JPH04287696A

JPH04287696A - （１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤

Info

Publication number: JPH04287696A
Application number: JP7365191A
Authority: JP
Inventors: Shigenori Tanaka; 重則田中; Hiroshi Tamura; 弘志田村; Makoto Oki; 誠大木
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1991-03-14
Publication date: 1992-10-13
Anticipated expiration: 2015-09-18
Also published as: JP3088120B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライセートを用いる（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ン測定剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートという）を使用して、エンドトキ
シンを測定する方法が知られている。この方法は、微量
のエンドトキシンによりライセートが凝固することに基
づいているが、その後の生化学的解明により、該反応は
いくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明ら
かにされている（中村隆範他、日本細菌学雑誌、３８、
７８１−８０３（１９８３））。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ｔ
ａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）から得
られるライセートにより、図１を用いて説明すると、ラ
イセートにエンドトキシンが加わると、ライセート中に
存在するＣ因子（エンドトキシン感受性因子、分子量１
２３，０００）が活性化され、生成した活性型Ｃ因子が
Ｂ因子（分子量６４，０００）の特定箇所を限定水解し
て活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッテ
ィングエンザイム（分子量５４，０００）を活性化して
クロッティングエンザイムに変換し、クロッティングエ
ンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量１
９，７２３）のジスルフィド結合で架橋されたループ内
の特定箇所を、すなわち…Ａｒｇ１８−Ｔｈｒ１９…の
間および…Ａｒｇ４６−Ｇｌｙ４７…の間を限定水解し
てＨ−Ｔｈｒ１９…Ａｒｇ４６−ＯＨで表されるペプチ
ドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコ
アギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カス
ケード反応とも言う）である。

【０００４】一方、このカスケード反応は、エンドトキ
シンのみではなく、ライセートに（１→３）−β−Ｄ−
グルカンが加わると図１におけるＧ因子が活性化され、
生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティングエンザイム
をクロッティングエンザイムに活性化し、以下エンドト
キシンの場合と同様に反応してコアギュリンゲルを生成
する。

【０００５】また、上記カスケード反応により生成する
クロッティングエンザイムは、反応系に別に添加される
、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル
−アルギニン−パラ−ニトロアニリド（ＢＯＣ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のパラ−ニトロアニリンを
遊離させるので、生成する発色物質パラ−ニトロアニリ
ンの吸光度を測定することによりエンドトキシンまたは
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定量を行うことができ
る。その作用を利用して、後記する実施例における（１
→３）−β−Ｄ−グルカンの特異的測定に使用している
。

【０００６】一方、従来から、ライセート中のＧ因子を
用いることにより（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定
する方法が報告されている（ＯｂａｙａｓｈｉＴ．　ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　
１４９，　５５−６５　（１９８５））。

【０００７】しかし、この方法は、ライセートをゲルろ
過法によりあるいはヘパリンまたはデキストラン硫酸を
固定化したアフィニティー担体を用いるクロマトグラフ
ィーにより分画し、エンドトキシン感受性因子のＣ因子
を除去して、Ｇ因子とクロッティングエンザイムとで（
１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法であって、
極めて煩雑な操作を必要とする方法である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、改良された
方法により得られた、エンドトキシン感受性因子を実質
的に含まないライセートからなる（１→３）−β−Ｄ−
グルカン測定剤を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、カブトガニ・
アメボサイト・ライセートを、または該ライセートとデ
キストランとの混合物を、セルロース系不溶性担体に接
触させて得られるエンドトキシン感受性因子を実質的に
含まないライセートからなる（１→３）−β−Ｄ−グル
カン測定剤である。

【００１０】ライセートとしては、リムルス・ポリフェ
ムス（Ｌ．　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ　、アメリカ産）、
タキプレウス・トリデンタツス（Ｔ．　ｔｒｉｄｅｎｔ
ａｔｕｓ、日本、中国産）、タキプレウス・ギガス（Ｔ
．　ｇｉｇａｓ、タイ国、マレーシア半島産）、カルシ
ノスコルピウス・ロツンディカウダ（Ｃ．　ｒｏｔｕｎ
ｄｉｃａｕｄａ　、タイ国、マレーシア半島産）等のカ
ブトガニ血リンパから、通常の方法により調製した血球
抽出液を挙げることができる。

