JP3088120B2 - （１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセートを用いる（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン測定剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートという）を使用して、エンドトキ
シンを測定する方法が知られている。この方法は、微量
のエンドトキシンによりライセートが凝固することに基
づいているが、その後の生化学的解明により、該反応は
いくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明ら
かにされている（中村隆範他、日本細菌学雑誌、３８、
７８１−８０３（１９８３））。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにエンドトキ
シンが加わると、ライセート中に存在するＣ因子（エン
ドトキシン感受性因子、分子量１２３，０００）が活性
化され、生成した活性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，
０００）の特定箇所を限定水解して活性型Ｂ因子を生成
し、活性型Ｂ因子はプロクロッティングエンザイム（分
子量５４，０００）を活性化してクロッティングエンザ
イムに変換し、クロッティングエンザイムはコアギュロ
ーゲン（凝固タンパク、分子量１９，７２３）のジスル
フィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を、すなわ
ち…Ａｒｇ¹⁸−Ｔｈｒ¹⁹…の間および…Ａｒｇ⁴⁶−Ｇｌ
ｙ⁴⁷…の間を限定水解してＨ−Ｔｈｒ¹⁹…Ａｒｇ⁴⁶−Ｏ
Ｈで表されるペプチドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離し
つつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される、とい
う一連の反応（カスケード反応とも言う）である。

【０００４】一方、このカスケード反応は、エンドトキ
シンのみではなく、ライセートに（１→３）−β−Ｄ−
グルカンが加わると図１におけるＧ因子が活性化され、
生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティングエンザイム
をクロッティングエンザイムに活性化し、以下エンドト
キシンの場合と同様に反応してコアギュリンゲルを生成
する。

【０００５】また、上記カスケード反応により生成する
クロッティングエンザイムは、反応系に別に添加され
る、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシ
ル−アルギニン−パラ−ニトロアニリド（ＢＯＣ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のパラ−ニトロアニリン
を遊離させるので、生成する発色物質パラ−ニトロアニ
リンの吸光度を測定することによりエンドトキシンまた
は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定量を行うことがで
きる。その作用を利用して、後記する実施例における
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの特異的測定に使用して
いる。

【０００６】一方、従来から、ライセート中のＧ因子を
用いることにより（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定
する方法が報告されている（ObayashiT. et al., Clin.
Chim. Acta, 149, 55-65 (1985))。

【０００７】しかし、この方法は、ライセートをゲルろ
過法によりあるいはヘパリンまたはデキストラン硫酸を
固定化したアフィニティー担体を用いるクロマトグラフ
ィーにより分画し、エンドトキシン感受性因子のＣ因子
を除去して、Ｇ因子とクロッティングエンザイムとで
（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法であっ
て、極めて煩雑な操作を必要とする方法である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、改良された
方法により得られた、エンドトキシン感受性因子を実質
的に含まないライセートからなる（１→３）−β−Ｄ−
グルカン測定剤を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、カブトガニ・
アメボサイト・ライセートを、または該ライセートとデ
キストランとの混合物を、セルロース系不溶性担体に接
触させて得られるエンドトキシン感受性因子を実質的に
含まないライセートからなる（１→３）−β−Ｄ−グル
カン測定剤である。

【００１０】ライセートとしては、リムルス・ポリフェ
ムス（L. polyphemus 、アメリカ産）、タキプレウス・
トリデンタツス（T. tridentatus、日本、中国産）、タ
キプレウス・ギガス（T. gigas、タイ国、マレーシア半
島産）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（C.
rotundicauda 、タイ国、マレーシア半島産）等のカブ
トガニ血リンパから、通常の方法により調製した血球抽
出液を挙げることができる。

【００１１】セルロース系不溶性担体に、カブトガニ・
アメボサイト・ライセートを接触させ、次いでこの担体
をライセートから除去する方法としては、膜状の該担体
にライセートを通過させ、その通過液を採取する方法、
粒状の担体を充填したカラムにライセートを通過させて
その素通り液を採取する方法、適当な大きさの担体（例
えば、チップ状の担体）にライセートを接触させた後
に、遠心分離、ろ過等の手法により該担体を除去する方
法等を挙げることができる。

