JPH0452558A - (1→3)―β―D―グルカンの測定剤 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
いる(1−3)−β−D−グルカンの測定剤に関する。
イセードという)を使用して、エンドトキシンを測定す
る方法が知られている。この方法は、ライセードが微量
のエンドトキシンにより凝固することに基づいているが
、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつか
の凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らかに
されている(中村隆範はか、日本細菌学雑誌、卦、78
1−803 (198311゜ すなわち、第1図に示すように、ライセードにエンドト
キシンが加わるとC因子(エンドトキシン感受性因子、
分子量123.000)を活性化して活性型C因子とな
り、これはB因子(分子量64.000)を限定水解し
、活性化して活性型B因子となり、これはプロクロツテ
ィングエンザイム(分子量54.000)を活性化して
クロツティングエンザイムに変換する。クロッティング
エンザイムはコアギュローゲン(凝固クンバク、分子量
19,723)のArg”−Thr”とA 1g46
G 1 y4?の特定箇所を限定水解することにより
ペプチドCを遊離し、コアギュローゲンをコアギュリン
に変換して凝固(ゲル化)させる。岩永らの方法(Ha
emostasis、 7.183−188(1978
1)により、さらにこのコアギュローゲンの氷解部位と
共通のアミノ酸配列を持った合成ペプチド、すなわち発
色合成基質Boc−Leu−Gl y−Arg−p−ニ
トロアニリド(pNA)あるいは発蛍光合成基質Boc
−Leu−Gly−Arg−4−メチルクマリル−7−
アミドとライセードを組み合わせた定量性のある測定法
が知られている。
て複数の凝固因子(全てセリンプロテアーゼ前駆体)を
順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコア
ギュリンゲルを形成するという一連の反応を利用してい
る。
わると、第1図におけるC因子を活性化して活性型C因
子となり、これがプロクロツティングエンザイムをクロ
ッティングエンザイムに変換し、エンドトキシンの場合
と同様にクロッティングエンザイムがコアギュローゲン
をコアギュリンに変換してゲルを形成し、また合成基質
を氷解する(森田ら、FEBS Lett、、 129
.318−321(1981))。
−グルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらにはセ
ルロース系血液透析膜の洗浄液中及び酸膜と接触した血
液中に含まれる物質などが知られており、これらはいず
れもウサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認め
られている。
成多糖体としても知られ、特に血液中の(1−3)−β
−D−グルカンを測定することにより体内における真菌
の存在を検知することができるので、(1→3)−β−
D−グルカンをエンドトキシンの影響を全(受けずに、
高い感度で再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医
学の分野で望まれている。
のエピトープ領域を同定すると共に、C因子活性化に対
する影響を調べた報告がなされている(三浦芳樹ら、生
化学、 61. No、9 、834rip−Aj06
リポ多糖感受性セリンプロテアーゼ前駆体(C因子
)のモノクロナール抗体の同定とその活性化機作解析へ
の応用」、平成元年9月25日、財団法人日本生化学会
発行)。
β−D−グルカンを測定する方法が報告されている(太
材ら、C11n、 Chim、 Acta。
イセードをゲル濾過法によりあるいはヘパリンまたはデ
キストラン硫酸を固定化したアフィニティー担体を用い
るクロマトグラフィーにより分画し、エンドトキシン感
受性のC因子を除去することにより、C因子とプロクロ
ッティングエンザイムのみで再構成するもので、きわめ
て煩雑な操作を必要とする方法である。
用し、エンドトキシン感受性のC因子の影響を受けずに
、ライセード中のC因子による反応を利用して(1−3
)−β−D−グルカンを測定する試薬に関する。
定剤は、 (1)ライセードと、エンドトキシン感受性因子に対す
る抗体とからなる(l→3)−β−〇−グルカンの測定
剤、および (2)エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化
した担体に、ライセードを接触させて得たエンドトキシ
ン感受性因子不含ライセードからなる(1−3)−β−
D−グルカンの測定剤、である。
キシンによって活性化されるC因子およびこの活性型C
因子により活性化されるB因子であり、 (1→3)−
β−D−グルカンをエンドトキシンの影響を受けること
なく特異的に測定するには、ライセードに含まれるこれ
らCおよびB因子の影響を排除しなければならない。こ
のため本発明ではC因子またはCおよびBの混合因子(
CB因子)に対する抗体をライセードと共に用いるか、
または抗C因子固定化によるC因子不含ライセードを用
いるものである。
ス(L、I)olyphemus、アメリカ産)、タキ
ブレウス・ギガス(T、 gigas、タイ国、マレシ
ア半島産)、タキブレウス・トリデンタツス(T、 t
ridentatus、日本産)、カルシ/ スml
JL、 ヒウス・ロツンデイカウダ(C,rotund
icauda、タイ国、マレーシア半島産)等のカブト
ガニから血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、
その成分(ライセード)を分離する。ライセードは一4
