WO1992016651A1

WO1992016651A1 - (1←3)-β-D-GLUCAN ASSAYING AGENT

Info

Publication number: WO1992016651A1
Application number: PCT/JP1992/000311
Authority: WO
Inventors: Shigenori Tanaka; Hiroshi Tamura; Makoto Ohki
Original assignee: Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1992-10-01
Also published as: DE69221879D1; FI925149A0; EP0598903A4; EP0598903A1; AU1544292A; FI101979B; FI101979B1; FI925149A; NO924382D0; DE69221879T2; CA2082962C; DK0598903T3; EP0598903B1; CA2082962A1; NO924382L; AU658408B2; ATE157403T1; NO303179B1

Description

明細書

( 1 - 3 ) 一； δ — D — グルカン測定剤

技術分野

本発明は、力ブトガニ ' ァメボサイト · ライセートを用いる（ 1

→ 3 ) 一一 D — グルカンの測定剤および真菌の検出方法に関する

背景技術

カブトガニ · ァメボサイト《ライセ一卜（以下単にライセー卜ともいう）を使用して、エンドトキシンを測定する方法（一般的にリムルステストと呼ばれている）が知られている。この方法は、微量のェンドトキシンによりライセー卜が凝固することに基づいているが、その後の生化学的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかにされている（中村隆範他、日本細菌学雑誌、 3_ _、 7 8 1 - 8 0 3 ( 1983 ) ) 。この反応を、例えば曰本産カブ卜ガニ C Tachypleus tridentatus )カヽら得られるライセートにより、図 1 を用いて説明すると、 .ライセ一卜にエンドトキシンが加わると、ライセート中に存在する C因子（エンドトキシン感受性因子、分子量 123 , 000 ) が活性化され、生成した活性型 C 因子が B因子（分子量 64 , 000) の特定箇所を限定水解して活性型 B 因子を生成し、活性型 B因子はプロクロッティングェンザィム（分子量 5⁴ , 000) を活性化してクロッティングェンザィムに変換し、クロッテイングェンザィムはコアギュローゲン（凝固タンパク、分子量 19 , 723) のジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所を、すなわち… A r g ^{1 8}— T h r ¹ a…の間および… A r g ^{4 G}— G 1 y ^{4 7}…の間を限定水解して H— T h r ^{, 0} - A r g ^β— 0 Hで表されるペプチド C (アミノ酸 2 8残基）を遊離しつつ残余の部分がコアギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カスケード反応とも言う）である。

—方、このカスケード反応は、エンドトキシンのみではなく、ライセ一卜に（ 1 → 3 ) — ー D— グルカンが加わると図 1 における G因子が活性化され、生成する活性型 G因子がプロクロッティングェンザィムをクロッティングェンザィムに活性化し、以下エンド卜キシンの場合と同様に反応してコアギュリンゲルを生成する。

また、上記カスケード反応により生成するクロッティングェンザィムは、反応系に別に添加される、例えば t 一ブトキシカルボ二ル一口イシルーグリシノレ一アルギニン一パラニトロァニリド（ B 0 c 一 L e u — G l y - A r - p N A ) からパラ二トロア二リンを遊離させるので、生成する発色物質パラ二トロアニリンの吸光度を測定することによりエンドトキシンまたは（ 1 → 3 ) — ー D—ダルカンの定量を行うことができる。後記する実施例における（ 1 → 3 ) 一 ^ — D—グルカンの特異的測定も上記カスケ一ド反応を利用して行われる。

—方、従来から、ライセ一ト中の G因子を用いることにより（ 1 → 3 ) — )5— D—グルカンを測定する方法が報告されている

( Obayashi T. et al . , Clin. Chim. Acta, 1 4 9 , 5 5 - 6 5 (1985)) 。

しかし、この方法は、ライセ一トをゲルろ過法によりあるいはへパリンまたはデキストラン硫酸を固定化したァフィ二ティ一担体を用いるクロマトグラフィ一により分画し、ェンドトキシン感受性因子である C因子を除去して、 G因子とプロクロッティングェンザィムとで（ 1 → 3 ) — S — D—グルカンを測定する方法であって、上記の分画には極めて煩雑な操作を必要とする方法である。発明の開示

本発明は、ライセートを原料として改良された方法により得られるエンドトキシン感受性因子（ C因子）を実質的に含まないライセート処理物からなる（ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカン測定剤を提供することにある。

本発明は、カブトガニ · ァメボサイト · ライセ一卜含有液を、ェンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触させて得られうる、エンドトキシン感受性因子を実質的に含まず、少なくとも（ 1 → 3 ) — ； δ — D — グルカンと特異的に反応する成分を含む力ブトガニ · ァメボサイト · ライセー卜処理物を主成分とする（ 1 → 3 ) — — D — グルカン測定剤である。

上記ェンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤としては、ポリアミド系不溶性担体またはセルロース系不溶性担体であることが好ましい。また、該測定剤は、デキストランを含むものであることが好ましい。また、該測定剤は、カスケード反応系の活性化に有効な 2 価金属塩または該 2 価金属塩及びク口ッティングェンザィムの基質を含むものであることが好ましい。

また、本発明は、力ブトガニ ' ァメボサイ.ト ' ライセ一ト含有液を、ェンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触させ、エンドトキシン感受性因子を実質的に含まず、少なくとも（ 1 → 3 ) 一 — D — グルカンと特異的に反応する成分を含むカブ卜ガ二 . ァメボサイト · ライセート処理物を得ることを特徵とする（ 1 → 3 ) 一ー D — グルカン測定剤の製造法である。

上記の製造法において、カブトガニ · ァメボサイト · ライセ一ト含有液がデキストランを含むものであることが好ましい。

また、本発明は、カブ卜ガニ ' ァメボサイ卜 ' ライセート処理物に、カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 価金属塩または該 2 価金属塩およびクロッティングェンザィムの基質を添加し、非加熱条件下で乾燥することを特徵とする（ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンの製造法である。

また、本発明は、真菌感染症患者の体液を上記の（ 1 → 3 ) 一 β — D —グルカン測定剤と接触させて反応させ、（ 1 → 3 ) 一 β - Ό ーグルカンによるカスケ一ド反応系における基質の変化を測定することを特徵とする真菌の検出方法である。

