JPH0452558A - （１→３）―β―Ｄ―グルカンの測定剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用
いる（１−３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下、単にラ
イセードという）を使用して、エンドトキシンを測定す
る方法が知られている。この方法は、ライセードが微量
のエンドトキシンにより凝固することに基づいているが
、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつか
の凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らかに
されている（中村隆範はか、日本細菌学雑誌、卦、７８
１−８０３　（１９８３１１゜ すなわち、第１図に示すように、ライセードにエンドト
キシンが加わるとＣ因子（エンドトキシン感受性因子、
分子量１２３．０００）を活性化して活性型Ｃ因子とな
り、これはＢ因子（分子量６４．０００）を限定水解し
、活性化して活性型Ｂ因子となり、これはプロクロツテ
ィングエンザイム（分子量５４．０００）を活性化して
クロツティングエンザイムに変換する。クロッティング
エンザイムはコアギュローゲン（凝固クンバク、分子量
１９，７２３）のＡｒｇ”−Ｔｈｒ”とＡ　１ｇ４６　
　Ｇ　１　ｙ４？の特定箇所を限定水解することにより
ペプチドＣを遊離し、コアギュローゲンをコアギュリン
に変換して凝固（ゲル化）させる。岩永らの方法（Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　７．１８３−１８８（１９７８
１）により、さらにこのコアギュローゲンの氷解部位と
共通のアミノ酸配列を持った合成ペプチド、すなわち発
色合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニ
トロアニリド（ｐＮＡ）あるいは発蛍光合成基質Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−
アミドとライセードを組み合わせた定量性のある測定法
が知られている。

該測定法は、エンドトキシンが引金（トリガー）となっ
て複数の凝固因子（全てセリンプロテアーゼ前駆体）を
順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコア
ギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用してい
る。

また、ライセードに（１→３）−β−Ｄ−グルカンが加
わると、第１図におけるＣ因子を活性化して活性型Ｃ因
子となり、これがプロクロツティングエンザイムをクロ
ッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場合
と同様にクロッティングエンザイムがコアギュローゲン
をコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基質
を氷解する（森田ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　１２９
．３１８−３２１（１９８１））。

このＣ因子に反応する物質としては（１→３）−β−Ｄ
−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらにはセ
ルロース系血液透析膜の洗浄液中及び酸膜と接触した血
液中に含まれる物質などが知られており、これらはいず
れもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認め
られている。

一方、（１→３）−β−Ｄ−グルカンは真菌細胞壁の構
成多糖体としても知られ、特に血液中の（１−３）−β
−Ｄ−グルカンを測定することにより体内における真菌
の存在を検知することができるので、（１→３）−β−
Ｄ−グルカンをエンドトキシンの影響を全（受けずに、
高い感度で再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医
学の分野で望まれている。

また、抗Ｃ因子モノクロナール抗体を１７種作成し、そ
のエピトープ領域を同定すると共に、Ｃ因子活性化に対
する影響を調べた報告がなされている（三浦芳樹ら、生
化学、　６１．　Ｎｏ、９　、８３４ｒｉｐ−Ａｊ０６
　　リポ多糖感受性セリンプロテアーゼ前駆体（Ｃ因子
）のモノクロナール抗体の同定とその活性化機作解析へ
の応用」、平成元年９月２５日、財団法人日本生化学会
発行）。

ライセード中のＣ因子を用いることにより（１−３）−
β−Ｄ−グルカンを測定する方法が報告されている（太
材ら、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ。

１４９、５５−６５　ｆ１９８５１１が、この方法はラ
イセードをゲル濾過法によりあるいはヘパリンまたはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィーにより分画し、エンドトキシン感
受性のＣ因子を除去することにより、Ｃ因子とプロクロ
ッティングエンザイムのみで再構成するもので、きわめ
て煩雑な操作を必要とする方法である。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、エンドトキシン感受性因子に対する抗体を使
用し、エンドトキシン感受性のＣ因子の影響を受けずに
、ライセード中のＣ因子による反応を利用して（１−３
）−β−Ｄ−グルカンを測定する試薬に関する。

すなわち、本発明の（１−３）−β−Ｄ−グルカンの測
定剤は、 （１）ライセードと、エンドトキシン感受性因子に対す
る抗体とからなる（ｌ→３）−β−〇−グルカンの測定
剤、および （２）エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化
した担体に、ライセードを接触させて得たエンドトキシ
ン感受性因子不含ライセードからなる（１−３）−β−
Ｄ−グルカンの測定剤、である。

