NO303179B1 - Reagens for bestemmelse av (1-3)-<beta>-D-glukan, en fremgangsmÕte for fremstilling derav samt dets anvendelse - Google Patents
Reagens for bestemmelse av (1-3)-<beta>-D-glukan, en fremgangsmÕte for fremstilling derav samt dets anvendelse Download PDFInfo
- Publication number
- NO303179B1 NO303179B1 NO924382A NO924382A NO303179B1 NO 303179 B1 NO303179 B1 NO 303179B1 NO 924382 A NO924382 A NO 924382A NO 924382 A NO924382 A NO 924382A NO 303179 B1 NO303179 B1 NO 303179B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- reagent
- lysate
- glucan
- endotoxin
- prepared
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 title claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 108010001062 polysaccharide-K Proteins 0.000 claims description 52
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 claims description 16
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 10
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims description 6
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract description 114
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 abstract description 13
- 241000239218 Limulus Species 0.000 abstract description 12
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 abstract description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 4
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 abstract description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 abstract description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 36
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 27
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 25
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 12
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 10
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 8
- -1 filter Substances 0.000 description 8
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 7
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 3
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 3
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 3
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 3
- 241000239224 Tachypleus tridentatus Species 0.000 description 3
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 108010045487 coagulogen Proteins 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 206010052366 systemic mycosis Diseases 0.000 description 3
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 3
- DELJNDWGTWHHFA-UHFFFAOYSA-N 1-azaniumylpropyl(hydroxy)phosphinate Chemical compound CCC(N)P(O)(O)=O DELJNDWGTWHHFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfamate Chemical compound [NH4+].NS([O-])(=O)=O GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 2
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 2
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100522110 Oryza sativa subsp. japonica PHT1-10 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 2
- 101100522109 Pinus taeda PT10 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 108010071063 butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N fluconazole Chemical compound C1=NC=NN1CC(C=1C(=CC(F)=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004884 fluconazole Drugs 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001146702 Candidatus Entotheonella factor Species 0.000 description 1
- 241000239219 Carcinoscorpius rotundicauda Species 0.000 description 1
- 229920002558 Curdlan Polymers 0.000 description 1
- 239000001879 Curdlan Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000655516 Eurycheilichthys limulus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239205 Merostomata Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000239221 Tachypleus gigas Species 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940078035 curdlan Drugs 0.000 description 1
- 235000019316 curdlan Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229940058401 polytetrafluoroethylene Drugs 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- XYZOMPCEZFRTOR-OALUTQOASA-N tert-butyl n-[(2s)-1-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XYZOMPCEZFRTOR-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
- G01N2400/22—Dextran
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et reagens for bestemmelse av (1-3)-Ø-D-glukan, en fremgangsmåte for fremstilling derav samt dets anvendelse for å påvise en mycete.
En metode for bestemmelse av endotoksin ved anvendelse av limulus amebocytt lysat (heretter betegnet lysat) er kjent og kalles vanligvis limulustesten. Denne metode utnytter koa-gulasjonen av lysatet med en spormengde endotoksin. Påføl-gende biokjemiske studier har vist at koagulasjonsreaksjonen bevirkes ved en trinnvis aktivering av en rekke koagulasjons-faktorer [Takanori Nakamura et al., Japanese Journal of Bacteriology, 38, 781-803 (1983)]. Denne reaksjonen er som et eksempel vist i det etterfølgende i forbindelse med fig. 1 med anvendelsen av et lysat oppnådd fra Tachypleus tridentatus i Japan. Når endotoksinet tilsettes til lysatet aktiveres faktor C (endotoksinsensitiv faktor, molekylvekt: 123.000) til å danne en aktivert faktor C. Denne aktiverte faktor C vil på restriktiv måte hydrolysere faktor B (molekylvekt: 64.000) i spesifikke seter til å danne en aktivert faktor B. Denne aktiverte faktor B aktiverer deretter et pro-klumpdannelsesenzym (molekylvekt: 54.000) og endrer det således til et klumpdannelsesenzym. Det således dannede enzym vil på restriktiv måte hydrolysene spesifikke seter (dvs.Arg<18->Thr1<9>og Arg<46->Gly<47>) i sløyfen som er tverr-bundet via disulfidbindinger i koagulogen (koagulerende protein, molekylvekt: 19.723) for derved å frigjøre et peptid C (bestående av 28 aminosyrerester) som er representert ved H-Thr<19>- - - Arg<46->0H, mens residualdelen av koagulogenet om-dannes til en koagulingel. Denne reaksjon omfatter således en rekke reaksjoner (et kaskade-reaksjonssystem).
Når ikke bare endotoksin men også (1-3)-Ø-D-glukan tilsettes til lysatet aktiveres, på den annen side, faktoren G i dette kaskade-reaksjonssystemet som vist i fig. 1. Den således dannede aktiverte faktor G aktiverer pro-klumpdannelsesenzymet til klumpdannelsesenzymet. Deretter fortsetter reaksjonen på samme måte som beskrevet over til å danne en koagulingel. Klumpdannelsesenzymet som er dannet i det ovennevnte kaskade-reaksjonssysternet frigir p-nitroanilin fra f.eks. t-butoksy-karbonyl-leucyl-glycyl-arginin-p-nitroanilid (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) som adderes separat til reaksjonssystemet. Således kan endotoksin eller (1-3)-Ø-D-glukan bestemmes kvantitativt ved å måle absorbansen av det dannede p-nitroanilin som er en kromogen substans. Dette kaskadereaksjonssystemet anvendes for den spesifikke bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan i eksemplene som er beskrevet i det etterfølgende.
På den annen side er det rapportert en metode for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan ved anvendelse av faktor G i lysatet [Obayashi, T. et al., Clin. Chim. Acta, 149, 55-65 (1985)].
Denne metode omfatter imidlertid fraksjonering av lysatet ved gelfiltrering eller affinitetskromatografi med anvendelse av en bærer med heparin- eller dekstransulfat bundet dertil for å fjerne endotoksinsensitiv faktor, dvs. faktor C og for særlig bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan med faktoren G og pro-klumpdannelsesenzymet. Denne metoden krever således svært kompliserte prosedyrer for den ovennevnte fraksjonering.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et reagens for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan som omfatter et bearbeidet lysat som i alt vesentlig ikke inneholder endotoksin-sensitiv faktor (faktor C) og som er oppnådd ved at lysatet behandles ved hjelp av en forbedret metode.
Oppfinnelsen vedrører således et reagens for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan, som er kjennetegnet ved at det som hovedkomponent omfatter et bearbeidet limulus amebocytt lysat som i alt vesentlig ikke omfatter noe endotoksin-sensitiv faktor og som omfatter minst en bestanddel som kan reagere spesifikt med (1-3)-p-D-glukan, og at det omfatter et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem, idet nevnte reagens kan oppnås ved at en limulus amebocytt lysat-holdig oppløsning bringes i kontakt med en polyamid-uoppløselig bærer eller en cellulose- uoppløselig bærer som spesifikt er istand til å adsorbere en endotoksin-sensitiv faktor.