ライセ一トとしては、リムノレス ' ポリフエムス（ Limulus polyph emus アメリカ産）、タキプレウス ' 卜リデンタツス（ Tachypleus tridentatus. 日本、 Φ国産）、タキプレウス - ギガス ( Tachyple us gigas. タイ国、マレーシア半島産）、カルシノスコゾレピウス ' ロッンディ力ウダ ( Carcinoscorpius rotundicauda. タイ国、マレーシァ半島産）等のカブトガニ血リンパ液から、適常の方法（例えは'、 J. Biochem. , 80 , 1011-1021 (1976 ) HS ) により弱製した血球抽出液を挙げることができる。

ポリアミド系またはセルロース系不溶性担体に、カブトガニ ' ァメボサイト · ライセ一トを接触させる方法は、連続法、バッチ法のいずれでもよく、膜状の該担体にライセ一ト.を通過させ、その通過液を採取する方法、粒状の担体を充塡したカラムにライセートを通過させてその素通り液を採取する方法、適当な大きさの担体（例えば、チップ状粒状、粉末状の担体）にライセ一卜を接触させた後に、通常の固液分離手段（例えば、遠心分離、ろ過等の手段）により該担体を除去する方法等を挙げることができる。

また、該担体にライセ一トを接触させる際、ライセートにデキス卜ランを混合しておくことにより、さらにエンドトキシン感受性因子の該担体への吸着を増加させることができ、かつ得られたライセ — ト処理物の（ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカンに対する測定感度も高めることができる。

用いるデキストランとしては平均分子量 5 , 000~ 5 , 000 , 000 、好ましくは 10 , 000~ 100 , 000 の範囲のものを挙げることができる。平均分子量が 5 , 000より下のデキストランはェンドトキシン感受性因子の担体への吸着効果が弱く使用することができない。また 5 , 000 , 000より上のものは粘性が高すぎて使用することができない。本発明に使用するポリアミド系不溶性担体としては、膜状（フィルター形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）、粒状、チップ状、粉末状等の形態を有し、酸アミド桔合の繰り返しによって主鎖を構成する結晶性の線状高分子物質であり、ジァミンとジカルボン酸との重縮合物ないしは、 ω —アミノカルボン酸または相当するラクタムから重縮合によって合成された化合物（例えばナイロン 6 、ナイロン 6 6等）等を主成分とする担体を挙げることができる。

本発明に使用するセルロース系不溶性担体としては、上述の如く、膜状（フィルタ一形、中空糸形、チューブ形、平膜形等）、粒状、チップ状、粉末状等の形態を有するセルロースまたはセルロース誘導体を主成分とする担体を挙げることができる。セルロース誘導体としては、セルロースエステル（例えば、セルロースアセテート、セルロースニトレート等）、アミノエチル―、ブロモアセチルー、ホスホー、カルボキシメチル一等の置換基を有するセルロース誘導体、カルボキシメチルセルロースのヒドラジド誘導体等を例示することができる。

本発明により、（ 1 → 3 ) — /3 — D — グルカンを測定する生体試料としては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、腹水、関節液、胸水、乳汁、尿等の、体液、浸出液、排泄液等を挙げることができる。

本発明の測定剤を用いて（ 1 → 3 ) — 9 — D — グルカンを測定するには、図 1 のカスケード反応によって、活性化されて生成するク口ッティングェンザィムの活性を公知の方法で測定すればよい。クロッティングェンザィムのアミダーゼ活性の測定には、基質として、例えば前記の発色性残基を有するペプチド合成基質、またはこれと同様の配列のぺプチドであって、 C末端のアルギニンのカルボキシル基に前記発色性残基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性残基、アンモニアなどがアミド結合により置換したペプチド合成基質を使用することができる。クロッティングェンザィムがこれらの合成基質に作用して生成する反応生成物を測定することによって、アミダ一ゼ活性の測定を行うことができる。具体的には、本発明の測定剤と（ 1 — 3 ) — / S — D—グルカンを含む反応系に上記ぺプチド合成基質を共存させ、反応（カスケード反応および必要に応じて生成物の他色素等への変換反応）によって生成する色素、蛍光物質またはアンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭 6 2 — 1 4 8 8 6 0 ) 等によって測定する方法を例示することができる。

クロッティングェンザィムのプロテアーゼ活性の測定には、本発明の測定剤中に含まれる（もしくは別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッティングェンザィムが作用してコアギュリンゲルが生成する際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉眼で判定する方法を採用することができる。

カブトガニ · ァメボサイト · ライセ一ト処理物を、本発明の測定に使用する際には、前記カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 価金属塩を存させる必要がある。このような 2 価金属塩としては、マグネシゥム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物等）、硫酸塩等が例示される。また、本発明の測定剤は、カブトガニ · ァメボサイト · ライセート処理物に上記 2価金属塩を共存させた状態で、非加熱条件下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を行って固体状態にしたものであってもよい。さらに、上記アミダ一ゼ活性を測定するための測定剤は、 2 価金属塩のほかに前記ペプチド合成基質を共存させたものであることが好ましく、これを乾燥処理したものであってもよい。

作用

本発明によれば、ポリアミド系またはセルロース系不溶性担体にライセートを接触させるだけで（ 1 → 3 〉一 9 一 D —グルカン感受性因子の活性が損なわれることなく、ライセー卜中のェンドトキシン感受性因子が吸着除去され、（ 1 → 3 ) — — D — グルカンにのみ特異的に反応するライセート処理物が得られる。また、該担体にライセ一トを接触させる際に、ライセー卜にデキス卜ランを混合してライセ一卜の粘性を上げることによって、該吸着除去の効果を高めることができる。図面の簡単な説明

図 1 はカブトガニ · ァメボサイト · ライセー卜のエンドトキシンならびに（ 1 → 3 ) — yS — D —グルカンによる反応機構を示す。図 2 は I — I 剤の（ 1 → 3 ) — — D — グルカンに対する検量線を示す。

図 3 は II一 H剤の（ 1 → 3 ) — S — D — グルカンに対する検量線を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1 カブ卜ガニ C T. tridentatus ) 血リンパ液 5 0 0 mlを 4 V、 1,500 rpm で 1 0分間遠心し、その沈殿部分（ァメボサイト）約 i 0 g に 1 0 0 mlの 0. 0 2 M 卜リス—塩酸緩衝液（ PH8. 0 ) を加え、ホモゲナイザー（ポリ卜ロン R P T 1 0 (商品名）、 Kinematics社製造）にて均一に破砕および抽出し、 ΙΟ,ΟΟΟΧ Gで 3 0分間冷却遠心し、上澄液と沈殿物とを採取した。得られた沈殿物をさらに 6 0 mlの緩衝液にて 2回抽出し、最終的に 2 0 0 mlのライセートを得た。

