JPH02207098A - β―グルカンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はβ−グルカン検出用試薬、β−グルカンの検出
効果を利用した真菌症の診断薬の製造等医療分野におい
て特にを用であるβ−グルカン類に対する特異性の高い
アメボサイト・ライセート及びその調整法に関するもの
である。

〔従来の技術〕 カブトガニの血リンパ液より取得されるアメボサイト・
ライセートのダラム陰性菌表層物質「エンドトキシン」
　（リポポリサッカライド）による凝固現象は、「リム
ルステスト」の−最多でエンドトキシン特異的検出法と
して医学、薬学の領域で広く利用されている。この様な
アメボサイト・ライセートの凝固を起こす物質としては
、エンドトキシン以外にトリプシン様プロテアーゼ（ト
リプシン、トロンビン等）及びβ−グルカンＭ（β−結
合を有するグルコースポリマー及びその誘導体）が知ら
れている。

アメボサイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固
現象は、エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子に
よる凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働き
によるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換
により起こることが明らかにされている。一方、アメボ
サイト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象がβ
−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素
前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギ
ュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり
、アメボサイト、・、ライセードに含まれるエンドトキ
シン性凝固酵素前駆体活性化因子とβ−グルカン性凝固
酵素前駆体活性化因子が異なるものであることがＭｏｒ
ｉｔａらにより報告された（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
、　１２９．２．３１８−３２１）　、硫酸化多Ｐｉ類
を担体とする液体クロマトグラフィーを用いたβ−グル
カン性凝固酵素前駆体活性因子の除去を特徴とするエン
ドトキシンに対する特異性の高いアメポサイト・ライセ
ードの調製方が岩永らにより開示されている。（特開昭
５９−２７８２９号）一方、真菌類の菌体成分であるβ
−グルカンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセ
ートを得る方法としては、本発明の発明者らによって出
願された特願昭６３−２９２４９４号に記載されている
。

この発明は、スルホプロピル基を吸着担体とするイオン
交換クロマトグラフィーにアメボサイト・ライセートを
付することにより、アメボサイト・ライセート中のエン
ドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子を、より簡便に
除去するものである。

即ち、先願発明のβ−グルカン類に対する特異性の高い
アメボサイト・ライセート及びその調製方法は、以下の
点を特徴とするものである。

（１）　　カブトガニから得られるアメボサイト・ライ
セートを、スルホプロピル基を吸着担体とするイオン交
換液体クロマトグラフィーに付し、エンドトキシン性凝
固酵素前駆体活性化因子を含む両分を除去することによ
りβ−グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・
ライセートを製造するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の液体クロマトグラフィーを用いてアメボサイト・
ライセート中のβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因
子は単離できるがその中にはコアギュローゲンは含んで
いない。したがって、β−グルカンによって凝固現象を
示すアメボサイト・ライセートを調整するにあたっては
、単離したβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子に
さらにコアギュローゲンを添加しなければならなかった
。

しかも、β−グルカン類に対する特異性を有するアメボ
サイト・ライセートの調製には複雑な操作が必要で、特
にゲル化で判定するライセードを調製することは困難で
あった。

本発明は、カブトガニの血リンパ液により取得されるア
メボサイトの抽出液（アメボサイト・ライセート）にカ
ブトガニ血球膜由来ベブタイドを添加することで、β−
グルカン類に対する特異性及び感度の高いアメボサイト
・ライセート及びその簡便な調製法を確立しようとする
ものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上記の事情に鑑み検討の結果得られたものであ
る。

すなわち、本発明者らはカブトガニの血リンパ液により
取得されるアメボサイトの抽出液（アメボサイト・ライ
セート）にカブトガニ血球膜由来ペプタイドを添加する
ことで、β−グルカン類に対する特異性及び感度の高い
アメボサイト・ライセート及びその簡便な調製法を見出
し本発明に達した。

カブトガニの体液凝固は、ごく微量のエンドトキシング
ラム陰性菌（リポポリサッカライド）が血球に触れるこ
とによって起因される。この反応は血球中の３種のセリ
ンプロテアーゼ前駆体とコアギュローゲンの関与するカ
スケード機構からなるが、その開始はこのリポポリサッ
カライドによるＣ因子のＣ因子への活性化がトリガーと
なる。

