JP2944709B2

JP2944709B2 - （１→３）―β―Ｄ―グルカンの測定剤

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Publication number: JP2944709B2
Application number: JP2161281A
Authority: JP
Inventors: 重則田中
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1999-09-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: US5266461A; JPH0452558A; WO1991019981A1; EP0491047A4; EP0491047A1; EP0491047B1; DE69123333D1; DE69123333T2

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
用いる（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤に関す
る。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単に
ライセートという）を使用して、エンドトキシンを測定
する方法が知られている。この方法は、ライセートが微
量のエンドトキシンにより凝固することに基づいている
が、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつ
かの凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らか
にされている（中村隆範ほか、日本細菌学雑誌、38、78
1−803（1983））。

すなわち、第１図に示すように、ライセートにエンド
トキシンが加わるとＣ因子（エンドトキシン感受性因
子、分子量123,000）を活性化して活性型Ｃ因子とな
り、これはＢ因子（分子量64,000）を限定水解し、活性
化して活性型Ｂ因子となり、これはブロクロッティング
エンザイム（分子量54,000）を活性化してクロッティン
グエンザイムに変換する。クロッティングエンザイムは
コアギュローゲン（凝固タンパク、分子量19,723）のAr
g¹⁸−Thr¹⁹とArg⁴⁶−Gly⁴⁷の特定箇所を限定水解するこ
とによりペプチドＣを遊離し、コアギュローゲンをコア
ギュリンに変換して凝固（ゲル化）させる。岩永らの方
法（Haemostasis,７,183−188（1978））により、さら
にこのコアギュローゲンの水解部位と共通のアミノ酸配
列を持った合成ペプチド、すなわち発色合成基質Boc−L
eu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド（pNA）あるいは発
蛍光合成基質Boc−Leu−Gly−Arg−４−メチルクマリル
−７−アミドとライセートを組み合わせた定量性のある
測定法が知られている。

該測定法は、エンドトキシンが引金（トリガー）とな
って複数の凝固因子（全てセリンプロテアーゼ前駆体）
を順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコ
アギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用して
いる。

また、ライセートに（１→３）−β−Ｄ−グルカンが
加わると、第１図におけるＧ因子を活性化して活性型Ｇ
因子となり、これがプロクロッティングエンザイムをク
ロッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場
合と同様にクロッティングエンザイムがコアギュローゲ
ンをコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基
質を水解する（森田ら、FEBS Lett.,129,319−321（198
1））。

このＧ因子に反応する物質としては（１→３）−β−
Ｄ−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらには
セルロース系血液透析膜の洗浄液中及び該膜と接触した
血液中に含まれる物質などが知られており、これらはい
ずれもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認
められている。

一方、（１→３）−β−Ｄ−グルカンは真菌細胞壁の
構成多糖体として知られ、特に血液中の（１→３）−β
−Ｄ−グルカンを測定することにより体内における真菌
の存在を検知することができるので（１→３）−β−Ｄ
−グルカンをエンドトキシンの影響を全く受けずに、高
い感度で再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医学
の分野で望まれている。

また、抗Ｃ因子モノクロナール抗体を17種作成し、そ
のエピトープ領域を固定すると共に、Ｃ因子活性化に対
する影響を調べて報告がなされている（三浦芳樹ら、生
化学，61,No.9,834「1p−Aj06 リボ多糖感受性セリン
プロテアーゼ前駆体（Ｃ因子）のモノクロナール抗体の
同定とその活性化機作解析への応用」、平成元年９月25
日、財団法人日本生化学会発行）。

ライセート中のＧ因子を用いることにより（１→３）
−β−Ｄ−グルカンを測定する方法が報告されている
（大林ら、Clin.Chim.Acta,149,55−65（1985））が、
この方法はライセートをゲル過法によりあるいはヘパ
リンまたはデキストラン硫酸を固定化したアフィニティ
ー担体を用いるクロマトグラフィーにより分画し、エン
ドトキシン感受性のＣ因子を除去することにより、Ｇ因
子とプロクロッティングエンザイムのみで再構成するも
ので、きわめて煩雑な操作を必要とする方法である。