以下の方法で 5種類の試薬を調製し、エンドトキシンおよび（ 1 → 3 ) 一 — D—グルカンに対する反応性を比較検討した。

I 一 A剤は 0. 8 M 塩化マグネシウム 2 0 0 1 と 6 mM B o c — L e u— G l y - A r g - p N A 2 0 0 β 1 の混液（以下 M S混液）にライセ一ト 8 8 0 a 1 を添加し、凍結乾燥することにより調製した無処理のライセ一ト試薬である。

I 一 B剤は、ライセ一ト 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフィルタ一（商品名）、直径 2 5 mm, ナルジヱ社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 β 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセ一ト試薬（ナイロン膜処理ライセ一卜）である。

I 一 C剤は、ライセ一ト 1. 2 mlを孔径 0. 2 2 〃 mのポリビニリデンフルオラィド膜フィルター（マイレクス G V (商品名）、直径 2 5 mm ミリポア社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した比較のライセー卜処理物である。

I 一 D剤は、ライセート 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 mのポリテトラフルォロエチレン膜フィルター（マイレクス F G (商品名）、直径 2 5 mm_N ミリポア社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した比較のライセー卜処理物である。

I 一 E剤は、ライセー卜 1. 2 mlを孔径 0. 2 0 mのポリスルフォン膜フイノレター（ァクロディスク（商品名）、直径 2 5 mm, ゲルマン社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した比絞のライセー卜処理物である。

上記 5 種類の試薬のそれぞれに 2. 2 mlの 0. 2 M トリス —塩酸緩衝液（ PH 8. 0 ) を加えて溶解し、その溶液 0. 1 mlにエンドトキシンまたは（ 1 → 3 ) — S — D —グルカン各々 0. 1 mlを添加して、 3 7 °C で 3 0 分間加温した。また、別にそれぞれ 2 倍濃度の各試料を 0 . 0 5 mlずづ添加して同様に加温した。 5種類の試薬に対する試料の反応性は、 3 0 分後に生じた P N A (パラ二卜ロア二リン）を、 0. 5 mlの 0. 0 4 %亜硝酸ナトリウム（ 0. 4 8 M 塩酸溶液）、 0. 3 %スルファミン酸アンモニゥム、 0. 0 7 % N— （ 1 —ナフチル）ェチレンジアミンニ塩酸塩を順次添加して発色させ、 5 4 5 nmの吸光度値を測定することにより判定した。

その結果を表 1 に示した。この結果から、ポリアミド系膜であるナイ口ン膜フィルターを一度通過させたライセー卜を使用すれば、エンドトキシンの影響を受けずに、（ 1 → 3 ) — ；8 — D —グルカンを特異的に定量することができる。

反応性（ΔΑΞΑδηπι ^Οπώ ) クノレ力ン二ノ卜卜干ンノノレカノ +

エンドトキシン

Ι-Α剤無処理 0.225 0.420 0.647

Ι-Β剤ナイロン膜 0.342 0.001 0.343 ポリビニリデン 0.225 0.417 0.644

フルオラィド膜 i- i ボリテトラフル 0.106 0.298 Q.408

ォロエチレン膜

Ι-Ε剤ポリスルフォン膜 0.218 0.326 0.545

*…… ( 1→ 3 ) 一 β— Ό—グルカン（ 3 pg/tube)

* *—E. coli G111:B4 由来（2.5 pg/tube)

大腸

*… ( ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D—グルカンの調製法）

国際特許公開第 9 0 / 0 2 9 5 1 ( 1 9 9 0 ) に準じ、カードラン（和光純薬工業（株）販売）の 1 gを約 1 0 0 mlの 5 mM NaOH 水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケ一ター ^TM (型式 5²0²P Z T、大岳製作所、東京）により 2 0 KHz 、 8 0 Wで 1 2 分間音波処理による低分子化を行った。処理液を 5 M N a O H水溶液を用い . 最終 0. 3 M 水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマ卜グラフィ一 ( G P C カラム： T S K g e l G 3000P W X L 2本、 G 2500 P X L 1 本、移動相： 0. 3 M N a 0 H水溶液、流速 0. 5 ml/ min ) により分画採取し、再クロマトにより分子量 216 , 000 の G P C分画精製標品（（ 1 → 3 ) — 9一 D—グルカン標品）を得た。実施例 2

実施例 1 で調製した原料ライセー卜 4 0 mlに同量の蒸留水を加えた（以下ライセート + D W) 。また該ライセート 4 0 mlに同量の 15 % (W V ) デキストラン（分子量 40 , 000) 水溶液を加え、 3,500 rpm で〗 0分間遠心してその上清を得た（以下ライセ一ト + D X ) 。

以下の方法で 4 種類の試薬を調製し、エンドトキシンおよび（ 1 → 3 ) 一 β 一 D— グルカンに対する反応性を比較検討した。

I — F剤は M S混液にライセー卜 + D W 1. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥することにより調製した無処理のライセー卜試薬（無処理 + D W ) である。

I 一 G剤は、 M S混液にライセ一ト + D x l. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥することにより調製したデキストランを含む無処理のライセ - 卜試薬（無処理 + D x ) である。

I — H剤は、ライセー卜 + D W 5. 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイロン膜フイノレター（ナルゲンシリンジフィルタ一）に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 παを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセート試薬（ナイロン膜 + D Wである。

I — I 剤は、ライセート + D x 5. 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフイノレター）に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製したデキストランを含む本発明のライセ一ト試薬（ナイロン膜 + D x ) である。

上記 4種類に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測定した。その結果を表 2 に示した。この結果から、あらかじめライセ一卜にデキストランを共存させておくと、ェンドトキシン感受性因子の担体への吸着効果を高めるとともに、得られたライセ一卜処理物の（ 1 → 3 ) 一 ^ 一 D —グルカンに対する感度を著しく高めることができることがわかる。

反応性（AA545nmZ30niin)

5H. ¾

グルカン * エンドトキシン" グルカン +

エンドトキシン i- i：無処理 + 0.219 0.412 0.634 無処理 + Dx 0.221 0.416 0.639 i-Hfi]：ナイ口ン膜 + DW 0.336 0.046 0.384 エ- 1剤：ナイ口ン膜 + DX 0.510 0.001 0.510

* ( 1→ 3 ) 一 — D -グルカン（ 3 pg/tube)

* *···Ε· coli 0111 :B4 由来 (2.5 pg/tube)

