KR100561660B1 - 유도체화되지않은수용성β(1-3)-글루칸에대한수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 특징화와 함께 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 함유하는 제제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신호 변환 경로의 활성화에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 변화시키는 작용제를 확인하기 위한 검정법 및 이 검정법에 의해 확인되는 작용제 뿐만 아니라 탄수화물 대 당지질의 상호작용의 특이성을 평가하기 위한 검정법에 관한 것이다.

Description

유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(또한 PGG-글루칸 또는 베타펙틴(상표명: Betafectin)으로 공지됨)은 독점 공정을 통해 제조된 신규하고 독특한 용해성 β(1-3)-글루칸이다. 이 분자의 생물학적 활성은 미립성 또는 그 밖의 용해성 β(1-3)-글루칸과 명확하게 구별될 수 있다. 다수의 연구소는 β-글루칸의 미립성 및 용해성 형태 둘 모두에 의한 아라키돈산 대사물질(참고문헌: Czop et al., J. Immunol. 141 (9) : 3170 - 3176 (1988)), 시토카인(참고문헌: Abel and Czop, Intl. J. Immunopharmacol. 14 (8) : 1363-1373 (1992); Doita et al., J. Leuk. Biol. 14(2) : 173-183 (1991)) 및 산화적 버스트(burst)(참고문헌: Cain et al., Complement 4: 75-86 (1987); Gallin et al., Int. J. Immunopharmacol. 14(2) : 173-183 (1992))의 직접 유도를 보고해오고 있다. 대조적으로, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 산화적 버스트 활성(참고문헌: Mackin et al., FASEB J. 8:A216 (1994)), 시토카인 분비(참고문헌: Putsiaka et al,, Blood 82: 3695-3700 (1993)) 또는 증식(참고문헌: Wakshull et al., J. Cell. Biochem. suppl. 18A: 22 (1994))와 같은 백혈구 기능을 직접 활성화시키지 않는다. 대신에, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 2차 자극물에 의한 활성화를 위해 세포를 프라이밍시킨다 (참고문헌; Mackin et al. (1994); Brunke-Reese and Mackin, FASEB J. 8:A488 (1994); and Wakshull et al. (1994)).
β-글루칸의 생물학적 활성은 표적 세포에 있는 특이적 수용체를 통해 매개된다. 여러 개 그룹의 연구자들은 미립성 β(1-3)-글루칸 제제형과 결합하는 수용체를 기술하였다. 예를 들어, 미립성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체(예를 들어, 지모산류 입자)는 Czop 및 그의 동료(Czop and Kay, J. Exp. Med. 173: 1511-1520 (1991); Szabo et al., J. Biol. Chem. 270: 2145-2151 (1995)) 및 골드만(Goldman: Immunology 63(2): 319-324 (1988); Exp. Cell. Res. 174(2); 481-490(1988))에 의해 기술되었다. 백혈구 보체 수용체 3(CR3, 또한 MAC 1 또는 CD11b/CD18로 공지되어 있음)는 미립성 및 일부 용해성 β-글루칸 뿐만 아니라 그밖의 폴리사카라이드와 결합하는 기능을 지닌 것으로 밝혀졌다(참고문헌; Thornton et al., J. Immunol. 156: 1235-1246 (1996)). 용해성 아미노화된 β-글루칸 제제형은 쥐과동물 복막 대식세포와 결합하는 것으로 밝혀졌고(참고문헌: Konopski et al., Biochim. Biophys. Acta 1221: 61-65 (1994)), 인산화된 β(1-3)-글루칸 유도체가 단핵세포 세포주에 결합하는 것으로 보고되었다(참고문헌: Muller et al., J. Immunol. 156: 3418-3425 (1996)). 수용체 매개된 과정으로 여겨지는 과정을 통해 β(1-3)-글루칸에 식작용하는 연어 대식세포(참고문헌; Engstad and Robertsen, Dev. Comp. Immunol. 18(5): 397-408 (1994)) 및 뇌 소교세포(참고문헌: Muller et al., Res. Immunol. 145: 267-275 (1994))의 기능이 또한 기술되어 왔다.
공교롭게도, 각각의 그룹은 공급원, 제조 방법, 순도 및 특징화의 면에서 광범하게 다른 β-글루칸 제제형을 사용하였다. 또한, 둘 모두 1차 및 확립된 세포주인 상이한 세포 유형 및 종, 및 상이한 기능 해독이 사용되었다. 따라서, 이들 연구자에 의해 기술된 다양한 수용체 간의 관계는 규정되지 않았다고 하더라도, Czop에 의해 기술된 수용체가 CR3가 아니라는 것은 명백하다 (참고문헌: Szabo et al., (1995))
도 1은 시간 경과에 따른 사람 백혈구 막에 대한 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합율을 도시하는 그래프이다. 전체 결합율은 검은 원으로 연결된 실선으로 표시되며, 비특이적 결합율은 흰 사각형으로 연결된 점선으로 표시된다. 데이터 지점은 3개 샘플의 평균 ±표준 편차를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 사람 백혈구 막에 대한 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합의 농도 의존성을 도시하는 그래프이다. 도 2a는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 농도 변화에 따른 전체 결합율(실선, 검은 원), 비특이적 결합율(점선, 흰 사각형) 및 특이적 결합율(점선, 흰 마름모)를 도시한다. 데이터 지점은 3개 샘플의 평균 ±표준 편차를 나타낸다. 도 2b는 결합율 데이터의 스캐차드(Scatchard) 분석을 도시한다.
도 3은 사람 백혈구 막으로의 방사성 표지된 β(1-3)-글루칸의 결합에 대한 인큐베이션 온도의 효과를 도시하는 그래프이다. 전체 결합율은 음영이 있는 막대로 표시되고, 비특이적 결합율은 흰 막대로 표시된다. 데이터는 37℃에서의 전체 결합율(%)로 표현되고, 데이터 지점은 3개 샘플의 평균 ±표준 편차를 나타낸다.
도 4는 시간 경과에 따른 쥐과동물 대식세포주 BMC2.3 에서의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 의한 NF-κB 활성화를 대조군 및 리포폴리사카라이드와 비교한 자동방사선사진을 도시한다. NF-κB 에 대한 레인은 화살표로 표시되어 있다.
도 5는 시간 경과에 따른 쥐과동물 대식세포주 BMC2.3 에서의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 의한 NF-IL6 활성화를 대조군과 비교한 자동방사선 사진을 도시한다. NF-IL6에 대한 레인은 화살표로 표시되어 있다.
도 6은 경합 결합에 대해 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 엑소글루카나아제 처리한 효과를 도시하는 그래프이다.
도 7은 경합 결합하는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 능력에 대한 NaOH 처리의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 8은 글리신(pH 2.5) 또는 1M NaCl로 처리된 사람 백혈구 막의 결합에 대한 효과를 도시하는 그래프이다. 음영이 있는 칼럼은 염수 대조군을 나타내며; 점형 칼럼은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 샘플을 나타낸다.
도 9는 CHAPS로 전처리된 사람 백혈구 막의 결합에 대한 효과를 도시하는 그래프이다. 음영이 있는 칼럼은 염수 대조군을 나타내며; 점형 칼럼은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 샘플을 나타낸다. 흰 칼럼은 덱스트란 샘플을 나타낸다.
도 10은 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 막으로의 결합에 대한 2-메르캅토에탄올로 처리된 사람 백혈구 막의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 11은 사람 백혈구 막의 클로로포름/메탄올/HBSS 추출물의 특정 결합에 대한 효과를 도시하는 그래프이다.
도 12는 결합 활성에 대한 사람 백혈구 막의 나트륨 과요오드산염 전처리의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 13은 결합 활성에 대한 단백질이 부분 결실된 사람 백혈구 막의 나트륨 과요오드산염 전처리의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 14는 3가지 검정 형식에서 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 및 단일 나선의 경합을 비교한 그래프이다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 또는 단일 나선 글루칸은 96-웰 플레이트 중의 락토실 세라미드(LacCer)(삼각형), 재구성된 막 중의 락토실 세라미드(사각형) 또는 사람 백혈구 막(윈)에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 경합시키기 위해 지정된 농도로 사용되었다. 흰 기호는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 나타내고, 검은 기호는 단일 나선을 나타낸다. 최대 경합은 각각의 유형의 검정법에서 경합물질로 사용된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 최대 농도에서 발견되었다.
도 15는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 및 고분자량의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(Network)이 단일 나선 또는 라미나린 보다 96-웰 플레이트 검정법에서 락토실 세라미드에 대한 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 더욱 효율적으로 경합한다는 것을 보여주는 데이터의 그래프이다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(원), 단일 나선(검은 사각형), 라미나린(십자형) 및 고분자량의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(Network)(교차평행선이 그어진 사각형)은 96-웰 플레이트 검정법에서 락토실 세라미드(소과동물)에 대한 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 경합시키기 위해 지정된 농도로 사용되었다. "대조군 결합율(%)" 은 경합물질이 없이 결합하는 %를 의미한다.
도 16a 및 16b는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 사람 호중구에서 핵 전사 인자인 NF-κB 및 NF-IL6을 활성화시킨다는 것을 보여주는 사진이다. 도 16A는 핵 전사 인자 NF-κB에 대한 결과를 도시한다. 도 16b는 핵 전사 인자 NF-IL6에 대한 결과를 도시한다. 둘 모두의 경우, 정제된 사람 호중구를 유도제화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(3㎍/ml) 또는 덱스트란(3㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 60분 동안 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 핵 추출물을 제조하고, 단백질/DNA 복합체 형성을 전기영동적 이동성 시프트 검정법(EMSA)로 평가하였다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 대조군 또는 덱스트란 처리된 호중구로부터의 추출물에 비해 32P 표지된 올리고누클레오티드 프로브에 특이적인 NF-κB 또는 NF-IL6로의 핵 추출 단백질의 결합을 증가시켰다. 수평 화살표는 단배질/DNA 복합체의 위치를 표시한다.
