JPH03187378A - 酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬 - Google Patents
酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬Info
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- JPH03187378A JPH03187378A JP32489689A JP32489689A JPH03187378A JP H03187378 A JPH03187378 A JP H03187378A JP 32489689 A JP32489689 A JP 32489689A JP 32489689 A JP32489689 A JP 32489689A JP H03187378 A JPH03187378 A JP H03187378A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、カブトガニから得られるアメボサイト・ライ
セートを利用した測定に係わり、特に、エンドトキシン
をトリガーとする酵素前駆体ファクターＣの誘導体の調
製法及びファクターＣの誘導体によるエンドトキシンの
定量法に関する。
セートを利用した測定に係わり、特に、エンドトキシン
をトリガーとする酵素前駆体ファクターＣの誘導体の調
製法及びファクターＣの誘導体によるエンドトキシンの
定量法に関する。
カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ 赳り吐弘址＋ ４ｔｒｉ
ｄｅｎｔａｔｕｓ＋ ｉ、 幻１特＋ Ｃａｒｃｉｎｏ
ｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕ−ｎｄｉｃａｒｄａ）の血
リンパ液より取得されるアメボサイト・ライセートのダ
ラム陰性菌表層物質「エンドトキシン」 （リポポリサ
ッカライド）による凝固現象は、「リムルステスト」の
−船名でエンドトキシン特異的検出法として医学、薬学
の領域で広く利用されている。アメボサイト・ライセー
トの凝固を起こす物質としてはエンドトキシン以外にト
リプシン様プロテアーゼ（トリプシン、トロンビン等）
及びβ−グルカン類（β−結合を有するグルコースポリ
マー及びその誘導体）が知られている。
ｄｅｎｔａｔｕｓ＋ ｉ、 幻１特＋ Ｃａｒｃｉｎｏ
ｓｃｏｒ ｉｏｓ ｒｏｔｕ−ｎｄｉｃａｒｄａ）の血
リンパ液より取得されるアメボサイト・ライセートのダ
ラム陰性菌表層物質「エンドトキシン」 （リポポリサ
ッカライド）による凝固現象は、「リムルステスト」の
−船名でエンドトキシン特異的検出法として医学、薬学
の領域で広く利用されている。アメボサイト・ライセー
トの凝固を起こす物質としてはエンドトキシン以外にト
リプシン様プロテアーゼ（トリプシン、トロンビン等）
及びβ−グルカン類（β−結合を有するグルコースポリ
マー及びその誘導体）が知られている。
アメボサイト、ライセードのエンドトキシンによる凝固
現象はエンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子によ
る凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きに
よるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換に
より起こることが明らかにされている。一方アメボサイ
ト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象がβ−グ
ルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素前駆
体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギュロ
ーゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり、ア
メボサイト・ライセートに含まれるエンドトキシン性凝
固酵素前駆体活性化因子とβ−グルカン性凝固酵素前駆
体活性化因子が異なるものであることがＭｏｒｉｔａら
により報告された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２９
．２，３１８−３２１）。
現象はエンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子によ
る凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きに
よるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換に