［課題を解決するための手段］本発明は、エンドトキシン感受性因子に対応する抗体
を使用し、エンドトキシン感受性のＣ因子の影響を受け
ずに、ライセート中のＧ因子による反応も利用して（１
→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する試薬に関する。

すなわち、本発明の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの
測定剤は、（１）ライセートと、エンドトキシン感受性因子に対す
る抗体とからなる（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
剤、および（２）エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化
した担体に、ライセートを接触させて得たエンドトキシ
ン感受性因子不含ライセートからなる（１→３）−β−
Ｄ−グルカンの測定剤、である。

エンドトキシン感受性因子は、前述したようにエンド
トキシンによって活性化されるＣ因子およびこの活性型
Ｃ因子により活性化されるＢ因子であり、（１→３）−
β−Ｄ−グルカンをエンドトキシンの影響を受けること
なく特異的に測定するには、ライセートに含まれるこれ
らＣおよびＢ因子の影響を排除しなければならない。こ
のため本発明ではＣ因子またはＣおよびＢの混合因子
（CB因子）に対する抗体をライセートと共に用いるか、
または抗Ｃ因子固定化によるＣ因子不含ライセートを用
いるものである。

本発明で使用するライセートは、リムルス・ポリフェ
ムス（L.polyphemus、アメリカ産）、タキプレウス・ギ
ガス（T.gigas、タイ国、マレーシア半島産）、タキプ
レウス・トリデンタツス（T.tridentatus、日本産）、
カルシノスコルピウス・ロツンデイカウダ（C.rotundic
auda、タイ国、マレーシア半島産）等のカブトガニから
血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、その成分
（ライセート）を分離する。ライセートは−40℃以下に
小分けして保存し、必要に応じ凍結融解して使用するの
が望ましい。

得られたライセートからＣ因子に対する抗体を製造す
るには、まず抗原となるＣ因子を精製しなければならな
いが、この方法としては、アガロース、セファロース
（ファルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等
の適当な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化
したものにライセートを接触させ、ＣまたはCB因子を含
む画分を採取する方法を採用することができる。接触さ
せる方法としては、例えば、上記固定化物とライセート
とを溶液中で接触させる方法、カラムクロマトグラフィ
ーにより接触させる方法等を挙げることができる。

エンドトキシン感受性因子を抗原とする抗体は、精製
したエンドトキシン感受性のＣ因子またはＣおよびCB因
子を抗原として使用し、これら抗原に対するポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する。

本発明で使用するポリクローナル抗体の製造方法とし
ては、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、
得られた抗体を、さらに精製することが望ましい。被免
疫動物に投与する際に、補助剤（アジュバンド）を併用
することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。

本発明で使用するモノクロナール抗体の製造方法とし
ては、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した
後に脾臓などを摘出し、該脾臓などから採取した細胞と
腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、
ハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試
験管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドー
マから上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細
胞株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウス
の腹腔などの生体内にて培養することによって、モノク
ローナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができ
る。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリン
パ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることが
できる。または、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来
のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な
抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウ
ム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポ
リエチレングリコールまたは等電点による選択的沈澱分
別法、ないし電気泳動、DEAE、CM−誘導体等のイオン交
換体やプロテインＡならびにハイドロキシアパタイト吸
着体による吸脱着法、ゲル過および超遠心法等を挙げ
ることができる。

（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する上記（１）
の方法において、該抗体をライセートと（１→３）−β
−Ｄ−グルカン溶液中に存在させるには、例えばライセ
ートの凍結乾燥品を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解
して調製した溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライ
セート中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥し
て得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶液して用
いる方法、ライセートと合成基質の凍結乾燥品を適当な
抗液等で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液を添加す
る方法、ライセートと合計基質の混合液中に予め必要量
の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あ
るいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、および必要
量の該抗体溶液を試料に添加する方法等が挙げられる。

