FR2858936A1 - Potentialisation de l'activation de prodrogues de haut poids moleculaire - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet une forme modifiée d'une prodrogue. Une forme typique de prodrogue selon l'invention comprend un groupe encombrant, un espaceur, une structure clivable dans l'appareil circulatoire et un agent thérapeutique ou un marqueur ; l'espaceur permettant ou facilitant le clivage de la structure clivable.

Description

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POTENTIALISATION DE L'ACTIVATION DE PRODROGUES
DE HAUT POIDS MOLECULAIRE
La présente invention concerne le domaine des prodrogues et plus particulièrement les prodrogues destinées au traitement et/ou au diagnostic de tumeurs cancéreuses et/ou de réactions inflammatoires.
Les prodrogues sont des molécules pharmacologiquement inactives susceptibles de se transformer in vivo en drogues (agents thérapeutiques actifs) après certaines modifications chimiques ou enzymatiques de leur structure. Les prodrogues permettent la libération de la drogue, c'est-à-dire la transformation de la prodrogue en drogue, au niveau d'un site d'action ou d'un tissus cible plutôt que dans l'appareil circulatoire ou dans un tissu non-cible. Elles permettent aussi de diminuer in vivo l'index thérapeutique (c'est-à-dire le rapport activité sur toxicité) d'agents thérapeutiques tels que les agents anti-tumoraux comme les anthracylines (telles la doxorubicine) et les alcaloïdes vinca ou des agents anti-tumoraux ayant des effets antiinflammatoires comme le méthotrexate. Ainsi, plusieurs prodrogues ont jusqu'à présent été développées dans le but d'obtenir une spécificité d'action élevée, une toxicité réduite et une stabilité améliorée dans le sang et/ou le sérum.
Il a été décrit dans l'art antérieur des prodrogues présentant la structure de base suivante : agent thérapeutique, oligopeptide clivable par une enzyme présente dans l'environnement extracellulaire de cellules cibles, groupe stabilisant ou masquant.
La demande de brevet PCT numéro de publication WO 96/05863 décrit notamment une prodrogue de formule bêta-
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Alanyl-Leucyl-Alanyl-Leucyl-Doxorubicine (ou encore bêtaALA-LEU-ALA-LEU-Dox ou bêta-ALAL-Dox). Cette prodrogue est stable dans le sang, c'est-à-dire relativement insensible au clivage par les peptidases du sang, et est réactivée in vitro par des peptidases sécrétées par un grand nombre de cellules tumorales. La prodrogue est successivement hydrolysée en Ala-Leu-Dox puis en Leu-Dox dans l'environnement extracellulaire péritumoral. La Leu-Dox pénètre dans la cellule par diffusion où elle est activée sous la forme Doxorubicine (Trouet et al. 2001). Les études de toxicité et d'activité in vivo avec la prodrogue cidessus montrent une réduction de la toxicité et une inhibition de la croissance tumorale plus importante par rapport à la Doxorubicine seule. Cependant, les études de pharmacocinétique montrent que son temps de demi-vie d'élimination rénale est court. La prodrogue semble être éliminée rapidement par les voies urinaires (Dubois et al.
2002) .
La demande de brevet PCT numéro de publication WO 00/33888 propose l'adjonction à la prodrogue bêtaAla-LeuAla-Leu-Dox d'un groupe masquant la charge positive de la bêta-Alanine afin d'améliorer son efficacité. Ce groupe masquant peut être, par exemple, un polyethylene glycol (PEG) .
La demande de brevet PCT numéro de publication WO 01/91798 décrit des prodrogues présentant une stabilité dans l'appareil circulatoire améliorée. Par exemple, les prodrogues peuvent être PEGylées, c'est-à-dire que le PEG est utilisé en tant que groupe stabilisant et/ou masquant .
La liaison de ce polymère (PEG) entraîne une amélioration des propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des prodrogues et donc une réduction de l'élimination rénale, de part la taille de la molécule. En effet, plus la molécule
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est grande plus son élimination est lente (Harris & Chess, 2003) .