エンドトキシン感受性因子は、前述したようにエンドト
キシンによって活性化されるＣ因子およびこの活性型Ｃ
因子により活性化されるＢ因子であり、　（１→３）−
β−Ｄ−グルカンをエンドトキシンの影響を受けること
なく特異的に測定するには、ライセードに含まれるこれ
らＣおよびＢ因子の影響を排除しなければならない。こ
のため本発明ではＣ因子またはＣおよびＢの混合因子（
ＣＢ因子）に対する抗体をライセードと共に用いるか、
または抗Ｃ因子固定化によるＣ因子不含ライセードを用
いるものである。

本発明で使用するライセードは、リムルス・ポリフエム
ス（Ｌ、Ｉ）ｏｌｙｐｈｅｍｕｓ、アメリカ産）、タキ
ブレウス・ギガス（Ｔ、　ｇｉｇａｓ、タイ国、マレシ
ア半島産）、タキブレウス・トリデンタツス（Ｔ、　ｔ
ｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ、日本産）、カルシ／　スｍｌ　
ＪＬ、　ヒウス・ロツンデイカウダ（Ｃ，ｒｏｔｕｎｄ
ｉｃａｕｄａ、タイ国、マレーシア半島産）等のカブト
ガニから血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、
その成分（ライセード）を分離する。ライセードは一４
０°Ｃ以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解し
て使用するのが望ましい。

得られたライセードからＣ因子に対する抗体を製造する
には、まず抗原となるＣ因子を精製しなければならない
が、この方法としては、アガロス、セファロース（ファ
ルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等の適当
な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化したも
のにライセードを接触させ、ＣまたはＣＢ因子を含む画
分を採取する方法を採用することができる。接触させる
方法としては、例えば、上記固定化物とライセードとを
溶液中で接触させる方法、カラムクロマトグラフィーに
より接触させる方法等を挙げることができる。

エンドトキシン感受性因子を抗原とする抗体は、精製し
たエンドトキシン感受性のＣ因子またはＣおよびＣＢ因
子を抗原として使用し、これら抗原に対するポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する。

本発明で使用するポリクローナル抗体の製造方法として
は、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、得
られた抗体を、さらに精製することが望ましい。被免疫
動物に投与する際に、補助剤（アジュバント）を併用す
ることは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。

本発明で使用するモノクローナル抗体の製造方法として
は、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した後
に牌臓などを摘出し、該牌臓などから採取した細胞と腫
瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハ
イブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試験
管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマ
から上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細胞
株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウスの
腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクロ
ーナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる
。細胞融合に用いる細胞としては、牌細胞以外にリンパ
節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることがで
きる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のも
のに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体
産生ハイブリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクロナル抗体の
精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等
の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポリエ
チレグリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法、
ないしは電気泳動、ＤＥＡＥ、ＣＭ−誘導体等のイオン
交換体やプロティンＡならびにハイドロキシアパタイト
吸着体による吸脱着法、ゲル濾過および超遠心法等を挙
げることができる６ （１−３）−〇−Ｄ−グルカンを測定する上記（１）の
方法において、該抗体をライセードと（１−３）−β−
Ｄ−グルカン溶液中に存在させるには、例えばライセー
ドの凍結乾燥品を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解し
て調製した溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセ
ード中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して
得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用い
る方法、ライセードと合成基質の凍結乾燥品を適当な緩
衝液等で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液を添加す
る方法、ライセードと合成基質の混合液中に予め必要量
の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あ
るいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、および必要
量の該抗体溶液を試料に添加する方法等が挙げられる。

また、上記（２）の方法に用いる該抗体の固定化担体に
ライセードを接触させてＣ因子を含まないライセードを
得る方法としては、該担体にライセードを接触させた後
に、遠心分離、ｉ濾過等の手法により該担体を除去する
方法、あるいは該担体を充填したカラムにライセードを
添加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。

該抗体の固定化担体としては、例えばセルロファイン（
生化学工業株式会社　販売、商品名）またはセファロー
ス等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通常
の方法により共有結合させた固定化担体を用いることが
できる。担体としては、この他にもセルロール、アガロ
ース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シリ
カビーズ等を用いることができる。

さらにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法として
、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方法
、例えば担体をエポキシ活性化後ホルミル化したのち、
抗体を結合させる方法等を挙げることができる。

ライセードを固定化担体に接触させる場合のｐＨとして
は、ライセード中のＣ因子および（１→３）−β−Ｄ−
グルカンとＣ因子により開始される経路に関与する凝固
因子が不活化されない程度のｐＨであれば良いが、好ま
しくはｐＨ６〜９の範囲が好ましい。また、接触させる
場合の温度としては、該凝固因子が同様に不活化されな
い温度であれば良いが、通常０〜４５℃、より好ましく
は０〜１０°Ｃである。

本発明により、（１−３）−β−Ｄ−グルカンを測定す
る生体試料としては、血液、血漿または血清の他に、脳
を髄液、腹水、関節液、胸水および尿などの体内外の浸
出または排泄液を挙げることができる。たとえば、血漿
を試料とするときは、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸等
の抗凝固剤を加えて分離することが必要である。

本発明の測定剤を用いて（１→３）−β−Ｄ−グルカン
を測定法するには、前述の発色合成基質あるいは発蛍光
合成基質を反応液中に共存させ、クロッティングエンザ
イムのアミグーゼ活性を測定する方法、凝固反応による
ゲル形成の有無を肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴っ
て生ずる濁度を適当な光学系を用いて測定する比濁法、
一定の濁度に達するまでの時間を適当な光学系を用いて
測定する比濁時間分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変
化を共振周波数の変化としてとらえ、水晶振動子ゲル化
測定装置を用いて測定する方法等を採用することができ
る。

［作用］ 本発明の（１−３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤は、Ｃ
因子に対する抗体を使用しているので、少量でも優れた
Ｃ因子に対する特異的結合能および中和効果を示すこと
が第一の特徴である。また、該抗体はリムルス反応阻害
物質として知られているアンチトリプシン、アンチトリ
ンビン■■等のプロテアーゼインヒビター類を含まず、
Ｃ因子活性を全く損なわないことが第二の特徴である。

（実施例） 以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。

実施例Ｉ ＢおよびＣ因子に対するポリクローナル抗体の製造 カブトガニ血リンパ液１．０℃を４℃下に、１．５００
ｒｐｍで１０分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイ
ト）約５０ｇに２５０−の０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）を加え、ホモゲナイザ−（ポリトロン
ＲＰＴＩＯ（商ｍ　）　、　Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製
）にて均一に破砕及び抽出し、冷却遠心分ｌ１ｉｆｆ１
機（トミー精工ＲＤ−２０１１Ｉ　）にて、１０．ＯＯ
Ｏｒｐｍで３０分間遠心した。得られた沈澱物をさらに
１５０−の同上緩衝液にて２回抽出し、最終的に５５０
−のライセードを得た。

同ライセード全量を、デキストラン硫酸固定化セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（５Ｘ２３ｃｍ、０．０５ＭＮａ
Ｃｌ２含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）で平衡化）に添加し、０．４５ＭＮａＣｆｆ含有０．
０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ１４８．　Ｏ）にて溶出
される画分、すなわち第１図に示すＢおよびＣ因子を含
むＢＣ画分を、後記する大鉢らの方法（Ｃ１ｉｎ、　（
：ｈｉｍ、　Ａｃｔａ、１４９．５５−６５　＋１９８
５１１　により、その活性を測定した。ついでその４０
−を１０−に減圧濃縮後、ＣＥ両因子の活性化を防ぐた
めに０．２３ｇのＥＤＴＡ−４Ｎａを添加した。

その１．０−に等量のフロイントコンプリートアジュバ
ント（ヤトロン社販売、商品名）を加え、ウサギ（ＪＷ
、２２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０
，３−１０．３−および０．４−ずつ皮下注射（感作）
した。感作は２週間に１度肝５回行い、ゲル内二重拡散
法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より１週間
後に頚静脈を切開して全採匍した。ひきつづき室温１時
間、４℃−晩放置後、２．０００ｒｐｍで５分間遠心分
離を行い、得られた血清５５−に５６℃で３０分間の熱
処理を行い非動化した後、防腐剤として０．０６ｇのア
ジ化ナトリウム（０，１％（Ｗ／Ｖ＋１　を添加した。