0°C以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解し
て使用するのが望ましい。
には、まず抗原となるC因子を精製しなければならない
が、この方法としては、アガロス、セファロース(ファ
ルマシア社販売、商品名)、またはその架橋体等の適当
な担体にデキストラン硫酸、ヘパリン等を固定化したも
のにライセードを接触させ、CまたはCB因子を含む画
分を採取する方法を採用することができる。接触させる
方法としては、例えば、上記固定化物とライセードとを
溶液中で接触させる方法、カラムクロマトグラフィーに
より接触させる方法等を挙げることができる。
たエンドトキシン感受性のC因子またはCおよびCB因
子を抗原として使用し、これら抗原に対するポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する。
は、該抗原をウサギ、ヤギ等の被免疫動物に投与し、得
られた抗体を、さらに精製することが望ましい。被免疫
動物に投与する際に、補助剤(アジュバント)を併用す
ることは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。
は、該抗原をマウスまたはラットの腹腔内に投与した後
に牌臓などを摘出し、該牌臓などから採取した細胞と腫
瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハ
イブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを試験
管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマ
から上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細胞
株を選別し、この選別株を試験管内培養またはマウスの
腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクロ
ーナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる
。細胞融合に用いる細胞としては、牌細胞以外にリンパ
節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることがで
きる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のも
のに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体
産生ハイブリドーマを得ることができる。
精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等
の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポリエ
チレグリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法、
ないしは電気泳動、DEAE、CM−誘導体等のイオン
交換体やプロティンAならびにハイドロキシアパタイト
吸着体による吸脱着法、ゲル濾過および超遠心法等を挙
げることができる6 (1−3)−〇−D−グルカンを測定する上記(1)の
方法において、該抗体をライセードと(1−3)−β−
D−グルカン溶液中に存在させるには、例えばライセー
ドの凍結乾燥品を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解し
て調製した溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセ
ード中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して
得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用い
る方法、ライセードと合成基質の凍結乾燥品を適当な緩
衝液等で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液を添加す
る方法、ライセードと合成基質の混合液中に予め必要量
の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あ
るいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、および必要
量の該抗体溶液を試料に添加する方法等が挙げられる。
ライセードを接触させてC因子を含まないライセードを
得る方法としては、該担体にライセードを接触させた後
に、遠心分離、i濾過等の手法により該担体を除去する
方法、あるいは該担体を充填したカラムにライセードを
添加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。
生化学工業株式会社 販売、商品名)またはセファロー
ス等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通常
の方法により共有結合させた固定化担体を用いることが
できる。担体としては、この他にもセルロール、アガロ
ース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シリ
カビーズ等を用いることができる。
、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方法
、例えば担体をエポキシ活性化後ホルミル化したのち、
抗体を結合させる方法等を挙げることができる。
は、ライセード中のC因子および(1→3)−β−D−
グルカンとC因子により開始される経路に関与する凝固
因子が不活化されない程度のpHであれば良いが、好ま