본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 사람 백혈구 막(HLM)에 있는 신규한 수용체와 특이적으로 결합한다는 발견에 관한 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, 방사성표지된 유도체화된 수용성 β(1-3)-글루칸은 사람 백혈구 뿐만 아니라 다양한 쥐과동물 및 사람 세포 주에서 유래된 막 수용체에 이러한 β-글루칸이 결합하는 지를 측정하기 위해 사용되었다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체는 막에 대해 특정하고 포화성인 결합을 나타내며, 용해성 β-글루칸의 서브클래스에 대해 고도로 선택적이다. 본 발명의 결과는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 본 발명의 수용체를 특징화하고, 이 수용체를 미립성 또는 용해성 β-글루칸에 대한 종래의 β-글루칸 수용체와 구별하며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 생물학적 활성의 메카니즘에 대한 중요한 정보를 밝혀낸다.
또한 본 발명은 예를 들어, 수용체-포지티브 세포 즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 함유하는 세포에서 1종 이상의 전사 조절 인자를 변조시킴으로써, 신호 변환 경로를 변화(예를 들어, 활성 또는 탈활성)시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 1가지 구체예에 있어서, 신호 변환 경로는 NF-κB 및/또는 NF-IL6 및/또는 jun/fos 패밀리의 전사 조절 인자로부터의 1종 이상의 전사 조절 인자에 의해 변조 또는 조절된다. 예를 들어, 전사 조절 인자는 NF-κB, NF-IL6 또는 AP-1 일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 변화될 수 있는 그 밖의 신호 변환 경로에는 ras/raf-1/MAP 키나아제 경로, G-단백질/포스포리파아제 C/단백질 키나아제 C 경로, JAK/STAT 경로, 포스포리파아제 A 경로, G-단백질/포스포리파아제 D/포스파티드산 경로 및 c-AMP 의존성 경로가 있다. 각각의 경로에서, 신호 경로의 적합한 활성제 또는 지시제는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체와 결합함으로써 활성화되고, 이러한 결합이 변조되면 이에 대응하는 신호 변환이 변화될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 활성이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합에 의해 활성화됨으로써, 신호 변환 과정이 활성화되어, 1종 이상의 전사 조절 인자(예를 들어, NF-κB, NF-IL6 또는 jun/fos 패밀리로부터)가 활성화된다. 이들 전사 조절 인자의 활성화는 관련된 신호 변환 경로의 활성화를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 수용체의 활성화는 다른 것들 중에서 수용체 형태의 변화, 리간드-수용체 복합제의 형성, 또는 리간드-수용체 복합체의 변화를 포함할 수 있다. 다른 방법으로, 수용체의 활성은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합 및 활성화 능력을 모방하는 약물에 의해 개시될 수 있다. 특정한 구체예에 있어서, 전사 조절 인자는 리간드 결합의 결과로서 활성화된다. 또 다른 구체예에 있어서, 전사 조절 인자의 활성은 약물이 수용체에 결합함으로써(즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 배제시키나, 수용체를 활성화시키는 능력은 없음), 일부 또는 전부가 감소된다.
본 발명은 또한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체와 결합하는 것을 변화(증가 또는 감소)시키는 약물을 확인하기 위한 검정법에 관한 것이다. 본 발명의 검정법은 방사성표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 및 시험하려는 약물을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체에 결합하는 데 적합한 조건하에 조합시키는 것을 포함한다. 시험하려는 약물의 존재하에 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 수용체에 대한 이것의 결합 정도를 결정하고, 이를 시험하려는 약물의 부재하의 결합 정도와 비교한다. 결합 정도의 차이는 약물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체화 결합하는 것을 변화시킨다는 것을 나타낸다. 약물의 존재하의 결합 정도의 증가는 약물이 결합을 연장 또는 증가시키며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 작용물질임을 나타낸다. 약물의 존재하의 결합 정도의 감소는 약물이 결합을 단축 또는 감소시키며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 길항물질임을 나타낸다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 검정법에 의해 확인된 약물에 관한 것이며, 이에 따른 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 활성의 작용물질 및 길항물질에 관한 것이다.
또한 본 발명은 또한 전사 조절 인자의 활성화와 같은 세포성 신호 변환 경로에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)시키는 약물을 확인하기 위한 신규한 검정법에 관한 것이다. 이 검정법은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 및 시험하려는 약물을, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 이것의 수용체로의 결합이 일어나는 조건(즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합하는데 적합한 조건)하에 조합시키는 것을 포함한다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체에 결합하면 수용체가 활성화되고, 이에 따라 NF-κB, NF-IL6 또는 jun/fos 패밀리로부터의 전사 인자와 같은 1종 이상의 전사 인자의 변조에 의해 예증 또는 측정되는 신호 변환을 활성화시킨다. 시험하려는 약물의 존재하의 선택된 전사 조절 인자의 활성화 정도를 결정하고, 시험하려는 약물의 부재하의 선택된 전사 조절 인자의 활성화 정도와 비교한다. 활성화 정도의 차이는, 약물이 전사 조절 인자의 활성화에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 변화시킨다는 것을 나타낸다. 약물의 존재하의 전자 조절 인자의 활성화의 증가는 약물이 활성화를 증강 즉, 연장 또는 증가시킨다는 것을 나타낸다. 약물의 존재하의 전사 조절 인자의 활성화의 감소는 활성화를 저하 즉, 단축 또는 감소시킨다는 것을 나타낸다.
본 발명의 검정법 및 방법은 전염병, 염증, 자기면역 질병, 국소빈혈 재관류 손상, 암, 천식 및 과민성 질환의 치료에 사용되는 약물 및 약제(drug)를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 또한 본원에 기술된 검정법 및 방법은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 연장시키는 약물을 확인하기 위해 이용될 수 있으므로, 예를 들어, 면역변조, 조혈, 전염병의 예방 및 치료, 혈소판 생성, 말초혈전구체 세포 부동화 및 창상 치료와 같은, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 사용될 수 있는 치료 또는 예방 분야에서 사용될 수 있다. 이들 약물 또는 약물은 예를 들어, 글루칸의 이것의 수용체로의 결합 및 이것의 효과를 연장시킴으로써 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 증강시키는 작용을 한다.
또한 본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 상의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 결합 부위와 관련하여 고안된 펩티드 또는 작은 유기 분자와 같은 약물 또는 약제에 관한 것이지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 이러한 약물 또는 약제는 이들이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 결합함으로써, 수용체와 결합하여 신호 변환과 같은 다운 스트림 사건의 활성화를 감소시키는데 이용가능한 β(1-3)-글루칸의 양을 감소시킨다는 점에서 수용체 결합 부위의 활성을 모방하도록 고안될 수 있다. 또한 본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체와 결합하여 활성화시키는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 활성의 작용물질 또는 모방물질에 관한 것이다. 다른 방법으로, 약물 또는 약제는 수용체 결합 부위와 결합하도록 고안될 수 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 의해 결합되지 않게 된다. 또한 본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합 활성의 길항물질에 관한 것이다.
본 발명은 다수의 분야에 적용된다. 예를 들어, 본 발명은 시판을 위한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 제조 방법 및 제품 특징화를 모니터링하고, 유체 중의 β-글루칸을 측정하고, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체와 상호작용하는 약물의 구조-활성 관계를 평가 및 결정하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 약물 및 소형 분자를 포함하는 다양한 약물을 말초 다형핵 백혈구, 단핵세포, 대식세포 및 상피 세포와 같은 수용체-포지티브 세포에 표적화 전달시키는데 이용된다. 또한 본 발명은 수용체-포지티브 세포 및 수용체-네거티브 세포 둘 모두를 증가시키기 위한 정제 설계에서 이용될 수 있을 뿐만 아니라 진단용 항-수용체 항체를 발생시키는데 이용될 수 있다.
본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(참조: 1992년 8월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제 07/934,015호, 이 출원의 내용은 본원에 참고로 포함되어 있음)이 사람 백혈구 막(HLM)에 있는 신규한 수용체와 특이적으로 결합한다는 발견에 관한 것이다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 미국 특허 출원 제 08/400,488호, 제 08/432,303호, 제 07/934,015호, 제 08/373,251호 및 08/469,233호 및 미국 특허 제 5,322,841호, 제 5,488,040호 및 제 5,532,223호에 기재되어 있다. 본 발명은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(또한 PGG-글루칸으로 공지됨)에 대한 수용체를 특징화하고, 이 수용체를 종래의 β(1-3)-글루칸 수용체와 명확히 구별하며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 생물학적 활성에 대한 중요한 정보를 밝혀낸다.