【００１２】また、該担体にライセートを接触させる
際、ライセートにデキストランを混合しておくことによ
り、さらにエンドトキシン感受性因子の該担体への吸着
作用を増大させることができ、かつ（１→３）−β−Ｄ
−グルカンに対する測定感度も高めることができる。

【００１３】用いるデキストランとしては平均分子量
５，０００〜５，０００，０００、好ましくは１０，０
００〜１００，０００の範囲を挙げることができる。

【００１４】平均分子量が５，０００より下のデキスト
ランはエンドトキシン感受性因子の吸着効果が弱く使用
することができない。また５，０００，０００より上の
ものは粘性が高すぎて使用することができない。

【００１５】本発明に使用するセルロース系担体として
は、膜状、粒状、チップ状等の形態を有するセルロー
ス、セルロースエステル（例えばセルロースアセテート
及びセルロースニトレート等）、アミノエチル−、ブロ
モアセチル−、ホスホ−、カルボキシメチル−等の置換
基を有するセルロース、カルボキシメチルセルロースの
ヒドラジド誘導体等を挙げることができる。

【００１６】本発明により、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンを測定する生体試料としては、血液、血漿、血清、
脳脊髄液、腹水、関節液、胸水、乳汁、尿等の、体液、
浸出液、排泄液等を挙げることができる。

【００１７】本発明の測定剤を用いて（１→３）−β−
Ｄ−グルカンを測定するには、前述の発色合成基質ある
いは発蛍光合成基質を反応液中に共存させ、クロッティ
ングエンザイムのアミダーゼ活性を測定する方法、凝固
反応によるゲル形成を検査する方法等を採用することが
できる。

【００１８】

【作用】本発明は、セルロース系不溶性担体に（１→
３）−β−Ｄ−グルカン感受性因子の活性が損なわれる
ことなく、ライセート中のエンドトキシン感受性因子が
吸着除去されることによって、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンにのみ反応するライセートが得られる。また、該
担体にライセートを接触させる際に、ライセートにデキ
ストランを混合してライセートの粘性を上げることによ
って、該吸着除去の効果を高める。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００２０】実施例１ カブトガニ（T. tridentatus）血リンパ液５００mlを４
℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部分
（アメボサイト）約２０g に１００mlの０．０２M トリ
ス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加え、ホモゲナイザー
（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinematica社製
造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００×Ｇで
３０分間冷却遠心し、上澄液と沈殿物とを採取した。得
られた沈殿物をさらに６０mlの緩衝液にて２回抽出し、
最終的に２００mlのライセートを得た。

【００２１】以下の方法で４種類の試薬を調製し、エン
ドトキシンおよび（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対す
る反応性を比較検討した。

【００２２】Ａ剤は、０．８M 塩化マグネシウム２００
μl と６mMＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２
００μl の混液（以下ＭＳ混液）にライセート８８０μ
l を添加し、凍結乾燥することにより調製した無処理の
ライセートである。

【００２３】Ｂ剤は、ライセート３．０mlを０．２２μ
m のセルロールエステル膜（ステリフィルＤ−ＧＳ（商
品名）、直径４７mm、ミリポア社製）に通過させた後、
そのろ液８８０μl をＭＳ混液に添加し、凍結乾燥する
ことにより調製した本発明のセルロースエステル膜処理
ライセートである。

【００２４】Ｃ剤は、ライセート３．０mlを０．２０μ
m のセルロースアセテート膜（ナルゲンフィルターウェ
ア（商品名）、直径４７mm、ナルジェ社製）に通過させ
た後、そのろ液８８０μl をＭＳ混液に添加し、凍結乾
燥することにより調製した本発明のセルロースアセテー
ト膜処理ライセートである。

【００２５】Ｄ剤は、ライセート３．０mlを０．２０μ
m のセルロースニトレート膜（ナルゲンフィルターウェ
ア（商品名）、直径４７mm、ナルジェ社製）に通過させ
た後、そのろ液８８０μl をＭＳ混液に添加し、凍結乾
燥することにより調製した本発明のセルロースニトレー
ト膜処理ライセートである。