また、β−グルカンによっても凝固する。このときＣ因
子が関与する。

アメボサイト・ライセートの凝固機構を次に示す。

（本頁以下余白） 前述したように、アメボサイト・ライセート中には、エ
ンドトキシンで活性化され凝固する経路と、β−グルカ
ンによって活性化され凝固する経路との二経路が存在す
る。すなわち、アメボサイト・ライセートは、エンドト
キシン又はβ−グルカンの存在によって凝固するもので
ある。したがって、アメボサイト・ライセートがある試
料との接触によって凝固した場合に、その試料中にエン
ドトキシン、β−グルカンのどちらが存在していたのか
を特定することはできない。

しかしながら、本発明のアメボサイト・ライセートはβ
−グルカンに対する特異性を示すものであるので試料中
にβ−グルカンが存在することが確定できる。

本発明は、カブトガニの血リンパ液より取得されるアメ
ボサイトの抽出液であるアメボサイト・ライセートにカ
ブトガニ血球膜由来ペプタイドを添加するものである。

このカブトガニ血球膜由来ペプタイドは、エンドトキシ
ンによって活性化され凝固する経路をブロックする能力
を有する。これはカブトガニ血球膜由来ペプタイドが試
料中のエンドトキシンを吸着することによってエンドト
キシンを不活性化するものと思われる。

次に本発明で用いるカブトガニのアメボサイト・ライセ
ート及びカブトガニ血球膜由来ペプタイドについて説明
する。

アメボサイト・ライセートは、カブトガニ、たとえば北
米産カブトガニ学名Ｌｉ５ｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅ＋
ｍｕｓ。

日本産カブトガニ学名Ｔａｃｈｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅ
ｎｔａｔｕｓ等と称する各種のカブトガニの血液リンパ
液より取得されるアメボサイトを抽出して得られる。た
とえばイオン強度０．０５以下の塩溶液、好ましくはＮ
ａＣ１を含むトリス−塩酸緩衝液を使用する。

カブトガニ血球膜由来ペプタイドはカブトガニ、たとえ
ば北米産カブトガニ学名Ｌｉｗ＋ｕｌｕｓ　ｐｏｌｙ−
ｐｈｅｍｕｓ、日本産カブトガニ学名Ｔａｃ）＋ｐｌｅ
ｕｓｔｒｉｄｅｎ　ｔａ　ｔｕｓその他Ｔ、ｇｉｇａｓ
、　Ｃａｒｃｉｎｏｓｏｒｐｉｕｓ　ｒｏｕｎｄ−ｃａ
ｕｄａと称する各種のカブトガニの血球膜中に見い出さ
れるものである。

このカブトガニの血球膜由来ペプタイドには、例えばク
キ。ブレシンＩ　（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ　Ｉ　）＋
タキプレシン■（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ　Ｕ　）＋ポ
リヘムシンＩ　（Ｐｏｌｙｐｈｅｓ＋−５ｉｎ　Ｉ）＋
ポリヘムシンＩ［（Ｐｏｌｙｐｈｅｓｓｉｎ　ＩＩ　）
等のペプタイドが含まれる。

これらのペプタイドに関しては次の文献に記載されてい
る。

第６１回日本生化学大会講演要旨集第８７４頁（タキプ
レイン１．　　Ｉｆ） 特願昭６３−２４４５２２号、特願昭６３−２０３７２
４号（ポリヘムシン１．ｎ） 次にこれらのペプタイドの構造式を示す。

〔タキプレシン■〕

式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

〔タキプレシン■〕

式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

〔ポリヘムシンＩ〕

式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

〔ポリヘムシン■〕

式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

（上記４種の構造式のうちＡｒｇ−ＮＨ２は、アルギニ
ンのカルボキシル基がアミドであることを示す。）次に
、カブトガニの血球膜由来ペプタイドの代表例としての
上記４種のペプタイドの製法の一例を簡単に示す。詳細
については上記文献に記載されている。

ポリフエムシン及びタキプレシンの製造北米産カブトガ
ニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　　ｏｌ　　ｈｅｍｕｓ）の血球に
、塩化ナトリウム及びベンズアミジン塩酸塩を含むトリ
ス塩酸緩衝液を加え粉砕し、これを遠心して沈澱物を得
る。これに塩酸溶液を加え粉砕し、遠心して上澄を得る
。これを５ｅｐｈａｄｅｘ　＠　Ｇ−５０カラムに添加
して、塩酸溶液で溶出する。２８０ｎｍにおける吸光度
を測定して集めた溶出区分を、コスモシール＠５Ｃ１８
カラムに添加しアセトニトリルの濃度を変化させたトリ
フルオロ酢酸溶液で溶出することにより、目的のポリヘ
ムシン画分を得る。ポリフエムシン【とボリフエムシン
パとは溶出時間が相違するのでこれを利用して分離する
ことができる。