実施例 3

カブトガニ（L. polyphenms)血リンパ液 6 0 0 mlを 4 。C、 1,500 rpm で 1 0 分間遠心し、その沈澱部分（ァメボサイ卜）約 I 2 gに

1 2 0 mlの 0. 0 2 M トリスー塩酸緩衝液（ PH8. 0 ) を加え、ホモゲナイザー（ポリトロン R P T 1 0 ) にて均一に破碎および抽出し、 10 , OOOx Gで 3 0 分間冷却遠心し、上澄液と沈殿物とを採取した。得られた沈殿物をさらに 6 5 mlの緩衝液にて 2 回抽出し、最終的に 2 2 0 mlのライセー卜を得た。同ライセ一卜 2 0 mlに同量の 1 5 %

( W / V ) デキストラン（分子量 70 , 000) を加え、 3 ,500rpmで 1 0 分間遠心後、その上清を D —ライセートとした。これを用いて、以下の方法で 2種類の試薬を調製し、エンドトキシンおよび（ 1 → 3 ) 一 β — D— グルカンに対する反応性を比較検討した。

I 一 J剤は M S混液に D— ライセート 1. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥することにより調製したデキストランを含む無処理のライセ一ト試薬（無処理 + D x ) である。

I 一 K剤は、 D— ライセート 1 0 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのナイロン膜フイノレター（ナルゲンメディアプラスフイノレターュニッ卜（商品名）、直径 9 0 mm、ナルジヱ社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製したデキストランを含む本発明のライセート試薬（ナイロン膜 + D x ) である。上記 2種類の試薬に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測定した。その結果を表 3 に示した。ポリアミド系膜であるナイロン膜を通過したライセート処理物はェンドトキシンとは反応せず、（ 1 → 3 ) 一 ^ 一 D— グルカンとのみ反応することが明らかである。また、ライセ一トにデキストランを共存させてから処理すると、（ 1 → 3 ) 一； S— D— グルカンに対する感度を著しく高めることがわ力、る o

3

反応性（AA545nm/30min) グルカン * エンドトキシン ** グルカン +

ェンドトキシン

I-J¾1J：無処理 + Dx 0.192 0.383 0.578

I-K¾IJ ：ナイロン膜 + DX 0.423 0.000 0.423

* ( 1→ 3 ) 一 ^一 D—グルカン（ 3 pg/tube)

* *— E. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 pg/tube) 実施例 4

市販ゲル化法リムルステスト試薬を使用する（ 1 → 3 ) - β - Ό ーグルカン測定剤の調製

市販のライセー卜製品すなわちゲル化法リムルステスト試薬を使用して、目的とする（ 1 → 3 ) — ； S — D—グルカン測定剤を以下のように簡単に調製した。

I 一 L剤はリムルステスト試薬（生化学工業（株）販壳プレゲル Μ (商品名）、 Lot. AB-01) を 2. 6 mlの注射用蒸留水に溶解した後, 孔径 0. 2 0 〃 mのナイロン膜フィルタ一（組織培養フィルタ一ュニット T C (商品名）、直径 4 7 mm、ナルジヱ社）に通過させ、そのろ液（通過液）を使用した本発明のライセ一ト試薬（ナイロン膜 + D W ) である。

I 一 M剤は無処理のプレゲル一 M (無処理 + D W ) である。

I — N剤はリムルステスト試薬（和光純薬工業（株）販売リムルス H S II-テストヮコ一（商品名）、 Lot. EMM090 )を 5. 0 mlの注射用蒸留水に溶解した後、同様にナイロン膜フィルター（組織培養フィルターユニット T C ) に通過させ、そのろ液（通過液） 2. 6 π を凍結乾燥することにより調製した本発明のライセート試薬（ナイ口ン膜処理 + D W) である。

I — 0剤は無処理のリムルス H S II—テストヮコ一（無処理 + D W ) である。

注射用蒸留水を用い、 I 一 Μ剤および I 一 Ν剤は 2 . 6 ml, I - 0剤は 5. 0 mlで溶解した。 I 一 L〜 I 一 0剤の 0. 1 mlに注射用蒸留水（ブランク）、エンドトキシン（ E. coli 0111 :B4 由来）および ( 1 → 3 ) — 6 — D—グルカンを別々に 0. 1 ml加え、 3 7 °Cで 6 0 分間静置加温し、ゲル形成の有無を調べた。その結果を表 4 に示した。表中、 +はゲルを形成したことを、一はゲルを形成しなかったことを表す。表 4 力、ら明らかなように、 I 一 Lおよび I 一 N剤は ( 1 → 3 ) — /5 — D — グルカンとのみ反応する目的に適したライセートであること力わ力、る。

4

(1—3)— β -D-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml

1 1

I一 L剤：ナイロノ + EW 一十十十

i- ：無処理 +D 一一一 + + + エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml ェ- ：ナイロン膜 + EW

Ι- §1]：無処理 + DW 一 + + +

(1→3)- β-Ό-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml

I- i：ナイロン膜 + EW 一 + + +

1-0剤：無処理 + EW 一 + + + エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml

I-N剤：ナイロン膜 + EW

τ- \：無処理 + EW + + + +

、丄 → 3 ) — ^ 一 D— グルカンは、真菌細胞壁の構成多糖体としても知られ、（ 1 → 3 ) — ー D— グルカンを測定することにより、体内における真菌の存在を'検知することができる。以下、実施例 ₅ 〜 7 において、本発明の方法による真菌の検出例をあげる。

実施例 5 (血漿検体の測定）

真菌による敗血症を疑った入院中の重症血液疾患（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫等）を有する患者 1 〗例を対象に、それぞれ無菌的に採血したへパリン加血漿を試料として 4 でで 1 5 0 X G、 1 0分間遠心して多血小板血漿を得た。その 0. 1 mlに 0. 3 2 の過塩素酸 0. 2 mlを加え、 3 7 °Cで 2 0 分間加温し、析出物を遠心（3 , 000rpm、 1 0 分間）除去し、その上清 0. 0 5 mlに 0. 1 8 M N a ◦ Hを 0. 0 5 ml加えて中和し、被検液とした。