【００１１】セルロース系不溶性担体に、カブトガニ・
アメボサイト・ライセートを接触させる方法としては、
膜状の該担体にライセートを通過させ、その通過液を採
取する方法、粒状の担体を充填したカラムにライセート
を通過させてその素通り液を採取する方法、適当な大き
さの担体（例えば、チップ状の担体）にライセートを接
触させた後に、遠心分離、ろ過等の手法により該担体を
除去する方法等を挙げることができる。

【００１２】また、該担体にライセートを接触させる際
、ライセートにデキストランを混合しておくことにより
、さらにエンドトキシン感受性因子の該担体への吸着作
用を増大させることができ、かつ（１→３）−β−Ｄ−
グルカンに対する測定感度も高めることができる。

【００１３】用いるデキストランとしては平均分子量５
，０００〜５，０００，０００、好ましくは１０，００
０〜１００，０００の範囲を挙げることができる。

【００１４】平均分子量が５，０００より下のデキスト
ランはエンドトキシン感受性因子の吸着効果が弱く使用
することができない。また５，０００，０００より上の
ものは粘性が高すぎて使用することができない。

【００１５】本発明に使用するセルロース系担体として
は、膜状、粒状、チップ状等の形態を有するセルロース
、セルロースエステル（例えばセルロースアセテート及
びセルロースニトレート等）、アミノエチル−、ブロモ
アセチル−、ホスホ−、カルボキシメチル−等の置換基
を有するセルロース、カルボキシメチルセルロースのヒ
ドラジド誘導体等を挙げることができる。

【００１６】本発明により、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンを測定する生体試料としては、血液、血漿、血清、
脳脊髄液、腹水、関節液、胸水、乳汁、尿等の、体液、
浸出液、排泄液等を挙げることができる。

【００１７】本発明の測定剤を用いて（１→３）−β−
Ｄ−グルカンを測定するには、前述の発色合成基質ある
いは発蛍光合成基質を反応液中に共存させ、クロッティ
ングエンザイムのアミダーゼ活性を測定する方法、凝固
反応によるゲル形成を検査する方法等を採用することが
できる。

【００１８】

【作用】本発明は、セルロース系不溶性担体に（１→３
）−β−Ｄ−グルカン感受性因子の活性が損なわれるこ
となく、ライセート中のエンドトキシン感受性因子が吸
着除去されることによって、（１→３）−β−Ｄ−グル
カンにのみ反応するライセートが得られる。また、該担
体にライセートを接触させる際に、ライセートにデキス
トランを混合してライセートの粘性を上げることによっ
て、該吸着除去の効果を高める。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００２０】実施例１カブトガニ（Ｔ．　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）血リンパ
液５００ｍｌを４℃、１，５００ｒｐｍ　で１０分間遠
心し、その沈殿部分（アメボサイト）約２０ｇ　に１０
０ｍｌの０．０２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０
）を加え、ホモゲナイザー（ポリトロンＲ　　ＰＴ１０
（商品名）、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製造）にて均一に
破砕および抽出し、１０，０００×Ｇで３０分間冷却遠
心し、上澄液と沈殿物とを採取した。得られた沈殿物を
さらに６０ｍｌの緩衝液にて２回抽出し、最終的に２０
０ｍｌのライセートを得た。

【００２１】以下の方法で４種類の試薬を調製し、エン
ドトキシンおよび（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対す
る反応性を比較検討した。

【００２２】Ａ剤は、０．８Ｍ　塩化マグネシウム２０
０μｌ　と６ｍＭＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡ２００μｌ　の混液（以下ＭＳ混液）にライセート
８８０μｌ　を添加し、凍結乾燥することにより調製し
た無処理のライセートである。

【００２３】Ｂ剤は、ライセート３．０ｍｌを０．２２
μｍ　のセルロールエステル膜（ステリフィルＤ−ＧＳ
（商品名）、直径４７ｍｍ、ミリポア社製）に通過させ
た後、そのろ液８８０μｌ　をＭＳ混液に添加し、凍結
乾燥することにより調製した本発明のセルロースエステ
ル膜処理ライセートである。

