WO1991019981A1

WO1991019981A1 - REAGENT FOR DETERMINING (1←3)-β-D-GLUCAN

Info

Publication number: WO1991019981A1
Application number: PCT/JP1991/000845
Authority: WO
Inventors: Shigenori Tanaka
Original assignee: Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1991-12-26
Also published as: DE69123333D1; DE69123333T2; JP2944709B2; US5266461A; EP0491047B1; EP0491047A4; JPH0452558A; EP0491047A1

Description

明細害

( 1 → 3 ) — /3— D—グルカンの測定剤

技術分野

本発明は、カブトガニ · ァメボサイト · ライセートを用いる

( 1 → 3 ) — — D—グルカンの測定剤に関する。

背景技術

力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセート（以下、単にライセートという）を使用して、エンドトキシンを測定する方法が知られている。この方法は、ライセートが微量のエンドトキシンにより凝固することに基づいているが、その後の生化学的解明により、該凝固反応はいくつかの凝固因子の段階的活性化によりおこることが明らかにされている（中村隆範ほか、日本細菌学雑誌、 38、 781-803(1983) )₀

すなわち、第 1 図に示すように、ライセートにエンドトキシンが加わると C因子（エンドトキシン感受性因子、分子量 123 , 000)を活性化して活性型 C因子となり、これは B因子（分子量 64,000 ) を限定水解し、活性化して活性型 B因子となり、これはプロクロッティングェンザィム（分子量 5⁴,000) を活性化してクロッティングェンザィムに変換する。クロッティングェンザィムはコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19,⁷²3) の Arg¹⁸ -Thr^ ⁹ と Arg"-G:iy^{< 7} の特定箇所'を限定水解することによりペプチド Cを遊離し、コアギュローゲンをコアギュリンに変換して凝固（ゲル化）させる。岩永らの方法（Haemostasis, 7, 183-188(1978) ) により、さらにこのコアギュ口一ゲンの水解部位と共通のアミノ酸配列を持った合成ぺプチド、すなわち発色合成基質 Boc -： Leu - Gly - Arg - p —二卜ロアニリド（pNA)あるいは発蛍光合成基質 Boc-Leu-Gly-Arg- 4 一メチルクマリル一 7 —アミドとライセ一トを組み合わせた定量性のある測定法が知られている。該測定法は、エンドトキシンが引金（トリガ一）となって複数の凝固因子（全てセリンプロテアーゼ前駆体）を順次活性化するカスケード機構によって、最終的にコアギユリンゲルを形成するという一連の反応を利用している。

また、ライセートに（ 1 → 3 ) — ;5 — D —グルカンが加わると、第 1 図における G因子を活性化して活性型 G因子となり、これがプロクロッティングェンザィムをクロッティングェンザィムに変換し、エンドトキシンの場合と同様にクロッティングェンザィムがコアギュローゲンをコアギユリンに変換してゲルを形成し、また合成基質を水解する（森田ら、 FEBS Lett. , 129, 318-321(1981) )₀

この G因子に反応する物質としては（ 1 → 3 ) 一 β - Ό ーグルカン、クレスチン、レンチナンなど、さらにはセルロース系血液透析膜の洗浄液中及び該膜と接触した血液中に含まれる物質などが知られており、これらはいずれもゥサギ発熱試験により発熱性を示さないことも認められている。

一方、（ 1 → 3 ) — 9 一 D —グルカンは真菌細胞壁の構成多糖体としても知られ、特に血液中の（ 1 → 3 ) — 3 — D — グルカンを測定することにより体内における真菌の存在を検知することができるので、（ 1 → 3 ) — ー D—グルカンをエンドトキシンの影響を全く受けずに、高い感度で再現性良く測定し得る方法が特に臨床検査医学の分野で望まれている。

また、抗 C因子モノクローナル抗体を 17種作成し、そのェピトープ領域を同定すると共に、 C因子活性化に対する影響を調ベた報告がなされている（三浦芳樹ら、生化学、 ^：, No.9 ,834

Γΐρ- Aj06 リポ多糖感受性セリンプロテアーゼ前駆体（ C因子）のモノクローナル抗体の同定とその活性化機作解析への応用」、平成元年 9月 25日、財団法人日本生化学会発行）。

ライセート中の G因子を用いることにより（ 1 → 3 ) — β —

D—グルカンを測定する方法が報告されている（大林ら、 Clin, Chim. Acta. 149, 55-65(1985 ))が、この方法はライセートをゲル濾過法によりあるいはへパリンまたはデキストラン硫酸を固定化したァフィ二ティ一担体を用いるクロマトグラフィ一により分画し、エンドトキシン感受生の C因子を除去することにより、 G因子とプロクロッティングェンザィムのみで再構成するもので、きわめて煩雑な操作を必要とする方法である。発明の開示