タキプレシンはボリフエムシンと同様の方法によって製
造することができ、血球抽出物の不溶性画分の塩酸抽出
物から５ｅｐｈａｄｅｘ　”　Ｇ−５０、逆相系ＨＰＬ
Ｃによりペプタイドを精製することによって得られる。

これらのペプタイドはこのようにカブトガニの血球膜か
ら得ることができるが、化学的合成法によっても製造で
きることは言うまでもない。

次に本発明を実施例により説明する。ただし、本発明は
この実施例により限定されるものではない。

〔実施例〕

アメリカ産カブトガニ血リンパ液よりアメボサイトを無
菌的に採取し、このアメボサイトを１２ａ＋ＭＭｇＣｈ
、　２０ＪＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）で
抽出して得られるアメボサイト・ライセートに、この血
球抽出残査をさらに塩酸抽出しゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ
により精製したポリヘムシンを添加した調製物を作る。

本調製物を用いたゲル化法によるβ−グルカンの定量法
は以下の通りである。

本調製物を０．１ｄずつ内径１０ｍ、長さ７５■の試験
管にいれ、さらにβ−グルカン標準液を０．１ｄを加え
る。（標準物質としてカルボキシメチル化カードランを
用いた。）試験管にふたをし、静かに混和後３７℃±１
で６０±２分間静置する９判定は静に１８０°転倒し、
内容物を観察する。内容物が凝固して変形しない場合溶
性（＋）それ以外の場合陰性（−）とする、また本調節
物がエンドトキシン（標準物として日本薬局方標準品を
用いた。）に対しては反応しないことを示すために試料
の代わりに既知濃度のエンドトキシンを用いた場合の結
果を第２図に示す、第１表、第２表により明らかなよう
に本調製物はエンドトキシンに対しては反応せずβ−グ
ルカンにのみ反応する。

第２表　エンドトキシン感受性 る。

〔発明の効果〕

本発明によりエンドトキシンに対しては反応せず、β−
グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセ
ートを容易に得ることができる。

また、本発明により取得されるアメボサイト・ライセー
トの調製物は、エンドトキシンに対しては反応せず、β
−グルカン類に対しては濃度依存的に高感度に反応する
ため、β−グルカン類に対する特異性の高い高感度な定
量用試薬として利用できる。さらに、β−グルカン類は
真菌類の菌体成分であるので、β−グルカン類の定量に
よる真菌症の診断薬としても利用できる。本調製物はβ
グルカン性の抗癌剤（クレスチン、レンチナンなど）と
も反応するためこれらの抗癌剤の血中濃度の測定にも可
能である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）カブトガニのアメボサイト・ライセートと、カブ
   トガニ血球膜由来ペプタイドとの混合物からなることを
   特徴とするβ−グルカン類に対する特異性の高いアメボ
   サイト・ライセート。
2. （２）カブトガニの血球膜由来ペプタイドが次式を有す
   るタキプレシン I （Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ I ）であ
   ることを特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ライ
   セート。 【遺伝子配列があります】 （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
3. （３）カブトガニの血球膜由来ペプタイドが次式を有す
   るタキプレシンII（ＴａｃｈｙｐｌｅｓｉｎII）である
   ことを特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ライセ
   ート。 【遺伝子配列があります】 （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
4. （４）カブトガニの血球膜由来ペプタイドが次式を有す
   るポリヘムシン I （Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎ I ）で
   あることを特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ラ
   イセート。 【遺伝子配列があります】 （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
5. （５）カブトガニの血球膜由来ペプタイドが次式を有す
   るポリヘムシンII（ＰｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎII）であ
   ることを特徴とする請求項１記載のアメボサイト・ライ
   セート。 【遺伝子配列があります】 （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
   直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
   のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
6. （６）カブトガニのアメボサイト・ライセートにカブト
   ガニ血球膜由来ペプタイドを添加することを特徴とする
   請求項１ないし５のいずれかに記載のβ−グルカン類に
   対する特異性の高いアメボサイト・ライセートの調製方
   法。