Reagenset ifølge oppfinnelsen kan foretrukket omfatte dekstran. Reagenset omfattende et bivalent metallsalt som nevnt i det foregående kan også omfatte et substrat for et klumpdannelsesenzym.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av et reagens for bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan, som er kjennetegnet ved at en limulus amebocytt lysat-holdig oppløsning bringes i kontakt med en polyamid-uoppløselig bærer eller en cellulose-uoppløselig bærer som spesifikt kan adsorbere en endotoksin-sensitiv faktor til å gi et bearbeidet limulus amebocytt lysat som i alt vesentlig ikke omfatter endotoksin-sensitiv faktor og som omfatter minst en bestanddel som er istand til å reagere spesifikt med (1-3)-p-D-glukan, idet det nevnte reagens også omfatter et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem.
I den ovennevnte fremgangsmåte er det foretrukket at opp-løsningen som omfatter limulus amebocytt lysat ytterligere omfatter dekstran.
Det divalente metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av kaskade-reaksjonssystemet kan eventuelt tilsettes sammen med et substrat for et klumpdannelsesenzym, til det behandlede limulus amebocytt lysat og hvorpå den oppnådde blanding tørkes uten oppvarming.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere en
anvendelse av reagenset for å påvise myceter og som omfatter at en kroppsvæske fra en pasient som lider av mykose bringes i kontakt med ovennevnte reagens, og måling av en forandring i et substrat i et kaskade-reaksjonssystem forårsaket av (1-3)-p-D-glukan.
Som lysat kan det anvendes ekstrakter fra blodlegemer fremstilt på vanlig måte fra hemolymfe fra hesteskokrabbe som inkluderer Limulus polyphemus i Amerika, Tachypleus tridentatus i Japan og Kina, Tachypleus gigas i Thailand og Malaysia og Carcino-scorpius rotundicauda i Thailand og Malaysia (f.eks. J. Biochem., 80, 1011-1021 (1976)).
Limulus amebocytt lysatet kan enten kontinuerlig eller sats-vis bringes i kontakt med en polyamid- eller celluloseuopp-løselig bærer, f.eks. ved at lysatet føres gjennom den nevnte bærer som er i form av en membran hvorpå den fraksjon som er passert samles, ved at lysatet føres gjennom en kolonne som er pakket med den nevnte bærer i form av partikler og hvorpå den passerte fraksjon samles eller ved at lysatet bringes i kontakt med den nevnte bærer i form av biter eller et pulver med passende størrelse og hvorpå bæreren fjernes ved hjelp av en vanlig anvendt faststoff/væske separasjonsprosedyre som sentrifugering eller filtrering.
Adsorpsjonen av endotoksin-sensitive faktorer ved hjelp av
bæreren kan ytterligere fremmes ved at dekstran tilsettes til lysatet før dette bringes i kontakt med bæreren, såvel som at sensitiviteten av det således oppnådde bearbeidede lysat overfor (1-3)-p-D-glukan også kan fremmes.
Den gjennomsnittlige molekylvekt for dekstranet som anvendes er fra 5000 til 5.000.000, foretrukket fra 10.000 til 100.000.
Dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt som er mindre
enn 50 00 kan ikke anvendes da det neppe fremmer adsorpsjonen av endotoksin-sensitive faktorer ved hjelp av bæreren. På den annen side kan dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt på over 5.000.000 ikke anvendes på grunn av usedvanlig høy viskositet.
Den polyamid-uoppløselige bærer som anvendes i forbindelse med oppfinnelsen er en krystallinsk lineær polymer med en hovedkjede som består av gjentatte syreamidbindinger og den er i form av en membran (f.eks. filter, hulfiber, rør, film), partikler, biter eller pulver. Eksempler derpå inkluderer bærere som omfatter et diamin/dikarboksylsyrepolykondensat eller en forbindelse som er dannet ved polykondensering av co-aminokarboksylsyre eller det tilsvarende laktam som nylon6eller nylon 66 som hovedkomponent.
Den cellulose-uoppløselige bærer som anvendes i forbindelse med oppfinnelsen er en bærer som omfatter cellulose eller et derivat derav som hovedkomponent og som er i form av en membran (f.eks. filter, hulfiber, rør, film), partikler, biter eller pulver som beskrevet i det foregående. Eksempler på cellulosederivater inkluderer celluloseestere som celluloseacetat eller cellulosenitrat, aminoetyl-, bromacetyl-, fosfor- eller karboksymetyl-substituert cellulose og karboksymetylcellulosehydrazid-derivat.
Biologiske prøver som kan anvendes for måling av (1-3)-p-D-glukan inkluderer kroppsfluid, eksudat og ekskret som blod, plasma, serum, cerebrospinalvæske, ascites, leddvæske, pleurittvæske, melk og urin.
(1-3)-p-D-glukan kan bestemmes ved anvendelse av reagenset i henhold til oppfinnelsen ved den metode som vanligvis anvendes for bestemmelse av aktiviteten av klumpdannelsesenzymet som er dannet gjennom aktiveringen i kaskadereaksjonssystemet som vist i fig. 1.
For å bestemme den amidolytiske aktivitet for klumpdannelsesenzymet, kan det ovennevnte syntetiske peptidsubstrat med en kromogen rest eller dem med liknende aminosyresekvens med unntak av at karboksylgruppen i arginin på den terminale ende ikke er substituert med den ovennevnte kromogene rest men med en kjent fluorescerende rest, luminiscerende rest eller med ammoniakk via en amidbinding, anvendes som et substrat. Den amidolytiske aktivitet kan således måles ved å bestemme prod-uktet som er dannet fra det syntetiske substrat gjennom reaksjonen med klumpdannelsesenzymet. Mere spesielt ble det ovennevnte syntetiske peptidsubstrat tilsatt til et reak sjonssystem som inkluderer reagenset i henhold til oppfinnelsen og (1-3)-P-D-glukan, og et kromogent eller fluorescerende produkt eller ammoniakk som er dannet i reaksjonen (kaskadereaksjon, eventuelt etterfulgt av omdannelse av prod-uktet til et annet fargestoff) bestemmes med f.eks. et spek-trofotometer, et fluorfotometer, en anordning for påvisning av kjemiluminescens eller en elektrode for påvisning av ammoniakk (JP-A-62-148860).
Proteaseaktiviteten for klumpdannelsesenzymet kan bestemmes ved å måle geleringsreaksjonen hvori klumpdannelsesenzymet reagerer med et koagulogen (substrat) som er inneholdt i reagenset i henhold til oppfinnelsen (eller tilsatt separat dertil) til å danne en koagulingel, enten ved hjelp av et passende apparat (f.eks. turbidimeter, viskosimeter) eller aktiviteten kan bestemmes visuelt.
Det bearbeidede limulus amebocytt lysat for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse kombineres med et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av det ovennevnte kaskade-reaksjonssystemet. Eksempler på det divalente metallsalt inkluderer halogenider (f.eks. klorider) og sulfater av jordalkalimetaller som magnesium, kalsium og strontium. • Reagenset i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles ved at det bearbeidede limulus amebocytt lysat tørkes sammen med de ovennevnte divalente metallsalter under betingelser uten oppvarming (f.eks. frysetørking) til fast form. Et reagens for bestemmelse av den ovennevnte amidolytiske aktivitet omfatter foretrukket det ovennevnte syntetiske peptidsubstrat i tillegg til det ovennevnte divalente metallsalt, og det kan eventuelt tørkes.