しくはpH6〜9の範囲が好ましい。また、接触させる
場合の温度としては、該凝固因子が同様に不活化されな
い温度であれば良いが、通常0〜45℃、より好ましく
は0〜10°Cである。
る生体試料としては、血液、血漿または血清の他に、脳
を髄液、腹水、関節液、胸水および尿などの体内外の浸
出または排泄液を挙げることができる。たとえば、血漿
を試料とするときは、ヘパリン、EDTA、クエン酸等
の抗凝固剤を加えて分離することが必要である。
を測定法するには、前述の発色合成基質あるいは発蛍光
合成基質を反応液中に共存させ、クロッティングエンザ
イムのアミグーゼ活性を測定する方法、凝固反応による
ゲル形成の有無を肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴っ
て生ずる濁度を適当な光学系を用いて測定する比濁法、
一定の濁度に達するまでの時間を適当な光学系を用いて
測定する比濁時間分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変
化を共振周波数の変化としてとらえ、水晶振動子ゲル化
測定装置を用いて測定する方法等を採用することができ
る。
因子に対する抗体を使用しているので、少量でも優れた
C因子に対する特異的結合能および中和効果を示すこと
が第一の特徴である。また、該抗体はリムルス反応阻害
物質として知られているアンチトリプシン、アンチトリ
ンビン■■等のプロテアーゼインヒビター類を含まず、
C因子活性を全く損なわないことが第二の特徴である。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。
rpmで10分間遠心し、その沈澱部分(アメーボサイ
ト)約50gに250−の0.02Mトリス−塩酸緩衝
液(pH8,0)を加え、ホモゲナイザ−(ポリトロン
RPTIO(商m ) 、 Kinematica社製
)にて均一に破砕及び抽出し、冷却遠心分l1iff1
機(トミー精工RD−2011I )にて、10.OO
Orpmで30分間遠心した。得られた沈澱物をさらに
150−の同上緩衝液にて2回抽出し、最終的に550
−のライセードを得た。
ースCL−6Bカラム(5X23cm、0.05MNa
Cl2含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0
)で平衡化)に添加し、0.45MNaCff含有0.
02Mトリス−塩酸緩衝液(p148. O)にて溶出
される画分、すなわち第1図に示すBおよびC因子を含
むBC画分を、後記する大鉢らの方法(C1in、 (
:him、 Acta、149.55−65 +198
511 により、その活性を測定した。ついでその40
−を10−に減圧濃縮後、CE両因子の活性化を防ぐた
めに0.23gのEDTA−4Naを添加した。
ント(ヤトロン社販売、商品名)を加え、ウサギ(JW
、22.5kg)の背中、尻および横腹のそれぞれに0
,3−10.3−および0.4−ずつ皮下注射(感作)
した。感作は2週間に1度肝5回行い、ゲル内二重拡散
法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より1週間
後に頚静脈を切開して全採匍した。ひきつづき室温1時
間、4℃−晩放置後、2.000rpmで5分間遠心分
離を行い、得られた血清55−に56℃で30分間の熱
処理を行い非動化した後、防腐剤として0.06gのア
ジ化ナトリウム(0,1%(W/V+1 を添加した。
2S 04溶液を48−加え、生じた沈澱を10.OO
Orpmで30分間遠心分離し沈澱を17%(W/VI
N a 2 S O4溶液で2回洗浄し、その沈澱を
O,1Ml−リス−塩酸緩衝液(pH8,0)50−に
溶解した。この溶液に、固形のN a t S O47
,5gを撹拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と
同様のトリス−塩酸緩衝液に溶かし、さらにNa w
So 4濃度7.5g150m11の条件で沈澱操作を
3回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。ひき
つづき0.05MNH4HCO,で平衡化したセルロフ
ァインGH−20m (生化学工業株式会社販売、商品
名)カラム(2,8X90cm、0.05MNH、Co
、で溶出)を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、ウサ
ギ抗(BC画分)血清のIgG溶液を得た。
、013M MgCl2g含有)0.1MIJ:、E、
coli G11l: B4由来のエンドトキシン(
600ng/M1)30uを加え、さらに各画分50J
L1を添加後、37℃で15分間加温する。ひきつづき
、0.005MN−クーシャリ−ブトキシカルボニル(
Boc)−Leu−Gly−Arg−pNA (p−ニ
トロアニリド)20μと凝固酵素前駆体(プロクロッテ
インクエンザイム)50μを加え、37℃で反応させる
。発色が認められることを確認し、0.6Mの酢酸0,
8−を添加することにより反応を停止し、次いで405
nmの吸光度を測定する。
mで10分間遠心し、その沈澱部分(アメーボサイト)
約53gに250m/の0.02M l−リス−塩酸緩
衝液(pH8,0,0,05M NaCff、O,00
1Mベンズアミジン、0.OOIM EDTA−4Na
含有)を加え、実施例1と同様に破砕、抽出後。
を200m1の同上緩衝液にてさらに2回抽出し、最終
的に6401dlのライセードを得た。
ースCL−6Bカラム(5x23.5cm、0.05M
NaCj2含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液、pns
、oで平衡化)に添加し、0.5MNaC!2含有0.