【００２６】上記４種類の試薬それぞれに、２．２mlの
０．２M トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加えて溶解
し、その溶液０．１mlにエンドトキシン（２５pg/ml)お
よび（１→３）−β−Ｄ−グルカン（３０pg/ml)各々
０．１mlを添加して、３７℃で３０分間加温した。４種
類の試薬に対する試料の反応性は、３０分後に生じたｐ
ＮＡ（パラニトロアニリン）を、０．５mlの０．０４％
亜硝酸ナトリウム（０．４８M 塩酸溶液）、０．３％ス
ルファミン酸アンモニウム、０．７％Ｎ−（１−ナフチ
ル）エチレンジアミン二塩酸塩を順次添加して発色さ
せ、５４５nmの吸光度値で示した。

【００２７】その結果を表１に示した。この結果からセ
ルロース系膜を一度通過させたライセートを使用すれ
ば、エンドトキシンの影響を受けずに、（１→３）−β
−Ｄ−グルカンを特異的に定量することができる。

【００２８】

【表１】

【００２９】＊…（（１→３）−β−Ｄ−グルカンの調
製法）国際特許公開第９０／０２９５１（１９９０）に
準じ、カードラン（和光純薬工業販売）の１g を約１０
０mlの５mM ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発
生機、ソニケーター^TM（大岳製作所、型式５２０２ＰＺ
Ｔ、東京）により２０KHz 、８０W で１２分間音波処理
による低分子化を行った。処理液を５M ＮａＯＨ水溶液
を用い、最終０．３M 水溶液とし、ゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー；ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ
Ｇ３０００ＰＷ×Ｌ ２本、Ｇ２５００ＰＷ×Ｌ １
本、移動相：０．３M ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ml／
min)により分画採取し、再クロマトグラフィーにより分
子量２１６，０００のＧＰＣ分画精製標品（（１→３）
−β−Ｄ−グルカン標品）を得た。

【００３０】実施例２ 実施例１で調製した原料ライセート４０mlに同量の蒸留
水を加えた（以下、ライセート＋ＤＷ）。また該ライセ
ート４０mlに同量の１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分
子量４０，０００）水溶液を加え、３，５００rpm で１
０分間遠心して、その上清を得た（以下、ライセート＋
Ｄｘ）。

【００３１】以下の方法で６種類の試薬を調製し、エン
ドトキシンおよび（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対す
る反応性を比較検討した。

【００３２】Ｅ剤は、ＭＳ混液にライセート＋ＤＷ１．
７６mlを添加し、凍結乾燥することにより調製した無処
理のライセート＋ＤＷである。

【００３３】Ｆ剤は、ＭＳ混液にライセート＋Ｄｘ１．
７６mlを添加し、凍結乾燥することにより調製した無処
理のライセート＋Ｄｘである。

【００３４】Ｇ剤は、ライセート＋ＤＷ２．１mlを０．
２２μm のセルロースエステル膜（マイレクスＧＳ（商
品名）、直径２５mm、ミリポア社製）に通過させた後、
そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥する
ことにより調製した本発明のセルロースエステル膜処理
ライセート＋ＤＷである。

【００３５】Ｈ剤は、ライセート＋Ｄｘ２．１mlを０．
２２μm のセルロースエステル膜（マイレクスＧＳ）に
通過させた後、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加
し、凍結乾燥することにより調製した本発明のセルロー
スエステル膜処理ライセート＋Ｄｘである。

【００３６】Ｉ剤は、ライセート＋ＤＷを０．２０μm
のセルロースアセテート膜（ナルゲンシリンジフィルタ
ー（商品名）、直径２５mm、ナルジェ社製）に通過させ
た後、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍結乾
燥することにより調製した本発明のセルロースアセテー
ト膜処理ライセート＋ＤＷである。

【００３７】Ｊ剤は、ライセート＋Ｄｘ２．１mlを０．
２０μm のセルロースアセテート膜（ナルゲンシリンジ
フィルター）に通過させた後、そのろ液１．７６mlをＭ
Ｓ混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発
明のセルロースアセテート膜処理ライセート＋Ｄｘであ
る。