Dans le cadre des travaux de recherche ayant conduit à la présente invention, la Demanderesse a préparé des prodrogues PEGylées à partir d'une prodrogue de la Doxorubicine (décrite dans la demande de brevet WO 96/05863) en utilisant différentes tailles de PEG, afin de diminuer son ultrafiltration rénale par la taille volumineuse du composé, tout en gardant ses propriétés de prodrogues (réactivation par les enzymes sécrétés par les cellules tumorales). La Demanderesse a couplé des PEGs de tailles croissantes (poids moléculaires de 350 à 20000 en passant par 750,2000, 5000) à la prodrogue bêta-Ala-Leu-Ala-LeuDox. Afin de tester la réactivation de ces dérivés PEGylés de cette prodrogue, des tests de clivage ont été réalisés in vitro. Ces tests avaient pour but d'évaluer la réactivation des dérivés PEGylées par les enzymes sécrétées par les cellules tumorales (LS-174T et MCF-7/6) par rapport à la bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox qui est hydrolysée en Leu-Dox en présence de milieu conditionné de ces cellules cancéreuses. Les résultats de ces tests ont montré 1) que quelque soit la taille du PEG, la réactivation de la drogue par clivage de la séquence peptidique (Ala-Leu-Ala-Leu) est moins efficace, comparé à la prodrogue sans le groupement PEG et 2) une corrélation entre la taille du PEG et le clivage de la prodrogue PEGylée : plus le PEG couplé était de grande taille, moins la prodrogue était clivée par les enzymes présentes dans l'environnement extracellulaire des cellules cibles. La demanderesse a émis l'hypothèse que la réduction du clivage du lien peptidique de la prodrogue était certainement due à un phénomène d'encombrement stérique du PEG. En d'autres termes, plus la prodrogue comprend un
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groupement stabilisant ou masquant de haut poids moléculaire, moins elle est réactivée, ce qui va à l'encontre du but recherché pour une prodrogue possédant une longue demi-vie.
La présente invention a précisément pour but d'offrir une nouvelle structure de prodrogue afin d'éliminer ce phénomène d'encombrement stérique et de permettre ou faciliter le clivage de l'oligopeptide lorsque le groupe masquant et/ou stabilisant est de taille volumineuse, tout en gardant une spécificité d'action élevée, une toxicité réduite et une stabilité dans le sang et/ou le sérum, préférentiellement chez un mammifère.
Ce but est atteint en insérant un bras moléculaire ou espaceur moléculaire entre le groupe masquant et/ou stabilisant (par exemple le PEG) et la séquence peptidique clivable par une enzyme spécifique de cette séquence.
Les espaceurs moléculaires selon l'invention, aussi désignés ci-après espaceurs , ont été choisis en tenant compte des propriétés hydrophiles des unités constituant l'espaceur.
La présente invention a donc tout d'abord pour objet un composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m : dans laquelle : - I est une substance d'intérêt active sur des cellules cibles, - A est un groupement augmentant le temps de demi-vie de B-I dans la circulation sanguine, - E-B est un groupe de liaison entre A et I, où : . B est une structure clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement à proximité ou au niveau desdites cellules cibles,
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. E est un groupe espaceur hydrophile, stable dans l'appareil circulatoire, qui éloigne A de B de façon à permettre ou faciliter le clivage de B à proximité ou au niveau desdites cellules cibles et ainsi permettre ou faciliter la libération de I ou la libération de I avec un reste de B, - n est un nombre entier compris entre 1 et soit le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, soit le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - m est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - p est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de I, sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, avec quand p = 1, n = m et quand m = 1, n = p.
Selon une première forme de réalisation préférée de la présente invention, p, n et m sont égaux à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivant A-E-B-I.
Selon une deuxième forme de réalisation préférée de la présente invention, m est égal à 1 et n et p sont identiques et supérieurs à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivante (A-E-B)t>1-I, où t représente un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles le groupement A-E-B- peut être fixé. Avantageusement, I peut être représenté par un polypeptide, tel qu'une molécule de cytokine TNF-alpha sur laquelle sont branchés plusieurs groupements A-E-B-.
Selon une troisième forme de réalisation préférée de la présente invention, p est égal à 1 et n et m sont
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identiques et supérieurs à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivante A-(E-B-I)k>1, ou k représente un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles le groupement -E-B-I peut être fixé. Avantageusement, A peut être représenté par un polymère, tel une molécule de PEG branché, sur laquelle sont branchés plusieurs groupements E-B-I.