Endotoksinsensitive faktorer som er inneholdt i lysatet kan adsorberes og elimineres, uten svekkelse av aktiviteten av
noen (1-3)-P-D-glukan-sensitiv faktor, ved at lysatet bringes i kontakt med en polyamid- eller cellulose-uoppløselig bærer og et bearbeidet lysat som er istand til å reagere spesifikt med (1-3)-p-D-glukan oppnås således. I tillegg kan den adsorberende/eliminerende virkning ytterligere økes ved at
dekstran på forhånd tilsettes til lysatet eller i trinnet hvor lysatet bringes i kontakt med bæreren slik at viskosi-teten av lysatet økes.
Kort beskrivelse av te<g>ningene.
Fig. 1 viser en reaksjonsmekanisme for limulus amebocytt
lysat med endotoksin og (1-3)-p-D-glukan.
Fig. 2 viser en kalibreringskurve for reagenset I-l overfor
(1-3)-p-D-glukan.
Fig. 3 viser en kalibreringskurve for reagenset II-H overfor
(1-3)-p-D-glukan.
Den foreliggende oppfinnelse er ytterligere illustrert ved hjelp av de etterfølgende eksempler.
Eksempel 1.
500 ml hemolymfe fra hesteskokrabbe (T. tridentatus) ble sentrifugert ved 4°C og ved 1500 rpm i 10 min. Til omtrent 10 g av det oppnådde presipitat (amebocytt) ble det tilsatt 100 ml 0,02 M Tris-HCl buffer (pH 8,0) og blandingen ble nedbrutt homogent ved hjelp av en homogenisator [Polytron R PT10 (varebetegnelse), produsert av Kinematical], etterfulgt av ekstraksjon. Det oppnådde ekstrakt ble deretter sentrifugert med avkjøling ved 10 000 x g i 30 min. for å samle supernatanten og presipitatet. Presipitatet ble ytterligere ekstrahert to ganger med porsjoner på 60 ml av bufferen for til slutt å oppnå 200 ml av lysatet.
Fem reagenser ble fremstilt ved hjelp av de følgende metoder og reaktivitetene av disse reagenser med endotoksin og (1-3)-P-D-glukan ble undersøkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens I-A var et ubehandlet lysatreagens som var fremstilt ved at 880 fil av lysatet var tilsatt til en blanding av 200/zl 0,8 M magnesiumklorid med 200 (il 6 mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (heretter "MS blanding"), etterfulgt av frysetørking.
Reagens I-B var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (et lysat behandlet med nylonmembran) som var oppnådd ved at 1,2 ml av lysatet ble ført gjennom et nylonmembranfilter med porestørrelse 0,20/zm [Nalgene Syringe Filter (varebetegnelse) , diameter 25 mm, produsert av Nalge] hvoretter 880/zl av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og idet det deretter ble gjennomført frysetørking.
Reagens I-C var et bearbeidet lysat for sammenligning som var oppnådd ved at 1,2 ml av lysatet ble ført gjennom et poly-(vinylidenfluorid)membranfilter med en porestørrelse på 0,22/zm [Millex GV (varebetegnelse) , diameter 25 mm, produsert av Millipore] , og hvoretter 880/il av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og det ble så gjennomført frysetørking.
Reagens I-D var et bearbeidet lysat for sammenligning som ble oppnådd ved at 1,2 ml av lysatet ble ført gjennom et poly-tetrafluoretylen-membranfilter med en porestørrelse på 0,2 0/zm [Millex FG (varebetegnelse) , diameter 25 mm, produsert av Millipore] , og hvorpå 880/zl av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og med etterfølgende fryse-tørking .
Reagens I-E var et bearbeidet lysat for sammenligning som var oppnådd ved at 1,2 ml av lysatet ble ført gjennom et poly-sulfon-membranfilter med en porestørrelse på 0,20/zm [Acrodisc (varebetegnelse), diameter 25 mm, produsert av Gelman Sciences] , hvoretter 880/zl av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og med etterfølgende frysetørking.
Til hver av de ovennevnte fem reagenser ble det tilsatt
2,2 ml 0,2 M Tris-HCl buffer (pH 8,0) og med etterfølgende oppløsning. Til 0,1 ml av den således oppnådde oppløsning ble det tilsatt 0,1 ml endotoksin eller (1-3)-p-D-glukan og
blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 min.. Separat ble 0,05 ml av hver prøve med dobbel konsentrasjon tilsatt og den oppnådde blanding ble inkubert på samme måte. Reaktivitetene av prøvene med disse fem reagenser ble bestemt ved at det på-følgende ble tilsatt 0,5 ml 0,04% natriumnitritt i 0,48 M saltsyre, 0,5 ml 0,3% ammoniumsulfamat og 0,5 ml 0,07% N-l-naftyletylendiamindihydroklorid til den inkuberte blanding hvorpå de ble reagert med pNA (p-nitroanilin) dannet etter 3 0 min. for å utvikle farge hvorpå absorbansen for oppløsningen måles ved 545 nm.
Tabell 1 viser resultatene. Resultatene indikerer at (1-3)-P-D-glukan kan bestemmes spesifikt uten innvirkning av endotoksin ved anvendelse av det limulus amebocytt lysat som er blitt ført gjennom et polyamid-membran(nylonmembran)filter en gang.
I overensstemmelse med internasjonal patentpublikasjon nr. W090/02951 (1990) ble 1 g curdlan (kommersielt tilgjengelig fra Wako Pure Chemical Industries) suspendert i omtrent 100 ml av en vandig oppløsning av 5 mM NaOH og desintegrert ved lydbehandling med en Sonicator [Model 52 02 PZT (Ohtake Seisakusho, Tokyo)] ved 20 kHz og 80 W under avkjøling på is i12min. Til den behandlede suspensjon ble det deretter tilsatt en vandig oppløsning av 5 M NaOH til å gi en slutt-konsentrasjon på 0,3 M NaOH som vandig oppløsning. Den oppnådde oppløsning ble fraksjonert ved gelpermeasjonskro-matografi (GPC kolonne: to TSK geler G3000 PWXL, en G2500 PWXL, mobil fase: vandig oppløsning av 0,3 M NaOH, strøm-ningstakt: 0,5 ml/min). Det ble oppnådd en renset GPC fraksjon ((1-3)-P-D-glukan preparat) med molekylvekt på 216.000 ved rekromatografi.
Eksempel 2.
Til 4 0 ml av utgangslysatet, fremstilt i eksempel 1 ble det tilsatt den samme mengde destillert vann (heretter lysat + DW). Til 40 ml av lysatet ble det tilsatt den samme mengde av en vandig oppløsning av 15% (vekt/volum) dekstran (molekylvekt: 40.000) og blandingen ble sentrifugert ved 3.500 rpm i 10 min. for å oppnå supernatanten (heretter lysat + Dx).