【００２４】Ｃ剤は、ライセート３．０ｍｌを０．２０
μｍ　のセルロースアセテート膜（ナルゲンフィルター
ウェア（商品名）、直径４７ｍｍ、ナルジェ社製）に通
過させた後、そのろ液８８０μｌ　をＭＳ混液に添加し
、凍結乾燥することにより調製した本発明のセルロース
アセテート膜処理ライセートである。

【００２５】Ｄ剤は、ライセート３．０ｍｌを０．２０
μｍ　のセルロースニトレート膜（ナルゲンフィルター
ウェア（商品名）、直径４７ｍｍ、ナルジェ社製）に通
過させた後、そのろ液８８０μｌ　をＭＳ混液に添加し
、凍結乾燥することにより調製した本発明のセルロース
ニトレート膜処理ライセートである。

【００２６】上記４種類の試薬それぞれに、２．２ｍｌ
の０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え
て溶解し、その溶液０．１ｍｌにエンドトキシン（２５
ｐｇ／ｍｌ）および（１→３）−β−Ｄ−グルカン（３
０ｐｇ／ｍｌ）各々０．１ｍｌを添加して、３７℃で３
０分間加温した。４種類の試薬に対する試料の反応性は
、３０分後に生じたｐＮＡ（パラニトロアニリン）を、
０．５ｍｌの０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ
　塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、
０．７％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸
塩を順次添加して発色させ、５４５ｎｍの吸光度値で示
した。

【００２７】その結果を表１に示した。この結果からセ
ルロース系膜を一度通過させたライセートを使用すれば
、エンドトキシンの影響を受けずに、（１→３）−β−
Ｄ−グルカンを特異的に定量することができる。

【００２８】

【表１】

【００２９】＊…（（１→３）−β−Ｄ−グルカンの調
製法）国際特許公開第９０／０２９５１（１９９０）に
準じ、カードラン（和光純薬工業販売）の１ｇ　を約１
００ｍｌの５ｍＭ　　ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、氷冷下
で音波発生機、ソニケーターＴＭ（大岳製作所、型式５
２０２ＰＺＴ、東京）により２０ＫＨｚ　、８０Ｗ　で
１２分間音波処理による低分子化を行った。処理液を５
Ｍ　ＮａＯＨ水溶液を用い、最終０．３Ｍ　水溶液とし
、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー；ＧＰＣカ
ラム：ＴＳＫ　　ｇｅｌ　　Ｇ３０００ＰＷ×Ｌ　　２
本、Ｇ２５００ＰＷ×Ｌ　　１本、移動相：０．３Ｍ　
ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）により分画
採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１６，０
００のＧＰＣ分画精製標品（（１→３）−β−Ｄ−グル
カン標品）を得た。

【００３０】実施例２実施例１で調製した原料ライセート４０ｍｌに同量の蒸
留水を加えた（以下、ライセート＋ＤＷ）。また該ライ
セート４０ｍｌに同量の１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン
（分子量４０，０００）水溶液を加え、３，５００ｒｐ
ｍ　で１０分間遠心して、その上清を得た（以下、ライ
セート＋Ｄｘ）。

【００３１】以下の方法で６種類の試薬を調製し、エン
ドトキシンおよび（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対す
る反応性を比較検討した。

【００３２】Ｅ剤は、ＭＳ混液にライセート＋ＤＷ１．
７６ｍｌを添加し、凍結乾燥することにより調製した無
処理のライセート＋ＤＷである。

【００３３】Ｆ剤は、ＭＳ混液にライセート＋Ｄｘ１．
７６ｍｌを添加し、凍結乾燥することにより調製した無
処理のライセート＋Ｄｘである。

【００３４】Ｇ剤は、ライセート＋ＤＷ２．１ｍｌを０
．２２μｍ　のセルロースエステル膜（マイレクスＧＳ
（商品名）、直径２５ｍｍ、ミリポア社製）に通過させ
た後、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に添加し、凍結
乾燥することにより調製した本発明のセルロースエステ
ル膜処理ライセート＋ＤＷである。

【００３５】Ｈ剤は、ライセート＋Ｄｘ２．１ｍｌを０
．２２μｍ　のセルロースエステル膜（マイレクスＧＳ
）に通過させた後、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に
添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のセル
ロースエステル膜処理ライセート＋Ｄｘである。