Selon une quatrième forme de réalisation préférée de la présente invention, p et m sont supérieurs à 1 et n peut être différent de p et de m. A titre d'exemple, si p = 2, n
3 et m = 2, le composé peut être représenté par la formule suivant : (I)-(B-E)-(A)-(E-B)-(I)-(B-E)-(A)
La substance d'intérêt active (I) peut être fixée soit directement à une ou plusieurs structures B par une liaison covalente, soit indirectement par l'intermédiaire d'un bras de liaison . A titre d'exemple, lorsque la structure B est une séquence d'acides aminés, et qu'elle est fixée directement à la substance d'intérêt I, la liaison covalente peut alors être réalisée à l'extrémité N-terminale ou C-terminale de la séquence d'acides aminés selon son orientation, ou à tout autre site de l'oligopeptide (par exemple au niveau de la chaîne latérale d'un des acides aminés). Par ailleurs, lorsque la liaison entre B et I est indirecte, le bras de liaison peut avoir plusieurs fonctions telles que faciliter le clivage entre B et I, fournir un moyen de liaison chimique approprié entre B et I, améliorer le procédé de synthèse du composé, améliorer les propriétés physiques de la substance d'intérêt (I), fournir un mécanisme supplémentaire de libération intracellulaire ou extracellulaire de la substance d'intérêt (I). Cette liaison
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indirecte peut être réalisée par tout procédé de couplage chimique, biochimique, enzymatique ou génétique connu de l'homme de l'art. A titre d'exemple de tels bras de liaison, on peut citer un réactif de pontage homo- ou hétérofonctionnel du type 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane- 1-carboxylate de succinimidyle (SMCC), des agents bi ou multifonctionnels contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle, aryle ou arylalkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cyanogène, carbonyldiimidazole, thiocarbonyldiimidazole des esters de succinimide ou des halogénures sulphoniques, phosgène, thiophosgène, des espaceurs auto-réarrangeables (ou self-immolatives ) (Schmidt et al., 2001).
L'espaceur (E) selon la présente invention lie le groupement A à la structure B. Il est préférentiellement hydrophile et stable dans l'appareil circulatoire.
Un espaceur est stable dans l'appareil circulatoire lorsque moins de 10%, de préférence moins de 2%, de l'espaceur est dégradé ou clivé dans le sang circulant (en particulier par des enzymes) pendant sa conservation dans du sang humain à 37C pendant plus de 2 heures. Avantageusement, en éloignant le groupement A de la structure B et de par son caractère préférentiellement hydrophile, l'espaceur permet ou facilite le clivage de la structure B à proximité ou au niveau des cellules cibles et ainsi permet ou facilite la libération de I ou la libération de I avec un reste de B.
L'espaceur peut présenter une taille en longueur pouvant être l'équivalent de l'ordre de 1 à 100 acides aminés.
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Selon un autre aspect de la présente invention, la taille de l'espaceur peut varier en fonction du poids moléculaire du groupement A. Selon cet aspect, la taille de l'espaceur est d'autant plus importante que le poids moléculaire de A est important.
L'espaceur selon la présente invention est constitué ou comprend au moins un groupement choisi parmi : les séquences d'acides aminés ; les peptidomimétiques ; pseudopeptides ; lespeptoïdes ; les chaînes alkyles, aryles ou arylalkyles substituées ; les polyalkylglycols ; les polysaccharides ; les polyols ; les polycarboxylates ; les poly(hydro)esters. L'espaceur peut aussi être constitué d'une combinaison d'au moins deux de ces groupements.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'espaceur est constitué ou comprend de 1 à 100, de préférence de 1 à 20 et tout préférentiellement de 2 à 10, acides aminés identiques ou différents, choisi(s) dans le groupe comprenant les acides aminés naturels en conformation D, les acides aminés non codés génétiquement ou acides aminés synthétique et non clivables par une enzyme présente dans l'appareil circulatoire, tel les acides aminés bêta ou gamma ou similaires. Par acides aminés naturels en conformation D on entend les acides aminés qui sont normalement codés par le code génétique mais qui, au lieu d'être naturellement en conformation L, sont synthétisés en conformation D. D'une manière générale, les acides aminés non codés génétiquement peuvent être préparés par voie de synthèse ou être dérivés d'une source naturelle.
On préfère, parmi les acides aminés naturels en conformation D, les acides aminés hydrophiles choisis parmi : la D-glutamine, la D-asparagine, le D-acide aspartique, le D-acide glutamique, la D-lysine, la D-
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arginine, la D-histidine et plus particulièrement la Dsérine et la D-thréonine.