Fire reagenser ble fremstilt ved hjelp av de etterfølgende metoder og reaktiviteter for disse reagenser overfor endotoksin og (1-3)-p-D-glukan ble undersøkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens I-F var et ubehandlet lysatreagens (ubehandlet + DW) som var fremstilt ved at 1,76 ml lysat + DW var tilsatt til MS blandingen og deretter frysestørket.
Reagens I-G var et ubehandlet lysatreagens som inneholdt dekstran (ubehandlet + Dx) som var fremstilt ved at 1,76 ml lysat + Dx var tilsatt til MS blandingen og frysetørket.
Reagens I-H var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (nylonmembran + DW) som var fremstilt ved at 5,0 ml lysat + DW var ført gjennom et nylonmembranfilter med porestørrelse på 0,20/zm (Nalgene Syringe Filter), hvorpå 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og frysetørket.
Reagens I-l var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som inneholdt dekstran (nylonmembran + Dx) som var fremstilt ved at 5,0 ml lysat + Dx var ført gjennom et nylonmembranfilter med en porestørrelse på 0,20 fxm (Nalgene Syringe Filger), hvoretter 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) var tilsatt til MS blandingen og frysetørket.
Reaktiviteter for hver prøve med de ovennevnte fire reagenser ble bestemt på samme måte som i eksempel 1. Tabell 2 viser resultatene. Resultatene indikerer at adsorpsjonen av endotoksin-sensitive faktorer ved hjelp av bæreren kan fremmes ved at dekstran først tilsettes til lysatet, og at sensitiviteten av det bearbeidede lysat overfor (1-3)-Ø-D-glukan som således er oppnådd derved kan økes i meget stor grad.
Eksempel 3.
600 ml hemolymfe fra hesteskokrabbe (L. polyphemus) ble sentrifugert ved 4°C og 500 rpm i 10 min. Til omtrent 12 g av det oppnådde presipitat (amebocytt) ble det tilsatt 12 0 ml 0,02 M Tris-HCl buffer (pH 8,0) og blandingen ble behandlet med en homogenisator (Polytron R PT10) med etterfølgende ekstraksjon. Ekstraktet ble deretter sentrifugert med av-kjøling ved 10 000 x g i 30 min. for å samle supernatanten og presipitatet. Presipitatet ble ytterligere ekstrahert 2 ganger med 65 ml porsjoner av bufferen for endelig å oppnå
220ml av lysatet. Til 20 ml av dette lysat ble det tilsatt den samme mengde 15% (vekt/volum) dekstran (molekylvekt: 70.000) og blandingen ble sentrifugert ved 3500 rpm i 10 min. Supernatanten ble deretter omtalt som D-lysatet. Ved anvendelse av dette D-lysatet ble det fremstilt to reagenser ved hjelp av de følgende metoder og reaktivitetene av disse reagenser med endotoksin og (1-3)-p-D-glukan ble undersøkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens I-J var et ubehandlet lysatreagens som inneholdt dekstran (ubehandlet + Dx) og som var fremstilt ved at 1,76 ml av D-lysatet tilsettes til MS blandingen og frysetørkes.
Reagens I-K var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som inneholdt dekstran (nylonmembran + Dx) som var fremstilt ved at 10 ml av D-lysatet var ført gjennom et nylonmembranfilter [Nalgene Media Plus Filter Unit (varebetegnelse), diameter 90 mm, produsert av Nalge], hvoretter 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og frysetørket.
Reaktiviteten for hver prøve med de ovennevnte to reagenser ble bestemt på samme måte som i eksempel 1. Tabell 3 viser resultatene. Resultatene indikerer at det behandlede lysat fremstilt ved passering gjennom polyamid (nylon) membranen ikke reagerte med endotoksin men utelukkende med (1-3)-p-D-glukan, og at sensitiviteten av lysatet overfor (1-3)-p-D-glukan kan økes i stor grad ved at dekstan tilsettes til lysatet før behandlingen.
Eksempel 4.
Fremstilling av reagens for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan ved anvendelse av et markedsført limulus testreagens med gelering: De ønskede reagenser for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan ble uten vanskelighet fremstilt fra markedsførte lysatprodukter, dvs. limulus testreagenser som gjør bruk av gelering, ved hjelp av følgende metode.
Reagens I-L var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som ble fremstilt ved at et limulus testreagens [Pregel-M (varebetegnelse), Lot. AB-01, kommersielt tilgjengelig fra Seikagaku Corporation] ble oppløst i 2,6 ml destillert vann for injeksjon, oppløsningen ble ført gjennom et nylonmembranfilter med en porestørrelse på 0,20/zm [Tissue Culture Filter Unit TC (varebetegnelse), diameter 47 mm, produsert av Nalge] og med anvendelse av det således oppnådde filtrat (passert fraksjon).
Reagens I-M var et ubehandlet Pregel-M reagens (ubehandlet +
DW) .
Reagens I-N var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som var fremstilt ved at et limulus testreagens [Limulus HSII-Test Wako (varebetegnelse), parti EMM090, kommersielt tilgjengelig fra Wako Pure Chemical Industries] ble oppløst i 5,0 ml destillert vann for injeksjon, hvoretter oppløsningen ble ført gjennom det samme nylonmembranfilter (Tissue Culture Filter Unit TC) og hvorpå 2,6 ml av det således oppnådde filtrat (passert fraksjon) ble frysetørket.
Reagens 1-0 var et ubehandlet Limulus HSII-Test Wako reagens (ubehandlet + DW).
Reagensene I-M og I-N ble oppløst i 2,6 ml porsjoner av destillert vann for injeksjon, mens reagens 1-0 ble oppløst i 5,0 ml destillert vann for injeksjon. Til 0,1 ml av hver av reagensene I-L til 1-0 ble det tilsatt 0,1 ml porsjoner av henholdsvis destillert vann for injeksjon (blindprøve), endotoksin (avledet fra E. coli 0111:B4) og (1-3)-p-D-glukan. Etter at blandingene var inkubert ved 37°C i 60 min. ble geleringen observert. Tabell 4 viser resultatene. I tabell 4 betyr + at det ble dannet en gel mens - betyr at det ikke ble dannet gel. Som det klart fremgår fra tabell4er reagensene I-L og I-N lysater som er egnet for formålet for den foreliggende oppfinnelse da de utelukkende vil reagere med (1-3)-p-D-glukan.
Det er kjent at (1-3)-p-D-glukan er et polysakkarid som byg-ger opp celleveggen i myceter. Tilstedeværelsen av myceter in vivo kan således undersøkes ved å måle (1-3)-p-Dglukan in vitro. I de etterfølgende eksempler 5 til 7 er metoder for påvisning av myceter i henhold til oppfinnelsen beskrevet.
Eksempel 5.
Måling av plasmaprøver.
Blod ble samlet aseptisk fra 11 pasienter som var innlagt på sykehus og som led av alvorlig hemopati (akutt lymfoblast leukemi, akutt myelogen leukemi, multippel myelom osv.) og som man antok led av septikemi, og heparin ble tilsatt til plasmaet som ble anvendt som en prøve. Hver prøve ble sentrifugert ved 4°C og ved 150 x g i 10 min. for å oppnå et platerikt plasma. Til 0,1 ml av det samme ble det tilsatt 0,2 ml 0,32 M perklorsyre og blandingen ble inkubert ved 37oC i 2 0 min. Deretter ble bunnfallet fjernet ved sentrifugering (3000 rpm, 10 min.). 0,05 ml av supernatanten ble nøytrali-sert ved tilsetning av 0,05 ml 0,18 M NaOH. Denne ble anvendt som en prøve.