より起こることが明らかにされている。一方アメボサイ
ト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象がβ−グ
ルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素前駆
体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギュロ
ーゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり、ア
メボサイト・ライセートに含まれるエンドトキシン性凝
固酵素前駆体活性化因子とβ−グルカン性凝固酵素前駆
体活性化因子が異なるものであることがＭｏｒｉｔａら
により報告された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２９
．２，３１８−３２１）。
硫酸化多糖類を担体とする液体クロマトグラフィーを用
いたβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子の除去を
特徴とするエンドトキシンに対する特異性の高いアメボ
サイト・ライセートの調製法が春永らにより開示されて
いる。（特開昭５９−２７８２９号） そこで、硫酸化多糖類！類を吸着担体とする液体クロマ
トグラフィー用充填剤を使用することで、アメボサイト
・ライセート中のエンドトキシンをトリガーとする酵素
前駆体を分画することが常法とされてきた。しかし、硫
酸化多糖類を吸着担体とするアフィニティークロマトグ
ラフィーのみでは高純度ファクターＣを精製することは
できなかった。
いたβ−グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子の除去を
特徴とするエンドトキシンに対する特異性の高いアメボ
サイト・ライセートの調製法が春永らにより開示されて
いる。（特開昭５９−２７８２９号） そこで、硫酸化多糖類！類を吸着担体とする液体クロマ
トグラフィー用充填剤を使用することで、アメボサイト
・ライセート中のエンドトキシンをトリガーとする酵素
前駆体を分画することが常法とされてきた。しかし、硫
酸化多糖類を吸着担体とするアフィニティークロマトグ
ラフィーのみでは高純度ファクターＣを精製することは
できなかった。
アメボサイト・ライセート中にはβ−グルカンをトリガ
ーとするカスケード系とエンドトキシンをトリガーとす
るカスケード系の二系列の凝固系があり、従来、市販さ
れているリムラス試薬の中にはβ−グルカンをトリガー
とするカスケード系を除去したものもあるが、血液中の
エンドトキシンを定量する際にライセード中の酵素が血
液中のプロテアーゼによって水解し、非エンドトキシン
性の反応をすることもあるので正確な測定値が得られな
いことがあった。
ーとするカスケード系とエンドトキシンをトリガーとす
るカスケード系の二系列の凝固系があり、従来、市販さ
れているリムラス試薬の中にはβ−グルカンをトリガー
とするカスケード系を除去したものもあるが、血液中の
エンドトキシンを定量する際にライセード中の酵素が血
液中のプロテアーゼによって水解し、非エンドトキシン
性の反応をすることもあるので正確な測定値が得られな
いことがあった。
カブトガニの血リンパ液より取得されるアメボサイトの
抽出液（アメボサイト・ライセート）中のエンドトキシ
ンをトリガーとするファクターＣを簡便な方法で単離精
製し、このファクターＣを用いてエンドトキシンを定量
することにすなわち、これらカスケード系の酵素を除去
したファクターＣを用いることでエンドトキシンに対し
て特異性の高い臨床試薬を提供することはすでに提案し
た。
抽出液（アメボサイト・ライセート）中のエンドトキシ
ンをトリガーとするファクターＣを簡便な方法で単離精
製し、このファクターＣを用いてエンドトキシンを定量
することにすなわち、これらカスケード系の酵素を除去
したファクターＣを用いることでエンドトキシンに対し
て特異性の高い臨床試薬を提供することはすでに提案し
た。
（特願平１−２１１４６２号）
しかしながら、従来のこれらの技術にあっては、有機溶
媒中に存在するエンドトキシンの定量は不可能であった
。
媒中に存在するエンドトキシンの定量は不可能であった
。
いままで測定が不可能であった有機溶媒中のエンドトキ
シンも定量することができ、デヒドロコール酸等の発熱
物質試験の必要とする油相性注射薬剤中のエンドトキシ
ンも定量可能とするものである。
シンも定量することができ、デヒドロコール酸等の発熱
物質試験の必要とする油相性注射薬剤中のエンドトキシ
ンも定量可能とするものである。
本発明者らは、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ 匹り地四
ｕ＋田映狸旦並ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ＋工、 ワｔシ