本発明は、エンドトキシン感受性因子に対する抗体を使用し、ェンドトキシン感受性の C因子の影響を受けずに、ライセート中の G因子による反応を利用して（ 1 → 3 ) 一 β — Ό一ゲ力ンを測定する試薬に関する。

すなわち、本発明の（ 1 → 3 ) — ； S— D—グルカンの測定剤は、 (1) ライセートと、エンドトキシン感受性因子に対する抗体とからなる（ 1 → 3 ) — /3 — D—グルカンの測定剤、および

(2) エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、ライセートを接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセートからなる（ 1 → 3 ) — 3— D—グルカンの測定剤、である。

エンドトキシン感受性因子は、前述したようにエンドトキシンによつて活性化される C因子およびこの活性型 C因子により活性化される B因子であり、（ 1 → 3 ) — S— D—グルカンをェンドトキシンの影響を受けることなく特異的に測定するには、ライセートに含まれるこれら Cおよび B因子の影響を排除しなければならない。このため本発明では C因子または Cおよび B の混合因子（ C B因子）に対する抗体をライセートと共に用いるか、または抗 C因子固定化による C因子不含ライセ一トを用いるものである。

本発明で使用するライセートは、リムルス · ポリフヱムス

( L.polyphemus、アメリカ産）、タキプレウス ' ギガス（T. gigas 、タイ国、マレーシア半島産）、タキプレウス · トリデンタツス（T.tridentatus、日本産）、カルシノスコノレピウス . ロッンディ力ウダ（ C. rotundicauda、タイ国、マレーシア半島産）等のカブトガ二から血リンパ液を採取し、次いで該血球を破砕し、その成分（ライセ一ト）を分離する。ライセートは— 40で以下に小分けして保存し、必要に応じ凍結融解して使用するのが望ましい。

得られたライセー卜から C因子に対する抗体を製造するにはまず抗原となる C因子を精製しなければならないが、この方法としては、ァガロース、セファロース（フアルマシア社販売、商品名）、またはその架橋体等の適当な担体にデキストラン硫酸、へパリン等を固定化したものにライセートを接触させ、 C または C B因子を含む画分を採取する方法を採用することができる。接触させる方法としては、例えば、上記固定化物とライセ一卜とを溶液中で接触させる方法、カラムクロマトグラフィ一により接触させる方法等を挙げることができる。

エンドトキシン感受性因子を抗原とする抗体は、精製したェンドトキシン感受性の C因子または Cおよび C B因子を抗原として使用し、これら抗原に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する。

本発明で使用するポリクローナル抗体の製造方法としては、該抗原をゥサギ、ャギ等の被免疫動物に投与し、得られた抗体を、さらに精製することが望ましい。被免疫動物に投与する際に、捕助剤（アジュバンド）を併用することは抗体産生細胞を賦活するので望ましい。

本発明で使用するモノクローナル抗体の製造方法としては、該抗原をマウスまたはラッ卜の腹腔内に投与した後に脾臓などを摘出し、該脾臓などから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイプリドーマを樹立し、得られたハイプリドーマを試験管内にて連続増殖させ、さらに得られたハイプリドーマから上記抗原に対する特異抗体を連続的に産生する細胞株を選別し、この選別株を試験官内培養またはマウスの腹腔などの生体内にて培養することによって、モノクローナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイプリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクロ一ナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニゥム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱およびポリェチレダリコールまたは等電点による選択的沈澱分別法、ないしは電気泳動、 DE AE、 CM-誘導体等のイオン交換体やプロティン Aならびにハイドロキシァパタイト吸着体による吸脱着法、ゲル濾過および超遠心法等を挙げることができる。

( 1 → 3 ) —；3 — D —グルカンを測定する上記 (1)の方法において、該抗体をライセートと（ 1 → 3 ) 一 β — Ό—グルカン溶液中に存在させるには、例えばライセートの凍結乾燥品を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセート中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、ライセートと合成基質の凍結乾燥品を適当な緩衝液等で溶解して調製した溶液に、該抗体溶液を添加する方法、ライセートと合成基質の混合液中に予め必要量の抗体溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で溶解して用いる方法、および必要量の該抗体溶液を試料に添加する方法等が挙げられる。また、上記 (2)の方法に用いる該抗体の固定化担体にライセ一卜を接触させて C因子を含まないライセ一トを得る方法としては、該担体にライセートを接触させた後に、遠心分離、濾過等の手法により該担体を除去する方法、あるいは該担体を充塡したカラムにライセートを添加してその素通り画分を集める方法等が挙げられる。

該抗体の固定化担体としては、例えばセル口ファイン（生化学工業株式会社販売、商品名）またはセファロ一ス等の適当な担体の水酸基と、抗体のアミノ基とを通常の方法により共有結合させた固定化担体を用いることができる。担体としては、この他にもセルロース、ァガロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、多孔性シリカビーズ等を用いることができる。

さらにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法として、担体に活性基を導入したのち、抗体を結合させる方法、例えば担体をエポキシ活性化後ホルミル化したのち、抗体を結合させる方法等を挙げることができる。

ライセートを固定化担体に接触させる場合の PHとしては、ライセート中の G因子および（ 1 → 3 ) — ;3— D —グルカンと G 因子により開始される経路に関与する凝固因子が不活化されない程度の PHであれば良い力、好ましくは PH 6〜 9の範囲が好ましい。また、接触させる場合の温度としては、該凝固因子が同様に不活化されない温度であれば良いが、通常 0〜 ⁴5°C、より好ましくは 0〜 10°Cである。

本発明により、（ 1 → 3 ) — yS — D —グルカンを測定する生体試料としては、血液、血漿または血清の他に、脳脊髄液、腹水、関節液、胸水および尿などの体内外の浸出または排泄液を挙げることができる。たとえば、血漿を試料とするときは、へパリン、 EDTA、クェン酸等の抗凝固剤を加えて分離することが J必要である。

本発明の測定剤を用いて（ 1 → 3 ) — ー D —グルカンを測定するには、前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質を反応液中に共存させ、クロッティングェンザィムのアミダーゼ活性を測定する方法、凝固反応によるゲル形成の有無を肉眼的に調べるゲル化法、凝固に伴って生ずる濁度を適当な光学系を用いて測定する比濁法、一定の濁度に達するまでの時間を適当な光学系を用いて測定する比濁時間分析法、凝固に伴って生ずる粘性の変化を共振周波数の変化としてとらぇ、水晶振動子ゲル化測定装置を用いて測定する方法等を採用することができる。本発明の（ 1→ 3 ) —；3— D —グルカンの測定剤は、 C因子に対する抗体を使用しているので、少量でも優れた C因子に対する特異的結合能および中和効果を示すことが第一の特徴である。また、該抗体はリムルス反応阻害物質として知られているアンチトリプシン、アンチトロンビン m等のプロテアーゼィンヒビター類を含まず、 G因子活性を全く損なわないことが第二の特徴である。図面の簡単な説明

第 1 図はカブトガニ血液凝固系のカスケード機構を示す。第 2図は A剤、 D剤のエンドトキシンに対する反応性を示す第 3図は A、 D剤の（ 1 → 3 ) — — D —グルカンに対する反応性を示す。第 4 図は（ 1 → 3 ) — — D—グルカンの水及びェンドトキシン添加希釈液に対する D剤の反応性を示す。

第 5図は実施例 8~10の（ 1 → 3 ) — S — D -グルカンの検量線を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

Bおよび C因子に対するポリクローナル抗体の製造

力ブトガニ血リンパ液 1. 0 ^を 4 °C下に、 1 , 500rpmで 10分間遠心し、その沈澱部分（ァメーボサイト）約 50gに 25( dの 0.02M トリス—塩酸緩衝液（ρΗ β.Ο) を加え、ホモゲナイザー (ポリトロン R PT10 (商標）、 Kinematics社製）にて均一に破砕及び抽出し、冷却遠心分離機（トミ一精ェ RD-20 m ) にて、 10,000rpm で 30分間遠心した。得られた沈澱物をさらに 150„^ の同上緩衝液にて 2回抽出し、最終的に 55(½ のライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファロース CL-6B カラム（ 5 X 23cm、 0.05M NaCl含有 0.02M トリス—塩酸緩衝液（PH8.0)で平衡化）に添加し、 0.45M NaCl含有 0.02M トリス一塩酸緩衝液（PH8.0)にて溶出される画分、すなわち第 1 図に示す Bおよび C因子を含む B C画分を、後記する大林らの方法 ( Clin, Chim, Acta、 149, 55 - 65 ( 1985 ) )により、その活性を測定した。ついでその ⁴0 を 10^に減圧濃縮後、 C， B両因子の活性化を防ぐために 0 · 23 gの EDTA-4N3を添加した。