Deretter ble 0,1 ml av reagenset I-l i henhold til oppfinnelsen for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan og som var fremstilt i henhold til metoden som beskrevet i eksempel 2 tilsatt dertil og blandingen ble inkubert til 37oC i 3 0 min.
Til den oppnådde oppløsning ble det påfølgende tilsatt 0,5 ml 0,04% natriumnitritt i 0,48 M saltsyre, 0,5 ml 0,3% ammoniumsulfamat og 0,5 ml 0,07% N-l-naftyletylendiamindihydroklorid for å bevirke diazo-kobling. Deretter ble absorbansen for den oppnådde oppløsning målt ved 545 nm. Mengden (1-3)-p-D-glukan ble vist ved hjelp av en kalibreringskurve (fig. 2) som ble fremstilt separat. Som vist i tabell 5 ble det påvist en høy konsentrasjon av (1-3)p-D-glukan i alle tilfellene (nr. 1 til nr. 11) (friske individer: 0,2 + 0,3 pg/ml).
I fem av disse tilfellene (nr. 1 til nr. 5) ble Candida albicans, Candida quilliermondii, Candida tropicalis, Candida krusei og Cryptococcus neoformans henholdsvis påvist ved hjelp av en blodagarkultur. De andre to tilfellene (nr. 6 og nr. 7) hadde negativ blodagarkultur, men Aspergillus fumigatus ble påvist ved histopatologisk undersøkelse ved autopsi. De resterende fire tilfeller (nr. 8 til nr. 11) hadde negativ blodagarkultur, skjønt det i stor grad var forventet at disse tilfellene led av mykose sett på bakgrunn av kliniske symptomer, utbredelse og medikamentsensitivitet. Tilførsel av antimykosemidler (amfotericin B, mikronazole og flukonazole) ga imidlertid en usedvanlig forbedring sett på bakgrunn av de kliniske symptomer i alle tilfellene. Det vil således forstås at prøvereagenset i henhold til oppfinnelsen forventes å være svært effektiv for en rask diagnose av mykose, særlig dyp mykose som nærmest ikke kan påvises ved hjelp av vanlig anvendte metoder.
Eksempel 6.
Måling av urinprøve.
(1-3)-p-D-glukan i urin fra tre pasienter som led av en komplisert infeksjonssykdom i urinveiene og som var innlagt på sykehus, og hvor Candida albicans eller Candida glabrata var påvist ved dyrking av urinen, ble bestemt ved anvendelse av reagenset i henhold til oppfinnelsen. Urinen ble samlet aseptisk i et sterilt beger. Til 0,005 ml av urinen ble det tilsatt 0,1 ml destillert vann for injeksjon og deretter 0,1 ml av reagenset I-B i henhold til oppfinnelsen fremstilt
ifølge metoden som beskrevet i eksempel 1 for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan med påfølgende inkubasjon ved 37oC i 30 min. Etter gjennomføring av diazo-kobling som angitt i eksempel 5, ble absorbansen for den oppnådde oppløsning målt ved 54 5 nm.
Mengden (1-3)-p-D-glukan ble beregnet ut fra en kalibreringskurve som var fremstilt separat. Som vist i tabell 6 ble en høy konsentrasjon av (1-3)-p-D-glukan påvist (friske individer: 10 pg/ml eller mindre) i alle tre tilfeller. Det fremkommer således at reagenset i henhold til oppfinnelsen forventes å være meget effektiv for en rask diagnose av mykotiske infeksjonssykdommer i urinveiene.
Eksempel 7.
Måling av prøver av cerebrospinalvæske.
Cerebrospinalvæske ble samlet aseptisk ved hjelp av en lumbal-punksjon fra 3 pasienter som var innlagt på sykehus og som man forventet led av meningitt og hvor det var bekreftet mykotisk meningitt ved påvisning av Cryptococcus neoformans i cerebrospinalvæsken. Til 0,05 ml av cerebrospinalvæsken ble det tilsatt 0,05 ml destillert vann for injeksjon og 0,1 ml av reagenset I-K i henhold til oppfinnelsen for bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan som beskrevet i eksempel 3 hvoretter blandingen ble inkubert ved 37oC i 30 min. Etter gjennom-føring av diazo-kobling som angitt i eksempel 5 ble absorbansen av den oppnådde oppløsning målt ved 545 nm. Mengden (1-3)-p-D-glukan ble beregnet ut fra en kalibreringskurve som var fremstilt separat. Som tabell 7 viser ble det påvist en høy konsentrasjon av (1-3)-p-D-glukan (friske individer: 1 pg/ml eller mindre) i alle de tre tilfellene. Det vil således forstås at reagenset i henhold til oppfinnelsen forventes å være meget effektivt for en rask og tidlig diagnostisering av mykotisk meningitt.
Eksempel 8.
Ved anvendelse av det urene lysat fremstilt ved den metode som er beskrevet i eksempel 1 ble det fremstilt fire reagenser ved hjelp av de følgende metoder og reaktivitetene av disse reagenser med endotoksin og (1-3)-p-D-glukan ble under-søkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens II-A var et ubehandlet lysatreagens som var fremstilt ved at 880 fil av lysatet ble tilsatt til MS blandingen, etterfulgt av frysetørking.
Reagens II-B var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (celluloseester-membran) som var oppnådd ved at 1,5 ml av lysatet ble ført gjennom et celluloseester-membranfilter med en porestørrelse 0,22 Lim [Sterifil D-GS (varebetegnelse), celluloseacetat/cellulosenitrat-blanding, diameter 47 mm, produsert av Millipore], og med etterfølgende tilsetning av 880/il av filtratet (passert fraksjon) til MS blandingen med påfølgende frysetørking.
Reagens II-C var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (celluloseacetat-membran) som var oppnådd ved at 1,5 ml av lysatet ble ført gjennom et celluloseacetat-membranfilter med en porestørrelse på 0,20 tun [Nalgene Filterware (varebetegnelse) , diameter 47 mm, produsert av Nalge] , og idet 880 til av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen, etterfulgt av frysetørking.
Reagens II-D var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (cellulosenitratmembran) som var oppnådd ved at 1,5 ml av lysatet ble ført gjennom et cellulosenitrat-membranfilter med en porestørrelse på 0,20/im [Nalgene Filterware (varebetegnelse) , diameter 47 mm, produsert av Nalge] , og 880/il av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen med etterfølgende frysetørking.
Reaktiviteter for hver prøve med de ovennevnte fire reagenser ble bestemt på samme måte som i eksempel 1.
Tabell 8 viser resultatene. Resultatene indikerer at (1-3)-P-D-glukan kan bestemmes kvantitativt og spesifikt uten innvirkning av endotoksin, ved anvendelse av lysatet som er ført gjennom et cellulosemembranfilter en gang.