、 Ｃａｒｃｉｎｏｓ仔」状態ｒｏ ｔｕｎｄ １ｃａ
ｒｄａ）からアメボサイト・ライセートを調製し、スル
ホプロピル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラ
フィーにアメボサイト・ライセートを付することにより
、アメボサイト・ライセート中のエンドトキシン性凝固
酵素前駆体活性化因子群より、ファクターＣをより簡便
にかつ高純度に採取できるという新規事実を見出したこ
と（特願平１−２１１４６２号参照）を基礎にし、さら
に発展させることにより本発明に到達したのである。す
なわち本発明はファクターＣをポリエチレングリコール
で修飾することによって有機溶媒中に存在するエンドト
キシンの定量測定を可能にした。
ｕ＋田映狸旦並ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ＋工、 ワｔシ
、 Ｃａｒｃｉｎｏｓ仔」状態ｒｏ ｔｕｎｄ １ｃａ
ｒｄａ）からアメボサイト・ライセートを調製し、スル
ホプロピル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラ
フィーにアメボサイト・ライセートを付することにより
、アメボサイト・ライセート中のエンドトキシン性凝固
酵素前駆体活性化因子群より、ファクターＣをより簡便
にかつ高純度に採取できるという新規事実を見出したこ
と（特願平１−２１１４６２号参照）を基礎にし、さら
に発展させることにより本発明に到達したのである。す
なわち本発明はファクターＣをポリエチレングリコール
で修飾することによって有機溶媒中に存在するエンドト
キシンの定量測定を可能にした。
本発明は次の（１）エンドトキシン測定用のポリエチレ
ングリコール−ファクターＣを調製する方法、（２）ポ
リエチレングリコール−ファクターＣを有効成分として
含むエンドトキシンの測定試薬及び（３）ポリエチレン
グリコール−ファクターＣを利用したエンドトキシンの
測定法に関する。
ングリコール−ファクターＣを調製する方法、（２）ポ
リエチレングリコール−ファクターＣを有効成分として
含むエンドトキシンの測定試薬及び（３）ポリエチレン
グリコール−ファクターＣを利用したエンドトキシンの
測定法に関する。
そして本発明は次の構成を有するものである。
１、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とする液体クロ
マトグラフィーに付し、エンドトキシンをトリガーとす
る凝固酵素前駆体ファクターＣを高純度に含む画分を調
製し、高純度ファクターＣを活性化ポリエチレングリコ
ールと反応せしめてエンドトキシン測定用ポリエチレン
グリコール−ファクターＣを調製する方法。
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とする液体クロ
マトグラフィーに付し、エンドトキシンをトリガーとす
る凝固酵素前駆体ファクターＣを高純度に含む画分を調
製し、高純度ファクターＣを活性化ポリエチレングリコ
ールと反応せしめてエンドトキシン測定用ポリエチレン
グリコール−ファクターＣを調製する方法。
２、上記１項で調製したポリエチレングリコールファク
ターＣ及び次の゛−一般式 ：式％ （式中、Ｒ＋はＮ末端に結合した保護基、Ｘはｐ−ニト
ロアニリンまたは４−メチルクマリンを表わす。）とか
らなることを特徴とするエンドトキシンの測定試薬。
ターＣ及び次の゛−一般式 ：式％ （式中、Ｒ＋はＮ末端に結合した保護基、Ｘはｐ−ニト
ロアニリンまたは４−メチルクマリンを表わす。）とか
らなることを特徴とするエンドトキシンの測定試薬。
３、上記１項で調製したポリエチレングリコール−ファ
クターＣ及び次の一般式： ％式％ （式中、Ｒ，は、Ｎ末端に結合した保護基を表す。
クターＣ及び次の一般式： ％式％ （式中、Ｒ，は、Ｎ末端に結合した保護基を表す。
Ｘはｐ−ニトロアニリンまたは４−メチルクマリンを表
わす。）とエンドトキシンを反応せしめ、遊離したＸの
量を光学的に測定することを特徴とするエンドトキシン
の測定法。
わす。）とエンドトキシンを反応せしめ、遊離したＸの
量を光学的に測定することを特徴とするエンドトキシン
の測定法。
そして、上記Ｒ，−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−ｘに含ま
れる化合物としては、 Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、 Ｂｏｃ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ＋Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−＾ｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−