Selon un mode préférentiel de la présente invention, l'espaceur est constitué ou comprend une séquence d'acides aminés identiques choisie parmi : (D-sérine)x ou (D-thréonine)x, où x est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 2 et 10, et tout préférentiellement entre 2 et 6.
Plus particulièrement, l'espaceur est : (D-sérine)-(D-sérine)-(D-sérine)-(D-sérine), ou (D-thréonine)-(D-thréonine)-(D-thréonine)-(Dthréonine)
Les acides aminés sont notés dans la présente invention soit en code à trois lettres, soit en code à une lettre, bien connus du l'homme de l'art.
Le groupement A est un groupement qui augmente in vivo le temps de demi-vie de B-I dans l'appareil circulatoire ou les tissus normaux (c'est-à-dire sains). Ce but est notamment atteint lorsque A réduit l'élimination rénale de la substance d'intérêt I ou du composé B-I ; cette élimination étant basée sur l'ultrafiltration par les reins des composés en fonction de la taille. Ainsi, plus le composé est grand plus son élimination est lente ; l'élimination rénale étant inefficace pour les composés ayant une masse moléculaire d'au moins 50 000 Dalton. Ce but peut aussi être atteint en diminuant la dégradation par le métabolisme hépatique des composés selon l'invention. En d'autres termes, diminuer le temps de demi-vie, c'est augmenter le temps de résidence moyen des composés dans le sang ou diminuer la clairance sanguine ou plasmatique.
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On entend par appareil circulatoire les fluides corporels, plus particulièrement le sang, et préférentiellement l'appareil circulatoire d'un mammifère.
De préférence, le groupement A est hydrophile ou amphipatique.
On préfère les groupements A qui sont stables dans l'appareil circulatoire (c'est-à-dire lorsque moins de 20%, de préférence moins de 2%, du composé de formule (A) p- (EB)n-(I)m est dégradé ou clivé dans le sang circulant (en particulier par des enzymes), pendant sa conservation dans du sang humain à 37 C pendant plus de 2 heures), non toxiques pour les cellules saines, non-immunogènes, noncoagulants, ou masquant (c'est-à-dire empêchant la substance d'intérêt (I) d'agir à la surface d'une cellule tant que celle-ci n'a pas été libérée de la prodrogue).
Avantageusement, le groupement A peut en outre présenter l'une ou plusieurs des propriétés suivantes : prévenir le clivage non spécifique et/ou la dégradation du groupe de liaison E-B ; les effets biologiques de la substance d'intérêt tant que la substance d'intérêt n'a pas été libérée de la prodrogue ; la stabilité du composé dans l'appareil circulatoire ; des propriétés de solubilisation dans l'eau, le sang et/ou le sérum du composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m ; des propriétés de ciblage du composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m vers les cellules cibles.
Par propriétés de ciblage du composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m vers les cellules cibles on entend que le groupement A permet au composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)mde se s'accumuler à proximité ou au niveau des cellules cibles.
Ce groupement A sera dit alors biospécifique , c'est-àdire capable de développer des interactions biologiques spécifiques et par conséquent d'être reconnu par des entités
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biologiques du système vivant. En particulier, il peut être greffé sur la surface du groupement A des séquences peptidiques tels des anticorps, antigènes ou des motifs d'acides aminés tels que arginine-glycine-acide aspartique (RGD) permettant d'augmenter sélectivement l'adhésion du composé selon l'invention à la surface de certains types cellulaires. Le groupement A peut aussi consister en un copolymère biospécifique par fonctionnalisation de chaînes macromoléculaires pré-existantes par des groupements chimiques appropriés dans le but d'être reconnus ou encore par copolymérisation de monomères fonctionnalisés.
En particulier, le groupement A est choisi parmi : les polypeptides (tels que le polyglutamate, le polyaspatate), les immunoglobulines, l'albumine, les polysaccharides, les polymères ou copolymères.
