JP5212821B2 - スペーサーを介して高分子へ結合する基質を含む修飾基質を用いた酵素測定アッセイ - Google Patents
スペーサーを介して高分子へ結合する基質を含む修飾基質を用いた酵素測定アッセイInfo
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Description
本発明は、大量出血又はプロトロンビン傾向を評価するためのみならず、並びに抗止血剤及び抗凝固剤の評価のための標準的方法及び試薬を提供する。本発明の1つの特徴において、A2Mに結合していないトロンビン(遊離トロンビン)は、A2Mに結合したトロンビン(トロンビン−A2M複合体)と区別し得る。
本発明のこれらの及びその他の特徴は、下記の添付の図面によって参照される以下の記載からより明確に理解されるであろう:
図1は、従来技術のアッセイの概略図を示すものである;
図2は、本発明の実施態様に従っている修飾基質がどのように結合し得るかを示す図である;
図3は、スペーサーの長さがどのように結合に影響し得るかを示す図である;
図4は、本発明の1つの特徴のアッセイを示す図である;そして
図5は、トロンビン生成アッセイからの結果を示す図である。
トロンビン基質S2238(ダイアファーマ製、米国オハイオ州ウエストチェスター)をエポキシアガロース(シグマ製、カナダ国オンタリオ州ミシサーガ;反応性エポキシド官能性基中の12原子のスペーサー末端を有するアガロースビーズマトリックス)と反応させS2238−アガロース(アガロースと12原子のスペーサー基を介して架橋したS2238)を製造会社の指示に基づき製造した。1ビン中のダイアファーマ製の25mgのS2238及びその他の固体(ロット番号N0548870)を2mLの水に溶解し、そして得られた溶液の1mLを1gの乾燥エポキシ活性化アガロース(ビーズは、S2238と混合するに先立ち、膨張させそして洗浄した。)との共役に用いた。リン酸塩pH9.0を共役反応(反転により混合した反応溶液を23℃において16時間)に用いた。過剰のエポキシ基は1Mのトリス塩酸pH9.0を用いて4時間の反応によりブロックした。最終反応混合液からのビーズは、濃塩酸を用いてpH4.0に滴定された0.1M酢酸ナトリウム(酢酸緩衝液)及び0.1M H3BO3 0.5M NaCl pH8.0を用いて交互に洗浄した。S2238−アガロースビーズはその後、4℃において酢酸緩衝液中の50%懸濁液として保存した。
トロンビン基質S2238及びS2238−アガロースの、遊離トロンビン及びトロンビンA2M複合体との反応性を測定した。
S2238との以下の反応を96穴のプレートウェルで実施した。
1. 5μLの溶液番号1を10μLの0.5mgのアンチトロンビン(精製したアンチトロンビンIIIタンパク、アフィニティバイオロジカルズ製、カナダ国オンタリオ州)/mL HBS溶液、1μLの100ユニット・ヘパリン(レオラボラトリーズ製、カナダ国オンタリオ州アジャックス)/mL HBS溶液及び74μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μL 3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
2. 5μLの溶液番号2を10μLの0.5mgのアンチトロンビン/mL HBS溶液、1μLの100ユニット・ヘパリン/mL HBS溶液及び74μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μLの3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
3. 5μLの溶液番号3を10μLの0.5mgのアンチトロンビン/mL HBS溶液、1μLの100ユニット・ヘパリン/mL HBS溶液及び74μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μLの3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
4. 5μLの溶液番号1を85μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μLの3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