02M I−リス−塩酸緩衝液(p)18.0)にて溶
出される画分(B因子およびC因子、活性測定法は後記
する中村らのEur、 J、 Biochem、、 1
54.511−521 (1986)記載の方法による
)を限外濾過(ダイアフロー・メンブレンPMIO、ア
ミコン社)にて濃縮し、セファロースCL−6B (フ
ァルマシア社製)カラム(4,OX129cm、O,I
M NaCJl!を含む0.02M酢酸ナトリウム緩衝
液、pH5,0で平衡化)によるゲルを濾過およびCM
、−セファロースCL−68(7フル?シア社製)カラ
ム(2,0X25cm、前記と同様の緩衝液で平衡化し
、0.IMから0.35MまでのNaCj!グラジェン
トで溶出)によるイオン交換にて、精製C因子15.5
mgを得た。精製C因子の純度をSDSポリアクリルア
ミド電気泳動にて検討した結果、非還元条件下にて1本
の明瞭なバンド、還元条件下では2本のバンドに分かれ
た。このことより、当該C因子は、S−8結合で結ばれ
た2本のポリペプチド鎖から成る高純度の精製標品であ
ることが明らかであろう。
gCρ2含有)20μに、E、 coli 0111:
B4由来のエンドトキシン(10μg/J)4μを加
え、さらに各画分1O−20p−1を添加後全量を20
04とし、37℃で10分間加温する。ひきつづき、0
.002MBCIC−Val−Pro−Arg−pNA
504を加え、37℃で7分間加温する。0.6Mの酢
酸0.8−を添加して反応を停止し、405nmの吸光
度を測定する。
g CR2含有)20μに活性型C因子溶液(C因子よ
りエンドトキシン添加にて調製、22Mg/−)1ON
!を加え、さらに各画分10μを添加後全量を2004
とし、37℃、10分間加温する。ひきつづき、0.O
05MBoc−Leu−Gly−Arg−pNA20u
と凝固酵素前駆体(プロクロツテイングエンザイム、0
.96mg/−)30μを加え、37°Cて3分間加温
する。0.6Mの酢酸0.8−を添加して反応を停止し
、405nmの吸光度を測定する。
、Bおよび0両因子の活性化を防ぐため023gのED
TA−4Naを添加した。そのl O−に等量のフロイ
ントコンプリートアジュバントを加え、ウサギ(JW、
♂、2.5kg)の背中、尻および横腹のそれぞれに0
.3−10.3−および0.4−づつ皮下注射(感作)
した。感作は2週間に1度肝5回行い、ゲル内二重拡散
法により抗体価の上昇を確認後、最終感作臼より1週間
後の頚静脈切開により全採血した。
prrlで5分間遠心分離を行い、得られた血清62−
に56℃で30分間の熱処理を行い非動化した後、防腐
剤として0.06gのアジ化ナトリウム(0,1%(W
/V))を添加した。
2 S O4溶液を48MI加え、生じた沈澱を10.
00Orpmで30分間遠心分離し、沈澱を17%(W
/V)Nag 504溶液で2回洗浄し、その沈澱を0
.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0) 50−に溶
解した。この溶液に固形のNaz 5O47,5gを撹
拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と同様のトリ
ス−塩酸緩衝液に溶かし、さらにNaaSO4濃度7.