そのに等量のフロイントコンプリートアジュバント (ャトロン社販売、商品名）を加え、ゥサギ（JW 2.5 kg ) の背中、尻および横腹のそれぞれに 0.3 、 0.3^および 0.4 m£ずつ皮下注射（感作）した。感作は 2週間に 1 度計 5回行い、ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より 1 週間後に頸静脈を切開して全採血した。ひきつづき室温 1 時間、 4 °C一晩放置後、 2,000rp_mで 5分間遠心分離を行い、得られた血清 55^に 56°Cで 30分間の熱処理を行い非働化した後、防腐剤として 0.06gのアジ化ナトリウム（0.1 （W/V) を添加した。その血清の ⁴8?^に対して ³⁴% (W/V)Na₂SO* 溶液を 48^加え、生じた沈濺を 10,000rpm で 30分間遠心分離し沈澱を 17% (W/V) Na, SO«溶液で 2回洗浄し、その沈濺を 0.1M トリスー塩酸緩衝液（PH⁸.0)50J ^に溶解した。この溶液に、固形の Na₂ SO< 7.5g を携拌しながら溶かし込み、生じた沈緞を上記と同様のトリス一塩酸緩衝液に溶かし、さらに Na,SO 濃度 7.5g ,50^の条件で沈澱操作を 3回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき 0 · 05M NH* HC0₃ で平衡化したセルロファィン GH-20m (生化学工業株式会社販売、商品名）カラム（ 2.8x 90cm、 0.05MNH4 HC0₃ で溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、ゥサギ抗（ B C画分）血清の igG溶液を得た。

〔 Cおよび B因子活性測定法〕

0.2 M トリス—塩酸緩衝液（PH 8.0、 0.013M MgCl₂ 含有） 0.1^に、 E. c oli 0111： B 4 由来のエンドトキシン（ 600ng Zn£) 30^fを加え、さらに各画分 50^を添加後、 3フでで 15分間加温する。ひきつづき、 0.005 M N—ターシャリーブトキシ力ノレ；二ノレ（Boc)—: Leu— Gly— Arg— pNA( p —二卜ロアニリド） 20μ£ と凝固酵素前駔体（プロクロッティングェンザィム）を加え、 37°Cで反応させる。発色が認められることを確認し、 0.6 Mの酢酸 0.8^を添加することにより反応を停止し、次いで 405 nmの吸光度を測定する。

実施例 2

精製 C因子に対するポリクローナル抗体の製造

力ブトガニ血リンパ 1.2^ を 4 °C下に l,500rpmで 10分間遠心し、その沈澱部分（ァメーボサイト）約 53g に ²⁵(½ の 0.0²M トリス—塩酸緩衝液（PH 8.0、 0.05MNaCl、 0.001Mベンズァミジン、 0.001M EDTA-4Na含有）を加え、実施例 1 と同様に破砕、抽出後、 10,000rpm で 30分間遠心した。得られた沈澱を 200；^の同上緩銜液にてさらに 2回抽出し、最終的に 640^のライセートを得た。

同ライセート全量を、デキストラン硫酸固定化セファロース CL-6B カラム（ 5 X 23 · 5cm、 0.05M NaCl含有 0.02M トリス一塩酸緩衝液、 PH 8.0で平衡化）に添加し、 0.5 MNaCl含有 0·0²Μ トリス—塩酸緩衝液（ΡΗ 8.0) にて溶出される画分（ Β因子および C因子、活性測定法は後記する中村らの Eur. J. Biochem. , 154, 511-521(1986) 記載の方法による）を限外濾過（ダイァフロー ' メンブレン ΡΜ10、アミコン社）にて濃縮し、セファロ —ス CL-6B (フアルマシア社製）カラム（ 4.0X l29cm、 0.1M NaClを含む 0.02M酢酸ナトリゥム緩衝液、 PH 5.0で平衡化）によるゲル濾過および C M—セファロース CL-6B (フアルマシア社製）カラム（ 2·ΟΧ 25αη、前記と同様の緩衝液で平衡化し、 0.1 Μから 0.³5Μまでの NaClグラジヱントで溶出）によるイオン交换にて、精製 C因子 15.5mgを得た。精製 C因子の純度を S D S ポリアクリルアミド電気泳動にて検討した結果、非還元条件下にて 1本の明瞭なバンド、還元条件下では 2本のバンドに分力ヽれた。このことより、当該 C因子は、 S— S結合で結ばれた 2 本のポリペプチド鎖から成る高純度の精製標品であることが明らカ、であろう。

〔 C因子活性測定法〕

1 M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0、 0.05MMgCl₂ 含有） 20 μί に、 E. coli 0111： B4由来のエンドトキシン（ / ml) 4≠ を加え、さらに各画分 10— を添加後全量を 200^とし、 37 °Cで 10分間加温する o ひきつづき、 0.002M Boc-Val-Pro-Arg-pN A を加え、 37°Cで 7分間加温する。 0.6Mの齚酸 0.8； ^を添加して反応を停止し、 ⁴05nm の吸光度を測定する。

〔B因子活性測定法〕

1 M トリス—塩酸緩衝液（PH 8.0、 0.05M gCl₂ 含有） 20μί に活性型 C因子溶液（ C因子よりエンドトキシン添加にて調製、

を添加後全量を 200 /^とし、 37°Cで 10分間加温する。ひきつづき、 0.005M Boc-Leu -Gly-Arg-pNA20^と凝固酵素前駆体（プロクロッティングェンザィム、 0.96m Zm 30/^を加え、 3⁷°Cで 3分間加温する。