ひきつづき実施例 2 に記載の方法で調製した本発明の（ 1 → 3 ) — /3 — D —グルカン測定剤（ I 一 I 剤） 0· 1 mlを加え、 3 7 °Cで 30 分間加温して反応させた。その反応液に 0. 0 4 %亜硝酸ナトリゥム ( 0. 4 8 M 塩酸溶液）、 0. 3 %スルファミン酸アンモニゥム、 0. 0 7 % N - 1 一ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩を各 0. 5 mlずつ順次加えてジァゾカツプリング反応を行い、 5 4 5 nroでその吸光度を測定して、別に作成した検量線（図 2 ) により（ 1 → 3 ) — β — Ό ーグルカン換算値として表した。表 5 に示すように全例（NO. 1 〜 NO. 1 1 ) において高濃度の（ 1 → 3 ) — — D —グルカンが検出され（健常人： 0. 2 ± 0. 3 pg/ ml) 、そのうちの 5例（No. 1 — No. 5 ) {ま、血培 ίこて、カンジタァノレビ、カンス C Candida albicans) ヽカンジダ ' グリエノレモンディ（ Candida guilliermondii) 、カンジダ - 卜ロピカリス ( Candida tropicalis) 、カンジ夕" ' クノレセィ（ Candida krusei) およびクリプトコッカス · ネオフォノレマンス（ Cr yptococcus neoformans)をそれぞれ検出し、 2 例 ( No. 6 、 No. 7 ) は血培では陰性であつたが、死亡後の解剖による組織病理学的検査によりァスペルギルス ' フミガッス（ Aspergillus fumigatus)を検出した。残り 4 例（No. 8〜 No. 1 1 ) については、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であった症例である力抗真菌剤（アンホテリシン

B、ミコナゾール、フルコナゾール）投与により、全例臨床的に顕著な改善を見た。従って、本発明の測定剤は真菌感染症とりわけ通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断に適切に用いられることが理解できょう。表 5 日和見の深在性真菌症の血漿中 ( 1→ 3 ) 一 8— D—グルカン濃度

血漿（1→3)— β

No. 住合/ ¾p串顆粒球数 rfn +Λ.

1111 ·*·口 Gufem * I zjlrt. j Ί-Λfr. !Hs sk Τα 一 D—グルカン

1 53/ F ALL 0 1 309.0 pg/ml (+) Candida albicans分離死亡

2 72/ F MM 960 420.3 (+) Candida guilliennondii分離生存

3 61/ AML 0 (+) Candida tropicalis分離死亡

4 45/ M APML 0 (+) Candida krusei分離生存

5 59/ M AIHA 2560 521.7 (+) Cryptococcus neoformans 分離生存

6 48/ F ALL 0 48.5 (-）全身性ァスペルギルス症（死体解剖）死亡

7 65/ F APML 0 139.4 (-) 全身性ァスペルギルス症（死体解剖）死亡

8 45/ F AML 6278 663. t卜

8 (-）フルコナゾ一ルにより改善生存

9 52/ M ALL 6 76.5 (-) ミコナゾールにより改善生存

10 32/M AML 1 (-) ミコナゾールにより改善生存

11 29/ F ALL 0 286.1 (-) アンホテリシン Bにより改善生存

A L L :急性リンパ性白血病、 AML ：急性骨髄性白血病、 A PML ：急性前骨髄球性白血病、

MM：多発性骨髄腫、 A I HA ：自己免疫性溶血性貧血

実施例 6 (尿検体の測定）

入院中に尿路感染症を併発した症例で、尿培養でカンジダ ' アルビカンス ( Candida albicans) ヽカンジダ · グラブレイタ ( Candida glabrata) を検出した 3症例につき、本発明の測定剤により尿中の ( 1 → 3 ) 一 ^ 一 D —グルカンを定量した。尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コップに採取し、その 0 · 005ιη1に注射用蒸留水 0. 1 mlを加えた後、実施例 1 に記載の本発明の（ 1 → 3 ) — — D —グルカン測定剤（ I 一 B剤） 0. 1 mlを加え、 3 7 °Cで 3 0 分間加温した。実施例 5 と同様にジァゾカツプリング反応を行った後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線より（ 1 → 3 ) 一 β 一 D —グルカン換算値として表した。表 6 に示すように 3 例中全例において高濃度の（ 1 → 3 ) — ー D —グルカンが検出され（健常人： 1 0 pgZ ml以下）、本発明の測定剤は真菌性尿路感染症の迅速診断に適切に用いられることが理解できょう。

表 6 真菌感染尿の尿中（ 1→ 3 ) — ー D—グルカン濃

NO, 15¾ tLl S CFU/ml (1→ 3 )— 3— D—グルカン（nq/ml )

1 Candida albicans >10< 28.5

2 Candida albicans >10« 12.5

3 Candida glabrata >10⁴ 18.0

実施例 7 (脳脊髄液検体の測定）

入院中に髄膜炎を疑われ、髄液中にクリプトコッカス ' ネオフォルマンス（ Cryptococcus neof ormans )を検出した真菌性髄膜炎の 3 症例につき、腰椎穿刺にて無菌的に採取した髄液 0. 0 5 mlに注射用蒸留水 0. 0 5 π を加え、さらに実施例 3 に記載の本発明の（ 1 → 3 ) 一； S — D —グルカン測定剤（ I 一 Κ剤〉 0. 1 mlを加え、 3 7 °Cで 30 分間加温した。実施例 5 と同様にジァゾカツプリング反応させた後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線より ( 1 → 3 ) 一；3 — D — グルカン換算値として表した。表 7 に示すように、 3 例中全例において高濃度の（ 1 → 3 ) — β — Ό — グルカンが検出され（健常人： 1 pg/" ml以下）、本発明の測定剤は真菌性髄膜炎の早期迅速診断に適切に用いられることが理解できょう。

表 7 真菌感染髄液の髄液中（ 1→ 3 ) — /3— D—グルカン濃度

No. TK fcH ¾ ( 1→3 ) - β— Ό—グルカン（pg/ml )

Crvptococcus neoformans 136.2

Crvptococcus neoformans 58.7

Cryptococcus neoformans 105.1

実施例 8

実施例 1 の方法で調製したライセートを用い、以下の方法で 4 種類の試薬を調製し、エンドキシンおよび（ 1 → 3 ) — β - Ό ーゲルカンに対する反応性を比較検討した。

I I一 Α剤は、 M S混液にライセート 8 8 0 a 1 を添加し、凍結乾燥することにより調製した無処理のライセ一ト試薬（無処理）である。

I I— B剤は、ライセー卜 1 . 5 mlを孑し径 0. 2 2 mのセルロースエステル膜フィルター（ステリフィノレ D— G S (商品名）、酢酸セルロースと硝酸セルロースとの混合物、直径 4 7 mm、ミリポア社製 ) に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセ一ト試薬（セルロースエステル膜）である。