5. 5μLの溶液番号2を85μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μLの3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
6. 5μLの溶液番号3を85μLのHBS溶液へ添加した。10分後、10μLの3.192mgのS2238/mL H2Oを混合しながら添加し、100秒間にわたり10秒毎に測定された405nmにおける吸光度の数値及びこの時間帯に於ける吸光度の変化(△A)を記録した。
S2238−アガロースビーズ(等容積の酢酸緩衝液に保存した)をよく混合しそして0.25mLの得られた均一分散液の別量をエッペンドルフチューブへ加えた。遠心分離、及び上澄を注意深く除去した後、それぞれのチューブ中のビーズを0.5mLの0.02Mトリス塩酸0.15M NaCl 0.6%ポリエチレングリコール8000 pH7.4(TSP)と混合し、遠心分離しそして上澄を除去した。ビーズはTSPと再び混合し、遠心分離しそして種々の物質と反応させるための準備のために、上澄を注意深く除去した。洗浄したS2238−アガロースビーズを用いた以下の反応を実施した。
1. 30μLの溶液番号1を、エッペンドルフチューブ内で570μLのHBS及び0.25mLの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。23℃において3分又は10分の後に、チューブを1分間遠心分離し、そして上澄を速やかに(但し注意深く)エッペンドルフチューブへ移した。100μLの反応上澄を96穴プレートのウェルへ移しそして405nmにおける吸光度を測定(終点の読み)した。
2. 30μLの溶液番号3を、エッペンドルフチューブ内で570μLのHBS及び0.25mLの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。23℃において3分又は10分の後に、チューブを1分間遠心分離し、そして上澄を速やかに(但し注意深く)エッペンドルフチューブへ移した。100μLの反応上澄を96穴プレートのウェルへ移しそして405nmにおける吸光度を測定(終点の読み)した。
3. 30μLの溶液番号3を、エッペンドルフチューブ内で60μLの0.5mgのアンチトロンビン/mL HBS、6μLの100ユニット・ヘパリン/mL HBS、504μLのHBS及び0.25mLの洗浄したビーズと混合して得られた溶液と混合した。23℃において3分又は10分の後に、チューブを1分間遠心分離し、そして上澄を速やかに(但し注意深く)エッペンドルフチューブへ移した。100μLの反応上澄を96穴プレートのウェルへ移しそして405nmにおける吸光度を測定(終点の読み)した。
4. 0.25mLのHBSを、エッペンドルフチューブ内で、洗浄したビーズと混合した。23℃において3分又は10分の後に、チューブを1分間遠心分離し、そして上澄を速やかに(但し注意深く)エッペンドルフチューブへ移した。100μLの反応上澄を96穴プレートのウェルへ移しそして405nmにおける吸光度を測定(終点の読み)した。
反応の結果を下記表1及び2に示す。
表1.可溶化S2238との反応.
基質及び障害している高分子表面の間のスペーサー中の原子の最小数の必要条件を確認するために、トロンビンの反応を、小さなCNBr活性化基によりセファロースビーズと結合したS2238を用いて試験した。
25mgのS2238(クロモジェニックス製、ロット番号526873)を含む未懸濁(乾燥)粉末のボトルを、2mLの水に懸濁させた。1mLの懸濁液を除去し、そして0.75mLの1.75mLの0.2M NaHCO3 1M NaCl pH 8.0とともに50mLのキャップ付きの遠心分離用試験管へ移した。