その血清の４８−に対して３４％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ　ａ　
２Ｓ　０４溶液を４８−加え、生じた沈澱を１０．ＯＯ
Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し沈澱を１７％（Ｗ／ＶＩ
　Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４溶液で２回洗浄し、その沈澱を
Ｏ，１Ｍｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５０−に
溶解した。この溶液に、固形のＮ　ａ　ｔ　Ｓ　Ｏ４７
，５ｇを撹拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と
同様のトリス−塩酸緩衝液に溶かし、さらにＮａ　ｗ　
Ｓｏ　４濃度７．５ｇ１５０ｍ１１の条件で沈澱操作を
３回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。ひき
つづき０．０５ＭＮＨ４ＨＣＯ，で平衡化したセルロフ
ァインＧＨ−２０ｍ　（生化学工業株式会社販売、商品
名）カラム（２，８Ｘ９０ｃｍ、０．０５ＭＮＨ、Ｃｏ
　、で溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、ウサ
ギ抗（ＢＣ画分）血清のＩｇＧ溶液を得た。

［ＣおよびＢ因子活性測定法］ ０、２Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨＢ、　　Ｏｌｏ
、０１３Ｍ　ＭｇＣｌ２ｇ含有）０．１ＭＩＪ：、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　Ｇ１１ｌ：　Ｂ４由来のエンドトキシン（
６００ｎｇ／Ｍ１）３０ｕを加え、さらに各画分５０Ｊ
Ｌ１を添加後、３７℃で１５分間加温する。ひきつづき
、０．００５ＭＮ−クーシャリ−ブトキシカルボニル（
Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　（ｐ−ニ
トロアニリド）２０μと凝固酵素前駆体（プロクロッテ
インクエンザイム）５０μを加え、３７℃で反応させる
。発色が認められることを確認し、０．６Ｍの酢酸０，
８−を添加することにより反応を停止し、次いで４０５
ｎｍの吸光度を測定する。

実施例２ 精製Ｃ因子に対するポリクローナル抗体の製造 カブトガニ血リンパ１．２２を４℃下に１．５０Ｏｒｐ
ｍで１０分間遠心し、その沈澱部分（アメーボサイト）
約５３ｇに２５０ｍ／の０．０２Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０，０，０５Ｍ　ＮａＣｆｆ、Ｏ，００
１Ｍベンズアミジン、０．ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ−４Ｎａ
含有）を加え、実施例１と同様に破砕、抽出後。

１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心した。得られた沈澱
を２００ｍ１の同上緩衝液にてさらに２回抽出し、最終
的に６４０１ｄｌのライセードを得た。

同ライセード全量を、デキストラン硫酸固定化セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（５ｘ２３．５ｃｍ、０．０５Ｍ
ＮａＣｊ２含有０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐｎｓ
、ｏで平衡化）に添加し、０．５ＭＮａＣ！２含有０．
０２Ｍ　Ｉ−リス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０）にて溶
出される画分（Ｂ因子およびＣ因子、活性測定法は後記
する中村らのＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１
５４．５１１−５２１　（１９８６）記載の方法による
）を限外濾過（ダイアフロー・メンブレンＰＭＩＯ、ア
ミコン社）にて濃縮し、セファロースＣＬ−６Ｂ　（フ
ァルマシア社製）カラム（４，ＯＸ１２９ｃｍ、Ｏ，Ｉ
Ｍ　ＮａＣＪｌ！を含む０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５，０で平衡化）によるゲルを濾過およびＣＭ
、−セファロースＣＬ−６８（７フル？シア社製）カラ
ム（２，０Ｘ２５ｃｍ、前記と同様の緩衝液で平衡化し
、０．ＩＭから０．３５ＭまでのＮａＣｊ！グラジェン
トで溶出）によるイオン交換にて、精製Ｃ因子１５．５
ｍｇを得た。精製Ｃ因子の純度をＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動にて検討した結果、非還元条件下にて１本
の明瞭なバンド、還元条件下では２本のバンドに分かれ
た。このことより、当該Ｃ因子は、Ｓ−８結合で結ばれ
た２本のポリペプチド鎖から成る高純度の精製標品であ
ることが明らかであろう。