II一 C剤は、ライセ一ト 1 . 5 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのセルロースアセテート膜フィルタ一（ナルゲンフイノレターウェア（商品名）、直径 4 7 mm. ナルジヱ社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 a I を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセ一ト試薬（セルロースアセテート膜）である。

II一 D剤は、ライセート 1 . 5 mlを孔径 0. 2 0 mのセルロース二卜レート膜フィルタ — （ナルゲンフイノレターウェア（商品名）、直径 4 7 mm. ナルジェ社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 8 8 0 u 1 を M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセ一ト試薬（セルロース二卜レー卜膜）である。

上記 4 種類の試薬に対する各試料の反応性は実施例 1 と同様に測

¾ した。

その結果を表 8 に示した。この結果からセルロース系膜を一度通過させたライセー卜を使用すれば、ェンドトキシンの影響を受けずに、（ 1 → 3 ) — 一 D—グルカンを特異的に定量できることがわかる。反応性（AA545nm 30min) 試薬孔径

( m) グルカン * エンドトキシン" グルカン +

エンド卜キシン-

II - A剤無処理 0.226 0.409 0.638 ェ I-B剤セルロース 0.22 0.349 0.004 0.354

エステル膜 ττ- \ セルロース 0.20 0.345 0.002 0.348

ァセテ一ト膜

II-E¾IJ セルロース 0.20 0.343 0.001 0.345

二トレ一ト膜

* ( 1→ 3 ) - β -Ό-グルカン（ 3 pg/tube)

* *···Ε. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 Pa/tube)

実施例 9

実施例 2で調製したライセート + D Wを用い、以下の方法で 6種類の試薬を調製し、エンドトキシンおよび（ 1 → 3 ) — β - Όーグルカンに対する反応性を比較検討した。

II- Ε剤は、 M S混液にライセート + D W 1. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥することにより調製した無処理のライセート試薬（ライセ一ト + D W ) である。

II一 F剤は、 M S混液にライセ一卜 + D X 1. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥することにより調製したデキストランを含む無処理のライセ一卜試薬（ライセ一ト + D x ) である。

II一 G剤は、ライセ一卜 + D W 5 mlを孔径 0. 2 2 mのセルロースエステル膜フィルタ一（マイレクス G S (商品名）、酢酸セル口ースと硝酸セルロースとの混合物、直径 2 5 nim、ミリポア社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセート試薬（セル口一スエステル膜 + D W) である。

II- H剤は、ライセ一ト + D x 5 mlを孔径 0. 2 2 mのセル口一スエステル膜フィルタ一（マイレクス G S ) に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製したデキストランを含む本発明のライセ一ト試薬（セル口ースエステル膜 + D x ) である。

II一 I 剤は、ライセート + D W 5 mlを孔径 0. 2 0 〃 mのセルロースアセテート膜フイノレター（ナルゲンシリンジフイノレター（商品名 ) 、直径 2 5 mm ナルジェ社製）に通過させた後、そのろ液（通過液） L 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製した本発明のライセート試薬（セルロースアセテート膜 + D W) である。

II— J剤は、ライセート + D x 5 mlを孔径 0. 2 0 のセルロースアセテート膜フイノレター（ナルゲンシリンジフイノレター）に通過させた後、そのろ液（通過液） 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥することにより調製レたデキストランを含む本発明のライセート試薬（セルロースアセテート膜 + D x ) である。

上記 6種類の試薬それぞれに対する試料の反応性は、実施例 1 と同様に測定した。その結果を表 9 に示した。この結果から、あら力、じめライセー卜にデキストランを共存させて処理すると、ェンドトキシン感受性因子の担体への吸着効果を高めるとともに、得られたライセート処理物の（ 1 → 3 ) — ^ — D — グルカンに対する感度を著しく高められることがわかる。表 9 反応性（AA545nmZ30min)

5¾ ¾ 孔径；

(i fi m) グルカン * エンドトキシン" グルカン +

エンドトキシ

II-E剤無処理 +DW 0.226 0.411 0.640 剤無処理 +Dx 0.227 0.417 0.646

II-G剤セルロース 0.22 0.347 0.046 0.396

エステル膜 +DW

II-H^ij セルロース 0.22 0.500 0.001 0.501

エステル膜 +Dx

II-I剤セルロース 0.20 0.351 0.050 0.403

ァセテ一卜膜 +D

II-J¾IJ セルロース 0.20 0.490 0.002 0.491

アセテート膜 +DX

*…… （ 1 ~* 3 ) - β - Ό -グルカン（ 3 pg/tube)

*氺… E. coli 0111:B4.由来 ( 2. 5 m/tube)

実施例 1 0

実施例 3 と同様の D —ライセ一トを用いて以下の方法で 8 種類の試薬を調製し、エンドトキシンおよび（ 1 → 3 ) 一 0 — Ό ーグルカンに対する反応性を比絞検討した。

II— K剤は、 M S混液に D —ライセート 1. 7 6 mlを添加し、凍結乾燥して調製した無処理のライセー卜試薬である。

II一 L剤は、 D—ライセート 2. 6 mlを同量の多孔性セルロースゲル（セル口ファイン G C — 2 0 0 m (商品名）、生化学工業（株）販売）と混合後、ガラスフィルター（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のライセート試薬（セルロースゲル）である。

II一 M剤は、 D—ライセー卜 2. 6 mlを同量のジェチルアミノエチノレセノレロースゲノレ ( D E A Eセノレ口 —ス、 Serva Feinbiochemica GmbH製）と混合後、ガラスフイノレター（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のライセ一ト試薬（ジェチルアミノエチルセルロースゲル）である。

II— N剤は、 D—ライセ一ト 2. 6 mlを同量のカルボキシメチルセノレ口一スゲノレ（ Serva Feinbiochemica GmbH 製）と混合後、ガラスフィルター（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のライセ一ト試薬（カルボキシメチルセルロースゲル）である。

1ェ— 0剤は、 D—ライセート 2. 6 mlを同量のホスホセルロースゲノレ（； Serva Feinbiochemica GmbH 製）と混合後、ガラスフイノレター ( G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した本発明のライセー卜試薬（ホスホセルロースゲル）である。

II一 P剤は、 D—ライセート 2. 6 mlを同量のァガロースゲル（セファロース C L一 6 B ' (商品名）、 Pharmacia 社製）と混合後、ガラスフィルター（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した比較のライセート試薬（ァガロースゲル）である。