ｐＮＡ。
れる化合物としては、 Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、 Ｂｏｃ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ＋Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒ
ｏ−＾ｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−
ｐＮＡ。
（式中、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカーボニル基、ρＮ
Ａはｐ−ニトロアニリン、ＮＣＡは次式の１１３ ４−メチルクマリル−７−ア藁ドを示す）等が挙げられ
る。
Ａはｐ−ニトロアニリン、ＮＣＡは次式の１１３ ４−メチルクマリル−７−ア藁ドを示す）等が挙げられ
る。
ポリエチレングリコール−ファクターＣの製法は次の通
りである。
りである。
イオン強度０．０５以下の塩溶液、好ましくはＮａＣｌ
を含むトリス−塩酸緩衝液でカブトガニのアメボサイト
を抽出して得られるアメボサイト・ライセートを、同じ
くイオン強度０．０５以下の塩溶液、好ましくはＮａＣ
１を含むトリス−塩酸緩衝液で平衡化したスルホプロピ
ル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラフィーに
付すことによりアメボサイト・ライセート中に含まれる
エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子をイオン交
換吸着体を吸着させる。次いでイオン強度０．２０以下
の塩溶液、好ましくはＮａＣｌを含むトリス−塩酸緩衝
液でコアギュローゲン（Ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）画分を
溶出後、イオン強度０．２０を越え、２．０以下の塩溶
液、好ましくは５００ｍＭ ＮａＣ１を含むトリス−塩
酸緩衝液で溶出することにより高純度ファクターＣを採
取することができる。このファクターＣを活性化ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧｚ）と反応させることにより
ポリエチレングリコール−ファクターＣを調製する。
を含むトリス−塩酸緩衝液でカブトガニのアメボサイト
を抽出して得られるアメボサイト・ライセートを、同じ
くイオン強度０．０５以下の塩溶液、好ましくはＮａＣ
１を含むトリス−塩酸緩衝液で平衡化したスルホプロピ
ル基を吸着担体とするイオン交換クロマトグラフィーに
付すことによりアメボサイト・ライセート中に含まれる
エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子をイオン交
換吸着体を吸着させる。次いでイオン強度０．２０以下
の塩溶液、好ましくはＮａＣｌを含むトリス−塩酸緩衝
液でコアギュローゲン（Ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）画分を
溶出後、イオン強度０．２０を越え、２．０以下の塩溶
液、好ましくは５００ｍＭ ＮａＣ１を含むトリス−塩
酸緩衝液で溶出することにより高純度ファクターＣを採
取することができる。このファクターＣを活性化ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧｚ）と反応させることにより
ポリエチレングリコール−ファクターＣを調製する。
（１）ファクターＣの活性すなわちエンドトキシン感受
性因子の活性測定法。
性因子の活性測定法。
ファクターＣはアメボサイト・ライセート又はそれを含
む液体をスルホプロピル基を吸着担体とする液体クロマ
トグラフィーにて処理し、溶離液の各両分がファクター
Ｃ活性を有するか否かを測定してファクターＣを含有す
る両分を特定する。
む液体をスルホプロピル基を吸着担体とする液体クロマ
トグラフィーにて処理し、溶離液の各両分がファクター
Ｃ活性を有するか否かを測定してファクターＣを含有す
る両分を特定する。
その際の活性測定法を示す。溶離の状態は第１図に示す
。
。
クロマトグラフィーの各画分のエンドトキシン感受性因
子（ファクターＣ）の活性の測定は次の方法により行っ
た。この方法により、各両分のファクターＣが含有され
ている割合を測定した。
子（ファクターＣ）の活性の測定は次の方法により行っ
た。この方法により、各両分のファクターＣが含有され
ている割合を測定した。
各画分１００μ１１エンドトキシン（リボポリサツカラ
イド、 Ｌ Ｐ Ｓ）（１００ｎｇ／ｄ）１０（ｂｚ
ｌと２０ｍＭのＭｇＣ１，を含む３２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０） ｂｕｆｆｅｒｌｏ。