［Ｃ因子活性測定法］ １Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐｎｓ、ｏ、０．０５Ｍ　Ｍ
ｇＣρ２含有）２０μに、Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１：
　Ｂ４由来のエンドトキシン（１０μｇ／Ｊ）４μを加
え、さらに各画分１Ｏ−２０ｐ−１を添加後全量を２０
０４とし、３７℃で１０分間加温する。ひきつづき、０
．００２ＭＢＣＩＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
５０４を加え、３７℃で７分間加温する。０．６Ｍの酢
酸０．８−を添加して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光
度を測定する。

［Ｂ因子活性測定法］ １Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０，００５Ｍ　Ｍ　
ｇ　ＣＲ２含有）２０μに活性型Ｃ因子溶液（Ｃ因子よ
りエンドトキシン添加にて調製、２２Ｍｇ／−）１ＯＮ
！を加え、さらに各画分１０μを添加後全量を２００４
とし、３７℃、１０分間加温する。ひきつづき、０．Ｏ
０５ＭＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２０ｕ
と凝固酵素前駆体（プロクロツテイングエンザイム、０
．９６ｍｇ／−）３０μを加え、３７°Ｃて３分間加温
する。０．６Ｍの酢酸０．８−を添加して反応を停止し
、４０５ｎｍの吸光度を測定する。

上記により精製したＣ因子溶液４０−を１０−に濃縮後
、Ｂおよび０両因子の活性化を防ぐため０２３ｇのＥＤ
ＴＡ−４Ｎａを添加した。そのｌ　Ｏ−に等量のフロイ
ントコンプリートアジュバントを加え、ウサギ（ＪＷ、
♂、２．５ｋｇ）の背中、尻および横腹のそれぞれに０
．３−１０．３−および０．４−づつ皮下注射（感作）
した。感作は２週間に１度肝５回行い、ゲル内二重拡散
法により抗体価の上昇を確認後、最終感作臼より１週間
後の頚静脈切開により全採血した。

ひきつづき室温１時間、４℃−晩放置後、２．０００ｒ
ｐｒｒｌで５分間遠心分離を行い、得られた血清６２−
に５６℃で３０分間の熱処理を行い非動化した後、防腐
剤として０．０６ｇのアジ化ナトリウム（０，１％（Ｗ
／Ｖ））を添加した。

４８ＮＩ！の血清に対して３４％（Ｗ／ＶＩ　Ｎ　ａ　
２　Ｓ　Ｏ４溶液を４８ＭＩ加え、生じた沈澱を１０．
００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈澱を１７％（Ｗ
／Ｖ）Ｎａｇ　５０４溶液で２回洗浄し、その沈澱を０
．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　５０−に溶
解した。この溶液に固形のＮａｚ　５Ｏ４７，５ｇを撹
拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と同様のトリ
ス−塩酸緩衝液に溶かし、さらにＮａａＳＯ４濃度７．
５ｇ１５０−の条件で沈澱操作を３回繰り返し、最終沈
澱を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき０．０５ＭのＮ
Ｈ，ＨＣＯ，で平衡したセルロファインＧＨ−２Ｏｎ＋
カラム（２，’８ｘ９０ｃｍ、０．０５ＭＮＨ４ＨＣＯ
ａにて溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、抗Ｃ
因子血清のＩｇＧ溶液を得た。

実施例３ 精製Ｃ因子に対するモノクローナル抗体の製造 実施例２で得られたＣ因子０５−（タンパク量、２００
μｇ／ＷＴＩ）を等量のフロイントコンプリートアジュ
バントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ１５週令、体重
２５ｇ）の背中に０．２−および尻に０３−を皮下注射
し、２度目の感作を２週目に行い、３週後に３００μｇ
／−のＣ因子０３−を静脈内投与し最終免疫とした。こ
れより４日後に９．３Ｘ１０’個の牌細胞を分離し、マ
ウスミエローマ５Ｐ１０細胞の１．９ｘｌＯ’個と常法
により融合させて、ハイブリドーマを作成した。得られ
たハイブリドーマにつき、Ｃ因子に結合すること、また
はＣ因子活性を中和させることができることを確認した
。つづいて、上記と同様のマウス腹腔内にプリスタン（
２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を０
．２−投与し、１週後にハイプリドーマ３ｘｌＯ’／匹
を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留がみられる２週目に
腹水を回収し、４０％飽和硫酸アンモニウムでＩｇＧ画
分を沈澱させ、最終的な腹水型モノクローナル抗体を得
た。