II一 Q剤は、 D—ライセート 2. 6 mlを同量のデキストランゲル (セフアデックス G— 1 5 0 (商品名）、 Pharmacia 社製）と混合後、ガラスフィルタ一（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 mlを M S 混液に添加し、凍結乾燥して調製した比較のライセー卜試薬（デキストランゲル）である。 II一 R剤は、 D —ライセート 2. 6 mlを同量のポリアクリノレアミドゲノレ（ノくィォゲノレ P — 300 (商品名）、 Bio-Rad Laboratories製）と混合後、ガラスフイノレター（ G 3 ) でろ過し、そのろ液 1. 7 6 ml を M S混液に添加し、凍結乾燥して調製した比較のライセー卜試薬 (ポリアクリルアミドゲル）である。

8種類の試薬に対する各試料の反応性は、実施例 1 と同様に測定した。その結果を表 1 0 に示した。この結果から、セルロース系担体を通過させたライセートを使用すれば、ェンド卜キシンの影響を受けずに、（ 1 → 3 ) — ^ — D —グルカンを特異的に定量することができることは明らかである。

1 0

反応性（AA545mv 30min) グルカン * エンドトキシン ** グルカン +

エンド卜キシ

Ιΐ-ΐφ\ 無処理 0.197 0.379 0.580

Il-I^fJ セルロースゲル 0.438 0.000 0.438

II-M¾I] ジェチルァミノ 0.431 0.004 0.436

ェチルセルロースゲル

II-N^IJ カルボキシメチル 0.428 0.002 0.431

セルロースゲル

II - 0剤ホスホセルロースゲル 0.426 0.001 0.427

II- P剤了ガロースゲル 0.186 0.201 0.390

II-Q剤デキストランゲル 0.181 0.214 0.399

II-R剤ポリアクリルアミド 0.188 0.368 0.559

ゲル

* ( 1→ 3 ) - ^ - D -グルカン（ 3 pg/tube)

* * --·Ε. coli 0111 :B4 由来 ( 2.5 ρα/tube) 実施例 I 1

市販ゲル化法リムルステスト試薬を使用する（ 1 → 3 ) — — D ーグルカン測定剤の調製

市販のライセ一ト試薬すなわちゲル化法リムルステスト試薬を使用して、目的とする（ 1 — 3 ) — ^ — D—グルカン測定剤を以下のようにして調製した。

Iエー L一 1 剤は、リムルステスト試薬（生化学工業（株）販売プレゲルー Μ (商品名）、 Lot AB-01 ) を 2. 6 παの注射用蒸留水に溶解した後、孔径 0. 2 2 mのセルロースアセテート膜フイノレター（ナルゲンフイノレターゥヱァ）に通過させ、そのろ液（通過液） 1. 4 mlを凍結乾燥することにより調製した本発明のライセート試薬であ

-5 o

II一 L一 2剤は、無処理のプレゲル一 Mである。

II一 L一 3剤は、リムルステスト試薬（和光純薬工業（株）販売リムルス H S II-テストヮコー（商品名）ヽ Lot. EMM090 )を 5. 0 ml の注射用蒸留水に溶解した後、 0. 2 2 jci mのセルロースエステル膜フィルター（ステリフィル D — G S ) に通過させ、そのろ液を使用した本発明のライセ一ト試薬である。 .

II一 L - 4剤は無処理のリムルス H S II—テストヮコ一である。注射用蒸留水を用い、 Iエー L一 1 剤は 1. 4 ml、 II一 L一 2剤は

2. 6 ml、 II— L一 4 剤は 5. 0 π で溶解し、実施例 4 と同じ試料を添加して同様に反応させ、ゲル形成の有無を調べた。その結果を表 1

1 に示した。表中 +はゲル化したことを、一はゲル化しな力、つたことを表す。表 1 1 力、ら明らかなようにェエー L一 1 およびェ1一 L — 3 は（ 1 → 3 ) — ^一 D—グルカンとのみ反応する目的に適したライセートであることがわかる。表 1 1

(1→3)- β -D-グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml

II - L - 1剤 ― ― ― + + +

II - Ιι - 2剤 — + + + エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml

II- 1 1剤一 ― ― ― ― ―

II-L - 2剤 + + +

(1→3) - β-Ό—グルカン 0 0.1 1 10 100 l,000ng/ml ェェ -L - 3剤 + + +

II- L-4剤 + + +

エンドトキシン 0 0.001 0.01 0.1 10 l,000ng/ml

Iエ- L-3剤

II - Ii - 4剤 + + + +

実施例 1 2 (血漿検体の測定）

実施例 5 と同様の方法で被検液を調製し、ひきつづき実施例 9 に記載の方法で調製した本発明の（ 1 → 3 ) — — D — グルカン測定剤（ II一 H剤） 0· 1 mlを加え、 3 7 °Cで 3 0 分間加温して反応させた。その反応液を実施例 5 と同様に処理して吸光度を測定して、別に作成した検量線（図 3 ) より（ 1 → 3 ) — ^ 一 D — グルカン換算値として表した。表 1 2 に示すように全例（NO. 1 〜 No. 1 1 ) において ¾濃度の（ 1 — 3 ) — ^ 一 D — グルカンが検出され（健常人

： 0. 2 ± 0. 3 pg/ ml) 、そのうちの 5 例（ No. 1 〜No. 5 ) は、血 +立にてカンジダ ' ァノレビカンス（ Candida— albicans) ヽカンシタ

• ク ' リエノレモンディ（ Candida _guilliermondii) 、カンシタ · トロピカリス ( Candida tropicalis ) 、カンジタ " · クノレセィ（ Candida krusei) およびクリプトコッカス ' ネオフォルマンス（ Cryptococc us neoforraans) をそれぞれ検出し、 2 例 ( o. 6 、 No. 7 ) は血培では陰性であつたが、死亡後の解剖による組織病理学的検査によりァスぺノレギノレス · フミガッス ( Aspergillus f umigatus )を検出した。残り 4例（No. 8〜！ Jo. 1 1 ) については、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であった症例であるが、抗真菌剤（アンホテリシン B、ミコナゾ —ル、フルコナゾール）投与により、全例臨床的に顕著な改善を見た。従って、本発明の測定剤は真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断に適切に用いられることが理解できょう。