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체는 사람 혈액 세포, 상세하게는 호중구 및 단핵 백혈구(단핵세포 및 림프구)에 주로 존재한다. 본원에서 사용되는 "수용체" 는 통상적인 수용체 분자 뿐만 아니라 결합 부위를 포함하고자 하며, 이러한 결합 부위는 자체 효과를 가질 수 있거나, 제 2 분자 또는 결합 부위를 유도 또는 활성화시켜 효과를 발생시킬 수 있다 [또한 제 2 부위의 "언마스킹(unmasking)으로 공지됨"; 참고문헌: Sandberg et al , Infect Immun. 63(7) : 2625-263l (1995)]. 본원에 사용된 " 수용체 "란 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 친화력을 지닌 화합물을 포함하고자 하며, 이들 화합물은 수용체 모방물질 또는 수용체 유사물질일 수 있고, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 합성될 수 있다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체는 β(1-3)-글루칸, 특히 3중 나선 형태의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 선택성을 나타낸다.
방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 경합하는 능력을 시험하기 위해 다양한 폴리사카라이드가 시험되었다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체는 β(1-3)-글루칸을 덱스트란, 만난, 글리코겐 및 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 비-β(1-3)-글루칸과 구별시킨다 (표 1). 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 샘플은 비특이적인 결합을 나타낸다. 아미노화된 글루칸은 커들란(curdlan)의 환원 아미노화에 의해 제조되며, 이는 롤프 셀젤리드(Rolph Seljelid, 노르웨이에 소재한 Tromso, Tromso 대학)에 의해 제공되었다. 엑소글루카나아제 샘플의 경우, 비표지되고 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 엑소글루카나아제로 처리한 다음, 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 경합시키기 위해 사용하였다. 항-이디오타입 항체는 마우스 단클론성 항-라미나린 항체에 대해 발생시킨 토끼 단클론성 항-유전자형 항체였다 [참고문헌: Czop et al., J. Immunol. 145(3): 995-1001 (1990)], β(1-3)-글루칸, 라미나린 및 아미노화된 글루칸이 사람 백혈구 막에 있는 수용체와 결합하는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 억제하지 않는다는 결과는 또한 이러한 폴리사카라아드 그룹의 선택성을 나타낸다.
표 1
사람 백혈구 막에 결합하는 3H-PGG-글루칸에 대한 다양한 인큐베이션 조건의 효과
비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(1mg)은 효소의 열 불활성화 전에 또는 후에 밤새 50℃에서 0.13 단위의 1,3-엑소글루카나아제(페니실리움 피노피룸(Penicillium pinophilum 으로부터 부분 정제됨)로 처리되었다. 다음, 사람 백혈구는 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(0.2 mg/ml)의 존재 또는 부재하에 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 함께 인큐베이팅되었다. 대조군으로서, 엑소글루카나아제가 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 부재하에 결합 반응에 첨가되었다. 결과는 도 6에 도시되어 있다.
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 (1 mg/ml)은 실온에서 30분 동안 1M의 NaOH로 처리된 다음, 0.1 mg/ml로 희석되었다. 분해된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 함유하는 겔 투과 크로마토그래피 단리된 분획은 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합의 경합에 대해 검정되었다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 및 분해된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 둘 모두 결합 검정에서 23 ㎍/ml으로 사용되었다.
사람 백혈구 막은 HBSS, 0.1M 글리신(pH 2.5) 또는 1M NaCl의 존재하에 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이팅된 다음, 4℃에서 60분 동안 180,000 x g로 원심분리에 의해 펠릿화되고, 세척되어, 결합 검정에서 사용되었다. 180,000 x g 스핀의 상등액은 단백질 함량에 대해 분석되었고 (BCA 시약, Pierce), 결과는 전체 단백질의 12% 및 20%가 HBSS 대조군을 초과하여 염 및 글리신 처리된 막으로부터 각각 방출됨을 나타내었다. 결과(도 8에 도시됨)는 높은 염 및 낮은 pH가 사람 백혈구 막으로의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합을 변조시키지 않음을 나타낸다. 따라서, 결합은 말초 단백질을 제거시키는 조건에 의해 영향을 받지 않는데, 이는 결합 부위가 말초 단백질이 아닐 것임을 암시한다.
사람 백혈구 막은 얼음 위에서 5분 동안 0.25%의 CHAPS의 존재 또는 부재하에 인큐베이팅된 다음, 4℃에서 45분 동안 180,000 x g로 원심분리되었다. 펠릿은 표시된 바와 같이 1 mg/ml의 최종 농도로, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 또는 덱스트란(평균 분자량 71,000, Sigma Chemical Co., MO)과 함께 결합 검정에 사용되었다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 특정한 결합의 유사한 증대는 세제 옥틸글루코시드에 의해 나타났다. 이들 결과는 결합 부위가 막의 소수성 부분과 관련된 영역을 아마도 함유함을 나타낸다.
결합 검정은 도 10에 표시된 농도(0, 0.1 및 1M)에서 2-메르캅토에탄올의 존재하에서 수행되었다. 유사한 결과는 동일한 농도의 디티오트레이톨(DTT)가 사용된 경우에도 수득되었다. 결합에 영향을 미치는데 고농도의 환원제가 필요하다는 것은 결합 부분이 결합에 필수적인 쉽게 이용가능한 이황화물 결합을 함유하지 않음을 나타낸다.
사람 백혈구 막은 실시예에 기재된 바와 같이 클로로포름/메탄올/HBSS(3:2:1)로 추출되었다. 단백질-감소된 분획은 최종 농도 1mg/ml의 도 11에 표시된 경합물질인 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 또는 덱스트란과 함께 결합검정(비오일/수크로오스 법)에 사용되었다. 이들 결과(도 11에 도시되어 있음)는 결합 부분이 클로로포름/메탄올 처리에도 잔존함을 나타낸다.
사람 백혈구 막(500㎍ 단백질)은 실온에서 도 12에 표시된 농도(10 및 100mM)에서 30분 동안 나트륨 과요오드산염과 함께 인큐베이팅되고, 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리되고, 린싱되어, 결합 검정(비오일/수크로오스; 도 12 참조)에 사용되었다. 단백질 결핍된 막(1.87mg의 사람 백혈구 막 단백질에서 유래됨)은 0.1M의 나트륨 과요오드산염 중에서 인큐베이팅되고, 전술한 바와 같이 처리되었다(도 13).
결과는 수용체가 막의 염 또는 낮은 pH 전처리에 의해 영향을 받지 않으며, 막의 세제 전처리에 의해 강화된다는 것을 보여준다. 결합 활성은 나트륨 과요오드산염 처리 및 고농도의 환원제에 의해 저하된다. 또한, 결합 부위는 클로로포름/메탄올/물로 추출가능한 것으로 여겨진다. 종합해보면, 이들 데이터는 결합 부위가 말초 단백질이 아닐 것이며, 막의 소수성 부분과 관련된 영역을 아마도 함유함을 나타낸다. 결합에 대한 나트륨 과요오드산염의 효과는 유도체화되지 안은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 막 표적인 당접합체일 수 있음을 나타내며, 이는 결합 부분이 클로로포름/메탄올 처리에도 잔존한다는 결과와 일치한다. 당접합체의 탄수화물 부분은 단백질, 지질 또는 둘 모두와 관련될 수 있고, 당지질 또는 당단백질인 당접합 수용체는 당분야에 공지되어 있다 [참고문헌: Sandberg et al., Infect. Immun. 63(7) : 2625-2631 (1995)].
다양한 세포주 및 사람 조직에 걸친 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 분포는 다양한 세포 유형에서 유래된 막으로 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합을 평가함으로써 측정하였다. 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합의 양은 평균 ±표준 편차 (ng/mg 막 단백질)로서 표현된다. 비특이적 결합은 100 배를 넘는 과량의 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 존재하에 결합된 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸으로서 규정된다. 특이적 결합은 (전체 결합) - (비특이적 결합)에 의해 측정되며, 표 2 중의 괄호 안의 숫자는 전체 결합율을 나타낸다. 보체 수용체 3(CR3)의 정량은 형광 표지된 항-CD11b를 사용하는 유량 세포측정에 의해 수행되었고, 데이터는 평균 채널 형광도(MCF)(임의 형광 단위)로서 표현되며, 이소타입 대조군에 대한 바탕값(background)은 감산하였다. 호중구 샘플은 조직학에 의한 호중구의 95% 이상이었다. 단핵 세포 샘플은 조직학에 의한 단핵 세포의 약 40 내지 50% 였다.
사람 말초혈에서 수용체를 발현하는 우세한 세포 유형은 호중구이며, 단핵백혈구(단핵세포 및 림프구)는 호중구의 측정된 발현치의 20% 미만을 발현시킨다. 사람 단핵세포주 U937은 검출가능한 양의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 결합하지 않는 반면에, 쥐과동물 대식세포주 BMC2.3(미국 매사추세츠 보스톤에 소재한 Dana-Farber 암 협회의 케네쓰 록(Kenneth Rock) 박사), RAW264.7 (ATCC) 및 P388D(1) (ATCC)는 가변량의 결합 활성을 발현한다. 이들 3가지 세포주를 유량 세포측정에 의해 CR3 발현에 대해 검정한 경우, P388D(1) 세포는 CR3가 없는 것으로 발견되었다. 따라서, 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 CR3 발현은 아무런 상관성이 없었다. 이러한 결과와 일치하게, CR3가 혈액 단핵세포에서 고도로 발현되는데, 이 CR3는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합 활성을 거의 지니지 않는다는 사실이 존재한다. 최종적으로, 쥐과동물 B 및 T 세포주(각각 LP27.4 및 DO11)는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 결합하지 않았다.
표 2
다양한 세포 유형에 대한 3H-PGG 글루칸 결합
방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 (1㎍/ml)을 사람 백혈구 막 (2mg/ml)과 함께 인큐베이팅시킨 경우, 결합의 발생을 위한 주위 온도에 대한 현저한 의존성이 입증되었다 (도 3). 유사한 결과는 22℃ 인큐베이션이 4 시간으로 연장된 경우 또는 인큐베이션이 4℃에서 수행된 경우에 수득되었지만, 비특이적 결합은 온도에 의해 영향을 받지 않았다.