1gのCNBr−活性化セファロース(アマシャムバイオサイエンス製、ロット番号299594)を、10mLの0.001M HCl中へ懸濁させ(膨張させ)、そしてその後焼結したガラスフィルター上で200mLの0.001M HClで洗浄した。洗浄したCNBr−活性化セファロースをS2238溶液と一緒に試験管へ移し、そして23℃において2時間揺動プレート上でインキュベートし、次いで4℃において18時間揺動プレート上でインキュベートした。反応後、反応溶液中のビーズを、焼結したガラスフィルター上で100mLの0.1M NaHCO3 0.5M NaCl pH8.0を用いて洗浄した。洗浄したビーズを15mLの0.1Mトリス塩酸pH8.0を含む50mLのキャップ付きの遠心分離試験管へ移し、そして23℃において2時間揺動プレート上でインキュベートした。ビーズはその後焼結したグラスフィルター上で10mLの0.1Mトリス塩酸 0.5M NaCl pH8.0を用いて洗浄し、次いで20mLの0.1M酢酸ナトリウム0.5M NaCl pH4.0を用いて洗浄した。このトリス塩酸/NaCl及び酢酸ナトリウム/NaClを用いた後者の洗浄をさらに5回繰り返した。最後に、等容量(押し固められたビーズの)の0.1M酢酸ナトリウム 0.5M NaCl pH4.0を加えたビーズをキャップ付きのプラスチック試験管に4℃において保存した。この保存したビーズのストックをS2238−セファロースとした。等容量の4M NaOHを用いたS2238−セファロースビーズ懸濁液の少量の副検体の混合物は、液相中で強い黄色の着色(405nmにおける吸収)を与え、セファロースビーズへの無傷のS2238基質の付着を確認した。
0.5mLの再懸濁化させたS2238−セファロースビーズをそれぞれの2マイクロフュージ試験管(1.5mL容量)へ移し、次いで12000gにおいて1分間遠心分離しそして生じた上澄を除去した。それぞれの試験管中のビーズを0.5mLの0.02Mトリス塩酸 0.15M NaCl 0.6% ポリエチレングリコール8000 pH7.4(TSP)中に懸濁させ、1分間遠心分離しそして得られた上澄を捨てた。100nMのヒトαトロンビン(エンザイムリサーチラボラトリーズ製)のTSP溶液を調製した。0.5mLのトロンビンを押し固められたS2238−セファロースビーズの1つの試験管に添加し(試験管1)、そして、0.5mLのTSPを他方のS2238−セファロースビーズの試験管へ添加した(試験管2)。別の空の試験管へ、0.05mLの遊離(ビーズと結合していない)S2238原液(12.5mgのS2238/mLの水溶液)、0.15mLのTSP及び0.5mLの100nMトロンビンを加えた(試験管3)。最後に、別の空の試験管へ、0.05mLの遊離S2238原液及び0.65mLのTSPを添加した(試験管4)。全ての試験管はキャップをしてそして試験管及び内容物を、手で持ち反転することにより23℃において10分間緩やかに振った。次いで転倒混合し、試験管を12000gにおいて1分間遠心分離しそして0.2mLのそれぞれの試験管からの上澄液を速やかに96穴マイクロタイタープレートの個々のウェルに移し、405nmにおける吸収を測定した。
結果:
異なるインキュベーション混合物からの吸光度の数値は以下の通りであった。
血漿を取りそしてフィブリノーゲンをアンクロド酵素を用いた反応によりフィブリン血栓を形成して、それを絡み付かせて除去し、脱繊維素血漿を得た。反応開始時間において組織因子(トロンボレルS)、CaCl2を添加し、予め保温した脱繊維素血漿中のトロンビン生成を開始させた。一定の時間点において、反応混合液から副検体をNa2EDTAへとり更なるトロンビン生成をCa2+のキレート化により停止させた。時間点における検体中のトロンビン活性(遊離トロンビン及びα−2−マクログロブリン(A2M)へ結合するトロンビンをここで、緩衝液中に懸濁させた遊離S2238基質又は立体障害されたS2238基質(S2238アガロースビーズ)のどちらかを混合することにより検出した。トロンビン−A2Mを検出するための遊離S2238又はS2238−アガロースの能力を決定するために、全ての遊離トロンビンが基質のインキュベーションに先立ちアンチトロンビン及びヘパリンと混合することにより阻害されることを除いて、上記方法と同様の実験を行った。血漿トロンビン生成の時間経過の間、プロトロンビンは最初にトロンビンへ変換されそしてその後遊離トロンビンが血漿アンチトロンビン(遊離S2338に対し発色活性のない)又はA2M(小さな発色のS2238基質に対し活性を有するA2Mと結合しているトロンビン)のどちらかにより、徐々に阻害される。このように、初期の時間点の検体(即ち、60秒)は、トロンビン−A2Mよりもより多くの遊離トロンビンを含むであろうが、一方、後期の時間点の検体(即ち300秒)は、遊離トロンビンよりもより多くのトロンビン−A2Mを含むであろう。
12mm(内径)x75mm(長)のポリカーボネートプラスチック試験管を血漿トロンビン生成に用いた。
1. 血漿の脱繊維素:
a. 800μLの血漿を10μLの30U/mLのアンクロド原液を用い37℃において10分間インキュベートした。
b. インキュベーションの後、形成したフィブリン血栓をプラスチック棒上に巻き取り、上澄の脱繊維素血漿を残した。
c. 試験管を氷中に10分間置いた。
d. 10分のインキュベーションの後、如何なる更なる血栓も巻き取られなかった。
e. 脱繊維素血漿を氷中に保存した。
2. 活性剤溶液(12.5μLのトロンボレルS及び4.0μL 1M CaCl2及び183.5μL HBS)を試験管中で37℃に温めた。別個の試験管中へ150μLの脱繊維素血漿を37℃に温めた。
3. t=0において、150μLの活性剤溶液を、37℃において150μLの脱繊維素血漿と混合した。
4. t=60及びt=300秒の両方において、25μLの反応混合物を除去しそして速やかに氷上において475μLの0.005M Na2EDTAを添加した。
5. いったん全ての時間点で、EDTAを用いて中和した後、50μLのそれぞれのEDTA/時間検体を135μLのHBS(ビーズ懸濁液中の最終S2238濃度が0.35nMの、約75μLの押し固められたビーズ)へ懸濁させたビーズとマイクロフュージチューブ中で37℃において混合した。時間検体の別量及びビーズ懸濁液を続いてのインキュベーションの間中反転により混合した。
6. 別個の試験管内に、50μLのEDTA/時間検体を、110μLの0.00016M S−2238のHBS溶液へ37℃において添加した。
7. 遊離S2238基質又はS2238−アガロースビーズのどちらかとのインキュベーションを10分行った後、40μLの50%酢酸をそれぞれの試験管へ添加し、基質の加水分解を停止させた。
8. 酢酸で中和したビーズ懸濁液を含むマイクロフュージ試験管を、1分間マイクロ遠心分離した。
9. それぞれの検体の上澄の200μLの別量を96穴プレートのウェルへ移しそして405nmにおける吸光度を測定した。
工程4において、25μLの時間検体を、5μLの50ユニット・アンチトロンビン/mL PBS(7.2mgアンチトロンビン/mL)及び2μLの100ユニット・ヘパリン/mL 0.15M NaClへ氷上で添加した以外は、上記に記載の実験を繰り返した。1分後、468μLの0.005M Na2EDTAを添加しそして前記のように手順を続けた。405nmにおいて検出された吸光度は基本的にトロンビン−A2M単独(遊離トロンビンはアンチトロンビン及びヘパリンにより中和されている)との基質反応に依存する。
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Claims (10)
- 遊離プロテイナーゼと反応し得、そして分子トラップ中に結合したプロテイナーゼとは反応し得ない修飾基質であって、該修飾基質が9乃至15原子を含むスペーサーを介して高分子に結合している基質を含み、前記プロテイナーゼは、トロンビンである、修飾基質。
- 前記高分子が、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルボネート、ダクロン、デキストラン、ポリテトラフルオロエチレン、タンパク質、多糖、及びポリヌクレオチドからなる群より選ばれる、請求項1に記載の修飾基質。
- 前記高分子がアガロースビーズである、請求項2に記載の修飾基質。
- 前記高分子がポリスチレンである、請求項2に記載の修飾基質。
- 検体中の遊離対結合トロンビンを検出する方法であって、該方法は、
i.請求項1に定義したような修飾基質を得る工程であって、トロンビンとの反応において、発色、蛍光又は化学発光切断生成物を産出するために更に修飾される工程;
ii.基質を検体と結合させる工程;そして
iii.発色、蛍光又は化学発光による信号により遊離トロンビンを検出する工程;を含む方法。 - 前記修飾基質が、容器の表面に非−共有結合する、請求項5に記載の方法。
- 前記修飾基質が、容器の表面に共有結合する、請求項5に記載の方法。
- 遊離酵素活性を測定するためのキットであって、該キットが請求項1において定義したような修飾基質を含むものであるキット。
- さらに、反応緩衝液及び組織因子を含む、請求項8に記載のキット。
- 前記修飾基質が反応容器の表面に結合されているものである、請求項8に記載のキット。
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