また、上記（２）の方法に用いる該抗体の固定化担体
にライセートを接触させてＣ因子を含まないライセート
を得る方法としては、該担体にライセートを接触させた
後に、遠心分離、過等の手法により該担体を除去する
方法、あるいは該担体を充填したカラムにライセートを
添加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。

該抗体の固定化担体としては、例えばセルロファイン
（生化学工業株式会社販売、商品名）またはセファロ
ース等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通
常の方法により共有結合させた固定化担体を用いること
ができる。担体としては、この他にもセルロース、アガ
ロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シ
リカビーズ等を用いることができる。

さらにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法とし
て、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方
法、例えば担体をエポキシ活性化後ホルミル化したの
ち、抗体を結合させる方法等を挙げることができる。

ライセートを固定化担体に接触させる場合のpHとして
は、ライセート中のＧ因子および（１→３）−β−Ｄ−
グルカンとＧ因子により開始される経路に関与する凝固
因子が不活性されない程度のpHであれば良いが、好まし
くはpH6〜９の範囲が好ましい。また、接触させる場合
の温度としては、該凝固因子が同様に不活化されない温
度であれば良いが、通常０〜45℃、より好ましくは０〜
10℃である。

本発明により、（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定
する生体試料としては、血液、血漿または血清の他に、
能脊髄液、腹水、関節液、胸水および尿などの体内外の
浸出または排泄液を挙げることができる。たとえば、血
漿を試料とするときは、ヘパリン、EDTA、クエン酸等の
抗凝固剤を加えて分離することが必要である。

本発明の測定剤を用いて（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンを測定法するには、前述の発色合成基質あるいは発蛍
光合成基質を反応液中に共存させ、クロッティングエン
ザイムのアミダーゼ活性を測定する方法、凝固反応によ
るゲル形成の有無を肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴
って生じる濁度を適当な光学系を用いて測定する比濁
法、一定の濁度に達するまでの時間を適当な光学系を用
いて測定する比濁時間分析法、凝固に伴って生ずる粘性
の変化を共振周波数の変化としてとらえ、水晶振動子ゲ
ル化測定装置を用いて測定する方法等を採用することが
できる。

［作用］本発明の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤は、
Ｃ因子に対する抗体を使用しているので、少量でも優れ
たＣ因子に対する特異的結合能および中和効果を示すこ
とが第一の特徴である。また、該抗体はリムルス反応阻
害物質として知られているアンチトリブシン、アンチト
ロンビンIII等をプロテアーゼインヒビター類を含ま
ず、Ｇ因子活性を全く損なわないことが第二の特徴であ
る。

（実施例）以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１ＢおよびＣ因子に対するポリクロナール抗体の製造カブトガニ血リンパ液1.0を４℃以下に、1,500rpm
で10分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約50
gに250mlの0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）を加え、
ホモゲナイザー（ポリトロンＲ PT10（商標）、Kinema
tica社製）にて均一に破砕及び抽出し、冷却遠心分離機
（トミー精工RD−20III）にて、10,000rpmで30分間遠心
した。得られた沈澱物をさらに150mlの同上緩衝液にて
２回抽出し、最終的に550mlのライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファ
ロースCL−6Bカラム（５×23cm、0.05M NaCl含有0.02M
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化に添加し、0.45M
NaCl含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）にて溶出
される画分、すなわち第１図に示すＢおよびＣ因子を含
むBC画分を、後記する大林らの方法（Clin,Chim,Acta,1
49,55−65（1985））により、その活性を測定した。つ
いでその40mlを10mlに減圧濃縮後、CB両因子の活性化を
防ぐために0.23gのEDTA−4Naを添加した。