방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합 활성은 β(1-3) 특이적 엑소글루카나아제에 민감한데, 이는 리간드의 결합 활성이 β(1-3)-글루칸임을 나타낸다. 그러나, 결합은 Czop의 항-이디오타입 항체(1990) 또는 항-보체 수용체 3 항체(참고문헌: Diamond et al., J. Cell Biol. 120: 1031-1043(1993))에 의해 억제되지 않는다. 이러한 데이터는 아미노화된 글루칸에 의해서도 억제되지 않는다는 것과 함께, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 신규한 백혈구 탄수화물 수용체임을 나타낸다.
사람 백혈구 막에 결합하는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 시간 및 농도 의존성은 다양한 시간 동안 37℃에서 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 (1000㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에, 1㎍/ml의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 2.5mg/ml의 사람 백혈구 막과 함께 인큐베이팅시킴으로써 결정되었다. 결합된 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 이중층 밀도 구배를 통한 원심분리레 의해 결합되지 않은 리간드와 분리되며, 막 펠릿이 용해되어, 방사성이 측정된다. 평형결합은 1㎍/ml의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 농도에서 37℃에서 60분 후에 달성되었다 (도 1).
사람 백혈구 막에 결합하는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 농도 의존성은 37℃에서 60분 동안 50배를 넘는 비표지된 수용성 β(1-3)-글루칸의 존재 (비특이적 결합) 또는 부재(전체 결합)하에, 2.2mg/ml의 사람 백혈구 막을 증가하는 농도의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 함께 인큐베이팅시킴으로서 결정되었다. 막 관련된 방사성은 실시예에 기재된 바와 같은 수크로오스/오일 밀도 구배를 통해 반응 혼합물을 원심분리시킨 후에 결정되었다. 특이적 결합은 전체 결합에서 비특이적 결합을 감산함으로써 계산되었다. 데이터는 방정식 B = Bmax(S/(S+Km)에 대한 선형 회귀 분석에 의해 조정되었으며, 이 방정식에서, B는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이고, Bmax는 최대 결합이고, S는 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 농도이고, Km은 최대 결합의 1/2에서의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 농도이다. 포화 결합은 약 2.5㎍/ml의 농도에서 달성되었다 (도 2a). 스캐차드 분석 (도 2b)는 1nM의 겉보기 친화력 및 약 56fm/mg 단백질의 최대 결합을 나타내었고, 겉보기 분해 상수는 약 12nM 이다.
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 의한 1개 이상의 전사 조절 인자의 변조에 의해 예증되는 신호 변환의 활성을 평가하기 위해, BMC2.3 세포가 37℃에서 다양한 시간 동안 3㎍/ml의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 함께 인큐베이팅되었다. 핵 추출물이 제조되고, NF-κB 또는 NF-IL6에 특이적인 32P 표지된 DNA 올리고누클레오티드와 함께 인큐베이팅되었다. 단백질-P DNA 복합체가 겔 전기영동(전기영동적 이동성 시프트 검정, EMSA)에 의해 결합되지 않은 32P DNA와 분리되었다. 결과(도 4 및 5)는 단백질-DNA 복합체의 시간 의존적 증가를 보여주며, 이는 이들 전사 인자가 유도체화되지 많은 수용성 β(1-3)-글루칸에 의해 활성화됨을 나타낸다. 비표지된 DNA 프로브에 의한 이러한 복합체의 형성의 억제 및 돌연변이체 프로브에 의한 억제의 결핍은 이러한 상호작용의 특이성을 입증한다 (데이터는 도시되지 않음).
정제된 사람 호중구는 37℃에서 60분 동안 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 (3㎍/ml) 또는 덱스트란 (3㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 인큐베이팅되었다. 핵 추출물이 제조되고, 단백질/DNA 복합체 형성이 전기영동적 이동성 시프트 검정(EMSA)에 의해 측정되었다. 도 16a 및 16b에 도시된 바와 같이, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 대조군 또는 덱스트란 처리된 호중구로부터의 추출물에 비해 NF-κB 또는 NF-IL6 특이적인 32P 표지된 올리고누클레오티드에 대한 핵 추출 단백질의 결합을 증가시켰다.
수용성 및 미립성 β(1-3)-글루칸이 둘 모두 종래에 기술되었다고 하더라도, 사람 백혈구 막에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 이것의 수용체의 결합 상호작용의 특징은 본원에 기술된 β-글루칸 수용체가 종래의 수용체와는 다른 분자체임을 나타낸다.
Czop에 의해 기술된 미립성 β(1-3)-글루칸 수용체는 사람 단핵세포 및 U937 세포에서 발견된다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합은 말초 다형핵세포(PMN)에 비해 단핵세포에서는 근소하며, 결합은 U937 세포에서는 발견되지 않았다. 또한, 글루칸 결합 부위를 점유하는 것으로 여겨지는 Czop (1990)에 의해 생성된 항-이디오타입 항체는 단핵세포에서 글루칸 입자 식작용을 효율적으로 억제하는 반면에, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합을 억제하는데 비효율적이다.
쥐과동물 복막 대식세포에 존재하는 아미노화된 글루칸에 대한 수용체(참고문헌: Konopski et al., (1994)는 4℃에서 기술된 아미노화된 글루칸에 결합하는 반면에, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 실온 이하에서 이것의 수용체와 결합하지 않는다. 또한, 용해성 아미노화된 글루칸의 샘플은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합하는데 경합하지 않았다 (표 1).
토른톤(Thornton) 등(1996)에 의해 기술된 CR3의 β(1-3)-글루칸 결합 활성은 CR3의 I-도메인에 대해 유도된 단클론성 항체에 의해 억제된다. 이러한 항체 중의 하나는 OKM1 이며, 이것은 종래의 시스템에서는 글루칸 결합을 억제하였지만, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합에 대한 억제 효과는 지니지 않았다. 사람 말초혈 PMN은 단핵세포에 비해 5 내지 10배 이상 특이적인 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합을 지녔지만, PMN 및 단핵세포는 둘 모두 고수준의 CR3를 발현시키는 것으로 공지되어 있다.
보다 최근에는, U937 세포에서 극히 고수준으로 발현되는 β-글루칸의 인산화된 유도체에 대한 수용체가 기술되었다 (참고문헌: Muller et al., J. Immunol. 156: 3418-3425 (1996)). 또 다시, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합이 U937 막에서 관찰되었다.
골드만(Goldman) 등 (참고문헌: Exp. Cell. Res. 174(2) : 481-490 (1988))에 의해 기술된 미립성 β-글루칸 수용체는 크기가 2,000 내지 4,000 달톤인 용해성 글루칸에 의해 억제될 수 있는 반면에, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합은 라미나린(분자량: 약 5,000 달톤) 또는 분자량이 18,000 달톤인 β-글루칸의 단일 사슬 이형태체에 의해 억제된다. 골드만 등의 수용체는 레티노산 또는 1α,25-히드록시비타민 D3에 의한 유도 후에만 발현되는 반면에(참고문헌: Goldman, Immunology 63(2): 319-324 (1988)), 유도체화된 수용성 β(1-3)-글루칸은 유도되지 않은 P388D(1) 세포와 결합한다. 연어 대식세포에 의한 글루칸 입자의 식작용은 고농도(800 μM)의 라미나리헵토오스(참고문헌: Engstad and Robertsen (1994))에 의해 거의 완전하게 억제될 수 있지만, 이러한 라미나리헵토오스는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합에 대해서는 효과가 없었다(데이터는 도시되지 않음).
본원에 기술된 바와 같이, 폴리스티렌 96-웰 플레이트 상에 부동화된 수 개의 글리코스핑고리피드는 락토실 세라미드(LacCer)(다양한 공급원으로부터), 갈락토실 세라미드(GalCer), 글로보트리아실 세라미드 및 아시알로간글리오시드-GM1을 포함하는 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 현저한 특이적 결합을 나타낸다 (표 3 참조). 이들 화합물은 공통적으로 말단 갈락토오스를 가지며, 이로써 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 글리코스핑고리피드 사이의 결합 상호작용에 관여할 수 있다. 그러나, 말단 갈락토오스만으로는 결합에 불충분한데, 그 이유는 사이코신(1-갈락토실 스핑고신)이 감지가능한 정도의 결합을 나타내지 않기 때문이다. 이러한 화합물은 세라미드의 지방산 부분이 없다.
LacCer 중의 수 개의 지방산 구조가, 표 4에 HLM으로부터의 HPLC 분획화된 LacCer로 도시된 바와 같이, 3H-유도체화되지 않은 수용성 글루칸의 결합을 지지할 수 있다고 하더라도, C18:1 스핑고신에서 발견되는 탄소-탄소 이중 결합이 결합에 매우 중요한데, 이는 시판되는 디히드로-스핑고신 LacCer가 결합하지 않기 때문이다.
3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 LacCer로의 결합은 HLM에 의한 결합과 유사하게 또한 온도 의존성인 것으로 발견되었다. 결합은 표 5에 나타난 바와 같이 4℃가 아닌 37℃에서 일어난다. 온도 특이성은 LacCer의 2개의 상이한 공급원에 의해 나타났다.