5g150−の条件で沈澱操作を3回繰り返し、最終沈
澱を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき0.05MのN
H,HCO,で平衡したセルロファインGH−2On+
カラム(2,’8x90cm、0.05MNH4HCO
aにて溶出)を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、抗C
因子血清のIgG溶液を得た。
μg/WTI)を等量のフロイントコンプリートアジュ
バントと混合し、マウス(BALB/C15週令、体重
25g)の背中に0.2−および尻に03−を皮下注射
し、2度目の感作を2週目に行い、3週後に300μg
/−のC因子03−を静脈内投与し最終免疫とした。こ
れより4日後に9.3X10’個の牌細胞を分離し、マ
ウスミエローマ5P10細胞の1.9xlO’個と常法
により融合させて、ハイブリドーマを作成した。得られ
たハイブリドーマにつき、C因子に結合すること、また
はC因子活性を中和させることができることを確認した
。つづいて、上記と同様のマウス腹腔内にプリスタン(
2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)を0
.2−投与し、1週後にハイプリドーマ3xlO’/匹
を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留がみられる2週目に
腹水を回収し、40%飽和硫酸アンモニウムでIgG画
分を沈澱させ、最終的な腹水型モノクローナル抗体を得
た。
ードの調製 実施例1に記載の方法で得られたライセード100−を
、01Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0,0,15M
NaCj2含有)で平衡化したエンドトキシンおよびβ
−グルカン不含の抗C因子固定化セルロファイン(調製
方法は後記)カラム(1,3x 12cm)に添加し、
0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0、IM Na
Cff含有)にて洗浄後、素通りした非吸着画分を集め
、C因子を全く含まないC因子不含ライセードを得た。
緩衝液(+)H7,1)で充分洗浄し、実施例1〜4に
記載のC因子に対する抗体溶液(10mg/mho、I
Mリン酸−Na緩衝液、pH7,1)10−に懸濁し
、NaCNBHs50mgを加え溶解させる。ひきつづ
き室温で8時間ゆるやかに撹拌し、0.2Mトリス−塩
酸緩衝液(pH7,0)で洗浄、濾過し、10mgのN
aCNBH,を含む5−の上記緩衝液を加え、室温で3
時間振とうする。その後、0.1Mトリス−塩酸緩衝液
(pH8、Olo、15MNaCj2含有)で充分洗浄
する。
ルカンの測定 以下の方法で3種類の試薬を調製し、3種類の試料につ
いてその反応性を比較検討した。
μモル、およびBoc−Leu−Gl y−Arg−p
NA2.86μモルを混合し、凍結乾燥して調製した。
清のIgG画分の10mg/MI0.02M トリス−
塩酸緩衝液(pH8,0)220uを添加、混合し、凍
結乾燥して調製した。C剤はA剤の成分に実施例3で調
製した抗C因子血清のIgG画分の10mg/1nI0
.02Mトリス−塩酸緩衝液2204を添加、混合し、
凍結乾燥して調製した。
酸緩衝液(pH8、0)に溶解させ、その溶液0. 1
1Id!を試験管に分注し、そこへ試料0.1−を添加
してよく混合し、37℃にて30分間反応させた。3種
類の試薬に対する試料の反応性は、30分後に生じたp
NAを、0.5−の0.04%亜硝酸ナトリウム(0,
48M塩酸溶液を含む)、0.3%スルファミン酸アン
モニウム、0.07%N−(1−ナフチル)エチレンジ
アミンニ塩酸塩を順次添加して発色させ、545nmの
吸光度値で示した。その結果を第1表に示した。この結
果から、BC画分に対するポリクローナル抗体及びC因
子に対するポリクローナル抗体を添加して調製した試薬
を用いれば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、(
1→3)−β−D−グルカンを特異的に定量することが
できることは明らかである。
び(1→3)−β−D−グルカンに対する反応性を比較
検討した。A剤は、ライセード4.40$、塩化マグネ
シウム440μモル、Boc−Leu−Gly−Arg
−pNA286uモルを混合し、凍結乾燥して調製した
。D剤はA剤の成分に、実施例3で調製した精製C因子
に対して中和能のあるモノクローナル抗体を含む溶液1
00μを添加して、凍結乾燥して調製した。
−塩酸緩衝液(pH8、0)に溶解させ、その溶液0.