イド、 Ｌ Ｐ Ｓ）（１００ｎｇ／ｄ）１０（ｂｚ
ｌと２０ｍＭのＭｇＣ１，を含む３２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０） ｂｕｆｆｅｒｌｏ。
μ之並びに基質Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａを１ｍＭ濃度で注射用蒸留水に溶解したもの１００μ
ｌを混合し３７°Ｃで１５分間保持した後、１０％酢酸
２ ｒｄを加えて反応を停止し、蛍光強度を励起波長３
４６ｎｍ、測定波長４４２ｎｍで測定することにより遊
離される静Ｃ（４−メチルアミックマリン）量を測定し
た。
Ａを１ｍＭ濃度で注射用蒸留水に溶解したもの１００μ
ｌを混合し３７°Ｃで１５分間保持した後、１０％酢酸
２ ｒｄを加えて反応を停止し、蛍光強度を励起波長３
４６ｎｍ、測定波長４４２ｎｍで測定することにより遊
離される静Ｃ（４−メチルアミックマリン）量を測定し
た。
（２）活性化ポリエチレングリコールの調製法１５ｇの
モノメトキシポリエチレングリコール（平均分子ｉ５，
０００）と５ｇのモレキュラーシープ３Ａ（１／１６）
を含むベンゼン（１００ｍｌ）に、炭酸ナトリウム（５
ｇ）と塩化シアヌル（０，２８ｇ、二回再結晶）を加え
、８０゛Ｃで１２０時間還流する。反応液を冷却濾過し
、石油エーテル（２００ｍＪりを加えて、活性化ポリエ
チレングリコール（ＰＧＥｚ）を沈澱させる。アセトン
に溶解後、石油エーテルで沈澱させる精製操作を３回繰
り返す。さらにゲル濾過により精製し、活性化ＰＧＥ、
を得る。
モノメトキシポリエチレングリコール（平均分子ｉ５，
０００）と５ｇのモレキュラーシープ３Ａ（１／１６）
を含むベンゼン（１００ｍｌ）に、炭酸ナトリウム（５
ｇ）と塩化シアヌル（０，２８ｇ、二回再結晶）を加え
、８０゛Ｃで１２０時間還流する。反応液を冷却濾過し
、石油エーテル（２００ｍＪりを加えて、活性化ポリエ
チレングリコール（ＰＧＥｚ）を沈澱させる。アセトン
に溶解後、石油エーテルで沈澱させる精製操作を３回繰
り返す。さらにゲル濾過により精製し、活性化ＰＧＥ、
を得る。
本発明における活性化ポリエチレングリコールとは、タ
ンパク質表面に効率よくポリエチレングリコール鎖を導
入するために塩化シアヌルに１つ又は２つのモノメトキ
シポリエチレングリコール鎖を結合したものであって、
具体的なものとしては下記の式を有するものが挙げられ
る。
ンパク質表面に効率よくポリエチレングリコール鎖を導
入するために塩化シアヌルに１つ又は２つのモノメトキ
シポリエチレングリコール鎖を結合したものであって、
具体的なものとしては下記の式を有するものが挙げられ
る。
（３） ポリエチレングリコール−ファクターＣの１
周製法 カブトガニ血球Ｌｏｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）ｂｕｆｆｅｒで抽出したアポサイト・ライセ
ード６０ｄを上記緩衝液で平衡化した５Ｐ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ ６５０ Ｃ（１０Ｘ３０ｃｍ）にかけ、上記
緩衝液５００ｄで洗浄することにより、素通り画分とし
て非エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子を得た
。（特開昭６３−２９２４９４）さらに０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む２０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０）
ｂｕｆｆｅｒ ５００ｍで溶出後、０．５Ｍ ＮａＣ１
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０） ｂｕｆ
ｆｅｒ ５００ｄで溶出した画分に目的とするファクタ
ーＣを得た。（第１図参照）このファクターＣ画分８０
戚を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５にまり脱塩し、凍結乾
燥後４０ｍＭ四ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０，０）ｂｕｆｆ
ｅｒ ｌＯｍ！で溶解したものに１．４ｇの活性化ポリ
エチレングリコールを加えて、３７°Ｃで１時間反応さ
せる。反応溶液を限外濾過して、ポリエチレングリコー
ルを除いた後、凍結乾燥してポリエチレングリコール−
ファクターＣを得た。
周製法 カブトガニ血球Ｌｏｇを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）ｂｕｆｆｅｒで抽出したアポサイト・ライセ