その1.0mlに等量のフロイントコンプリートアジュバ
ント（ヤトロン社販売、商品名）を加え、ウサギ（JW、
♂2.5kg）の背中、尻および横腹のそれぞれに0.3ml、0.
3mlおよび0.4mlずつ皮下注射（感作）した。感作は２週
間に１度計５回行い、ゲル内二重拡散法により抗体価の
上昇を確認後、最終感作日より１週間後に頚静脈を切開
して全採血した。ひきつづき室温１時間、４℃一晩放置
後、2,000rpmで５分間遠心分離を行い、得られた血清55
mlに56℃で30分間の熱処理を行い非働化した後、防腐剤
として0.06gのアジ化ナトリウム（0.1％（W/V））を添
加した。その血清の48mlに対して34％（W/V）Na₂SO₄溶
液を48ml加え、生じた沈澱を10,000rpmで30分間遠心分
離し沈澱を17％（W/V）Na₂OS₄溶液で２回洗浄し、その
沈澱を0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）50mlに溶解し
た。この溶液に、固形のNa₂SO₄7.5gを撹拌しながら溶か
し込み、生じた沈澱を上記と同様のトリス−塩酸緩衝液
に溶かし、さらにNa₂SO₄濃度7.5g/50mlの条件で沈澱操
作を３回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。
ひきつづき0.05M NH₄HCO₃で平衡化したセルロファインG
H−20m（生化学工業株式会社販売、商品名）カラム（2.
8×90cm、0.05M NH₄CO₃で溶出）を通過させ脱塩した
後、凍結乾燥し、ウサギ抗（BC画分）血清のIgG溶液を
得た。

［ＣおよびＢ因子活性測定法］ 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.013M MgCl₂含
有）0.1mlに、E.coli 0111:B4由来のエンドトキシン（6
00ng/ml）30μを加え、さらに各画分50μを添加
後、37℃で15分間加温する。ひきつづき、0.005M N−タ
ーシャリーブトキシカルボニル（Boc）−Leu−Gly−Arg
−pNA（ｐ−ニトロアニリド）20μと凝固酵素前駆体
（プロクロッテイングエンザイム）50μを加え、37℃
で反応させる。発色が認められることを確認し、0.6Mの
酢酸0.8mlを添加することにより反応を停止し、次いで4
05nmの吸光度を測定する。

実施例２精製Ｃ因子に対するポリクローナル抗体の製造カブトガニ血リンパ1.2を４℃下に1,500rpmで10分
間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）約53gに250
mlの0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.05M NaCl、0.
001Mベンズアミジン、0.01M EDTA−4Na含有）を加え、
実施例１と同様に破砕、抽出後、10,000rpmで30分間遠
心した。得られた沈澱を200mlの同上緩衝液にてさらに
２回抽出し、最終的には640mlのライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファ
ロースCL−6Bカラム（５×23.5cm、0.05M NaCl含有0.02
Mトリス−塩酸緩衝液、pH8.0で平衡化）に添加し、0.5M
NaCl含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）にて溶出
される画分（Ｂ因子およびＣ因子、活性測定法は後記す
る中村らのEur.J.Biochem.,154.511−521（1986）記載
の方法による）を限外過（ダイアフロー・メンブレン
PM10、アミコン社）にて濃縮し、セファロースCL−6B
（ファルマシア社製）カラム（4.0×129cm、0.1M NaCl
を含む0.02M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0で平衡化）に
よるゲル過およびCM−セファロースCL−6B（ファルマ
シア社製）カラム（2.0×25cm、前記と同様の緩衝液で
平衡化し、0.1Mから0.35MまでのNaClグラジェントで溶
出）によるイオン交換にて、精製Ｃ因子15.5mgを得た。
精製Ｃ因子の純度をSDSポリアクリルアミド電気泳動に
て検討した結果、非還元条件下にて１本の明瞭なバン
ド、還元条件下では２本のバンドに分かれた、このこと
より、当該Ｃ因子は、Ｓ−Ｓ結合で結ばれた２本のポリ
ペプチド鎖から成る高純度の精製標品であることが明ら
かであろう。

［Ｃ因子活性測定法］ 1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.05M MgCl₂含有）20
μに、E.coli 0111:B4由来のエンドトキシン（10μg/
ml）４μを加え、さらに各画分10−20μを添加後全
量を200μとし、37℃で10分間加温する。ひきつづ
き、0.002M Boc−Val−Pro−Arg−pNA50μで加え、37
℃で７分間加温する。0.6Mの酢酸0.8mlを添加して反応
を停止し、405nmの吸光度を測定する。