表 1 2 日和見の深在性真菌症の血漿中 ( 1→ 3 ) 一 _ D—グルカン澳度

血漿（1→3)— β

NO. 年令 Z性疾患顆粒球数血培臨床症状感染結果 — D—グルカン

1 3/ F ALL 0/ _w 1 325.2 pg/ml (+ ) Candida albicans分離死亡

2 72/ F MM 960 415.0 (+ ) Candida guilliermondii分離生存

3 61/ M AML 0 (+ ) Candida tropicalis分離死亡

4 45/ M APML o 86.8 (+ ) Candida kmsei分離生存

5 59/M AIHA 2560 540.2 (+ ) Cryptococcus neoformans 分離生存

6 48/ F ALL 0 50.5 (-）全身性ァスヘルキルス症（死体解剖）死亡

7 65/ F APML 0 138.7 (-）全身性ァスペルギルス症（死体解剖）死亡卜

8 45/ F AML 6278 669.9卜

(-）フルコナゾールにより改善生存

9 52/ M ALL 6 76.8 (-）ミコナゾ一ルにより改善生存

10 32/M AML 1 ミコナゾ一ルにより改善生存

11 29/ F ALL 0 275.1 (-) アンホテリシン Bにより改善生存

A L L :急性リンパ性白血病、 AML ：急性骨髄性白血病、 A PML :急性前骨髄球性白血病、

MM ：多発性骨髄腫、 A I H A ：自己免疫性溶血性貧血

実施例 1 3 (尿検体の測定）

実施例 6 と同様の方法で尿路感染症患者の尿から被検液を調製しひきつづき、実施例 8 に記載の本発明方法による（ 1 ^→ 3 ) — β — D—グルカン測定剤（ェ I一 C剤） 0. 1 mlを加え 3 7 °Cで 3 0分間加温した。実施例 5 と同様にジァゾカップリング反応させた後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線より（ 1 — 3 ) 一ー D—グルカン換算値として表した。表 1 3 に示すように 3例中全例において高濃度の（ 1 → 3 ) — 3 — D—グルカンが検出され（健常人： 1 O pgZml以下）、本発明測定剤を用いる測定方法は真菌性尿路感染症の迅速診断法として、有力な手法であることが理解できょう。

1 3 真菌感染尿の尿中（ 1→ 3 ) -/3-D-グルカン濃度

NO. 検出菌 CFU/ml (ι→ 3 )— 一 D—グルカン（ng/ml )

1 Canaxda albicans >10⁴ 27.5

2 Candida albicans >10⁴ 12.9

3 Candida glabrata >10⁴ 17.8

実施例 1 4 (脳脊髄液検体の測定）

実施例 7 と同様の方法で髄膜炎患者の髄液から被検液を調製し、ひきつづき実施例 1 0 に記載の本発明方法による（ 1 → 3 ) — β — D— グルカン測定剤（ II一 L剤） 0. 1 mlを加えて、 3 7 °Cで 3 0分間加温した。実施例 5 と同様にジァゾカップリング反応させた後、 5 4 5 nmでその溶液の吸光度を測定し、別に作成した検量線より（ 1 → 3 ) 一 yS — D — グルカン換算値として表した。表 1 4 に示すように、 3 例中全例において高濃度の（ 1 3 ) 一 J3 — Ό ーグルカンが検出され（健常人： 1 pgZ ml以下）、本発明の測定剤を使用する測定方法は真菌性髄膜炎の早期迅速診断法として有力な手法であることが理解できょう。

表 1 4 真菌感染髄液の髄液中（ 1→ 3 ) — ^一 D—グルカン濃度

No. 検出菌 (1→3)— β — Ό—グルカン（pg/ml)

Crvntococcus neoformans 138.5

Crvptococcus neoformans 60.8

Cryptococcus neoformans 105.5

産業上の利用可能性

本発明はライセートを用いて（ 1 — 3 ) — 5 — D —グルカンを特異的に測定するための、ェンドトキシン感受性因子を含まない測定剤およびそれを使用する測定法を提供するものであり、血液や尿をはじめとした生体試料中に存在する真菌由来の（ 1 → 3 ) — β - Ό ーグルカンを迅速簡便かつ高い精度で測定することが可能である。菌培養法等に代表される通常の検査法では診断困難な深在性真菌感染症の迅速診断ならびに適切な治療法および治療効果の判定に利用することができる。

さらに本発明の測定剤は、注射用蒸留水、注射薬および医療用具に混入する真菌由来の（ 1 — 3 ) — ； S — D — グルカンを迅速かつ正確に測定することを可能とし、また抗腫瘍活性を有する（ 1 → 3 ) 一 3 — D — グルカンのスクリーニングにも利用することができる。

Claims

請求の範囲

1 . カブトガニ · ァメボサイト · ライセ一ト含有液を、エンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に接触させて得られうる、エンドトキシン感受性因子を実質的に含まず、少なくとも（ 1 → 3 ) — ^ 一 D—グルカンと特異的に反応する成分を含むカブトガ二 · ァメボサイト · ライセ一ト処理物を主成分とする（ 1 → 3 ) — — D—グルカン測定剤。

2 . ェンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤がポリアミド系不溶性担体またはセルロース系不溶性担体である請求項 1 の測定剤。

3. デキストランを含む請求項 1 の測定剤。

4. カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2価金属塩を含む請求項 1 または 2 の測定剤。

5 . カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 ffi金属塩とクロッティングェンザィムの基質を含む請求項 1 または 2 の測定剤。

6 . 力ブトガニ ' ァメボサイト ' ライセート含有液を、エンドトキシン感受性因子を特異的に吸着する吸着剤に f妾触させ、ェンド卜キシン感受性因子を実質的に含まず、少なくとも（ 1 → 3 ) 一 β - Ό —グルカンと特異的に反応する成分を含むカブトガニ · ァメボサイト . ライセート処理物を得ることを特徵とする（ 1 → 3 ) 一 β - D -グルカン測定剤の製造法。

7. カブトガニ · ァメボサイ卜 · ライセート含有液がデキストランを含むものである請求項 6 の製造法。

8. カブ卜ガニ ' ァメボサイ卜 · ライセ一卜処理物に、カスケ一ド反応系の活性化に有効な 2 価金属または該 2 価金属塩およびク口ッティングェンザィムの基質を添加し、非加熱条件下で乾燥することを特徵とする請求項 6 の製造法。

9 . 真菌感染症患者の体液を請求項 1 〜 5 のいずれかに記載の（ 1 → 3 ) 一 ^ — D — グルカン測定剤と接触させて反応させ、（ 1 — 3 ) 一 β — Ό—グルカンによるカスケ一ド反応系における基質の変化を測定することを特徴とする真菌の検出方法。