【００３６】Ｉ剤は、ライセート＋ＤＷを０．２０μｍ
　のセルロースアセテート膜（ナルゲンシリンジフィル
ター（商品名）、直径２５ｍｍ、ナルジェ社製）に通過
させた後、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に添加し、
凍結乾燥することにより調製した本発明のセルロースア
セテート膜処理ライセート＋ＤＷである。

【００３７】Ｊ剤は、ライセート＋Ｄｘ２．１ｍｌを０
．２０μｍ　のセルロースアセテート膜（ナルゲンシリ
ンジフィルター）に通過させた後、そのろ液１．７６ｍ
ｌをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥することにより調製し
た本発明のセルロースアセテート膜処理ライセート＋Ｄ
ｘである。

【００３８】上記６種類の試薬それぞれに２．２ｍｌの
０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて
溶解し、その溶液０．１ｍｌにエンドトキシン（２５ｐ
ｇ／ｍｌ）および（１→３）−β−Ｄ−グルカン（３０
ｐｇ／ｍｌ）各々０．１ｍｌを添加して、３７℃で３０
分間加温し、実施例１と同様にして６種類の試薬に対す
る試料の反応性を調べた。その結果を表２に示した。こ
の結果から、あらかじめライセートにデキストランを共
存させておくと、エンドトキシン感受性因子の吸着効果
を高めるとともに、（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対
する感度を著しく高めることができることがわかる。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例３カブトガニ（Ｌ．　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）血リンパ液
６００ｍｌを４℃、１，５００ｒｐｍ　で１０分間遠心
し、その沈殿部分（アメボサイト）約２３ｇ　に１１０
ｍｌの０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
加え、ホモゲナイザー（ポリトロンＲ　　ＰＴ１０）に
て均一に破砕および抽出し、１０，０００×Ｇで３０分
間冷却遠心し、上澄液と沈殿物とを採取した。得られた
沈殿物をさらに６５ｍｌの緩衝液にて２回抽出し、最終
的に２２０ｍｌのライセートを得た。同ライセート２０
ｍｌに同量の１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量７
０，０００）を加え、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心
後、その上清をＤ−ライセートとした。これを用いて、
以下の方法で８種類の試薬を調製し、エンドトキシンお
よび（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する反応性を比
較検討した。

【００４１】Ｋ剤は、ＭＳ混液にＤ−ライセート１．７
６ｍｌを添加し、凍結乾燥して調製した無処理のライセ
ートである。

【００４２】Ｌ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
の多孔性セルロースゲル（セルロファインＧＣ−２００
ｍ（商品名）、生化学工業販売）と混合後、ガラスフィ
ルター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ
混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のセルロー
スゲル処理ライセートである。

【００４３】Ｍ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
のジエチルアミノエチルセルロースゲル（ＤＥＡＥセル
ロース、Ｓｅｒｖａ　Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　
ＧｍｂＨ　製）と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）で
ろ過し、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に添加し、凍
結乾燥して調製した本発明のジエチルアミノエチルセル
ロースゲル処理ライセートである。

【００４４】Ｎ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
のカルボキシメチルセルロースゲル（Ｓｅｒｖａ　Ｆｅ
ｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ＧｍｂＨ製）と混合後、ガ
ラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６ｍ
ｌをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明の
カルボキシメチルセルロースゲル処理ライセートである
。

【００４５】Ｏ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
のホスホセルロースゲル（Ｓｅｒｖａ　Ｆｅｉｎｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ　ＧｍｂＨ製）と混合後、ガラスフィル
ター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混
液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のホスホセル
ロースゲル処理ライセートである。

【００４６】Ｐ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
のアガロースゲル（セファロースＣＬ−６Ｂ（商品名）
、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　社製）と混合後、ガラスフィル
ター（Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混
液に添加し、凍結乾燥して調製した比較のアガロースゲ
ル処理ライセートである。

【００４７】Ｑ剤は、Ｄ−ライセートを同量のデキスト
ランゲル（セファデックスＧ−１５０（商品名）、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　社製）と混合後、ガラスフィルター（
Ｇ３）でろ過し、そのろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に添
加し、凍結乾燥して調製した比較のデキストランゲル処
理ライセートである。

【００４８】Ｒ剤は、Ｄ−ライセート２．６ｍｌを同量
のポリアクリルアミドゲル（バイオゲルＰ−３００（商
品名）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
）と混合後、ガラスフィルター（Ｇ３）でろ過し、その
ろ液１．７６ｍｌをＭＳ混液に添加し、凍結乾燥して調
製した比較のポリアクリルアミドゲル処理ライセートで
ある。