3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합에 대한 경합의 이형태체특이성은 HLM에 의해 종래에 기술된 특이성과 또한 유사하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 96-웰 검정 및 재구성 검정 둘 모두에서 동일한 정도로 HLM 및 LacCer로의 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합과 경합한다. 대조적으로, 단일 나선(SH) 글루칸은 어떠한 검정에서도 효율적으로 경합하지 않는다. 또한, 네트워크(Network), 즉, 3중 나선 구조로 주로 존재하고 분자량이 1백만을 넘는 글루칸을 포함하는 글루칸 제제형은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 유사하게 경합하는 반면에, 라미나린은 96-웰 플레이트 검정에서 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 결합을 위해 효율적으로 경합하지 않는다 (도 15 참조).
표 3
96-웰 플레이트 검정에서 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(PGG-글루칸)의 다양한 스핑고리피드로의 특이적 결합
표 4
96-웰 플레이트 검정에서 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(PGG-글루칸)의 규정된 구조를 갖는 LacCer로의 특이적 결합
표 5
락토실 세라미드에 대한 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(PGG-글루칸)의 특이적 결합의 온도 의존성
표 6
GalCer II에 대한 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(PGG-글루칸) 결합의 경합
전술된 결과로부터, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 생체내 수용체는 LacCer인 것으로 여겨진다. 그러나, 전술된 바와 같이 시험된 그 밖의 화합물은 또한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 친화력을 지니는데,이들 화합물은 본원에 사용된 "수용체" 란 용어에 포함시키고자 한다. 예를 들어, 이들 화합물은 본원에 기술된 검정에서 LacCer 수용체 대신 사용될 수 있다. 이러한 연구로부터, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 화합물의 친화력을 결정하는 다음의 3가지 특징이 있는 것으로 여겨진다: 화합물의 지방산 사슬의 길이, 화합물중의 말단 갈락토오스의 존재, 및 화합물의 스핑고신 부분 중의 이중 결합의 존재 또는 부재. 상세하게는, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 친화력을 지니는 본원에 있는 화합물은 길이상 약 16 내지 약 24개의 탄소를 갖는 지방산 사슬을 가지며, 말단 갈락토오스를 함유하며, 스핑고신 부분 중에 이중 결합을 함유한다. 그러나, 16개 보다 적고 24개 보다 많은 탄소를 갖는 화합물이 또한 본 발명에 의해 의도된다. 또한, 본원에 사용된 "말단 갈락토오스"는 변형되지 않은 갈락토오스 뿐만 아니라 술폰화 갈락토오스와 같이 유도체화 또는 변형된 갈락토오스를 포함하고자 한다. 따라서, 이들 특징을 갖는 화합물은 본 발명에 포함되며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 친화력을 갖는 그 밖의 화합물과 함께 본원에 기술된 방법에서 사용하는데 적합하다.
본원에 기술된 연구의 결과로써, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 제조 방법을 모니터링하고, 생성물을 특징화할 수 있다. 즉, 시험 샘플은 표준 경합 수용체 결합 검정에 포함될 수 있어서, 수용체에 대한 상대적 친화력의 면에서 분자가 특징화된다. 이러한 특징화는 하기 특징의 일부 또는 전부에 대한 정보를 제공할 것이다: 배치 대 배치 특성, 특정 형태의 β(1-3)-글루칸으로서 생성물의 확인 및 생성물의 순도.
본원에 기술된 연구의 또 다른 결과로서, 유체중의 β-글루칸을 측정하기 위해 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 사용할 수 있다. 시험 샘플은 표준 포획 또는 경합 검정에 포함되어, 공지된 β-글루칸 표준에 의해 생성된 표준 곡선과 비교될 수 있다. 본 발명의 방법은 진균혈증에 대한 진단법으로서 혈청, 혈장, 소변, 활액, 뇌척수액, 폐 세정, 담즙 및 그 밖의 체액 중의 용해성 β-글루칸을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 또한 이 방법은 진균 오염을 시험하기 위해 식품 제조 공정에서 β-글루칸 수준을 측정할 뿐만 아니라, 효모 발효를 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.
시험 샘플은 또한 표준 포획 또는 경합 검정에 포함되어, 구조-활성 관계를 밝히기 위해 표준 샘플과 비교될 수 있다. 대안적으로, 시험 샘플 결합은 방사성표지후 즉시 시험될 수 있다. 또한 샘플은 이들 기능의 억제 또는 자극에 대한 시험을 위해 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 수용체 매개된 검정에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정은 중합체 또는 소형 분자 수용체 작용물질의 발생에 이용될 수 있거나, 예를 들어 면역억제 치료 도중에 기회성 진균 감염의 결과로서 발생할 수 있는 이식편 거부를 억제하기 위해서와 같이, 부적합한 면역증강을 억제하는 수용체 길항물질을 발생시키기 위해 이용될 수 있다.
본원에 기술된 발견은 또한 다양한 약물을 수용체-포지티브 세포에 표적 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 약물은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 컨쥬게이팅(예를 들어, 화학 컨쥬게이팅, 교차결합 또는 공유결합)되어, PMN 및 대식세포와 같은 수용체-포지티브 세포에 표적화될 수 있는 접합 분자를 생성시킬 수 있다. 이러한 표적화된 전달 시스템은 내성 세포내 병원체(예를 들어, 미코박테리움, 레슈마니아, 말라리아)에 대한 항균제, 유전자 치료(예를 들어, 기능부전 효소에 대한 증강된 시토카인 생성 또는 대체)용 유전자 또는 특정 항체의 증강된 제시 및 생성 또는 T 세포 활성화를 위한 항원과 같은 약물의 전달을 강화시키기 위해 사용될 수 있다.
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 이것의 수용체로의 특이적 결합은 수용체-포지티브 및 수용체-네거티브 세포(즉, 수용체를 함유하지 않는 세포) 모두의 정제 방법을 제공한다. 예를 들어, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸은 고체 매트릭스에 고정되어, 수용체-포지티브 세포를 포지티브하게 선택하거나 수용체-네거티브 세포를 네거티브하게 선택하기 위해 친화성 매트릭스로 사용될 수 있다. 유사하게, 항-수용체 항체는 부동화되고 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 대신 사용될 수 있다. 이 방법에 의해 정제된 세포는 세포 치료에서 사용하기 위해 계속 증식될 수 있다.
또한, 본 발명은 진단용 항-수용체 항체를 생성시킬 수 있다. 단클론성 또는 다클론성 항체는 표준 기법에 의해 부화 또는 정제된 수용체 제제형을 사용하여 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체와 결합하는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 기술된 수용체에 결합하는 다클론성 및 단클론성 항체는 본 발명의 범위에 포함된다. 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유동물은 면역원 형태의 수용체(즉, 항체 반응을 유도할 수 있는 수용체의 항원성 부분)로 면역될 수 있다. 면역원성을 부여하기 위한 기법에는 예를 들어, 담체에 대한 접합 또는 당분야에 널리 공지된 그 밖의 기법이 있다. 항원은 보조제의 존재하에 투여될 수 있고, 면역화의 경과는 혈장 또는 혈청 중의 항체 역가의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. ELISA 또는 그 밖의 면역검정은 항체의 수준을 평가하기 위해 항원으로서 면역원과 함께 이용될 수 있다. 본원에 기술된 당지질 수용체에 대한 항체는 예를 들어, 코사사이엘락 등(Koscielak et al.; Immunochemistry 5: 441 (1968)), 하코모리(Hakomori; Methods of Enzymol. 28: 232-236 (1972)) 및 마커스와 재니스(Marcus and Janis; J. Immunol. 104: 1530 (1970))에 기재된 기법과 같은 표준 기법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 항체는 질병 병리학(예를 들어, 잠복성 진균 감염에 대한 반응 또는 국소빈혈)을 반영하는 수용체-포지티브 또는 수용체-네거티브 세포 집단의 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 예를 들어, 수용체-포지티브 세포, 즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 함유하는 세포에서 전사 조절 인자를 변조시킴으로써, 신호 변환 경로를 변화(예를 들어, 활성 또는 탈활성)시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 1가지 구체예에 있어서, 전사 조절 인자는 전사 조절 인자의 NF-κB 및/또는 NF-IL6 및/또는 jun/fos 패밀리에서 유래한다. 예를 들어, 전사 인자는 NF-κB, NF-IL6 또는 AP-1 일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 유도체화된 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 활성은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합을 통해 활성화됨으로써, 전사 조절 인자(예를 들어, NF-κB, NF-IL6 또는 jun/fos 패밀리에서 유래함)에 의해 조절되는 신호 변환 경로가 활성화된다. 수용체의 활성화는 다른 것들 중에서 수용체 형태의 변화, 리간드-수용체 복합체의 형성 또는 리간드-수용체 복합체의 변화를 포함할 수 있다.
대안적으로, 수용체의 활성은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합 및 활성화 능력을 모방하는 약물에 의해 활성화될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 전사 조절 인자는 리간드 결합의 결과로써 활성화될 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 전사 조절 인자의 활성은 수용체에 결합하지만(즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 배제시킴), 수용체를 활성화시키는 능력은 없는 약물의 결합에 의해 일부 또는 전부가 감소된다.
본 발명의 방법에 의해 변화될 수 있는 그 밖의 신호 변환 경로에는 ras/raf-1/MAP 키나아제 경로, G-단백질/포스포리파아제 C/단백질 키나아제 C 경로, JAK/STAT 경로, 포스포리파아제 A 경로, G-단백질/포스포리파아제 D/포스파티드산 경로 및 c-AMP 의존성 경로를 포함한다. 각각의 경로에 있어서, 신호 경로의 적합한 활성제 또는 지시제는 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체에 결합함으로써 활성화되고, 이러한 결합의 변조는 이에 상응하는 신호 변환을 변화시킬 수 있다.