Les polymères peuvent comprendre la polyvinylpyrrolidone, le copolymère pyrane, le polyhydroxypropyl-méthacrylamide-phénol, le polyhydroxy- éthyl-aspanamide-phénol, le poly(oxyde d'éthylène) polylysine substitué par des résidus palmitoyle, le poly(acide lactique), la poly(epsilon-caprolactone), le poly(acide hydroxybutyrique), les polyorthoesters, les polyacétals, les polydihydropyranes, les polycyanoacrylates et les copolymères d'hydrogel séquences réticulés ou amphipatiques.
De préférence, le groupement A est choisi parmi : un polyalkylène glycol, polyalkylène oxide, polyalkylène imine, des copolymères du chlorure de vinyle. A titre d'exemple, lorsque le groupement A est un copolymères du chlorure de vinyle, la présence de groupements sulfonate, ou sulfonate et carboxylate est nécessaire pour que le polymère ne développe pas une activité coagulante.
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De préférence encore, le groupement A est choisi parmi un polyéthylène oxide, un polyéthylène imine, le styrène sulfonate de sodium (NaSS), le maléate de sodium et de butyle (MMBE), le méthacrylate d'hydroxypropyle ou N- (2hydroxypropyl)méthacrylamide (HPMA), le méthacrylate de méthyle (MMA), le poly-[N-(2-hydroxyéthyl)-L-glutamine] (PHEG), le poly-[N-(hydroxyéthyl)-DL-aspartamide] (PHEA).
En particulier et de manière préférentielle, le groupement A est un polyéthylène glycol (PEG). La taille du PEG peut être comprise en 200 et 50000 Da, de préférence entre 350 et 20000 Da et de préférence encore entre 1000 et 10000 Da. La présence de ces PEG permet une amélioration des propriétés pharmacocinétiques (Duncan et al., 1994), pharmacodynamiques et donc une réduction de l'élimination rénale des composés selon l'invention. Par ailleurs, un autre avantage connu de l'art antérieur, est que le PEG permet une accumulation préférentielle dans les tumeurs. En effet, les PEGs d'un poids moléculaire de 104 Da ou plus montrent une accumulation plus importante dans les tumeurs que dans les tissus normaux (Greenwald et al., 2003, Seymour et al, 1995) .
Le groupement A peut en outre être un agent à activité thérapeutique ou agent à activité diagnostique.
Avantageusement, un groupement A ayant des propriétés d'agent à activité diagnostique pourra posséder des éléments à propriétés paramagnétiques, c'est-à-dire posséder dans ses couches électroniques des électrons célibataires comme le gadolinum, le manganèse et le fer qui renforcent notamment le contraste en imagerie par résonance magnétique (IRM) . A titre d'exemple, on peut citer le sulfonate de polystyrène sur lequel est fixé du fer.
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L'invention a également pour objet des composés mettant en #uvre une ou plusieurs substances de ciblage capables de vectoriser le composé de formule (A)p-(E-B)n- (I)m vers les cellules cibles. A titre d'exemple, les substances de ciblage peuvent être des anticorps, des antigènes, des liposomes.
De préférence, la ou les substance (s) de ciblage est (sont) couplée (s) au composé de formule (A) p- (E-B) n- (I) au niveau d'un ou plusieurs groupement(s) A.
Selon la présente invention, la structure B est clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement dans l'environnement des cellules cibles.
On entend plus particulièrement par cellules cibles les cellules qui sont impliquées dans une pathologie ou qui présentent un intérêt thérapeutique ou de diagnostic. Ces cellules cibles sont préférentiellement choisies dans le groupe comprenant les cellules tumorales primaires ou secondaires (les métastases), les cellules stromales des tumeurs primaires ou secondaires, les cellules endothéliales néoangiogéniques des tumeurs ou des métastases tumorales, les macrophages, les monocytes, lymphocytes ou polynucléaires infiltrants les tumeurs et les métastases tumorales.
On entend plus particulièrement par clivable sélectivement , un clivage qui est dépendant de la séquence à cliver. En d'autres termes, la séquence à cliver est préférentiellement reconnue par une enzyme présente dans l'environnement des cellules cibles et elle est peu ou pas dégradée dans l'appareil circulatoire ou à proximité des cellules non-cibles. L'expression dans l'environnement des cellules cibles signifie que l'enzyme est présente soit uniquement soit préférentiellement à
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proximité ou au niveau des cellules cibles. Il est à remarquer que même si le clivage ne se réalise pas uniquement à proximité ou au niveau des cellules cibles, le fait que le clivage soit réalisé préférentiellement (ou en grande partie ou dans la majorité des cas) à proximité ou au niveau des cellules cibles, rend ce clivage sélectif. En d'autres termes encore, le clivage est dit sélectif lorsque l'enzyme se trouve en plus grande concentration à proximité ou au niveau des cellules cibles par rapport au reste de l'organisme.