【００３８】上記６種類の試薬それぞれに２．２mlの
０．２M トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加えて溶解
し、その溶液０．１mlにエンドトキシン（２５pg/ml)お
よび（１→３）−β−Ｄ−グルカン（３０pg/ml)各々
０．１mlを添加して、３７℃で３０分間加温し、実施例
１と同様にして６種類の試薬に対する試料の反応性を調
べた。その結果を表２に示した。この結果から、あらか
じめライセートにデキストランを共存させておくと、エ
ンドトキシン感受性因子の吸着効果を高めるとともに、
（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する感度を著しく高
めることができることがわかる。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例３ カブトガニ（L. polyphemus)血リンパ液６００mlを４
℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈殿部分
（アメボサイト）約２３g に１１０mlの０．０２Mトリ
ス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加え、ホモゲナイザー
（ポリトロンＲ ＰＴ１０）にて均一に破砕および抽出
し、１０，０００×Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液と
沈殿物とを採取した。得られた沈殿物をさらに６５mlの
緩衝液にて２回抽出し、最終的に２２０mlのライセート
を得た。同ライセート２０mlに同量の１５％（Ｗ／Ｖ）
デキストラン（分子量７０，０００）を加え、３，５０
０rpmで１０分間遠心後、その上清をＤ−ライセートと
した。これを用いて、以下の方法で８種類の試薬を調製
し、エンドトキシンおよび（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに対する反応性を比較検討した。

【００４１】Ｋ剤は、ＭＳ混液にＤ−ライセート１．７
６mlを添加し、凍結乾燥して調製した無処理のライセー
トである。

【００４２】Ｌ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
多孔性セルロースゲル（セルロファインＧＣ−２００ｍ
（商品名）、生化学工業販売）と混合後、ガラスフィル
ター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液
に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のセルロースゲ
ル処理ライセートである。

【００４３】Ｍ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
ジエチルアミノエチルセルロースゲル（ＤＥＡＥセルロ
ース、Serva Feinbiochemica GmbH 製）と混合後、ガラ
スフィルター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６mlを
ＭＳ混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のジエ
チルアミノエチルセルロースゲル処理ライセートであ
る。

【００４４】Ｎ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
カルボキシメチルセルロースゲル(Serva Feinbiochemic
a GmbH製）と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）でろ過
し、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥
して調製した本発明のカルボキシメチルセルロースゲル
処理ライセートである。

【００４５】Ｏ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
ホスホセルロースゲル(Serva Feinbiochemica GmbH製）
と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、そのろ
液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥して調製し
た本発明のホスホセルロースゲル処理ライセートであ
る。

【００４６】Ｐ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
アガロースゲル（セファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）、
Pharmacia 社製）と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）
でろ過し、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍
結乾燥して調製した比較のアガロースゲル処理ライセー
トである。

【００４７】Ｑ剤は、Ｄ−ライセートを同量のデキスト
ランゲル（セファデックスＧ−１５０（商品名）、Phar
macia 社製）と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）でろ
過し、そのろ液１．７６mlをＭＳ混液に添加し、凍結乾
燥して調製した比較のデキストランゲル処理ライセート
である。

【００４８】Ｒ剤は、Ｄ−ライセート２．６mlを同量の
ポリアクリルアミドゲル（バイオゲルＰ−３００（商品
名）、Bio-Rad Laboratories製）と混合後、ガラスフィ
ルター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６mlをＭＳ混
液に添加し、凍結乾燥して調製した比較のポリアクリル
アミドゲル処理ライセートである。

【００４９】上記８種類の試薬それぞれに２．２mlの
０．２M トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加えて溶解
し、その溶液０．１mlにエンドトキシン（２５pg/ml)及
び（１→３）−β−Ｄ−グルカン溶液（３０pg/ml)各々
０．１mlを添加し、３７℃で３０分間加温し、実施例１
と同様にして８種類の試薬に対する試料の反応性を調べ
た。その結果を表３に示した。この結果から、セルロー
ス系担体を通過させたライセートを使用すれば、エンド
トキシンの影響を受けずに、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンを特異的に定量することができることは明らかであ
る。