［Ｂ因子活性測定法］ 1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、0.05M MgCl₂含有）20
μに活性型Ｃ因子溶液（Ｃ因子よりエンドトキシン添
加にて調製、22μg/ml）10μを加え、さらに各画分10
μを添加後全量を200μとし、37℃、10分間加温す
る。ひきつづき、0005M Boc−Leu−Gly−Arg−pNA20μ
と凝固酵素前駆体（プロクロッテイングエンザイム、
0.96mg/ml）30μを加え、37℃で３分間加温する。0.6
Mの酢酸0.8mlを添加して反応を停止し、405nmの吸光度
を測定する。

上記により精製したＣ因子溶液40mlを10mlに濃縮後、
ＢおよびＣ両因子の活性化を防ぐため023gのEDTA−4Na
を添加した。その1.0mlに等量のフロイントコンプリー
トアジュバントを加え、ウサギ（JW、♂、25kg）の背
中、尻および横腹のそれぞれに0.3ml、0.3mlおよび0.4m
lづつ皮下注射（感作）した。感作は２週間に１度計５
回行い、ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認
後、最終感作日より１週間後の頚静脈切開により全採血
した。ひきつづき室温１時、４℃一晩放置後、2,000rpm
で５分間遠心分離を行い、得られた血清62mlに56℃で30
分間の熱処理を行い非働化した後、防腐剤として0.06g
のアジ化ナトリウム（0.1％（W/V））を添加した。48ml
の血清に対して34％（W/V）Na₂SO₄溶液を48ml加え、生
じた沈澱を10,000rpmで30分間遠心分離し、沈澱を17％
（W/V）Na₂SO₄溶液で２回洗浄し、その沈澱を0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（pH8.0）50mlに溶解した。この溶液に
固形のNa₂SO₄7.5gを撹拌しながら溶かし込み、生じた沈
澱を上記と同様のトリス−塩酸緩衝液に溶かし、さらに
Na₂SO₄濃度7.5g/50mlの条件で沈澱操作を３回繰り返
し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき0.05
MのNH₄HCO₃で平衡したセルロファインGH−20mカラム
（2.8×90cm、0.05M NH₄HCO₃にて溶出）を通過させ脱塩
した後、凍結乾燥し、抗Ｃ因子血清のIgG溶液を得た。

実施例３精製Ｃ因子に対するモノクローナル抗体の製造実施例２で得られたＣ因子0.5ml（タンパク量、200μ
g/ml）を等量のフロイントコンプリートアジュバントと
混合し、マウス（BALB/C、５週令、体重25g）の背中に
0.2mlおよび尻に0.3mlを皮下注射し、２度目の感作を２
週目に行い、３週後に300μg/mlのＣ因子0.3mlを静脈内
投与し最終免疫とした。これより４日後に9.3×10⁷個の
脾細胞を分離し、マウスミエローマSP/0細胞の1.9×10⁷
個と常法により融合させて、ハイブリドーマを作成し
た。得られたハイブリドーマにつき、Ｃ因子に結合する
こと、またはＣ因子活性を中和させることができること
を確認した。つづいて、上記と同様のマウス腹腔内にプ
リスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を
0.2ml投与し、１週間後にハイブリドーマ３×10⁷/匹を
腹腔内に投与し、腹水の大量貯留がみられる２週目に腹
水を回収し、40％飽和硫酸アンモニウムでIgG画分を沈
澱させ、最終的な腹水型モノクローナル抗体を得た。

実施例４抗Ｃ因子固定化セルロファインによるＣ因子不含ライセ
ートの調製実施例１に記載の方法で得られたライセート100ml
を、01Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、015M NaCl含有）
で平衡化したエンドトキシンおよびβ−グルカン不含の
抗Ｃ因子固定化セルロファイン（調製方法は後記）カラ
ム（1.3×12cm）に添加し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（p
H8.0、1M NaCl含有）にて洗浄後、素通りした非吸着画
分を集め、Ｃ因子を全く含まないＣ因子不含ライセート
を得た。