実施例４ 抗Ｃ因子固定化セルロファインによるＣ因子不含ライセ
ードの調製 実施例１に記載の方法で得られたライセード１００−を
、０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，１５Ｍ
ＮａＣｊ２含有）で平衡化したエンドトキシンおよびβ
−グルカン不含の抗Ｃ因子固定化セルロファイン（調製
方法は後記）カラム（１，３ｘ　１２ｃｍ）に添加し、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、ＩＭ　Ｎａ
Ｃｆｆ含有）にて洗浄後、素通りした非吸着画分を集め
、Ｃ因子を全く含まないＣ因子不含ライセードを得た。

［抗Ｃ因子固定化セルロファインの調製方法］ ホルミルセルロファイン１０ｇを０，１Ｍリン酸−Ｎａ
緩衝液（＋）Ｈ７，１）で充分洗浄し、実施例１〜４に
記載のＣ因子に対する抗体溶液（１０ｍｇ／ｍｈｏ、Ｉ
　Ｍリン酸−Ｎａ緩衝液、ｐＨ７，１）１０−に懸濁し
、ＮａＣＮＢＨｓ５０ｍｇを加え溶解させる。ひきつづ
き室温で８時間ゆるやかに撹拌し、０．２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄、濾過し、１０ｍｇのＮ
ａＣＮＢＨ，を含む５−の上記緩衝液を加え、室温で３
時間振とうする。その後、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８、Ｏｌｏ、１５ＭＮａＣｊ２含有）で充分洗浄
する。

実施例５ ポリクローナル抗体を使用する（ｌ→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定 以下の方法で３種類の試薬を調製し、３種類の試料につ
いてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセード４４０ｄ、塩化マグネシウム４４０
μモル、およびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡ２．８６μモルを混合し、凍結乾燥して調製した。

Ｂ剤は、Ａ剤の成分に実施例１で調製した抗ＢＣ画分血
清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ／ＭＩ０．０２Ｍ　トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２２０ｕを添加、混合し、凍
結乾燥して調製した。Ｃ剤はＡ剤の成分に実施例３で調
製した抗Ｃ因子血清のＩｇＧ画分の１０ｍｇ／１ｎＩ０
．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液２２０４を添加、混合し、
凍結乾燥して調製した。

３種類の試薬それぞれを２．２−の０．２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８、０）に溶解させ、その溶液０．　１
１Ｉｄ！を試験管に分注し、そこへ試料０．１−を添加
してよく混合し、３７℃にて３０分間反応させた。３種
類の試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐ
ＮＡを、０．５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，
４８Ｍ塩酸溶液を含む）、０．３％スルファミン酸アン
モニウム、０．０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジ
アミンニ塩酸塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの
吸光度値で示した。その結果を第１表に示した。この結
果から、ＢＣ画分に対するポリクローナル抗体及びＣ因
子に対するポリクローナル抗体を添加して調製した試薬
を用いれば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、（
１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に定量することが
できることは明らかである。

実施例６ （１−３）−β−Ｄ−グルカンの測定 以下の方法で２種類の試薬を調製し、エンドトキシン及
び（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比較
検討した。Ａ剤は、ライセード４．４０＄、塩化マグネ
シウム４４０μモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡ２８６ｕモルを混合し、凍結乾燥して調製した
。Ｄ剤はＡ剤の成分に、実施例３で調製した精製Ｃ因子
に対して中和能のあるモノクローナル抗体を含む溶液１
００μを添加して、凍結乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを２．２１ｎＩの０．２Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８、０）に溶解させ、その溶液０．
１−を試験管に分注し、そこへ試料０１−を添加してよ
く混合し、３７℃にて３０分間反応させた。２種類の試
薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐＮＡを
０．５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８Ｍ塩
酸）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０７
％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩を順
次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示した。

第２図はエンドトキシンに対する反応性を比較した実験
結果である。Ａ剤はエンドトキシンに対して濃度依存的
に反応するが、Ｄ剤は１．０００ｎｇ／−のエンドトキ
シンに対しても全く反応しない。この結果は、精製Ｃ因
子に対するモノクローナル抗体が、ライセード中のＣ因
子を完全に中和し、エンドトキシンに対する反応性を消
失させていることを示している。

第３図は、Ａ、Ｄ両試薬の（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに対する反応性を用量反応曲線で比較した結果である
。２つの試薬の用量反応曲線はほとんど一致しており、
このことはＤ剤に含まれる精製Ｃ因子に対するモノクロ
ーナル抗体が、ライセードの（１→３）−β−Ｄ−グル
カンに対する反応性に全く影響を与えないことを示して
いる。