또한 본 발명은 전사 조절 인자의 활성화와 같은 신호 변환 경로에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 변화시키는 약물을 확인하기 위한 신규 검정법에 관한 것이다. 이러한 검정은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 및 시험하려는 약물을, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 이것의 수용체로의 결합이 일어나는 조건(즉, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합하는데 적합한 조건)하에 조합시키는 것을 포함한다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 이것의 수용체에 결합하면 수용체가 활성화되고, 이로써 NF-κB 및/또는 NF-IL6 및/또는 jun/fos 패밀리의 전사 조절 인자와 같은 전사 조절 인자에 의해 나타나는 바와 같이 신호 변환 경로가 활성화된다. 시험하려는 약물의 존재하에 선택된 전사 조절 인자의 활성화 정도가 결정되어(예를 들어, 실시예에서와 같이, 전사 조절 인자에 특이적인 방사성표지된 DNA 올리고누클레오티드를 사용하여), 시험하려는 약물의 부재하에 선택된 전사 조절 인자의 활성화 정도와 비교되며, 활성화 정도의 차이는 약물이 전사 조절 인자의 활성화에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 변화시킴을 나타낸다. 약물의 존재하에 전사 조절 인자의 활성화의 증가는 약물이 활성화를 증강, 즉, 연장 또는 증가시킴을 나타낸다. 약물의 존재하에 전사 조절 인자의 활성화의 감소는 약물이 활성화를 저하, 즉, 단축 또는 감소시킴을 나타낸다.
또한 본 발명은 탄수화물과 당지질 사이의 상호작용의 특이성을 평가하기 위한 검정 또는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 선택된 탄수화물과 선택된 당지질은 탄수화물과 당지질 사이의 상호작용에 적합한 조건하에 조합되어, 탄수화물과 당지질 사이의 상호작용 정도가 측정된다. 이러한 상호작용 정도는 또다른 당지질 또는 탄수화물의 존재하에 선택된 당지질 및 선택된 탄수화물 사이의 상호작응 정도와 비교된다.
예를 들어, 선택된 탄수화물에 대한 특정 당지질의 친화력을 결정하기 위해, 이 둘은 적합한 조건하에 조합되어, 상호작용 정도가 측정된다. 전형적으로, 상호작용은 결합일 것이다. 그런 다음, 상호작용 정도는 선택된 경합물질 탄수화물의 존재하에 상호작용 정도와 비교된다. 이러한 방식으로, 당지질과 선택된 탄수화물 사이의 상호작용의 특이성은 당지질과 경합물질 탄수화물 사이의 상호작용과 비교될 수 있고, 상대적 특이성이 측정될 수 있다.
유사하게, 선택된 당지질에 대한 특정 탄수화물의 친화력을 결정하기 위해, 이 둘은 적합한 조건하에 조함되어, 상호작용 정도가 측정된다. 그런 다음, 상호작용 정도는 선택된 경합물질 당지질의 존재하에 상호작용 정도와 비교된다. 이러한 방식으로, 탄수화물 및 선택된 당지질 사이의 상호작용의 특이성은 탄수화물 및 경합물질 당지질 사이의 상호작용과 비교될 수 있고, 상대적 특이성이 측정될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 당지질은 LacCer 이다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 탄수화물은 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 이다.
하기 실시예는 본 발명의 예시를 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 참고문헌의 내용은 본원에 참고로 포함되어 있다.
재료
락토실 세라미드(HLM)를 사람 백혈구 막으로부터 하기에 기재된 바와 같이 정제하였다. 모든 그 밖의 스핑고리피드, 세라미드 및 인지질을 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.; 미국 미주리주 세인트루이스 소재)으로부터 구입하였는데, 단, 락토실 세라미드(돼지)는 마트레야, 인코포레이티드(Matreya, Inc.; 펜실바니아, Pleasant Gap)로부터 구입하였다. 솔바블레[상표명: SOLVABLE]는 듀퐁, 넨(Dupont, NEN; 매사추세츠주 보스톤 소재)로부터 구입하였다. 96-웰 폴리스티렌 플레이트는 코닝(Corning; 뉴욕)으로부터 구입하였다.
방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 준비
유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(PGG-글루칸, 17mg; HPD0144, Alpha-Beta Technology, Worcester, MA)을 멸균된 발열원이 없는(SPF)수 중에서 72시간 동안 실온에서 NaIO4(225mg; Sigma, St. Louis, MO)와 함께 인큐베이팅시켰다. 50mg의 글리세롤을 첨가함으로써 과요오드산염을 켄칭(quench)시켰다. 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 SPF수에 대해 투석시킨 다음, 100 mCi의 NaBH(뉴잉글랜드 누클리어, 매사추세츠주 보스톤 소재)로 환원 표지화시켰다. 방사성 표지된 유도체화된 수용성 β(1-3)-글루칸을 투석(10 K 컷-오프) 및 한외여과에 의해 삼중수소화된 저분자량 부산물과 분리시켰다. 표지된 생성물의 순도를 겔 투과 크로마토그래피에 의해 평가하였다.
사람 호중구의 준비
신선한 전혈을 항응고제로서 산 시트레이트 덱스트로오스를 사용하여 정상 사람 지원자로부터 채취하였다. 덱스트란 침강후에, 세포를 원심분리시키고(400 x g, 7분), 자가 조직 혈장 중에 재현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 피콜(Ficoll) 구배(림프구 분리 배지; Organon Teknika, Durham, NC) 상에 적층시키고, 원심분리시켰다(400 x g, 30분). 펠릿으로부터 회수된 세포를 저장성 용해시켜 잔여 RBC를 제거하였다. 남아있는 세포는 형태학 표준에 의해 판정하여 95%를 넘는 호중구였다.
사람 백혈구 막의 준비
사람 도너로부터의 담황갈색 피복 세포(적십자, Dedham, MA)을 실온에서 15 내지 20분 동안 3% 덱스트란 중에 인큐베이팅시켜, 적혈구와 백혈구를 분리하였다. 백혈구-풍부 상등액을 펠릿화시키고(500 x g, 7분), 얼음 냉각된 포스페이트 완충염수(PBS; Life Technologies, Grand Island, NY) 중에서 1회 세척하였다. 모든 후속 조작을 4℃에서 수행하였다. 남아있는 적혈구를 저장성 용해에 의해 제거하고, 원심분리(850 x g, 7분)하여 백혈구를 회수하였다. 세포 펠릿을 약 3 내지 4 x 부피 PBS 중에 재현탁시키고, 프로테아제 억제제를 첨가하였다 (5 mM EDTA, 40㎍/ml 아프로티닌, 1μM 펩스타틴 A, 1㎍/ml 루펩틴, 50 μM PMSF). 프로브 초음파처리(50 와트, 30 x 1 초 펄스)에 의해 세포를 파괴하였다. 핵 및 남아있는 온전한 세포를 저속 원심분리(700 x g, 7분)에 의해 제거하였다. 때때로, 저속 펠릿을 다시 초음파처리하고, 저속 원심분리를 한 번 더 수행하였다. 그런 다음, 저속 상등액을 고속 초원심분리(180,000 x g, 1시간)에 의해 수집하였다. 막 펠릿을 Ca 및 Mg를 함유하는 행크스(Hanks') 균형 염 용액 (HBSS) 중에 재현탁시켰다. 막 단백질을 BCA 또는 코마시에(Comassie)법(Pierce, Rockland, IL)을 이용하여 결정하였다. 우혈청 알부민(Sigma, St. Louis, MO)을 10x 원액으로부터의 1mg/ml에 첨가하고, 막을 4 내지 5 mg/ml로 액체 질소에서 보관하였다. 일부의 경우, 막을 단백질 첨가 없이 냉동 보관하였지만, 상이한 보관 조건의 결과로써 결합의 변화는 관찰되지 않았다.
일부의 경우, 신선한 사람 백혈구를 산 시트레이트 덱스트로오스에서 수집한 전혈로부터 준비하였다. 적혈구를 덱스트란 침강에 의해 제거하고, 백혈구-풍부 층을 채취하여, 전술한 대로 처리하였다. 최종적으로, 정제된 호중구 및 단핵 백혈구(단핵세포 및 림프구를 포함함)를 백혈구-풍부 층을 자가 조직 혈장 중에 재현탁시키고, 세포를 림프구 분리 배지(LSM; Organon Technika) 상에 적층시킨 다음, 원심분리(700 x g, 30분)함으로써 준비하였다. 호중구 풍부 펠릿 및 밀도 경계로 존재하는 단핵 세포를 얼음 냉각된 PBS 중에 세척하고, 막을 전술한 대로 제조하였다. 염색된 시토스핀(Cytospin)(Shandon) 제제형은 호중구 제제형의 순도가 95%를 넘고, 단핵 제제형이 약 40 내지 50%의 단핵세포를 함유함을 나타내었다.
