭＢ基質調製物：原液ｌの１容量部および原液２の１
０容量部を相互に混合した。

■、４．測定操作 前記の如くして膿庖液から調製されたＨ３Ｖ含有検体の
１５０μαずつおよびブランク値として調製に用いられ
たそれぞれの溶ｍ１５０μαずつを抗−Ｈ５Ｖアツセイ
ズレート（実施例１．１参照）のウェル中に充填し、イ
ンキュベーター中３７°Ｃで２時間放置した。ウェルの
内容物を吸引して除去し、そしてウェルを洗浄緩衝液と
呼ばれるＰＢＳ中の１ｇ／（２ツイーン２０の溶液を用
いて４回洗っｌこ　。

次に抗−Ｈ５Ｖ−ＰＯＤ　１００μαずつを各ウェルに
加え、前記のようにして３７°Ｃで１時間インキュベー
トした。ウェルの内容物を吸引することにより除去し、
そしてウェルを洗浄緩衝液で４回洗った。各ウェルにＴ
）ＪＢ基質調製物１００μａずつを加え、２０〜２２°
Ｃで３０分間インキュベートしそしてＩＮ硫ａ１００μ
ａの添加によりインキュベーションを停止させた。着色
した溶液のＥ４５０をＰＢＳのブランク値に比較して測
定した。

その結果を表に示す。この表から、アミンオキシドを含
有する溶液で処理した後の膿庖液はプルロニックＦ６８
、テトロニック７０７およびテトロニック１１０７の各
溶液、すなわち従来法溶液で処理された膿庖液より明ら
かに高い吸光を示すことが判る。

Ｈ５Ｖ−含有膿庖液をＰＢＳ中の 下記添加物を有する溶液で　　　　　４５０ｎｍでのδ
吸収処理　　　　　　　　　　　　　　　（検体−ブラ
ンク値）評　　価　　日　　　　　　　　　０　　　７
　　１４　　２１添加物アミンオキシド　　　　（ａ）
　　６１９　　ｎ、ｔ、　　６４４　６５３ＷＳ３５　
　　　　　　　　　　　　＜ｂ’）　　５７８　５９０
　６５８　６３７ココヤシジメチルアミ７　　　　（ａ
）　　６６１　５８２　５７７　６１１オキシド　　　
　　　　　　　（ｂ）　　７２１　５７７　５４７　５
５４テトラデシルジメチルア　　　（ａ）　　６７６　
５５１　５３０　５４９ミンオキシド　　　　　　　　
（ｂ）　　５８０　５０６　４６１　５２４ココヤシビ
ス（２−ヒドロキ　　（ａ）　　６８８　６２９　５８
１　５６５ジエチル）−アミンオキシド　　（ｂ）　　
６４６　５６０　６０５　４１９ブルロニツクＦ６８　
　　　　　　（ａ）　　３８６（ｂ）　　３５１ テトロニック７０７　　　　　　　（ａ）　　３７４（
ｂ）　　３２０ テトロニック１１０７　　　　　　　（ａ）　　３８５
（ｂ）　　３３６ 実施例　２ ４０ｍＱ／Ｑのウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中の下記
溶液を調製した。

ａ）　　ｌｏｇ／１２　　Ｎ−アセチル−し−システィ
ンｂ）　１ｇ／Ｑ　パンクレアチン、およびｃ）　　４
０ｍ（１／Ｑ　　アミンオキシドＷＳ　３５これら溶液
の同量ずつを喀痰と混合し、１８〜２５°Ｃに保持しそ
して２００μａエツベンドルフピペツトを使用してピペ
ット操作性に関し１０分毎に検査した。

溶液Ｃ）との混合物は３０分後にはピペット操作可能で
あり、従って検体として使用できるが、一方溶液ａ）お
よびｂ）との混合物は前記した時点でまだピペット操作
ができないことが判明しｌこ。