第４図は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの蒸留水による
希釈系列と、１１００ｎ／−のエンドトキシン溶液によ
る希釈系列に対するＤ剤の用量反応曲線である。２つの
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、Ｄ
剤を用いれば、試料中に混在するエンドトキシンには全
く影響されずに（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的
に定量できることを示している。

以上の結果から、精製Ｃ因子に対するモノクローナル抗
体を添加して調製した試薬を用いれば、エンドトキシン
の影響を全く受けずに、（１−３）−β−Ｄ−グルカン
を特異的に定量することができることは明らかである。

実施例７ （１−３）−β−Ｄ−グルカンの測定 以下の方法で２種類の試薬を調製し、３種類の試料につ
いてその反応性を比較検討した。

Ａ剤は、ライセード４４０μ、塩化マグネシウム４４０
μモルおよびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ２．８６ｕモルを混合し、凍結乾燥して調製した。Ｅ
剤は、実施例４で調製したＣ因子不含ライセード４４０
４、塩化マグネシウム４４０ｕモル、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２．８６μモルを混合し、凍結
乾燥して調製した。

２種類の試薬それぞれを２．２−の０２Ｍトノスー塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、その溶液０．１−を試
験管に分注し、そこへ試料０．　１−を添加してよく混
合し、３７°Ｃにて３０分間反応させた。２種類の試薬
に対する試料の反応性は、３０分後に生したｐＮＡを、
０．５−の０．０４％亜硝酸ナトリウム（０，４８Ｍ塩
酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．
０７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩
を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示し
た。その結果を第２表に示した。

この結果から、Ｃ因子不含ライセードを用いて調製した
試薬によれば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、
（ｌ→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に定量すること
ができることは明らかである。

実施例８ 血漿検体の測定 対象は、真菌による敗血症を疑った自治医大血液科に入
院中の重症血液疾患（急性リンパ性白血病、急性骨髄性
白血病、多発性骨髄腫等）を有する患者の１１例で、そ
れぞれ無菌的に採血したヘパリン加血漿を試料として、
４℃で１５０ｘＧ、１０分間遠心して多血小板血漿（Ｐ
ＲＰＩを得た。その０１−に０．３２Ｍの過塩素酸０．
２−を加え、３７℃で２０分間加温し、析出物を遠心（
３，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間）除去し、その上清００５
−に０．１８ＮＮａＯＨを０．０５−加えて中和し被検
液とした。

ひきつづき実施例６に記載の方法で調製した、本発明に
よる（ｌ→３）−β−Ｄ−グルカン測定系０１−を加え
、３７℃で３０分間加温した。この溶液に０．０４％亜
硝酸ナトリウム（０，４８Ｍ塩酸溶液）、０３％スルフ
ァミン酸アンモニウム、０．０７％Ｎ−（１−ナフチル
）エチレンジアミンニ塩酸塩の各０．５−を順次加えて
ジアゾカップリングし、５４５　ｎ＋ａでその吸光度を
測定し、別に作成した検量線（第５図）のａより（１→
３）−β−Ｄ−グルカン換算量として表わした。第３表
に示すように１１例金側において高濃度の（１−３）−
β−Ｄ−グルカンが検出され（健常人＝０．２±０．３
ｐｇ／ＮＩ）、そのうちの５例（Ｎｏ、　１−Ｎｏ、　
５　）は、血培にて、カンシタ・アルビカンス（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　、カンジダ・グリエル
モンディ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄ
ｉｉ）　、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　、カンジダ・クルセイ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）およびクリプトコツカス°
ネオフオルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏ
ｆｏｒｍａｎｓｌをそれぞれ検出し、残りの２例（Ｎｏ
、　６〜Ｎｏ、　７　）は血培では陰性であったが、死
亡後の解剖による組織病理学的検査によりアスペルギル
ス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇ
ａｔｕｓｌを検出した。さらに残り４例（Ｎｏ、　８〜
Ｎｏ、　ｌ　１　）については、臨床症状、経過、薬剤
感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず、血
培では陰性であったが、抗真菌剤（アンホテリシン、ミ
コナゾール、フルコナゾール）投与により、臨床的に顕
著な改善を見た。従って、本発明方法はセルロース系透
析膜による血液透析施行例（第４表のＮｏ、　１−Ｎｏ
、　５　）を除いて、真菌感染症とりわけ通常の検査法
では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断
法としてきわめて有力な手法として評価されつるもので
あることが理解できよ第４表 セルロースアセテート膜による血液透析患者の血中の（
１−３）−β−Ｄ−グルカン濃度４０２８．０ 実施例９ 尿検体の測定 自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培
養でカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉ
ｃａｎｓ）　、カンジダ・グラブレイク（Ｃａｎｄｉｄ
ａｇｌａｂｒａｔａ）を検出した３症例につき、本発明
方法による尿中（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定量を
行った。

尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コツプに採取し、その０
．００５−に実施例７に記載の本発明方法による（１−
３）−β−Ｄ−グルカン測定系０．２ＭＩを加え、３７
℃で３０分間加温した。実施例８と同様にジアゾカップ
リング後、５４５ｒｖでその溶液の吸光度を測定し、別
に作成した検量線（第５図）のｂより（１→３）−β−
Ｄ−グルカン換算値として表わした。第５表に示すよう
に３例中全例において高濃度の（１−３）−β−Ｄ−グ
ルカンが検出され（健常人：１０ｐｇ／−以下）、本発
明方法は真菌性尿路感染症の迅速確定診断法として、き
わめて有力な手法であることが理解できよう。

第５表 真菌感染床の尿中〔ｌ→３）−β−Ｄ−グルカン濃度 ３　　Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ　　＞１０’
　　　　　　　１６．７＊コロニ一形成単位 実施例１Ｏ 脳を髄液検体の測定 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプト
コツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を検出した真菌性髄膜炎の
３症例につき、本発明方法による（１→３）−〇−Ｄ−
グルカンの定量を行った。

腰椎穿刺にて無菌的に採取した髄液０．０５ｍｔ’に注
射用蒸留水０．０５−を加え、さらに実施例５に記載の
本発明方法による（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定系
０．１−を加え、３７℃で３０分間加温した。実施例８
と同様にジアゾカップリング後、５４５ｎｍでその溶液
の吸光度を測定し、別に作成した検量線（第５図）のｂ
より（１→３）−β−Ｄ−グルカン換算値として表わし
た。第６表に示すように、３例中全例において高濃度の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出され（健常人：１
ｐｇ／−以下）、本発明方法は真菌性髄膜炎の早期迅速
診断法としてきわめて有力な手法として評価され得るも
のであることが理解できよう。

第６表 真菌感染髄液の髄液中（ｌ→３）−β−Ｄ−グルカン濃
度 ３　　Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎ
ｓ　　　　　　１０５．０［発明の効果］ 以上述べたように、本発明はライセードを用いた〔ｌ→
３）−β−Ｄ−グルカンに特異的な測定剤を提供するも
のであり、血液や尿、骨髄液等の生体試料中に存在する
真菌由来の（１−３）−β−Ｄ−グルカンを迅速簡便か
つ高い精度で測定することが可能であり、菌培養法等に
代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染
症の迅速な診断ならびに治療効果の判定に役立つもので
、特に臨床検査医学に貢献するところ大である。

さらに本発明は、注射用蒸留水、医療用具および注射薬
を汚染した（１−３）−β−Ｄ−グルカンを迅速かつ正
確に測定することを可能とし、また（ｌ→３）−β−Ｄ
−グルカンに代表される抗腫瘍多糖のスクリーニングに
も有力な手法を提供するもので、これらはいずれも本発
明の副次的効果として、とくに医薬品製造分野に貢献す
るところ大である。

【図面の簡単な説明】

第１図はカブトガニ血液凝固系のカスケード機構を示す
。 第２図はＡ剤、Ｄ剤のエンドトキシンに対する反応性を
示す。第３図はＡ、Ｄ剤の（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに対する反応性を示す。第４図は（１→３）−β−Ｄ
−グルカンの水及びエンドトキシン添加希釈液に対する
Ｄ剤の反応性を示す。 第５図は実施例８〜１０の（１−３）−β−Ｄ−グルカ
ンの検量線を示す。 第 図 第 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カブトガニ・アメボサイト・ライセートと、エン
   ドトキシン感受性因子に対する抗体とからなる（１→３
   ）−β−Ｄ−グルカンの測定剤。
2. （２）エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化
   した担体に、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
   接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセー
   トからなる（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定剤。