［抗Ｃ因子固定化セルロファインの調製方法］ホルミルセルロファイン10gを0.1Mリン−酸Na緩衝液
（pH7.1）で充分洗浄し、実施例１〜４に記載のＣ因子
に対する抗体溶液（10mg/ml0.1Mリン酸−Na緩衝液、pH
7.1）10mlに懸濁し、NaCNBH₃50mgを加え溶解させる。ひ
きつづき室温で８時間ゆるやかに撹拌し、0.2Mトリス−
塩酸緩衝液（pH7.0）で洗浄、過し、10mgのNaCNBH₃を
含む5mlの上記緩衝液を加え、室温で３時間振とうす
る。その後、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0、015M Na
Cl含有）で充分洗浄する。

実施例５ポリクローナル抗体を使用する（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定以下の方法で３種類の試薬を調製し、３種類の試料に
ついてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネシウム440μ
モル、およびBoc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモルを混
合し、凍結乾燥して調製した。Ｂ剤は、Ａ剤の成分に実
施例１で調製した抗BC画分血清のIgG画分の10mg/ml0.02
Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）220μを添加、混合
し、凍結乾燥して調製した。Ｃ剤はＡ剤の成分に実施例
３で調製した抗Ｃ因子血清のIgG画分の10mg/ml0.02Mト
リス−塩酸緩衝液220μを添加、混合し、凍結乾燥し
て調製した。

３種類の試薬それぞれ2.2mlの0.2Mトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0）に溶解させ、その溶液0.1mlを試験管に分注
し、そこへ試料0.1mlを添加してよく混合し、37℃にて3
0分間反応させた。３種類の試薬に対する試料の反応性
は、30分後に生じたpNAを、0.5mlの0.04％亜硝酸ナトリ
ウム（0.48M塩酸溶液を含む）、0.3％スルファミン酸ア
ンモニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジア
ミン二塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度
値で示した。その結果を第１表に示した。この結果か
ら、BC画分に対するポリクローナル抗体及びＣ因子に対
するポリクローナル抗体を添加して調製した試薬を用い
れば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、（１→
３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に定量することができ
ることは明らかである。

実施例６（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定以下の方法で２種類の試薬を調製し、エンドトキシン
及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比
較検討した。Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネ
シウム440μモル、Boc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモル
を混合し、凍結乾燥して調製した。Ｄ剤はＡ剤の成分
に、実施例３で調製した精製Ｃ因子に対して中和能であ
るモノクローナル抗体を含む溶液100μを添加して、
凍結乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを2.2mlの0.2Mトリス−塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解させ、その溶液0.1mlを試験管に分
注し、そこへ試料0.1mlを添加してよく混合し、37℃に
て30分間反応させた。２種類の試薬に対する試料の反応
性は、30分後に生じたpNAを0.5mlの0.04％亜硫酸ナトリ
ウム（0.48M塩酸）、0.3％スルファミン酸アンモニウ
ム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩
酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度値で示し
た。

第２図はエンドトキシンに対する反応性を比較した実
験結果である。Ａ剤はエンドトキシンに対して濃度依存
的に反応するが、Ｄ剤は1,000ng/mlのエンドトキシンに
対しても全く反応しない。この結果は、精製Ｃ因子に対
するモノクローナル抗体が、ライセート中のＣ因子を完
全に中和し、エンドトキシンに対する反応性を消失させ
ていることを示している。

第３図は、Ａ、Ｄ両試薬の（１→３）−β−Ｄ−グル
カンに対する反応性を容量反応曲線で比較した結果であ
る。２つの試薬の用量反応曲線はほとんど一致してお
り、このことはＤ剤に含まれる精製Ｃ因子に対するモノ
クローナル抗体が、ライセートの（１→３）−β−Ｄ−
グルカンに対する反応性に全く影響を与えないことを示
している。

第４図は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの蒸留水によ
る希釈系列と、100ng/mlのエンドトキシン溶液による希
釈系列に対するＤ剤の用量反応曲線である。２つの用量
反応曲線はほとんど一致しており、このことは、Ｄ剤を
用いれば、試料中に混在するエンドトキシンに全く影響
されずに（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に定量
できることを示している。