特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I ［式中、 ａ）Ｒ＿１はそのアルカノイルまたはアルケノイル部分
   が８〜１８個の炭素原子を含有する１−アルカノイルま
   たはアルケノイル−アミノプロピル基、またはそれらの
   混合物であり、そしてＲ＿２およびＲ＿３はメチル、エ
   チルまたはプロピル基またはそれらの混合物であるか、
   または ｂ）Ｒ＿１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキル
   またはアルケニル基、またはそれらの混合物であり、そ
   して Ｒ＿２およびＲ＿３はメチル、エチルまたはプロピル基
   またはそれらの混合物であるか、または ｃ）Ｒ＿１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキル
   またはアルケニル基、またはそれらの混合物であり、そ
   して Ｒ＿２はメチル、エチルまたはプロピル基でありそして Ｒ＿３はヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基
   、またはそれらの混合物であるか、または ｄ）Ｒ＿１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキル
   またはアルケニル基、またはそれらの混合物であり、そ
   して Ｒ＿２およびＲ＿３はヒドロキシエチルまたはヒドロキ
   シプロピル基であるか、または ｅ）Ｒ＿１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルキル
   またはアルケニル基またはそれらの混合物、およびオキ
   シエチルまたはオキシプロピル基、またはそれらの重縮
   合物であり、そして Ｒ＿２およびＲ＿３はメチル、エチル、プロピルまたは
   ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基、または
   それらの混合物であるか、または ｆ）Ｒ＿１は８〜１８個の炭素原子を含有するアルカノ
   イルまたはアルケノイル基、またはそれらの混合物、お
   よびオキシエチルまたはオキシプロピル基、またはそれ
   らの重縮合物であり、そして Ｒ＿２およびＲ＿３はメチル、エチル、プロピルまたは
   ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基、または
   それらの混合物であり、ここでＲ＿１、Ｒ＿２およびＲ
   ＿３はアミド基またはフェノール基を含有しうるものと
   する］ を含有するアミンオキシド、および その少なくとも１種が被分析物質と反応できる免疫化学
   的反応体、 を含有する生物学的物質中の被分析物質の検出および測
   定のための試薬、ここでこれら反応体はこの試薬上また
   は中に同じに存在するか、またはそれらの一部分または
   全部が他の試薬上または中に存在することができるもの
   とする。 ２）アミンオキシドが１−アルカノイルアミノ−３−ジ
   メチルアミノ−プロパン−３−Ｎ−オキシドであり、か
   つ該アルカノイル基が鎖の長さＣ＿８−Ｃ＿１＿８を有
   する脂肪酸の混合物に由来することからなる請求項１記
   載の試薬。 ３）Ｒ＿１がココヤシ油から得られるアルキルでありそ
   してＲ＿２およびＲ＿３がメチルであることからなる請
   求項１記載の試薬。 ４）アミンオキシドがテトラデシルジメチルアミンオキ
   シドであることからなる請求項１記載の試薬。 ５）Ｒ＿１およびＲ＿２がココヤシ油から得られるアル
   キルでありそしてＲ＿３が２−ヒドロキシエチルである
   ことからなる請求項１記載の試薬。 ６）アミンオキシドが容器中に存在することからなる請
   求項１記載の試薬。 ７）アミンオキシドが溶液中に溶解または懸濁されてい
   ることからなる請求項１記載の試薬。 ８）アミンオキシドがドライケミカルアツセイ系中に存
   在することからなる請求項１記載の試薬。 ９）被分析物質を場合により水溶液中で請求項１記載の
   式 I を有するアミンオキシドと混合しそして得られた
   混合物を免疫化学的に測定することからなる、生物学的
   物質中に含有される被分析物質の免疫化学的測定法。 １０）固相中に存在する免疫化学的反応体を場合により
   他の免疫化学的反応体と共に生物学的物質およびアミン
   オキシドと混合し、次に固相を液相から分離しそして被
   分析物質を固相についてまたは液相中で測定することか
   らなる請求項９記載の方法。 １１）免疫化学的アツセイにおける請求項１記載の式
   I を有するアミンオキシドの使用。