On entend plus particulièrement par enzyme , une hydrolase. L'enzyme peut être choisie dans le groupe comprenant les peptidases, les endopeptidases, les enzymes lysosomiales, les lipases, les glycosidases.
Selon un mode préféré de la présente invention, l'enzyme est une peptidase spécifique des cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques, macrophages ou monocytes. On entend par enzyme spécifique une enzyme sécrétée uniquement ou préférentiellement par les cellules cibles dans le milieu extracellulaire de ces cellules cibles. A titre d'exemple, lorsque l'enzyme est spécifique des cellules tumorales, celle-ci peut être choisie dans le groupe comprenant la Néprilysine (CD10), la Thimet oligopeptidase (TOP), le Prostate Spécifie Antigen (PSA), la plasmine, la légumaïne, les collagènases, l'urokinase, les cathepsines, les métallopeptidases de matrice.
Le choix de la structure B est bien entendu fonction de l'enzyme présente dans l'environnement des cellules cibles. Ainsi, si l'enzyme est une peptidase, la structure B comprendra une séquence d'acides aminés (ou oligopeptide) clivable par cette peptidase ; si l'enzyme est une
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glycosidase (par exemple une saccharase), alors la structure B comprendra un oligosaccharide clivable par cette glycosidase ; si l'enzyme est une lipase, alors la structure B comprendra une chaîne lipidique clivable par cette lipase, et ainsi de suite.
Ainsi B est clivable par une peptidase sélectivement présente dans l'environnement des cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques, macrophages, monocytes, lymphocytes ou polynucléaires.
L'invention vise à titre préféré les structures B comprenant ou constituées d'un oligopeptide clivable sélectivement par une enzyme présente dans l'environnement des cellules tumorales. Ces oligopeptides comprennent de préférence entre 2 et 10 acides aminés, et de préférence encore de 3 à 7. A titre d'exemple, l'invention vise les séquences suivantes (préférentiellement en conformation L):
Ala-Phe-Lys (SEQ ID n 1), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID n 2) ou bêta-Ala-Leu-Ala-Leu, Ala-Leu-Lys-Leu-Leu (SEQ ID n 3),
Ala-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID n 4), His-Ser-Ser-LysLeu-Gln-Leu (SEQ ID n 5), Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (SEQ ID n 6), Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (SEQ ID n 7).
Cependant, l'homme de l'art connaît d'autres séquences d'acides aminés clivables sélectivement par une enzyme spécifique de cellules tumorales, telles celles décrites dans les demandes de brevet PCT numéro de publication WO 96/05863, WO 00/33888, WO 01/68145, WO 01/91798, WO 01/95943, WO 01/95945, WO 02/00263, WO 02/100353.
Les enzymes selon l'invention sont susceptibles de cliver sélectivement la structure B de manière à permettre la libération de I ou la libération de I avec un reste de B.
L'expression libération de I avec un reste de B est expliquée par l'exemple suivant. Si la structure B est une séquence d'acides aminés dont la séquence est Ala-Leu-AlaLeu, la substance d'intérêt la doxorubicine (B-I étant AlaLeu-Ala-Leu-Dox) et l'enzyme la CD10, alors cette enzyme
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clivera la séquence d'acides aminés entre Ala-Leu-Ala et Leu, libérant ainsi un produit Leu-doxorubicine. Ce produit est donc défini comme I avec un reste de B .
On entend par une substance d'intérêt active sur des cellules cibles (I), une substance dont le site d'action se situe ou dont son effet s'exercera à la surface ou dans des cellules cibles. A titre d'exemple, une telle substance d'intérêt peut être choisie parmi le groupe comprenant un agent chimique, un polypeptide, un acide nucléique (ADN, ARN sens ou antisens, simple ou double brin, ADN complémentaire, ARN interférant, et analogues), un antibiotique, un virus ou un marqueur, éventuellement couplé à une substance vectrice (par exemple un anticorps).