0.6 Mの酢酸 0·⁸ ^を添加して反応を停止し、 405nm の吸光度を測定する。

上記により精製した C因子溶液 40^をに濃縮後、 C因子の活性化を防ぐため 0.23gの EDTA-4Naを添加した。その 1.0„£ に等量のフロイントコンプリートアジュバントを加え、ゥサギ (JW、、 2.5 kg) の背中、尻および横腹のそれぞれに 0.3^、 0.3 および 0.4^づっ皮下注射（感作）した。感作は 2週間に 1 度計 5 回行い、ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認後、最終感作日より 1週間後の頸静脈切開により全採血した。ひきつづき室温 1 時間、 4 で一晩放置後、 2,000rpmで 5 分間遠心分離を行い、得られた血清 62^に 56°Cで 30分間の熱処理を行い非働化した後、防腐剤として 0.06_g のアジ化ナトリゥム（ 0.1%(W/V) )を添加した。 48^の血清に対して 34% (W/V) Na₂ S0₄溶液を 48mi加え、生じた沈澱を 10 , OOOrpm で 30分間遠心分離し、沈殿を 17% (W/V)Na₂S0₄ 溶液で 2回洗浄し、その沈澱を 0.1M トリスー塩酸緩衝液（ΡΗ8.0)5(½ηこ溶解した。この溶液に固形の Na, S0₄ 7 · 5 gを援拌しながら溶かし込み、生じた沈澱を上記と同様のトリスー塩酸緩衝液に溶かし、さらに Na₂ SO* 濃度 7.5gZ5(½ の条件で沈澱操作を 3回繰り返し、最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。ひきつづき 0.05Mの NH₄HC0₃ で平衡したセル口ファイン GH-20mカラム（2.8X 90cm、 0.05M NH« HC0₃ にて溶出）を通過させ脱塩した後、凍結乾燥し、抗 C因子血清の IgG 溶液を得た。

実施例 3

精製 C因子に対するモノクローナル抗体の製造

実施例 2で得られた C因子 0.5^ (タンパク量、

を等量のフロイントコンプリートアジュバン卜と混合し、マウス（BALB/C、 5週令、体重 25g ) の背中に 0.2^および尻に 0.3 を皮下注射し、 2度目の感作を 2週目に行い、 3週後に 300 の C因子 0.3^を静脈内投与し最終免疫とした。これより 4 日後に 9.3X 10⁷ 個の脾細胞を分離し、マウスミエ口一マ S P / 0細胞の 1.9X 10⁷ 個と常法により融合させて、ハィプリドーマを作成した。得られたハイプリドーマにつき、 C 因子に結合すること、または C因子活性を中和させることができることを確認した。つづいて、上記と同様のマウス腹腔内にプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチルペン夕デカン）を Q.2jd 投与し、 1週後にハイプリドーマ 3 X 10⁷ 匹を腹腔内に投与し、腹水の大量貯留がみられる 2週目に腹水を回収し、 40%飽和硫酸アンモニゥムで igG 画分を沈澱させ、最終的な腹水型モノクローナル抗体を得た。

実施例 4

抗 C因子固定化セル口ファインによる C因子不含ライセ一トの調製

実施例 1 に記載の方法で得られたライセートを、 0.1M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0、 0.15M NaCl含有）で平衡化したェンドトキシンおよび ^ーグルカン不含の抗 C因子固定化セル口ファイン（調製方法は後記）カラム（1.3 X 12cm ) に添加し、 0.1 M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0、 1 M NaCl含有）にて洗浄後、素通りした非吸着画分を集め、 C因子を全く含まない C因子不含ライセ一トを得た。

〔抗 C因子固定化セルロフアインの調製方法〕

ホルミルセル口ファイン 10 gを 0 · 1Mリン酸一 Na緩衝液（ pH 7.1)で充分洗浄し、実施例 1〜 4 に記載の C因子に対する抗体溶液（lOmg/ 0.1Mリン酸— Na緩衝液、 pH7 · 1 ) 10m に懸濁し、 NaCNBH₃ 50mgを加え溶解させる。ひきつづき室温で 8時間ゆるやかに攪拌し、 0.2Mトリス—塩酸緩衝液（PH 7.0) で洗浄、濾過し、 10mgの NaCNBH₃ を含むの上記緩衝液を加え、室温で 3時間振とうする。その後、 0.1M トリスー塩酸緩衝液（PH 8.0 、 0.15MNaCl含有）で充分洗浄する。

実施例 5

ポリクローナル抗体を使用する（ 1— 3 ) 一 β— Ό ーグルカンの測定

以下の方法で 3種類の試薬を調製し、 3種類の試料についてその反応性を比較検討した。

Α剤は、ライセート 440^、塩化マグネシウム 440^モル、および Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 2.86〃モルを混合し、凍結乾燥して調製した。 B剤は、 A剤の成分に実施例 1で調製した抗 B C 画分血清の IgG 画分の lOm /^0.02M トリス—塩酸緩衝液（PH