【００５０】

【表３】

【００５１】実施例４ 市販ゲル化法リムルステスト試薬を使用する（１→３）
−β−Ｄ−グルカン測定剤の調製 市販のライセート製品すなわちゲル化法リムルステスト
試薬を使用して、目的とする（１→３）−β−Ｄ−グル
カン測定剤を以下のようにして調製した。

【００５２】Ｌ−１剤は、プレゲル−Ｍ（生化学工業販
売ライセート、LotAB-01)を２．６mlの注射用蒸留水に
溶解した後、０．２２μmのセルロースアセテート膜
（ナルゲンフィルターウェア）に通過させ、そのろ液
１．４mlを凍結乾燥することにより調製した本発明のセ
ルロースアセテート膜処理ライセート＋ＤＷである。

【００５３】Ｌ−２剤は、無処理のプレゲル−Ｍであ
る。

【００５４】Ｌ−３剤はリムルスＨＳII−テストワコー
（和光純薬工業販売ライセート、Lot. EMM090)を５．０
mlの注射用蒸留水に溶解した後、０．２２μm のセルロ
ースエステル膜（ステリフィルＤ−ＧＳ）に通過させ、
そのろ液を使用した本発明のセルロースエステル膜処理
ライセート＋ＤＷである。

【００５５】Ｌ−４剤は無処理のリムルスＨＳII−テス
トワコーである。

【００５６】注射用蒸留水を用い、Ｌ−１剤は１．４m
l、Ｌ−２剤は２．６ml、Ｌ−４剤は５．０mlで溶解し
た。Ｌ−１〜Ｌ−４剤の０．１mlに注射用蒸留水（ブラ
ンク）、エンドトキシン（E. coli 0111:B4 由来）およ
び（１→３）−β−Ｄ−グルカンを別々に０．１ml加
え、３７℃で６０分間静置加温し、ゲル形成の有無を調
べた。その結果を表４に示した。表中、＋はゲル化した
ことを、−はゲル化しなかったことを表す。表４から明
らかなようにＬ−１およびＬ−３剤は（１→３）−β−
Ｄ−グルカンとのみ反応する目的に適したライセートで
あることがわかる。

【００５７】

【表４】

【００５８】実施例５（血漿検体の測定） 真菌による敗血症を疑った入院中の重症血液疾患（急性
リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫等）
を有する患者１１例を対象に、それぞれ無菌的に採血し
たヘパリン加血漿を試料として、４℃で１５０×Ｇ、１
０分間遠心して多血小板血漿を得た。その０．１mlに
０．３２M 過塩素酸０．２mlを加え、３７℃で２０分間
加温し、析出物を遠心（３，０００rpm 、１０分間）除
去し、その上清０．０５mlに０．１８M ＮａＯＨを０．
０５ml加えて中和し被検液とした。

【００５９】ひきつづき実施例２に記載の方法で調製し
た本発明の（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤（Ｈ
剤）０．１mlを加え、３７℃で３０分間加温した。その
反応液に０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８M 塩酸
溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０
７％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各
０．５ml順次加えてジアゾカップリングし、５４５nmで
その吸光度を測定して別に作成した検量線（図２）より
（１→３）−β−Ｄ−グルカン換算量として表した。表
５に示すように全例（No. １〜No. １１）において高濃
度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出され（健常
人：０．２±０．３pg／ml）、そのうちの５例（No. １
〜No. ５）は、血培にて、カンジダ・アルビカンス（Ca
ndida albicans）、カンジダ・グリエルモンディ（Cand
ida guilliermondii）、カンジダ・トロピカリス（Cand
ida tropicalis）、カンジダ・クルセイ（Candida krus
ei）およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryp
tococcus neoformans)をそれぞれ検出し、２例（No. ６
及びNo. ７）は血培では陰性であったが、死亡後の解剖
による組織病理学的検査によりアスペルギルス・フミガ
ツス（Aspergillus fumigatus)を検出した。さらに残り
４例（No. ８〜No. １１）については、臨床症状、経
過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわ
らず血培では陰性であったが、抗真菌剤（アンホテリシ
ン、ミコナゾール、フルコナゾール）投与により、臨床
的に顕著な改善を見た。従って、本発明の測定剤は真菌
感染症とりわけ通常の検査法では診断がきわめて困難な
深在性真菌感染症の迅速診断法として、適切に用いられ
ることが理解できる。