Eksempel 9.
Ved anvendelse av lysatet + DW som fremstilt i eksempel 2 ble det fremstilt seks reagenser ved hjelp av de følgende metoder og reaktiviteten av disse reagenser med endotoksin og (1-3)-P-D-glukan ble undersøkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens II-E var et ubehandlet lysatreagens (lysat + DW) som var fremstilt ved at 1,76 ml lysat + DW ble tilsatt til MS blandingen og frysetørket.
Reagens II-F var et ubehandlet lysatreagens som inneholdt dekstran (lysat + Dx) som var fremstilt ved at 1,76 ml lysat + Dx tilsettes til MS blandingen og frysetørkes.
Reagens II-G var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (celluloseester-membran + DW) som var fremstilt ved at 5 ml lysat + DW var ført gjennom et celluloseester-membranfilter med en porestørrelse på 0,22 [ im [Millex GS (varebetegnelse), celluloseacetat/cellulosenitratblanding, diameter 25 mm, produsert av Millipore], 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført fryse-tørking .
Reagens II-H var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som inneholdt dekstran (celluloseestermembran + Dx) som var fremstilt ved at 5 ml lysat + Dx var ført gjennom et celluloseester-membranfilter med en porestørrelse på 0,22/im (Millex GS), 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) tilsettes til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reagens II-I var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (celluloseacetatmembran + DW) som var fremstilt ved at 5 ml lysat + DW var ført gjennom et celluloseacetat-membranfilter med en porestørrelse på 0,20 Lim [Nalgene Syringe Filter (varebetegnelse), diameter 25 mm, produsert av Nalge], 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reagens II-J var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som inneholdt dekstran (celluloseacetatmembran + Dx) som var fremstilt ved at 5 ml lysat + Dx var ført gjennom et celluloseacetat-membranf ilter med en porestørrelse på 0,20/im (Nalgene Syringe Filter), 1,76 ml av filtratet (passert fraksjon) ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennom-ført frysetørking.
Reaktiviteter for hver prøve med de ovennevnte seks reagenser ble bestemt ved metoden som beskrevet i eksempel 1. Tabell 9 viser resultatene. Resultatene indikerer at adsorpsjonen av endotoksin-sensitive faktorer ved hjelp av bæreren kan fremmes ved at dekstran først tilsettes til lysatet og at sensitiviteten for det således oppnådde bearbeidede lysat overfor (1-3)-p-D-glukan derved kan økes ekstremt.
Eksempel 10.
Ved anvendelse av D-lysatet som fremstilt i eksempel 3 ble det fremstilt 8 reagenser ved hjelp av de følgende metoder og reaktiviteten av disse reagenser med endotoksin og (1-3)-p-D-glukan ble undersøkt og sammenlignet med hverandre.
Reagens II-K var et ubehandlet lysatreagens som ble fremstilt ved at 1,76 ml av D-lysatet ble tilsatt til MS blandingen og med etterfølgende frysetørking.
Reagens II-L var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (cellulosegel) som ble fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengde av en porøs cellulosegel [Cellulofine GC-200 m (varebetegnelse), kommersielt tilgjengelig fra Seikagaku Corporation], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reagens II-M var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (dietylaminoetylcellulosegel) som var fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengde av en dietyl aminoetylcellulosegel [DEAE-Cellulose, produsert av Serva Feinbiochemica GmbH], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reagens II-N var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (karboksymetylcellulosegel) som var fremstilt ved at 2,6 ml D-lysatet ble blandet med den samme mengde av en karboksymetylcellulosegel [produsert av Serva Feinbiochemica GmbH], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gj ennomført frysetørking.
Reagens II-0 var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen (fosforcellulosegel) som var fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengde av en fosforcellulosegel [produsert av Serva Feinbiochemica GmbH], blandingen ble filtrert gjennom en glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reagens II-P var et lysatreagens for sammenligning (agarosegel) som var fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengden av en agarosegel [Sepharose CL-6B (varebetegnelse), produsert av Pharmacia], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført fryse-tørking .
Reagens II-Q var et lysatreagens for sammenligning (dekstrangel) som var fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengden av en dekstrangel [Sephadex G-150 (varebetegnelse), fremstilt av Pharmacia], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført fryse-tørking .
Reagens II-R var et lysatreagens for sammenligning (polyakrylamidgel) som var fremstilt ved at 2,6 ml av D-lysatet ble blandet med den samme mengden av en polyakrylamidgel [Bio-Gel P-300 (varebetegnelse), produsert av Bio-RadLaboratories], blandingen ble filtrert gjennom et glassfilter (G3), 1,76 ml av filtratet ble tilsatt til MS blandingen og det ble gjennomført frysetørking.
Reaktiviteter for hver prøve med de ovennevnte 8 reagenser ble bestemt ved hjelp av metoden som beskrevet i eksempel 1. Tabell 10 viser resultatene. Resultatene indikerer at (1-3)-P-D-glukan kan bestemmes spesifikt og kvantitativt uten påvirkning av endotoksin ved anvendelse av lysatet som er blitt ført gjennom en cellulosebærer.
Eksempel 11.
Fremstilling av reagens for bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan ved anvendelse av markedsført limulus-testreagens med gelering: De ønskede reagenser for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan ble fremstilt fra markedsførte lysatprodukter, dvs. limulus- testreagenser med gelering, ved anvendelse av den etter-følgende metode.
Reagens II-L-1 var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som var fremstilt ved at et limulus-testreagens [Pregel-M (varebetegnelse) parti AB-01, kommersielt tilgjengelig fra Seikagaku Corporation] ble oppløst i 2,6 ml destillert vann for injeksjon, oppløsningen ble ført gjennom et celluloseacetat-membranfilter med en porestørrelse på 0,22/zm (NalgeneFilterware) og 1,4 ml av det således oppnådde filtrat (passert fraksjon) ble frysetørket.
Reagens II-L-2 var et ubehandlet Pregel-M reagens.
Reagens II-L-3 var et lysatreagens i henhold til oppfinnelsen som var fremstilt ved at et limulus-testreagens [LimulusHSII-Test Wako (varebetegnelse), parti EMM090, kommersielt tilgjengelig fra Wako Pure Chemical Industries] ble oppløst i 5,0 ml destillert vann for injeksjon, oppløsningen ble ført gjennom et celluloseester-membranfilter (Sterifil D-GS) og det således oppnådde filtrat ble anvendt.
Reagens II-L-4 var et ubehandlet Limulus HSII-Test Wako reagens.
Reagensene II-L-1, II-L-2 og II-L-4 ble oppløst i henholdsvis1,4 ml, 2,6 ml og 5,0 ml destillert vann for injeksjon. De samme prøver som ble anvendt i eksempel 4 ble tilsatt til de ovennevnte reagenser og det ble testet for gelering. Tabell 11 viser resultatene. I tabell 11 betyr + at det ble dannet en gel mens - betyr at det ikke ble dannet gel. Som det klart fremgår fra tabell 11 er reagensene II-L-1 og II-L-3 lysater som er egnet for formålet i henhold til oppfinnelsen da de utelukkende reagerte med (1-3)-P-D-glukan.