8.0) を添加、混合し、凍結乾燥して調製した。 C剤は A 剤の成分に実施例 3で調製した抗 C因子血清の igG 画分の lOmg

トリスー塩酸緩衝液 220μ£を添加、混合し、凍結乾燥して調製した。

3種類の試薬それぞれを ².2^の 0.2Μ トリスー塩酸緩衝液

(ΡΗ 8.0) に溶解させ、その溶液を試験管に分注し、そこへ試料 0.1^を添加してよく混合し， 37°Cにて 30分間反応させた。 3種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた pNA を、 0.⁵^の 0.0⁴%亜硝酸ナトリウム（ 0.⁴⁸M塩酸溶液を含む）、 0.3 スルファミン酸アンモニゥム、 0.07% N— ( 1 — ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩を順次添加して発色させ 545mn の吸光度値で示した。その結果を第 1表に示した。この結果から、 B C画分に対するポリクローナル抗体及び C因子に対するポリクローナル抗体を添加して調製した試薬を用いればエンドトキシンの影響を全く受けずに、（ 1 → 3 ) - β - Ό - グルカンを特異的に定量することができることは明らかである

1

試料反応性 ( Δ A545nm/30min)

(pg/tube) A剤 B剤 C剤

エンドト B因子及び

グルカン * キシン ** ί ^体なし C因子抗体 C因子抗体

2.5 0.455 0.001 0.001

3.0 0.231 0.233 0.230

3.0 2.5 0.688 0.234 0.233

*…カードン * *― E. coli 0111:B4 由来実施例 6

( 1 - 3 ) 一 3 — D —グルカンの測定

以下の方法で 2種類の試薬を調製し、エンドトキシン及び ( 1 → 3 ) 一）S — D —グルカンに対する反応性を比較検討した ₍ A剤は、ライセ一ト、塩化マグネシウム 440 モル、 Boc-Leu-Gly-Arg_pNA 2.86^モルを混合し、凍結乾燥して調製した。 D剤は A剤の成分に、実施例 3で調製した精製 C因子に対して中和能のあるモノクローナル抗体を含む溶液 100^を添加して、凍結乾燥して調製した。

2種類の試薬それぞれを 2.²m£の 0.²M トリスー塩酸緩衝液 (PH 8.0) に溶解させ、その溶液 0.1m£を試験管に分注し、そこへ試料 0.1； ^を添加してよく混合し、 37°Cにて 30分間反応させた。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた PNA を 0.5^の 0.04%亜硝酸ナトリウム（ 0.48M塩酸）、 0.

3%スルファミン酸アンモニゥム、 0.07% N - ( 1一ナフチル）エチレンジアミンニ塩酸塩を順次添加して発色させ、 545nm の吸光度値で示した。

第 2 図はエンドトキシンに対する反応性を比較した実験結果である。 A剤はェンドトキシンに対して濃度依存的に反応するが、 D剤は 1, 000ng/ のェンドトキシンに対しても全く反応しない。この結果は、精製 C因子に対するモノクローナル抗体が、ライセート中の C因子を完全に中和し、ェンドトキシンに対する反応性を消失させていることを示している。

第 3図は、 A、 D両試薬の（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンに対する反応性を用量反応曲線で比較した結果である。 2つの試薬の用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは D剤に含まれる精製 C因子に対するモノクローナル抗体が、ライセー卜の（ 1 → 3 ) — — D—グルカンに対する反応性に全く影響を与えないことを示している。

第 4 図は（ 1 → 3 ) — ； S— D—グルカンの蒸留水による希釈系列と、 100ng/m のェンドトキシン溶液による希釈系列に対する D剤の用量反応曲線である。 2つの用量反応曲線はほとんど一致しており、このことは、 D剤を用いれば、試料中に混在するエンドトキシンには全く影響されずに（ 1 → 3 ) 一 β— Ό — グルカンを特異的に定量できることを示している。

以上の結果から、精製 C因子に対するモノクローナル抗体を添加して調製した試薬を用いれば、ェンドトキシンの影響を全く受けずに、（ 1 → 3 ) — yS— D—グルカンを特異的に定量することができることは明らかである。

実施例 7

( 1 → 3 ) — — D—グルカンの測定

以下の方法で 2種類の試薬を調製し、 3種類の試料についてその反応性を比較検討した。

A剤は、ライセート "0μ£、塩化マグネシウム 4⁴0 モルおよび Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 2·86/ζモルを混合し、凍結乾燥して調製した。 Ε剤は、実施例 4で調製した C因子不含ライセート 440 μ£、塩ィ匕マグネシウム 440 モル、 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA

2·86/ζモルを混合し、凍結乾燥して調製した。

2種類の試薬それぞれをの 0.2M トリスー塩酸緩衝液 ( PH 8.0) に溶解し、その溶液 0.1? ^を試験管に分注し、そこへ試料 0.1» ^を添加してよく混合し、 37°Cにて 30分間反応させた。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた PNA を、の 0.04%亜硝酸ナトリゥム（ 0.48M塩酸溶液）、 0.3%スルファミン酸アンモニゥム、 0.07% N — ( 1 —ナフチル）エチレンジァミン二塩酸塩を順次添加して発色させ、 545 nmの吸光度値で示した。その結果を第 2表に示した。この結果から、 C因子不含ライセ一トを用いて調製した試薬によれば、エンドトキシンの影響を全く受けずに、（ 1 → 3 ) — β — Ό — グルカンを特異的に定量することができることは明らかである 2

試料反応性 (△ A545nm/30min) Py / uUDe } Λ則 p ¾ m| エンドト C因子不含グルカン * キシンライセートライセート

2.5 0.455 0.001

3.0 0.231 0.232

3.0 2.5 0.688 0.233

*…カードラン

* * ― E. coli 0111:B4 由来

実施例 8

血漿検体の測定

対象は、真菌による敗血症を疑った自治医大血液科に入院中の重症血液疾患（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫等）を有する患者の 1 1 例で、それぞれ無菌的に採血したへパリン加血液を試料として、 4でで 150X G、 10分間遠心して多血小板血漿（PRP) を得た。その O.lmHこ 0.32Mの過塩素酸 Ο·²^を加え、 37でで 20分間加温し、析出物を遠心

( 3,000rpm、 10分間）除去し、その上清 0.05 に 0.18M NaOHを 0.05^加え中和し被検液とした。

ひきつづき実施例 6 に記載の方法で調製した、本発明による ( 1 - 3 ) 一； S— D—グルカン測定剤 0.1^を加え、 37。Cで 30 分間加温した。この溶液に 0.04%亜硝酸ナトリウム（0.48M塩酸溶液）、 0.3%スルファミン酸アンモニゥム、 0.07% N― ( 1 一ナフチル）エチレンジァミン二塩酸塩の各 0 · ⁵J ^を順次加えてジァゾカツプリングし、 545nm でその吸光度を測定し、別に作成した検量線（第 5図）の a より（ 1 → 3 ) — 3 — D—グルカン換算量として表わした。第 3表に示すように 1 1例全例において高濃度の（ 1 → 3 ) — ^ 一 D —グルカンが検出され（健常人： 0 · 2± 0 .3pg/m ) 、そのうちの 5例（ No. 1 〜 No. 5 ) は、血培 ίこて、カンジダ · ァノレビカンス ( Candida albicans ) ゝ力ンジタ · グリエノレモンディ（Candida guilliermondii ) 、カンジダ · 卜ロピカリス ( Candida tropicalis ) 、カンジタ · クノレセィ（ Candida krusei ) およびクリプトコッカス . ネオフオルマンス ( Cryptococcus neof ormans )をそれぞれ検出し、残りの 2例（ Να 6 , Να 7 ) は血培では陰性であつたが、死亡後の解剖による組織病理学的検査によりァスペルギルス · フミガタス ( Aspergil lus fumigatus )を検出した。さらに残り 4例（ tfe 8 〜Να 11) については、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず、血培では陰性であつたが、抗真菌剤（アンホテリシン Β、ミコナゾ一ル、フルコナゾール）投与により、臨床的に顕著な改善を見た。従って、本発明方法はセルロース系透析膜による血液透析施行例（第 4表の No. 1 ~ No. 5 ) を除いて、真菌感染症とりわけ通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断法としてきわめて有力な手法として評価されうるものであることが理解できょう。