1−を試験管に分注し、そこへ試料01−を添加してよ
く混合し、37℃にて30分間反応させた。2種類の試
薬に対する試料の反応性は、30分後に生じたpNAを
0.5−の0.04%亜硝酸ナトリウム(0,48M塩
酸)、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.07
%N−(1−ナフチル)エチレンジアミンニ塩酸塩を順
次添加して発色させ、545nmの吸光度値で示した。
結果である。A剤はエンドトキシンに対して濃度依存的
に反応するが、D剤は1.000ng/−のエンドトキ
シンに対しても全く反応しない。この結果は、精製C因
子に対するモノクローナル抗体が、ライセード中のC因
子を完全に中和し、エンドトキシンに対する反応性を消
失させていることを示している。
ンに対する反応性を用量反応曲線で比較した結果である
。2つの試薬の用量反応曲線はほとんど一致しており、
このことはD剤に含まれる精製C因子に対するモノクロ
ーナル抗体が、ライセードの(1→3)−β−D−グル
カンに対する反応性に全く影響を与えないことを示して
いる。
希釈系列と、1100n/−のエンドトキシン溶液によ
る希釈系列に対するD剤の用量反応曲線である。2つの
用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、D
剤を用いれば、試料中に混在するエンドトキシンには全
く影響されずに(1→3)−β−D−グルカンを特異的
に定量できることを示している。
体を添加して調製した試薬を用いれば、エンドトキシン
の影響を全く受けずに、(1−3)−β−D−グルカン
を特異的に定量することができることは明らかである。
いてその反応性を比較検討した。
μモルおよびBoc−Leu−Gl y−Arg−pN
A2.86uモルを混合し、凍結乾燥して調製した。E
剤は、実施例4で調製したC因子不含ライセード440
4、塩化マグネシウム440uモル、Boc−Leu−
Gly−Arg−pNA2.86μモルを混合し、凍結
乾燥して調製した。
緩衝液(pH8,0)に溶解し、その溶液0.1−を試
験管に分注し、そこへ試料0. 1−を添加してよく混
合し、37°Cにて30分間反応させた。2種類の試薬
に対する試料の反応性は、30分後に生したpNAを、
0.5−の0.04%亜硝酸ナトリウム(0,48M塩
酸溶液)、0.3%スルファミン酸アンモニウム、0.
07%N−(1−ナフチル)エチレンジアミンニ塩酸塩
を順次添加して発色させ、545nmの吸光度値で示し
た。その結果を第2表に示した。
試薬によれば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、
(l→3)−β−D−グルカンを特異的に定量すること
ができることは明らかである。
院中の重症血液疾患(急性リンパ性白血病、急性骨髄性
白血病、多発性骨髄腫等)を有する患者の11例で、そ
れぞれ無菌的に採血したヘパリン加血漿を試料として、
4℃で150xG、10分間遠心して多血小板血漿(P
RPIを得た。その01−に0.32Mの過塩素酸0.
2−を加え、37℃で20分間加温し、析出物を遠心(
3,OOOrpm、10分間)除去し、その上清005
−に0.18NNaOHを0.05−加えて中和し被検
液とした。
よる(l→3)−β−D−グルカン測定系01−を加え
、37℃で30分間加温した。この溶液に0.04%亜
硝酸ナトリウム(0,48M塩酸溶液)、03%スルフ
ァミン酸アンモニウム、0.07%N−(1−ナフチル
)エチレンジアミンニ塩酸塩の各0.5−を順次加えて
ジアゾカップリングし、545 n+aでその吸光度を
測定し、別に作成した検量線(第5図)のaより(1→
3)−β−D−グルカン換算量として表わした。第3表
に示すように11例金側において高濃度の(1−3)−
β−D−グルカンが検出され(健常人=0.2±0.3
pg/NI)、そのうちの5例(No、 1−No、
5 )は、血培にて、カンシタ・アルビカンス(Can
dida albicans) 、カンジダ・グリエル
モンディ(Candida guilliermond
ii) 、カンジダ・トロピカリス(Candida
tropicalis) 、カンジダ・クルセイ(Ca
ndida krusei)およびクリプトコツカス°
ネオフオルマンス(Cryptococcus neo
formanslをそれぞれ検出し、残りの2例(No
、 6〜No、 7 )は血培では陰性であったが、死
亡後の解剖による組織病理学的検査によりアスペルギル
ス・フミガタス(Aspergillus fumig
atuslを検出した。さらに残り4例(No、 8〜
No、 l 1 )については、臨床症状、経過、薬剤