ード６０ｄを上記緩衝液で平衡化した５Ｐ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ ６５０ Ｃ（１０Ｘ３０ｃｍ）にかけ、上記
緩衝液５００ｄで洗浄することにより、素通り画分とし
て非エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子を得た
。（特開昭６３−２９２４９４）さらに０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む２０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０）
ｂｕｆｆｅｒ ５００ｍで溶出後、０．５Ｍ ＮａＣ１
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ８，０） ｂｕｆ
ｆｅｒ ５００ｄで溶出した画分に目的とするファクタ
ーＣを得た。（第１図参照）このファクターＣ画分８０
戚を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５にまり脱塩し、凍結乾
燥後４０ｍＭ四ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０，０）ｂｕｆｆ
ｅｒ ｌＯｍ！で溶解したものに１．４ｇの活性化ポリ
エチレングリコールを加えて、３７°Ｃで１時間反応さ
せる。反応溶液を限外濾過して、ポリエチレングリコー
ルを除いた後、凍結乾燥してポリエチレングリコール−
ファクターＣを得た。
（４）エンドトキシンの定量
（ａ） （３）で調製した凍結乾燥ポリエチレン−フ
ァクターＣに注射用蒸留水５ ｍｌを加え熔解する。フ
ァクターＣｌ０（ｂｚｆ、１０ｐｇ／−から１０’ｐｇ
／ｄの濃度のエンドトキシン（日本薬局方標準品）１ｍ
ＭのＢｏｃ−Ｖａｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ １００
．！／ １を混合し３７℃、６０分間保温する。 さら
に１１．１％酢酸２成を加え反応を停止する。（第２図
Δで示す） （ｂ） （３）で精製した凍結乾燥ポリエチレン−フ
ァクターＣにエタノール５ ｍｌを加え溶解する。ファ
クターＣＩ００μｌ、１０ｐｇ／ｄから１０’ｐｇ／ｄ
の濃度のエンドトキシン（エタノールに溶解した日本薬
局方標準品）及びエタノールに溶解した１ｍＭＢｏｃＶ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ １００μｌを混合し３
７°Ｃ１６０分間保温する。さらに１５％酢酸２戚を加
え反応を停止する。（第２図○で示す） 反応を停止した後、反応液の蛍光強度を励起波長３４６
ｒ＋ｍ 、測定波長４４２ｎｍで測定することにより遊
離されるＡＭＣ（４−メチルアごツクマリン）量を測定
した。
ァクターＣに注射用蒸留水５ ｍｌを加え熔解する。フ
ァクターＣｌ０（ｂｚｆ、１０ｐｇ／−から１０’ｐｇ
／ｄの濃度のエンドトキシン（日本薬局方標準品）１ｍ
ＭのＢｏｃ−Ｖａｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ １００
．！／ １を混合し３７℃、６０分間保温する。 さら
に１１．１％酢酸２成を加え反応を停止する。（第２図
Δで示す） （ｂ） （３）で精製した凍結乾燥ポリエチレン−フ
ァクターＣにエタノール５ ｍｌを加え溶解する。ファ
クターＣＩ００μｌ、１０ｐｇ／ｄから１０’ｐｇ／ｄ
の濃度のエンドトキシン（エタノールに溶解した日本薬
局方標準品）及びエタノールに溶解した１ｍＭＢｏｃＶ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ １００μｌを混合し３
７°Ｃ１６０分間保温する。さらに１５％酢酸２戚を加
え反応を停止する。（第２図○で示す） 反応を停止した後、反応液の蛍光強度を励起波長３４６
ｒ＋ｍ 、測定波長４４２ｎｍで測定することにより遊
離されるＡＭＣ（４−メチルアごツクマリン）量を測定
した。
上記の（ａ）及び（ロ）で示したように、本発明の測定
法又は測定試薬を使用したエンドトキシンの測定は、水
溶液中に含まれるエンドトキシン及び有機溶媒中に含ま
れるエンドトキシンの両方に適用できるものである。
法又は測定試薬を使用したエンドトキシンの測定は、水
溶液中に含まれるエンドトキシン及び有機溶媒中に含ま
れるエンドトキシンの両方に適用できるものである。
エンドトキシンに対する特異性の高い定量用試薬として
利用でき、さらに、エンドトキシンはダラム陰性菌の菌
体成分であるので、エンドトキシンの定量による敗血症
の診断薬としても利用できる。従来不可能とされていた
有機溶媒中のエンドトキシンの定量も可能となった。
利用でき、さらに、エンドトキシンはダラム陰性菌の菌
体成分であるので、エンドトキシンの定量による敗血症
の診断薬としても利用できる。従来不可能とされていた