Eksempel 12.
Måling av plasmaprøver.
Prøvene ble fremstilt ved den samme metode som beskrevet i eksempel 5. 0,1 ml av reagenset II-H i henhold til den foreliggende oppfinnelse for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan og fremstilt ved hjelp av metoden som beskrevet i eksempel 9 ble tilsatt dertil, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 min. Den oppnådde reaksjonsblanding ble behandlet på samme måte som i eksempel 5 og absorbansen av den oppnådde oppløsning ble målt. Mengden (1-3)-p-D-glukan ble beregnet ut fra en kalibreringskurve (fig. 3) som var fremstilt separat. Som vist i tabell 12, ble en høy konsentrasjon av (1-3)-p-D-glukan påvist i alle tilfellene (nr. 1 til nr. 11) (friske individer: 0,2 ± 0,3 pg/ml). I fem av disse tilfellene (nr.
1 til nr. 5) ble henholdsvis Candida albicans, Candida quilliermondii, Candida tropicalis, Candida krusei og Cryptococcus neoformans påvist ved hjelp av en blodagarkultur. De andre to tilfeller (nr. 6 og nr. 7) hadde negativ blodagarkultur, men Asperqillus fumigatus ble påvist ved en histopatologisk undersøkelse i forbindelse med autopsi. De gjen-værende fire tilfeller (nr. 8 til nr. 11) hadde negativ
blodagarkultur, skjønt med sterk mistanke om at de nevnte tilfeller led av mykose sett på bakgrunn av kliniske symptomer, utvikling og medikamentfølsomhet. Tilførsel av anti-mykotiske midler (amfoterisin B, mikronazole og flukonazole) resulterte i betydelig forbedring sett på bakgrunn av kliniske symptomer i alle tilfellene. Ut fra det foregående vil det således forstås at reagenset i henhold til den foreliggende oppfinnelse forventes å være meget effektiv for en rask diagnose av mykose, særlig dyp mykose som vanskelig påvises ved konvensjonelle testmetoder.
Eksempel 13.
Måling av urinprøve.
Urinprøver ble fremstilt fra pasienter som led av en infeksjonssykdom i urinveien, på samme måte som i eksempel6.
0,1 ml av reagenset II-C i henhold til oppfinnelsen, fremstilt ved hjelp av metoden som bekrevet i eksempel 8, ble tilsatt til urinen for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan hvoretter prøven ble inkubert ved 37oC i 3 0 min. Etter gjennomføring av diazo-kobling som angitt i eksempel 5, ble absorbansen for den oppnådde oppløsning målt ved 54 5 nm. Mengden (1-3)-p-D glukan ble beregnet ut fra en kalibreringskurve som var fremstilt separat. Som vist i tabell 13 ble det påvist en høy konsentrasjon av (l-3)-p~D-glukan (friske individer: 10 pg/ml eller mindre) i alle de tre tilfellene. Målemetoden ved anvendelse av reagenset i henhold til oppfinnelsen forventes således å være meget effektiv for en rask diagnose av mykotiske
infeksjonssykdommer i urinveien.
Eksempel 14.
Måling av prøver av cerebrospinalvæske.
Prøver av cerebrospinalvæske ble fremstilt fra pasienter med meningitt ved hjelp av metoden som beskrevet i eksempel7. 0,1 ml av reagenset II-L i henhold til oppfinnelsen, fremstilt i eksempel 10, for bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan ble deretter tilsatt og blandingen ble inkubert ved 3 7oC i 3 0 min. Etter at diazo-kobling var gjennomført som angitt i eksempel 5, ble absorbansen for den oppnådde oppløsning målt ved 545 nm. Mengden (1-3)-p-D-glukan ble beregnet ut fra en kalibreringskurve som var fremstilt separat. Som vist i tabell 14, ble en høy konsentrasjon av (1-3)-p-D-glukan påvist (friske individer: 1 pg/ml eller mindre) i alle tre tilfeller. Målemetoden ved anvendelse av reagenset i henhold til oppfinnelsen forventes således å være meget effektiv for en tidlig og rask diagnose av mykotisk meningitt.
Industriell anvendbarhet.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et endotoksin-sensitivt, faktor-fritt reagens for spesifikk bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan ved anvendelse av lysat og anvendelse av det nevnte reagens. (1-3)-p-D-glukan av mykotisk opprinnelse inneholdt i biologiske prøver som blod eller urin kan raskt og lett bestemmes med stor nøyaktighet ved reagenset ifølge oppfinnelsen. Det foreliggende reagens kan derfor anvendes for rask diagnostisering, passende terapi og evaluering av terapeutisk effekt av dyp mykose som vanskelig kan påvises ved konvensjonelle testmetoder som mycetedyrking.
Reagenset i henhold til oppfinnelsen gjør det videre mulig å gjennomføre en hurtig og nøyaktig bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan av mykotisk opprinnelse som kontaminerer destillert vann for injeksjon, medikamenter for parenteral tilførsel og medisinsk utstyr. Videre kan reagenset i henhold til oppfinnelsen anvendes for screening av (1-3)-P-D-glukan med antitumor aktivitet.
Claims (7)
1. Reagens for bestemmelse av (1-3)-p-D-glukan,karakterisert vedat det som hovedkomponent omfatter et bearbeidet limulus amebocytt lysat som i alt vesentlig ikke omfatter noe endotoksin-sensitiv faktor og som omfatter minst en bestanddel som kan reagere spesifikt med (1-3)-P-D-glukan, og at det omfatter et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem, idet nevnte reagens kan oppnås ved at en limulus amebocytt lysat-holdig oppløsning bringes i kontakt med en polyamid-uoppløselig bærer eller en cellulose-uoppløselig bærer som spesifikt er istand til å adsorbere en endotoksin-sensitiv faktor.
2. Reagens som angitt i krav 1,
karakterisert vedat det omfatter dekstran.
3. Reagens som angitt i krav 1 eller 2,karakterisert vedat det omfatter et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem og et substrat for et klumpdannelsesenzym.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av et reagens for bestemmelse av (1-3)-P-D-glukan,
karakterisert vedat en limulus amebocytt lysat-holdig oppløsning bringes i kontakt med en polyamid-uoppløselig bærer eller en cellulose-uoppløselig bærer som spesifikt kan adsorbere en endotoksin-sensitiv faktor til å gi et bearbeidet limulus amebocytt lysat som i alt vesentlig ikke omfatter endotoksin-sensitiv faktor og som omfatter minst en bestanddel som er istand til å reagere spesifikt med (1-3)-P-D-glukan, idet det nevnte reagens også omfatter et divalent metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisert vedat den nevnte limulus amebocytt lysat-holdige oppløsning omfatter dekstran.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisert vedat det divalente metallsalt som er effektivt i forbindelse med aktiveringen av et kaskade-reaksjonssystem eventuelt tilsettes sammen med et substrat for et klumpdannelsesenzym til det nevnte bearbeidede limulus amebocytt lysat og hvorpå den oppnådde blanding tørkes uten oppvarming.