【００４９】上記８種類の試薬それぞれに２．２ｍｌの
０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて
溶解し、その溶液０．１ｍｌにエンドトキシン（２５ｐ
ｇ／ｍｌ）及び（１→３）−β−Ｄ−グルカン溶液（３
０ｐｇ／ｍｌ）各々０．１ｍｌを添加し、３７℃で３０
分間加温し、実施例１と同様にして８種類の試薬に対す
る試料の反応性を調べた。その結果を表３に示した。こ
の結果から、セルロース系担体を通過させたライセート
を使用すれば、エンドトキシンの影響を受けずに、（１
→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に定量することがで
きることは明らかである。

【００５０】

【表３】

【００５１】実施例４市販ゲル化法リムルステスト試薬を使用する（１→３）
−β−Ｄ−グルカン測定剤の調製市販のライセート製品すなわちゲル化法リムルステスト
試薬を使用して、目的とする（１→３）−β−Ｄ−グル
カン測定剤を以下のようにして調製した。

【００５２】Ｌ−１剤は、プレゲル−Ｍ（生化学工業販
売ライセート、ＬｏｔＡＢ−０１）を２．６ｍｌの注射
用蒸留水に溶解した後、０．２２μｍのセルロースアセ
テート膜（ナルゲンフィルターウェア）に通過させ、そ
のろ液１．４ｍｌを凍結乾燥することにより調製した本
発明のセルロースアセテート膜処理ライセート＋ＤＷで
ある。

【００５３】Ｌ−２剤は、無処理のプレゲル−Ｍである
。

【００５４】Ｌ−３剤はリムルスＨＳＩＩ−テストワコ
ー（和光純薬工業販売ライセート、Ｌｏｔ．　ＥＭＭ０
９０）を５．０ｍｌの注射用蒸留水に溶解した後、０．
２２μｍ　のセルロースエステル膜（ステリフィルＤ−
ＧＳ）に通過させ、そのろ液を使用した本発明のセルロ
ースエステル膜処理ライセート＋ＤＷである。

【００５５】Ｌ−４剤は無処理のリムルスＨＳＩＩ−テ
ストワコーである。

【００５６】注射用蒸留水を用い、Ｌ−１剤は１．４ｍ
ｌ、Ｌ−２剤は２．６ｍｌ、Ｌ−４剤は５．０ｍｌで溶
解した。Ｌ−１〜Ｌ−４剤の０．１ｍｌに注射用蒸留水
（ブランク）、エンドトキシン（Ｅ．　ｃｏｌｉ　０１
１１：Ｂ４　由来）および（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンを別々に０．１ｍｌ加え、３７℃で６０分間静置加温
し、ゲル形成の有無を調べた。その結果を表４に示した
。表中、＋はゲル化したことを、−はゲル化しなかった
ことを表す。表４から明らかなようにＬ−１およびＬ−
３剤は（１→３）−β−Ｄ−グルカンとのみ反応する目
的に適したライセートであることがわかる。

【００５７】

【表４】

【００５８】実施例５（血漿検体の測定）真菌による敗
血症を疑った入院中の重症血液疾患（急性リンパ性白血
病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫等）を有する患者
１１例を対象に、それぞれ無菌的に採血したヘパリン加
血漿を試料として、４℃で１５０×Ｇ、１０分間遠心し
て多血小板血漿を得た。その０．１ｍｌに０．３２Ｍ　
過塩素酸０．２ｍｌを加え、３７℃で２０分間加温し、
析出物を遠心（３，０００ｒｐｍ　、１０分間）除去し
、その上清０．０５ｍｌに０．１８Ｍ　ＮａＯＨを０．
０５ｍｌ加えて中和し被検液とした。