有機溶媒中のエンドトキシンの定量も可能となった。
第１図はエンドトキシン感受性因子（ファクターＣ）の
クロマトグラフィーによる溶離を示す図である。 第２図はファクターＣ及びポリエチレンゲルコール−フ
ァクターＣのエンドトキシンに対する定量性を示した図
である。図中、○はポリエチレングリコール−ファクタ
ーＣを示し、ΔはファクターＣを示す。
クロマトグラフィーによる溶離を示す図である。 第２図はファクターＣ及びポリエチレンゲルコール−フ
ァクターＣのエンドトキシンに対する定量性を示した図
である。図中、○はポリエチレングリコール−ファクタ
ーＣを示し、ΔはファクターＣを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カブトガニのアメボサイト・ライセート又はそれを
含む液体をスルホプロピル基を吸着担体とする液体クロ
マトグラフィーに付し、エンドトキシンをトリガーとす
る凝固酵素前駆体ファクターＣを高純度に含む画分を調
製し、高純度ファクターＣを活性化ポリエチレングリコ
ールと反応せしめてエンドトキシン測定用ポリエチレン
グリコール−ファクターＣを調製する方法。 ２、上記１項で調製したポリエチレングリコール−ファ
クターＣ及び次の一般式： Ｒ＿１−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｘ （式中、Ｒ＿１はＮ末端に結合した保護基、ｘはｐ−ニ
トロアニリンまたは４−メチルクマリンを表わす。）を
有する基質化合物とからなることを特徴とするエンドト
キシンの測定試薬。 ３、上記１項で調製したポリエチレングリコール−ファ
クターＣ及び次の一般式： Ｒ＿１−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｘ （式中、Ｒ＿１はＮ末端に結合した保護基、ｘはｐ−ニ
トロアニリンまたは４−メチルクマリンを表わす。）を
有する基質化合物とエンドトキシンを反応せしめ、遊離
したｘの量を光学的に測定することを特徴とするエンド
トキシンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32489689A JPH03187378A (ja) | 1989-12-16 | 1989-12-16 | 酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32489689A JPH03187378A (ja) | 1989-12-16 | 1989-12-16 | 酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03187378A true JPH03187378A (ja) | 1991-08-15 |
Family
ID=18170837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32489689A Pending JPH03187378A (ja) | 1989-12-16 | 1989-12-16 | 酵素前駆体ファクターｃの調整方法及びその調整試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03187378A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG107124A1 (en) * | 1994-08-19 | 2004-11-29 | Univ Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes |
| EP1409984A4 (en) * | 2001-06-28 | 2006-07-19 | Cambrex Bio Science Walkersvil | METHOD AND REAGENT FOR DETECTING ENDOTOXIN |
-
1989
- 1989-12-16 JP JP32489689A patent/JPH03187378A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG107124A1 (en) * | 1994-08-19 | 2004-11-29 | Univ Singapore | Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes |
| EP1409984A4 (en) * | 2001-06-28 | 2006-07-19 | Cambrex Bio Science Walkersvil | METHOD AND REAGENT FOR DETECTING ENDOTOXIN |
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