感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず、血
培では陰性であったが、抗真菌剤(アンホテリシン、ミ
コナゾール、フルコナゾール)投与により、臨床的に顕
著な改善を見た。従って、本発明方法はセルロース系透
析膜による血液透析施行例(第4表のNo、 1−No
、 5 )を除いて、真菌感染症とりわけ通常の検査法
では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断
法としてきわめて有力な手法として評価されつるもので
あることが理解できよ第4表 セルロースアセテート膜による血液透析患者の血中の(
1−3)−β−D−グルカン濃度4028.0 実施例9 尿検体の測定 自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培
養でカンジダ・アルビカンス(Candidaalbi
cans) 、カンジダ・グラブレイク(Candid
aglabrata)を検出した3症例につき、本発明
方法による尿中(1→3)−β−D−グルカンの定量を
行った。
.005−に実施例7に記載の本発明方法による(1−
3)−β−D−グルカン測定系0.2MIを加え、37
℃で30分間加温した。実施例8と同様にジアゾカップ
リング後、545rvでその溶液の吸光度を測定し、別
に作成した検量線(第5図)のbより(1→3)−β−
D−グルカン換算値として表わした。第5表に示すよう
に3例中全例において高濃度の(1−3)−β−D−グ
ルカンが検出され(健常人:10pg/−以下)、本発
明方法は真菌性尿路感染症の迅速確定診断法として、き
わめて有力な手法であることが理解できよう。
16.7*コロニ一形成単位 実施例1O 脳を髄液検体の測定 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプト
コツカス・ネオフォルマンス(Cryptococcu
s neoformans)を検出した真菌性髄膜炎の
3症例につき、本発明方法による(1→3)−〇−D−
グルカンの定量を行った。
射用蒸留水0.05−を加え、さらに実施例5に記載の
本発明方法による(1→3)−β−D−グルカン測定系
0.1−を加え、37℃で30分間加温した。実施例8
と同様にジアゾカップリング後、545nmでその溶液
の吸光度を測定し、別に作成した検量線(第5図)のb
より(1→3)−β−D−グルカン換算値として表わし
た。第6表に示すように、3例中全例において高濃度の
(1→3)−β−D−グルカンが検出され(健常人:1
pg/−以下)、本発明方法は真菌性髄膜炎の早期迅速
診断法としてきわめて有力な手法として評価され得るも
のであることが理解できよう。
度 3 Cryptococcus neoforman
s 105.0[発明の効果] 以上述べたように、本発明はライセードを用いた〔l→
3)−β−D−グルカンに特異的な測定剤を提供するも
のであり、血液や尿、骨髄液等の生体試料中に存在する
真菌由来の(1−3)−β−D−グルカンを迅速簡便か
つ高い精度で測定することが可能であり、菌培養法等に
代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染
症の迅速な診断ならびに治療効果の判定に役立つもので
、特に臨床検査医学に貢献するところ大である。
を汚染した(1−3)−β−D−グルカンを迅速かつ正
確に測定することを可能とし、また(l→3)−β−D
−グルカンに代表される抗腫瘍多糖のスクリーニングに
も有力な手法を提供するもので、これらはいずれも本発
明の副次的効果として、とくに医薬品製造分野に貢献す
るところ大である。
。 第2図はA剤、D剤のエンドトキシンに対する反応性を
示す。第3図はA、D剤の(1→3)−β−D−グルカ
ンに対する反応性を示す。第4図は(1→3)−β−D
−グルカンの水及びエンドトキシン添加希釈液に対する
D剤の反応性を示す。 第5図は実施例8〜10の(1−3)−β−D−グルカ
ンの検量線を示す。 第 図 第 図
Claims (2)
- (1)カブトガニ・アメボサイト・ライセートと、エン
ドトキシン感受性因子に対する抗体とからなる(1→3
)−β−D−グルカンの測定剤。 - (2)エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化
した担体に、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセー
トからなる(1→3)−β−D−グルカンの測定剤。
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