세포주으로부터 유래한 막의 준비
비부착성 세포주를 원심분리(500 x g, 7분)에 의해 수집하고, 얼음 냉각된 PBS 중에 세척하고, 막을 전술한 대로 준비하였다. 살짝 부착된 세포주를 얼음 냉각된 PBS로 세척하고, 세포 스크랩퍼(Costar)로 부드럽게 스크랩핑함으로써 제거하였다. 90%를 넘는 세포가 염료 배제에 의해 결정된 바와 같이 이 과정 동안에 생존하였다. 세포를 PBS 및 프로테아제 억제제 중에 재현탁시켰다. 단단히 부착된 세포를 얼음 냉각된 PBS로 세척한 다음, 전술한 PBS + 프로테아제와 함께 인큐베이팅시켰다. 그런 다음, 세포를 스크랩핑에 의해 제거하고, 원심분리(500 x g, 7분)에 의해 수집하였다. 그런 다음, 부착성 세포로부터의 막을 전술한 대로 준비하였다.
결합 검정 (오일/수크로오스 법)
막을 1mg/ml의 BSA의 존재 및 부재하에 HBSS 중의 2 내지 5 mg/ml까지 희석시켰다. 반응 혼합물을 280㎕ 막 (2 내지 4 mg/ml의 최종 농도), 35㎕의 염수 또는 시험 샘플(다양한 농도임), 및 35㎕의 방사성 표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 (1㎕/ml의 최종 농도)로 구성하였다. 결합은 37℃에서 60 내지 120분 동안 진행시켰다. 인큐베이션의 종결시에, 반응 혼합물중 100㎕ 분액을 400㎕의 원심분리 튜브(Brinkman) 중의 100㎕의 디부틸 프탈레이트 (아래층) 및 PBS 중의 100㎕의 8% 수크로오스 (윗층)으로 구성된 이중층 밀도 구배의 상부에 적층시켰다. 튜브를 15,000 x g 에서 4 내지 5분 동안 스피닝시키고, 막 펠릿을 함유하는 팁(tips)을 분리하고, 300 ㎕ 솔바블레(New England Nuclear, Boston, MA) 중에 50℃에서 밤새 인큐베이팅시켜 펠릿을 용해시킨 다음, 액체 섬광 계수법에 의해 방사성을 결정하였다. 첨가된 막이 없는 오일층에서는 방사능이 발견되지 않았다. 대안적으로, 막을 직접 이들의 인큐베이션 튜브 중에서 37℃에서 4 내지 5분 동안 15,000 x g로 원심분리하고, 펠릿을 HBSS로 세척한 다음, 펠릿을 용해시키고, 액체섬광 계수법에 의해 방사능을 측정하였다.
결합 검정(비오일/수크로오스 법)
오일/수크로오스 구배를 사용하는 법에 대한 대안적인 방법은 마이크로퓨지튜브 중에서 12,000 x g로 5분 동안 결합 검정의 100㎕ 분액을 원심분리한 다음, 생성되는 펠릿을 HBSS로 린싱시키는 것을 포함하였다. 그런 다음, 펠릿을 솔바브레 중에 용해시키고, 상기와 같이 방사능을 측정하였다.
클로로포름/메탄올/완충액에 의한 막의 추출
전술한 바와 같이 준비된 사람 백혈구 막 (5mg 단백질/ml)을 3:2의 클로로포름/메탄올 (부피)의 5 부피와 함께 볼텍싱시키고, 1,500 x g에서 원심분리하여 상을 분리시켰다. 상부의 수성상 및 하부의 유기상을 단백성 경계로부터 분리하고, 조합하고, 아르곤 흐름 하에 약 50 ㎕까지 농축시켰다. 잔여물을 HBSS 중에 재현탁시키고, 간단히 초음파처리하고, 원심분리하여(12,000 x g, 10분)하여, 막을 펠릿화시켰다. 펠릿을 500 ㎕의 HBSS 중에 재현탁시키고, 100㎕를 350㎕ 결합 검정당 사용하였다. BCA 시약(Pierce)을 사용하는 단백질 검정은 단백질의 약 85%가 재현탁된 분획으로부터 제거됨을 나타내었다.
전기영동적 이동성 시프트 검정 (EMSA) (쥐과동물)
DMEM + 10% 우태아혈청 중의 BMC2.3 세포를 3㎍/ml의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 함께 다양한 시간 길이 동안 인큐베이팅시켰다. 핵 추출물을 디그남 등의 방법(Dignam et al.; Nuc. Acid Res. 11:1475-1489 (1983))에 의해 준비하였다. 그런 다음, 핵 추출물을 실온에서 20분 동안 32P 표지된 DNA 올리고누클레오티드와 함께 인큐베이팅시켰다. 프로브로 사용된 올리고누클레오티드의 서열은 AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (서열번호 1) 이었다. 그런 다음, 반응 혼합물을 4% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시키고, 결과를 자동방사선사진법으로 기록하였다.
전기영동적 이동성 시프트 검정 (EMSA) (사람)
전술한 대로 정제한 사람 호중구 (4.5 x 106 세포/ml; 전체 10ml)를 RPMI + 10% FCS (Sigma Chemical Co.) 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 그런 다음, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸 또는 덱스트란 (둘 모두 3㎍/ml로)을 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 60분 더 계속하였다. 대조군 세포에는 아무것도 첨가하지 않았다. 인큐베이션의 종결시에, 세포를 얼음 냉각된 PBS + 20mM EDTA 중에서 세척하고, 핵 추출물을 준비하고, 전술한 대로 EMSA를 수행하였다.
사람 백혈구 막 (HLM)으로부터의 락토실 세라미드(LacCer)의 정제
1. 클로로포름/메탄올/완충액에 의한 막의 추출
1ml의 HBSS 중의 HLM (15mg 단백질)을 1분간 볼텍싱함으로써 클로로포름(3mL) 및 메탄올(2mL)로 추출하고, 10분간 1500 x g에서 원심분리하여 층을 분리하였다. 상부층 및 단백성 경계상을 버렸다. 하부층을 아르곤의 흐름 하에 건조시키고, 200 μL 클로로포름/메탄올 (10:1) 중에 재현탁시켰다.
2. LacCer의 얇은막 크로마토그래피 분석
분석하려는 샘플을 HPTLC 실리카겔 플레이트 상에 스포팅하고, 상업적으로 구입가능한 LacCer 표준과 함께 클로로포름/메탄올/물 (80:20:2) 중에 방치하였다. LacCer을 오르시놀 스프레이 시약(Schnaar, Methods in Enzymology 230: 380)(Academic Press, 1994)으로 가시화시켰다.
3. 실리카겔 크로마토그래피
상기 추출물의 100μL를 클로로포름 중에 평형시킨 실리카겔 칼럼(2mL, 60Å, 200 내지 400 메쉬)에 첨가하였다. 칼럼을 클로로포름(8mL)으로 세척한 다음, 아세톤으로 세척한 후에, 아세톤/메탄올 (9.1, 16ml)으로 글리코스핑고리피드 분획을 용리하였다. 아세톤/메탄올 분획을 건조 농축시키고, 아세톤/메탄올 (10:1) 중에 재현탁시켰다.
4. DEAE-세파덱스 크로마토그래피
실리카 크로마토그래피로부터의 아세톤/메탄올 분획을 DEAE-세파덱스 A-25칼럼(아세테이트 형태의 1mL 수지, 클로로포름/메탄올 (1:2) 중에 준비됨)에 첨가하였다. 칼럼을 60mL 클로로포름/메탄올 (1:2)로 세척하였다. 중성 글리코스핑고리피드를 함유하는 이 분획을 건조시키고, 클로로포름/메탄올 (5:1) 중에 재현탁시켰다.
5. 최종 실리카겔 크로마토그래피
DEAE-세파덱스로부터의 분획을 클로로포름 중에 평형시킨 실리카겔 칼럼(25 x 0.8 cm)에 첨가하였다. 칼럼을 클로로포름(60mL)으로 세척한 다음, 클로로포름/메탄올 (7.5:1) (60mL)로 세척하였다. LacCer를 클로로포름/메탄올 (5:1) (60mL)로 용리시킨 다음, 클로로포름/메탄올 (2:1) (60mL)로 용리시켰다.
6. HPLC 분류
LacCer의 개개의 성분으로의 분류를 역상 대칭 C18 칼럼(3.9 x 150 mm, Waters Associate, Milford, MA) 및 1mL/분의 유속의 메탄올 중의 3.5%의 0.2 M의 암모늄 아세테이트의 이동상을 사용하는 휴렛 팩커드 1090 HPLC 상에서 수행하였다. 206nm에서의 u.v. 흡광도에 의해 피크를 수집하고, 건조시키고, TLC에 의해 분석하여, LacCer를 함유하는 분획을 확인하였다. 단리된 분획을 45℃에서 S.E.D.E.R.E. 세덱스 55 증발 매스 검출기 (Alfortville France)를 사용하여 정량화하였다.
7. GC-MS 분석
3가지의 상이한 분석을 각각의 단리된 LacCer 분획에서 수행하였다. 분액을 가메탄올 분해시키고, 메탄올 용액을 헥산으로 추출하였다. 추출된 지방산 메틸 에스테르를 GC-MS(참고문헌: Irie et al., J. Biochem. 108: 531-536 (1990))에 의해 분석하였다. 메탄올 층을 건조시키고, 트리메틸실릴화시키고, 헥산 중에 용해시켰다. 생성되는 트리메틸실릴화된 메틸 글리코시드를 GC-MS(Irie et al., 1990)에 의해 분석하였다. 제 2 분액을 세라미드 글리카나아제 (하기 참조)로 처리하고, 동결 건조시켰다. 생성되는 아실화된 스핑고신 및 올리고사카라이드를 트리메틸실리화시키고, 헥산 중에 용해시키고, HT-5 알루미늄을 입힌 모세관 칼럼 상에서 GC-MS에 의해 분석하였다.