【００６０】

【表５】

【００６１】実施例６（尿検体の測定） 入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培養でカンジ
ダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グ
ラブレイタ（Candida glabrata）を検出した３症例につ
き、本発明方法による尿中（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンの定量を行った。尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コッ
プに採取し、その０．００５mlに注射用蒸留水０．１ml
を加えた後、実施例１に記載の本発明方法による（１→
３）−β−Ｄ−グルカン測定剤（Ｃ剤）０．１mlを加
え、３７℃で３０分間加温した。前記と同様にジアゾカ
ップリング後、５４５nmでその溶液の吸光度を測定し、
別に作成した検量線より（１→３）−β−Ｄ−グルカン
換算値として表した。表６に示すように３例中全例にお
いて高濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出され
（健常人：１０pg／ml以下）、本発明の測定剤は真菌性
尿路感染症の迅速診断法として、適切に用いられること
が理解できる。

【００６２】

【表６】

【００６３】実施例７（脳脊髄液検体の測定） 入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプトコッカス・
ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans)を検出し
た真菌性髄膜炎の３症例につき、本発明方法による髄液
中（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定量を行った。腰椎
穿刺にて無菌的に採取した髄液０．０５mlに注射用蒸留
水０．０５mlを加え、さらに実施例３に記載の本発明方
法による（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤（Ｌ剤）
０．１mlを加えて、３７℃で３０分間加温した。前記と
同様にジアゾカップリング後、５４５nmでその溶液の吸
光度を測定し、別に作成した検量線より（１→３）−β
−Ｄ−グルカン換算値として表した。表７に示すよう
に、３例中全例において高濃度の（１→３）−β−Ｄ−
グルカンが検出され（健常人：１pg／ml以下）、本発明
の測定剤は真菌性髄膜炎の迅速診断法として、適切に用
いられることが理解できる。

【００６４】

【表７】

【００６５】

【発明の効果】本発明はライセートを用いて（１→３）
−β−Ｄ−グルカンを特異的に測定するための、エンド
トキシン感受性因子を含まない測定剤を提供するもので
あり、血液や尿をはじめとした生体試料中に存在する真
菌由来の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを迅速簡便かつ
高い精度で測定することが可能である。菌培養法等に代
表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染症
の迅速診断ならびに適切な治療法および治療効果の判定
に利用することができる。

【００６６】さらに本発明の測定剤は、注射用蒸留水、
注射薬および医療用具に混入する（１→３）−β−Ｄ−
グルカンを迅速かつ正確に測定することを可能とし、ま
た（１→３）−β−Ｄ−グルカンに代表される抗腫瘍性
多糖のスクリーニングにも利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートのエン
ドトキシンならびに（１→３）−β−Ｄ−グルカンによ
る反応機構を示す。

【図２】Ｈ剤の（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する
検量線を示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/52 G01N 33/579 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   をセルロース系不溶性担体に接触させ、次いでこの担体
   を該ライセートから除去することによって得られる、エ
   ンドトキシン感受性因子を実質的に含まないライセート
   からなる、（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤。
2. 【請求項２】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   が、デキストランを含有するライセートである、請求項
   １記載の測定剤。
3. 【請求項３】 カブトガニ・アメボサイト・ライセート
   をセルロース系不溶性担体に接触させ、次いでこの担体
   を該ライセートから除去することによってエンドトキシ
   ン感受性因子を実質的に含まないライセートを得る工程
   を含む、（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤の製造方
   法。
4. 【請求項４】 請求項１又は２に記載の（１→３）−β
   −Ｄ−グルカン測定剤に、検体を接触させる工程を含
   む、（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。
5. 【請求項５】 請求項１又は２に記載の（１→３）−β
   −Ｄ−グルカン測定剤を含む、真菌感染症診断薬。