Ladite substance d'intérêt (I) est préférentiellement un agent à activité thérapeutique et plus préférentiellement un agent à activité thérapeutique anti-tumorale, antiangiogénique ou anti-inflammatoire. L'agent peut avoir une cible (par exemple un récepteur) ou site d'action extracellulaire ou intracellulaire. Il peut aussi comprendre une séquence peptidique pénétrante telle qu'une séquence décrite dans la demande de brevet PCT numéro WO 01/64738. A titre d'exemple, I est choisie dans le groupe des agents à activité thérapeutique anti-tumorale, comprenant : les alcaloïdes vinca tels que la vincristine, la vinblastine, la vindésine, la vinorelbine ; taxanes ou taxoïdes tels que le paclitaxel, le docétaxel, le 10-déacetyltaxol, 1'7-epi- taxo, la baccatine III, le xylosyltaxol ; agents alkylants (ou alcoylants) tels que l'ifosfamide, le melphalan, le chloraminophène, la procarbazine, le chlorambucil, la thiophosphoramide, le busulfan, la dacarbazine (DTIC), les mitomycines dont la mitomycine C, les nitroso-urées et leurs dérivés (par exemple
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estramustine, BCNU, CCNU, fotémustine) ; dérivés du platine tels que le cisplatine et les analogues (par exemple carboplatine, oxaliplatine) ; antimétabolites tels que le méthotrexate, l'éminoptérine, le 5-fluorouracile, la 6- mercaptopurine, le raltitrexed, la cytosine arabinoside (ou cytarabine), l'adénosine arabinoside, la gemcitabine, la cladribine, la pentostatine, la fludarabine phosphate, les hydroxyurées ; les inhibiteurs de topoisomérases I ou II tels que les dérivés de la camptothécine (par exemple l'irinotécan et le topotécan ou hydrochlorure de 9- diméthylaminométhyle-hydroxy-camptothécine), les epipadophyllotoxines (par exemple l'étoposide, le téniposide), l'asmacrine ; le mitoxanthrone ; L- canavanine ; les antibiotiques tels que les anthracyclines et par exemple l'adriamycine ou doxorubicine, la THP-adriamycine, la daunorubicine, l'idarubicine, la rubidazone, la pirarubicine, la zorubicine et l'aclarubicine, les analogues d'anthracyclines et par exemple l'épiadriamycine (4'épi-adriamycine ou épirubicine) et la mitoxantrone, les bléomycines, les actinomycines dont l'actinomycine D, la streptozotocine, la calichéamycine, les duocarmycines, la combrestatine ; L-asparaginase ; leshormones ; les inhibiteurs purs de l'aromatase ; les androgènes ; les analogues-antagonistes de la LH-RH ; cytokines tels que l'interféron alpha (IFN-alpha), l'interféron gamma (IFN-gamma), l'interleukine 1 (IL-1), l'IL-2, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-10, le TNF-alpha, le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-alpha), les antagonistes de l'IGF-1 (insuline like growth factor); les inhibiteurs du protéasome ; les inhibiteurs de la farnesyl-transférase (FTI) ; les épothilones ; lesmaytansinoïdes ; le discodermolide ; la fostrécéine ; les peptides BH3 ; les peptides p53 ; les caspases ; le granzyme B ; les
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ribozymes ; les anticorps monoclonaux tels que le rituximab, le tastuzumab ; inhibiteurs de tyrosine kinases tels que le STI 571 (imatinib mesylate); les andostatines ; les protéines, peptides, cytokines anti-inflammatoires.
Par marqueurs , on entend des enzymes, des anticorps, des molécules chimiques fluorescentes ou phosphorescentes, des molécules utilisables en scintigraphie. On peut citer à titre d'exemple, la coumarine, la 7-amido-trifluoraméthyle coumarine, la paranitroanilide, la 8-naphtylamide et la 4-méthoxy naphtylamide, la fluoroscéine, la biotine, la rhodamine, la tétraméthylrhodamine, la GFP (green fluorescent protein), les agents utilisés en scintigraphie comme des isotopes radioactifs, et les dérivés de ces composés.
L'invention vise aussi des sels d'addition basique ou acide pharmaceutiquement acceptables, hydrates, solvates, précurseurs, métabolites ou stéréoisomères, desdits composés selon la présente invention.