日和見の深在性真菌症における血漿中（ 1→ 3 ) - β - Ό -グルカン濃度

No. 年令性疾患顆粒球数血漿（ 1→ 3 ) — 血培備考予後 β — Ό—グルカン

1

丄 ΛΤ.Τ. 304.6pg/nrf (+ ) Candida albicans分離广

9 MM 960 402.0 (+ ) Candida guilliermondii分 ¾g

q ϋ fi1ノ Μ ΔΜΤ. 0 (+ ) Candida tropical is分離

A 45ノ Μ t AiPtT J_l. 0 8寸7.6 (+ ) Candida k sei分離土 ττ

Ό AIHA 2560 525.6 (+ ) Cryptococcus neoformans 分離

U 48/F ALL 0 49.2 (一）全身性ァスペルギルス症（死休角死亡し

7 65/ F APL 0 145.1 (一）全身性ァスペルギルス症（死体解剖）死亡

8 45/ F AML 6278 645.6 (-) フルコナゾ一ルにより改善生存

9 52/ M ALL 6 76.5 (一）ミコナゾ一ルにより改善生存

10 32/ M AML 1 39.0 (一）ミコナゾールにより改善生存

11 29/ F ALL 0 264.4 (一）アンホテリシン Bにより改善生存

A L L :急性リンノ、°性白血病、 AML ：急性骨髄性白血病、 AP L ：前骨髄球性白血病、

MM ：多発性骨髄腫、 A I HA ：自己免疫性溶血性貧血

第 4 表

セレ口スアセテート膜による血液透析患者の血中の（ 1 3 ) - /5 D—グルカン濃度

Να ( 1 → 3 ) - β — Ό —グルカン

1 1528.0

2 2603.7

3 2051.5

4 1764.3

5 4028.0

実施例 9

尿検体の測定自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培養でカンジ夕 · アルビカンス（ Candida albicans ) 、カンジダ ' グラブレイタ（ Candida glabrata) を検出した 3症例につき、本発明方法による尿中（ 1 → 3 ) — j8— D—グルカンの定量を行つた。

尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コップに採取し、その 0·005 に実施例 7 に記載の本発明方法による（ 1→ 3 ) - β - Ώ - グルカン測定剤 0.²^を加え、 3⁷°Cで 30分間加温した。実施例 8 と同様にジァゾカップリング後、 545nm でその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線（第 5図）の b より（ 1 → 3 ) 一；3— D—グルカン換算値として表わした。第 5表に示すように 3例中全例において高濃度の（ 1→ 3 ) 一 β — Ό — グルカンが検出され（健常人： lOpgZ 以下）、本発明方法は真菌性尿路感染症の迅速確定診断法として、きわめて有力な手法であるとが理解できよう。

第 5 表

真菌感染尿の尿中（ 1 → 3 ) — /3— D—グルカン-濃度

No. 検出菌 CFU* /rd ( 1 → 3 ) - β -

D—グルカン（ng/π )

1 Candida albicans > 10< 25.5

2 Candida albicans > 10< 13.0

3 Candida glabrata > 10^ 16.7

*コロニー形成単位実施例 1 0

脳脊髄液検体の測定

自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプトコッカス · ネオフォノレマンス ( Cryptococcus neoformans)を検出した真菌性髄膜炎の 3症例につき、本発明方法による（ 1 → 3 ) 一； 3— D—グルカンの定量を行つた。

腰推穿刺にて無菌的に採取した髄液 0.05^に注射用蒸留水 0 · 05^を加え、さらに実施例 5 に記載の本発明方法による

( 1 → 3 ) 一 /3— D—グルカン測定剤 0.1^を加え、 37°Cで 30 分間加温した。実施例 8 と同様にジァゾ力ップリング後、 545 nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線（第 5図）の b より（ 1 → 3 ) — ー D—グルカン換算値として表わした。第 6表に示すように、 3例中全例において高濃度の（ 1 → 3 ) 一；3— D—グルカンが検出され（健常人： 1 pgZ 以下）、本発明方法は真菌性髄膜炎の早期迅速診断法としてきわめて有力な手法として評価され得るものであることが理解できょう。第 6 表

真菌感染髄液の髄液中（ 1 → 3 ) — ー D—グルカン濃度

Να 検出菌 ( 1 - * 3 ) — — D—グルカン

1 Cryptococcus neof ormans 120 . 5

2 Cryptococcus neof ormans

3 Cryptococcus neof ormans 105. 0

産業上の利用可能性

以上述べたように、本発明はライセートを用いた（ 1 → 3 ) 一ー D—グルカンに特異的な測定剤を提供するものであり、血液や尿、髄液等の生体試料中に存在する真菌由来の（ 1 — 3 ) 一ー D—グルカンを迅速簡便かつ高い精度で測定することが可能であり、菌培養法等に代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染症の迅速な診断ならびに治 CD療効果の判定に役立つもので、特に臨床検査医学に貢献するところ大である。さらに本発明は、注射用蒸留水、医療用具および注射薬を汚染した（ 1→ 3 ) —；3— D—グルカンを迅速かつ正確に測定することを可能とし、また（ 1→ 3 ) — — D—グルカンに代表される抗腫瘍多糖のスクリーニングにも有力な手法を提供するもので、これらはいずれも本発明の副次的効果として、とくに医薬品製造分野に貢献するところ大である。

Claims

請求の範囲

(1) カブトガニ · ァメボサイト · ライセートと、エンドトキシン感受性因子に対する抗体とからなる（ 1 → 3 ) — β - Ό ーグルカンの測定剤。

(2) エンドトキシン感受性因子に対する抗体を固定化した担体に、カブトガニ · ァメボサイト · ライセートを接触させて得たエンドトキシン感受性因子不含ライセートからなる（ 1 → 3 ) 一 — D—グルカンの測定剤。