【００５９】ひきつづき実施例２に記載の方法で調製し
た本発明の（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤（Ｈ剤
）０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分間加温した。その
反応液に０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ　塩
酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．
０７％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各
０．５ｍｌ順次加えてジアゾカップリングし、５４５ｎ
ｍでその吸光度を測定して別に作成した検量線（図２）
より（１→３）−β−Ｄ−グルカン換算量として表した
。表５に示すように全例（Ｎｏ．　１〜Ｎｏ．　１１）
において高濃度の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出
され（健常人：０．２±０．３ｐｇ／ｍｌ）、そのうち
の５例（Ｎｏ．　１〜Ｎｏ．　５）は、血培にて、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）、カンジダ・グリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ　
ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・トロピカ
リス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カン
ジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）およ
びクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）をそれぞれ検出
し、２例（Ｎｏ．　６及びＮｏ．　７）は血培では陰性
であったが、死亡後の解剖による組織病理学的検査によ
りアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出した。さらに残り４例
（Ｎｏ．　８〜Ｎｏ．　１１）については、臨床症状、
経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかか
わらず血培では陰性であったが、抗真菌剤（アンホテリ
シン、ミコナゾール、フルコナゾール）投与により、臨
床的に顕著な改善を見た。従って、本発明の測定剤は真
菌感染症とりわけ通常の検査法では診断がきわめて困難
な深在性真菌感染症の迅速診断法として、適切に用いら
れることが理解できる。

【００６０】

【表５】

【００６１】実施例６（尿検体の測定）入院中に尿路感
染症を併発した症例で、尿培養でカンジダ・アルビカン
ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・
グラブレイタ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ）を
検出した３症例につき、本発明方法による尿中（１→３
）−β−Ｄ−グルカンの定量を行った。尿は中間尿を無
菌的に滅菌採尿コップに採取し、その０．００５ｍｌに
注射用蒸留水０．１ｍｌを加えた後、実施例１に記載の
本発明方法による（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤
（Ｃ剤）０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分間加温した
。前記と同様にジアゾカップリング後、５４５ｎｍでそ
の溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線より（１
→３）−β−Ｄ−グルカン換算値として表した。表６に
示すように３例中全例において高濃度の（１→３）−β
−Ｄ−グルカンが検出され（健常人：１０ｐｇ／ｍｌ以
下）、本発明の測定剤は真菌性尿路感染症の迅速診断法
として、適切に用いられることが理解できる。

【００６２】

【表６】

【００６３】実施例７（脳脊髄液検体の測定）入院中に
髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプトコッカス・ネオフォ
ルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍ
ａｎｓ）を検出した真菌性髄膜炎の３症例につき、本発
明方法による髄液中（１→３）−β−Ｄ−グルカンの定
量を行った。腰椎穿刺にて無菌的に採取した髄液０．０
５ｍｌに注射用蒸留水０．０５ｍｌを加え、さらに実施
例３に記載の本発明方法による（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン測定剤（Ｌ剤）０．１ｍｌを加えて、３７℃で３
０分間加温した。前記と同様にジアゾカップリング後、
５４５ｎｍでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した
検量線より（１→３）−β−Ｄ−グルカン換算値として
表した。表７に示すように、３例中全例において高濃度
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが検出され（健常人：
１ｐｇ／ｍｌ以下）、本発明の測定剤は真菌性髄膜炎の
迅速診断法として、適切に用いられることが理解できる
。

【００６４】

【表７】

【００６５】

【発明の効果】本発明はライセートを用いて（１→３）
−β−Ｄ−グルカンを特異的に測定するための、エンド
トキシン感受性因子を含まない測定剤を提供するもので
あり、血液や尿をはじめとした生体試料中に存在する真
菌由来の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを迅速簡便かつ
高い精度で測定することが可能である。菌培養法等に代
表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染症
の迅速診断ならびに適切な治療法および治療効果の判定
に利用することができる。

【００６６】さらに本発明の測定剤は、注射用蒸留水、
注射薬および医療用具に混入する（１→３）−β−Ｄ−
グルカンを迅速かつ正確に測定することを可能とし、ま
た（１→３）−β−Ｄ−グルカンに代表される抗腫瘍性
多糖のスクリーニングにも利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートのエン
ドトキシンならびに（１→３）−β−Ｄ−グルカンによ
る反応機構を示す。

【図２】Ｈ剤の（１→３）−β−Ｄ−グルカンに対する
検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トを、セルロース系不溶性担体に接触させて得られるエ
ンドトキシン感受性因子を実質的に含まないライセート
からなる（１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤。
【請求項２】　　カブトガニ・アメボサイト・ライセー
トがデキストランを含有する請求項１の測定剤。