7. Anvendelse av et reagens som angitt i krav 1-3 for å påvise en mycete, og som omfatter at en kroppsvæske fra en pasient som lider av mykose bringes i kontakt med nevnte reagens, og måling av en forandring i et substrat i et kaskade-reaksjonssystem forårsaket av (1-3)-p-D-glukan.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3073652A JP3040184B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | （１→３）−β−Ｄ−グルカン用測定剤 |
| JP03073651A JP3088120B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | （１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤 |
| PCT/JP1992/000311 WO1992016651A1 (en) | 1991-03-14 | 1992-03-13 | (1←3)-β-D-GLUCAN ASSAYING AGENT |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO924382D0 NO924382D0 (no) | 1992-11-13 |
| NO924382L NO924382L (no) | 1992-11-13 |
| NO303179B1 true NO303179B1 (no) | 1998-06-08 |
Family
ID=26414792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO924382A NO303179B1 (no) | 1991-03-14 | 1992-11-13 | Reagens for bestemmelse av (1-3)-<beta>-D-glukan, en fremgangsmÕte for fremstilling derav samt dets anvendelse |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0598903B1 (no) |
| AT (1) | ATE157403T1 (no) |
| AU (1) | AU658408B2 (no) |
| CA (1) | CA2082962C (no) |
| DE (1) | DE69221879T2 (no) |
| DK (1) | DK0598903T3 (no) |
| FI (1) | FI101979B (no) |
| NO (1) | NO303179B1 (no) |
| WO (1) | WO1992016651A1 (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3322700B2 (ja) * | 1992-09-14 | 2002-09-09 | 生化学工業株式会社 | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 |
| CN1120847C (zh) * | 1994-09-01 | 2003-09-10 | 生化学工业株式会社 | (1→3)－β－D－葡聚糖结合性蛋白质、识别该蛋白质的抗体及其利用 |
| US6084092A (en) | 1997-01-31 | 2000-07-04 | The Collaborative Group, Ltd. | β(1-3)-glucan diagnostic assays |
| US6110692A (en) | 1996-05-01 | 2000-08-29 | The Collaborative Group, Ltd. | Receptor for underivatized aqueous soluble β(1-3)-glucan |
| US6413715B2 (en) | 1997-01-31 | 2002-07-02 | The Collaborative Group | β(1-3)-glucan diagnostic assays |
| JP4346844B2 (ja) | 2001-11-16 | 2009-10-21 | 生化学工業株式会社 | （１→３）−β−Ｄ−グルカン結合ドメインタンパク質、該物質を使用した測定法及び測定キット |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1328074C (en) * | 1988-09-01 | 1994-03-29 | Shigenori Tanaka | Horseshoe crab amebocyte lysate factor g inhibitor |
| JP2564632B2 (ja) * | 1988-11-21 | 1996-12-18 | マルハ株式会社 | β−グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
| JP2854872B2 (ja) * | 1989-02-02 | 1999-02-10 | マルハ株式会社 | カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体 |
| JP2944709B2 (ja) * | 1990-06-21 | 1999-09-06 | 生化学工業株式会社 | （１→３）―β―Ｄ―グルカンの測定剤 |
| JP2560139B2 (ja) * | 1990-07-19 | 1996-12-04 | マルハ株式会社 | βーグルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
| DE69232307T2 (de) * | 1991-05-16 | 2002-07-18 | Ass Cape Cod Inc | Endotoxinbindendes und -neutralisierendes protein und verwendungen dafür |
-
1992
- 1992-03-13 DK DK92906698.3T patent/DK0598903T3/da active
- 1992-03-13 AU AU15442/92A patent/AU658408B2/en not_active Expired
- 1992-03-13 AT AT92906698T patent/ATE157403T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-13 CA CA002082962A patent/CA2082962C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-13 DE DE69221879T patent/DE69221879T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-13 EP EP92906698A patent/EP0598903B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-13 WO PCT/JP1992/000311 patent/WO1992016651A1/ja active IP Right Grant
- 1992-11-12 FI FI925149A patent/FI101979B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 NO NO924382A patent/NO303179B1/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU658408B2 (en) | 1995-04-13 |
| NO924382D0 (no) | 1992-11-13 |
| FI925149A (fi) | 1992-11-12 |
| EP0598903A4 (en) | 1993-02-05 |
| DE69221879T2 (de) | 1998-01-29 |
| AU1544292A (en) | 1992-10-21 |
| WO1992016651A1 (en) | 1992-10-01 |
| NO924382L (no) | 1992-11-13 |
| FI925149A0 (fi) | 1992-11-12 |
| ATE157403T1 (de) | 1997-09-15 |
| CA2082962C (en) | 2002-04-23 |
| DK0598903T3 (da) | 1998-03-02 |
| DE69221879D1 (de) | 1997-10-02 |
| EP0598903B1 (en) | 1997-08-27 |
| FI101979B1 (fi) | 1998-09-30 |
| FI101979B (fi) | 1998-09-30 |
| CA2082962A1 (en) | 1992-09-15 |
| EP0598903A1 (en) | 1994-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3524120B2 (ja) | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 | |
| US5702882A (en) | Reagent for endotoxin-specific assay | |
| EP0491047B1 (en) | Method for determining (1- 3)-beta-d-glucan | |
| EP0330991B1 (en) | Process for measuring endotoxin | |
| EP0613004B1 (en) | Reagent for endotoxin assay and method for endotoxin assay using the same | |
| EP0588303B1 (en) | Reagent for endotoxin-specific assay | |
| JP2957251B2 (ja) | エンドトキシンの測定法 | |
| US5681710A (en) | Reagent for determining (1→3)-β-D-glucan | |
| JP3402476B2 (ja) | リポ多糖結合性タンパク質及びその製造法 | |
| NO303179B1 (no) | Reagens for bestemmelse av (1-3)-<beta>-D-glukan, en fremgangsmÕte for fremstilling derav samt dets anvendelse | |
| EP0549102B1 (en) | Beta-glucans detection reagents and methods of detecting beta-glucans | |
| WO1999011671A1 (fr) | PREPARATION DE (1→3)-β-D-GLUCANE A PARTIR DE CHAMPIGNONS | |
| JP3040184B2 (ja) | （１→３）−β−Ｄ−グルカン用測定剤 | |
| EP0350004B1 (en) | Method for determination of pyrogen content | |
| WO1988002862A1 (en) | Endotoxin assay | |
| CN104311888A (zh) | 氧化亚铜/壳聚糖复合材料、敏感膜、生物传感器、制备方法及应用 | |
| JP3088120B2 (ja) | （１→３）−β−Ｄ−グルカン測定剤 | |
| JP2701916B2 (ja) | β―グルカンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその調製方法 | |
| JP3822974B2 (ja) | エンドトキシン特異的ライセートの製造方法 | |
| WO2004001419A1 (en) | Process for determining endotoxin level in hemoglobin solutions | |
| JPH11196895A (ja) | 昆虫体液反応性物質の特異的測定剤及び測定方法 | |
| JP2004109147A (ja) | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 | |
| JP2007240397A (ja) | （１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法 | |
| CONJUGATE | WE HENNINK, L. DOST, SW KIM, WG van AKEN and J. FEIJEN | |
| JPH0416765A (ja) | エンドトキシンの測定方法 |