以上の結果から、精製Ｃ因子に対するモノクローナル
抗体を添加して調製した試薬を用いれば、エンドトキシ
ンの影響を全く受けずに、（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンを特異的に定量することができることは明らかであ
る。

実施例７（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定以下の方法で２種類の試薬を調製し、３種類の試料に
ついてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセート440μ、塩化マグネシウム440μ
モルおよびBoc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86μモルを混合
し、凍結乾燥して調製した。Ｅ剤は、実施例４で調製し
たＣ因子不含ライセート440μ、塩化マグネシウム440
μモル、Boc−Leu−Gly−Arg−pNA2.86モルを混合し、
と凍結乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを2.2mlの0.2Mトリス−塩酸塩
緩衝液（pH8.0）に溶解し、その溶液0.1mlを試験管に分
注し、そこへ試料0.1mlを添加してよく混合し、37℃に
て30分間反応させた。２種類の試薬に対する試料の反応
性は、30分後に生じたpNAを、0.5mlの0.04％亜硝酸ナト
リウム（0.48M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アンモ
ニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン
二塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの吸光度値で
示した。その結果を第２表に示した。この結果から、Ｃ
因子不含ライセートを用いて調製した試薬によれば、エ
ンドトキシンの影響を全く受けずに、（１→３）−β−
Ｄ−グルカンを特異的に定量することができることは明
らかである。

実施例８血漿検体の測定対象は、真菌による敗血症を疑った自治医大血液科に
入院中の重症血液患者（急性リンパ性白血病、急性骨髄
性白血病、多発性骨髄腫等）を有する患者の11例で、そ
れぞれ無菌的に採血したヘパリン加血漿を試料として、
４℃で150×Ｇ、10分間遠心して多血小板血漿（PRP）を
得た。その0.1mlに0.32Mの過塩素酸0.2mlを加え、37℃
で20分間加温し、析出物を遠心（3,000rpm、10分間）除
去し、その上清0.05mlに0.18N NaOHを0.05ml加えて中和
し被検液とした。

ひきつづき実施例６に記載の方法で調製した、本発明
による（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定系0.1mlを加
え、37℃で30分間加温した。この溶液に0.04％亜硝酸ナ
トリウム（0.48M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アン
モニウム、0.07％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミ
ン二塩酸塩の各0.5mlを順次加えてジアゾカップリング
し、545nmでその吸光度を測定し、別に作成した検量線
（第５図）のａより（１→３）−β−Ｄ−グルカン換算
量として表わした。第３表に示すように11例全例におい
て高濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出され
（健常人:0.2±0.3pg/ml）、そのうちの５例（No.1〜N
o.5）は、血培にて、カンジダ・アルビカンス（Candida
albicans）、カンジダ・グリエルモンディ（Candida g
uilliermondii）、カンジダ・トロピカリス（Candida t
ropicalis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）
およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptoco
ccus neoformans）をそれぞれ検出し、残りの２例（No.
6〜No.7）は血培では陰性であったが、死亡後の解剖に
よる組織病理学的検査によりアスペルギルス・フミガタ
ス（Aspergillus fumigatus）を検出した。さらに残り
４例（No.8〜No.11）については、臨床症状、経過、薬
剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず、
血培では陰性であったが、抗真菌剤（アンホテリシン、
ミコナゾール、フルコナゾール）投与により、臨床的に
顕著な改善を見た。従って、本発明方法はセルロース系
透析膜による血液透析施行例（第４表のNo.1〜No.5）を
除いて、真菌感染症とりわけ通常の検査法では診断がき
わめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断法としてきわ
めて有力な手法として評価されうるものであることが理
解できよう。

実施例９尿検体の測定自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿
培養でカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、
カンジダ・グラブレイタ（Candida glabrata）を検出し
た３症例につき、本発明方法による尿中（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの定量を行った。

尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コップに採取し、その
0.005mlに実施例７に記載の本発明方法による（１→
３）−β−Ｄ−グルカン測定系0.2mlを加え、37℃で30
分間加温した。実施例８と同様にジアゾカップリング
後、545nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した
検量線（第５図）のＢより（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン換算値として表わした。第５表に示すように３例中全
例において高濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検
出され（健常人:10pg/ml以下）、本発明方法は真菌性尿
路感染症の迅速確定診断法として、きわめて有力な手法
であることが理解できよう。

実施例10 脳脊髄液検体の測定自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプ
トコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoform
ans）を検出した真菌性髄膜炎の３症例につき、本発明
方法による（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定量を行っ
た。

腰推穿刺にて無菌的に採取した髄液0.05mlに注射用蒸
留水0.05mlを加え、さらに実施例５に記載の本発明方法
による（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定系0.1mlを加
え、37℃で30分間加温した。実施例８と同様にジアゾカ
ップリング後、545nmでその溶液の吸光度を測定し、別
に作成した検量線（第５図）のｂより（１→３）−β−
Ｄ−グルカン換算値として表わした。第６表に示すよう
に、３例中全例において高濃度の（１→３）−β−Ｄ−
グルカンが検出され（健常人:1pg/ml以下）、本発明方
法は真菌性髄膜炎の早期迅速診断法としてきわめて有力
な手法として評価され得るものであることが理解できよ
う。

［発明の効果］以上述べたように、本発明はライセートを用いた（１
→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的な測定剤を提供する
ものであり、血液や尿、骨髄液等の生体試料中に存在す
る真菌由来の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを迅速簡便
かつ高い精度で測定することが可能であり、菌培養法等
に代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感
染症の迅速な診断ならびに治療効果の判定に役立つもの
で、特に臨床検査医学に貢献するところで大である。

さらに本発明は、注射用蒸留水、医療用具および注射
薬を汚染した（１→３）−β−Ｄ−グルカンを迅速かつ
正確に測定することを可能とし、また（１→３）−β−
Ｄ−グルカンに代表される抗腫瘍多糖のスクリーニング
にも有力な手法を提供するもので、これらはいずれも本
発明の副次的効果として、とくに医薬品製造分野に貢献
するところ大である。

【図面の簡単な説明】

第１図はカブトガニ血液凝固系のカスケード機構を示
す。第２図はＡ剤、Ｄ剤のエンドトキシンに対する反応性を
示す、第３図はＡ、Ｄ剤の（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに対する反応性を示す。第４図は（１→３）−β−Ｄ
−グルカンの水及びエンドトキシン添加希釈液に対する
Ｄ剤の反応性を示す。第５図は実施例８〜10の（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の検量線を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートと
エンドトキシン感受性因子に対し特異的結合能および中
和能を有するエンドトキシン感受性因子に対する抗体と
を共存させ、該ライセート中のエンドトキシン感受性因
子に対するエンドトキシンの反応性を消失させてなる
（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的に反応する該ラ
イセートを含む（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
剤。
【請求項２】エンドトキシン感受性因子に対する抗体を
固定化した担体に、カブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートを接触させ、該担体を該ライセートから分離させる
ことにより得られる、該ライセート中のエンドトキシン
感受性因子が除去された（１→３）−β−Ｄ−グルカン
に特異的に反応する該ライセートを含む（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定剤。
【請求項３】エンドトキシン感受性因子に対し特異的結
合能および中和能を有するエンドトキシン感受性因子に
対する抗体とカブトガニ・アメボサイト・ライセートと
の組み合わせからなる（１→３）−β−Ｄ−グルカンの
測定キット。
【請求項４】検体に、請求項１又は２に記載の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤を混合し、アミダーゼ
活性又は凝固反応を測定する（１→３）−β−Ｄ−グル
カンの測定法。
【請求項５】検体とエンドトキシン感受性因子に対し特
異的結合能および中和能を有するエンドトキシン感受性
因子に対する抗体との混合物を、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセートに接触され、アミダーゼ活性又は凝固
反応を測定する（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
法。