재구성된 막에서의 결합 검정
막을 수용체-네거티브 세포주인 U937로부터 준비하고, 전술한 대로 클로로포름/메탄올로 추출하였다. 단백성 경계상을 제거한 후에, 상부 및 하부층을 조합하고, (락토실 세라미드 또는 정제로부터의 분획과의) 결합에 대해 검정하려는 샘플과 함께 아르곤의 흐름하에 건조시켰다.
대안적으로, 정제된 인지질의 혼합물을 결합 검정에서 사용하기 위해 샘플과 함께 건조시켰다. 인지질 혼합물은 포스파티딜콜린(132㎍), 포스파티딜에탄올아민(112㎍), 포스파티딜이노시톨(36㎍) 및 포스파티딜세린(56㎍)을 함유하였다.
건조된 지질/샘플 제제형을 간단한 초음파처리에 의해 HBSS(500μL) 중에 재현탁시키고, 12,000 x g에서 10분간 원심분리시켰다. 이러한 스핀으로부터의 상등액을 버리고, 펠릿을 HBSS(560μL) 중에 재현탁시켰다. 280μL의 분액을 염수(35μL) 또는 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(10mg/mL 원액의 35μL) 및 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(10㎍/mL의 35μL)를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 검정을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨후, 100 μL 분액을 분리시키고, 실온에서 12,000 x g에서 5분간 마이크로퓨지 튜브 중에서 원심분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠릿을 150μL의 HBSS로 린싱하였다. 그런 다음, 펠릿을 솔바블레 중에 용해시키고, 섬광 유체를 첨가하고, 방사능을 측정하였다.
96-웰 플레이트에서의 결합 검정
측정하려는 락토실 세라미드 또는 샘플을 에탄올 중에 현탁시켰다. 기재된 바와 같이 분액을 3개로 하여 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 공기 건조시켰다. 하기 성분을 사전혼합한 다음, 100μL를 각각의 웰에 첨가하였다: 염수(10μL) 또는 비표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(10mg/ml 원액의 10μL), 3H-유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸(10㎍/ml 원액의 10μL), 및 HBSS(80μL). 플레이트를 37℃에서 1.5 내지 2 시간 동안 인큐베이팅시킨후, 상등액을 각각의 웰로부터 분리하여, 버렸다. 웰을 HBSS(200μL)로 린싱하고, 솔바블레(100μL)를 첨가하였다. 플레이트를 60℃에서 5분 동안 인큐베이팅시킨 다음, 상등액을 분리하고, 계수하였다.
균등물
당분야의 숙련자는 단지 통상적인 실험을 이용함으로써 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물을 하기 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims (37)

  1. a) 탄수화물과 당지질 사이의 상호작용에 적합한 조건하에 당지질과 탄수화물을 조합시키는 단계;
    b) 당지질에 대한 탄수화물의 친화력을 측정하는 단계; 및
    c) 단계 (b)에서 측정된 친화력을 경합물질 탄수화물 또는 당지질의 존재하의 친화력과 비교함으로써 당지질에 대한 탄수화물의 친화력을 평가하는 단계를 포함하여, 당지질에 대한 탄수화물의 친화력을 평가하는 검정법.
  2. 제 1항에 있어서 , 당지질이 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 검정법.
  3. 제 1항에 있어서, 탄수화물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸임을 특징으로 하는 검정법.
  4. a) 방사성표지된 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 및 시험하려는 약물을, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합시키는데 적합한 조건하에 조합시키는 단계;
    b) 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 수용체에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 (b)에서 측정된 결합 정도를, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합시키는데 적합한 조건하에서 시험하려는 약물의 부재하의 결합 정도와 비교하는 단계를 포함하여, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 대해 친화력을 갖는 약물을 확인하기 위한 검정법으로서, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 수용체에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 결합 정도의 감소는 약물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 대해 친화력을 가짐을 나타내는 검정법.
  5. 제 4항에 있어서, 수용체가 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 검정법.
  6. 제 4항에 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 친화력을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 검정법.
  7. 제 6항에 있어서, 화합물이 수용체 유사체 또는 수용체 모방체임을 특징으로 하는 검정법.
  8. 당지질에 대한 탄수화물의 결합을 변화시키는 약물을 확인하기 위한 검정법으로서,
    a) 방사성표지된 탄수화물, 당지질 및 시험하려는 약물을, 탄수화물과 당지질의 상호작용에 적합한 조건하에서 조합시키는 단계;
    b) 당지질에 대한 탄수화물의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 (b)에서 측정된 결합 정도를, 탄수화물과 당지질의 상호작용에 적합한 조건하에 시험하려는 약물의 부재하의 결합 정도와 비교하는 단계를 포함하여, 당지질에 대한 탄수화물의 결합 정도의 차이가 약물이 당지질에 대한 탄수화물의 결합을 변화시킴을 나타내는 검정법.
  9. 제 8항에 있어서, 탄수화물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸임을 특징으로 하는 검정법.
  10. 제 8항에 있어서, 당지질이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체임을 특징으로 하는 검정법.
  11. 제 10항에 있어서, 당지질이 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 검정법.
  12. 제 8항에 있어서, 약물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 작용제(agonist)임을 특징으로 하는 검정법.
  13. 제 8항에 있어서, 약물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체의 길항제(antagonist)임을 특징으로 하는 검정법.
  14. 시험관내에서, 탄수화물, 당지질 및 제 8항에 따른 검정법에 의해 확인된 약물을, 탄수화물을 당지질에 결합시키는데 적합한 조건하에 조합시켜서, 약물이 약물의 부재하의 결합에 비해 당지질에 대한 탄수화물의 결합을 변화시키는 것을 포함하여, 당지질에 대한 탄수화물의 결합을 변화시키는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 친화력을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 검정법.
  16. 제 15항에 있어서, 화합물이 수용체 유사체 또는 수용체 모방체임을 특징으로 하는 검정법.
  17. 시험관내에서 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 함유하는 세포에 약물을 전달시키는 방법으로서,
    a) 전달하려는 약물을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 접합시켜 접합 분자를 생성시키는 단계; 및
    b) 접합 분자의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합시키는데 적합한 조건하에 접합 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체를 함유하는 세포 중의 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸과 결합하여, 접합 분자의 약물을 세포에 전달하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 수용체가 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 친화력을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 화합물이 수용체 유사체 또는 수용체 모방체임을 특징으로 하는 방법.
  21. 신호 전달 경로의 활성화를 변화시키는 약물을 확인하기 위한 검정법으로서,
    a) 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체 및 시험하려는 약물을, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합시키는데 적합한 조건하에 조합시키는 단계;
    b) 신호 전달 경로의 활성화 정도를 측정하는 단계; 및
    c) 단계 (b)에서 측정된 활성화 정도를, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 수용체에 결합시키는데 적합한 조건하에 시험하려는 약물의 부재하의 활성화 정도와 비교하는 단계를 포함하며, 신호 전달 경로의 활성화 정도의 차이가 약물이 신호 전달 경로의 활성화를 변화시킴을 나타내는 검정법.
  22. 제 21항에 있어서, 활성화 정도가 약물의 부재하에서 보다 약물의 존재하에서 큰 경우, 약물이 신호 전달 경로의 활성화에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 증강시킴을 특징으로 하는 검정법.
  23. 제 21항에 있어서, 활성화 정도가 약물의 부재하에서 보다 약물의 존재하에서 작은 경우, 약물이 신호 전달 경로의 활성화에 대한 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 효과를 저하시킴을 특징으로 하는 검정법.
  24. 제 21항에 있어서, 신호 전달 경로의 활성화가 1종 이상의 전사 조절 인자를 조절함으로써 측정됨을 특징으로 하는 검정법.
  25. 제 24항에 있어서, 전사 조절 인자가 NF-κB, NF-IL6 및 jun/fos 패밀리의 일원으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 검정법.
  26. 제 21항에 있어서, 단계 (b)가 전사 조절 인자에 특이적인 32P 표지된 DNA 올리고누클레오티드에 의해 수행됨을 특징으로 하는 검정법.
  27. 시험관내에서 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸, 당지질 및 제 21항에 따른 검정법에 의해 확인된 약물을, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸을 당지질에 결합시키기에 적합한 조건하에 조합시켜서, 약물이 약물의 부재하의 결합에 비해 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 당지질과의 결합을 변화시키는 것을 포함하여, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸의 당지질과의 결합을 변화시키는 방법.
  28. 시험관내에서 a) 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 당지질 수용체를 함유하는 세포를 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 당지질 수용체에 결합하여 이를 활성화시키는 약물과 접촉시켜, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 당지질 수용체를 활성화시켜서, 신호 전달 경로를 활성화시키는 단계를 포함하여, 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대한 당지질 수용체를 함유하는 세포에서 신호 전달 경로를 활성화시키는 방법,
  29. 제 28항에 있어서, 신호 전달 경로의 활성화가 1종 이상의 전사 조절 인자를 조절함으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 전사 조절 인자가 NF-κB, NF-IL6 및 jun/fos 패밀리의 일원으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, 약물이 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 21항에 있어서, 수용체가 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 검정법.
  33. 제 21항에 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 친화력을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 검정법.
  34. 제 33항에 있어서, 화합물이 수용체 유사체 또는 수용체 모방체임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 28항에 있어서, 수용체가 락토실 세라미드임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 28항에 있어서, 수용체가 유도체화되지 않은 수용성 β(1-3)-글루칸에 대해 친화력을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 화합물이 수용체 유사체 또는 수용체 모방체임을 특징으로 하는 방법.
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