L'expression "sels pharmaceutiquement acceptables" se réfère aux sels non toxiques des composés selon l'invention qui peuvent être généralement préparés en faisant réagir une base libre du composé selon l'invention avec un acide organique ou inorganique convenable. Ces sels conservent l'efficacité biologique et les propriétés des bases libres. Comme exemples représentatifs de tels sels, on peut citer les sels hydrosolubles et hydroinsolubles, tels que les acétates, ansonates (4,4-diaminostilbènes-2,2'disulfonates), benzènesulfonates, benzonates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates, borates, bromures, buryrates, édétates de calcium, camsylates, carbonates, chlorures, citrates, clavulariates, dichlorhydrates, édétates,
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édisylates, estolates, ésylates, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, glycolylarsanylates, hexafluorophosphates, hexylrésorcinates, hydrabamines, bromhydrates, chlorhydrates, hydroxynaphtoates, iodures, isothionates, lactates, lactobionates, laurates, malates, maléates, mandélates, mésylates, méthylbromures, méthylnitrates, méthylsulfates, mucates, napsylates, nitrates, 3-hydroxy-2-naphtoates, oléates, oxalates, palmitates, pamoates (1,1-méthylène-bis-2-hydroxy-3naphtoates, emboates), pantothénates, phosphates/ diphosphates, picrates, les polyglucuronates (tels que les polygalacturonates et polyglucuronates), propionates, ptoluènesulfonates, salicylates, stéarates, subacétates, succinates, sulfates, sulfosalicylates, suramates, tannates, tartrates, téoclates, tosylates, triéthiodides, valérates et les sels de N-méthylglucamine ammonium.
L'invention vise aussi une composition comprenant, comme principe actif au moins un composé selon la présente invention. Elle a aussi pour objet l'utilisation de telles compositions pour la formulation et la préparation de produits biologiques, pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, de diagnostique ou de traçage.
L'invention vise plus particulièrement les formulations pharmaceutiques comprenant au moins un composé selon la présente invention, pouvant être en association avec un véhicule, vecteur, diluant ou excipient pharmaceutiquement acceptables.
Un sujet peut être traité avec une quantité pharmaceutiquement efficace d'un composé selon l'invention.
L'expression "quantité pharmaceutiquement efficace" signifie une quantité capable d'induire la réponse biologique ou
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médicale d'un tissu, système, animal ou humain telle qu'attendue par le chercheur ou le médecin traitant.
Les compositions définies ci-dessus peuvent également comprendre ou êtres associées à au moins un autre principe actif médicament ou au moins un adjuvant bien connu de l'homme de l'art (vitamine C, agents antioxydants, etc.) pour êtres utilisés en synergie avec le composé selon l'invention pour améliorer et prolonger le traitement.
Les compositions sont particulièrement utiles en ce sens qu'elles ont une très faible toxicité, ou ne sont pas toxiques.
Les formulations pharmaceutiques selon l'invention sont susceptibles d'être utilisées in vivo à des fins préventives ou curatives, par exemple des infections virales, des métastases, de l'apoptose cellulaire (maladies dégénératives, ischémie tissulaire...), des maladies infectieuses (virales, bactériennes, par mycoses,... ), du cancer et de la néo-angiogénèse pathologique.
L'administration des composés selon l'invention peut se faire par l'un quelconque des modes d'administration accepté pour les agents thérapeutiques. Ces procédés comprennent l'administration systémique par exemple orale, nasale, parentérale, ou l'administration topique, par exemple transdermique, ou encore l'administration centrale, par exemple par voie chirurgicale intracrânienne, ou encore l'administration intraoculaire.
L'administration orale peut se faire au moyen de comprimés, gélules, capsules molles (y compris les formulations à libération différée ou prolongée), pilules, poudres, granules, élixirs, teintures, suspensions, sirops et émulsions. Cette forme de présentation est plus
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particulièrement adaptée au passage de la barrière intestinale.
L'administration parentérale se fait généralement par injection sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse ou par perfusion. Les compositions injectables peuvent être préparées sous des formes classiques, soit en suspension ou solution liquide soit sous forme solide convenant à une dissolution extemporanée dans un liquide.
Une possibilité pour l'administration parentérale utilise l'implantation d'un système à libération lente ou libération prolongée qui assure le maintien d'un niveau constant de dose, par exemple, selon US-A-3 710 795.
Pour l'administration intranasale, on peut utiliser des véhicules intranasaux convenables.
Pour l'administration transdermique, on peut utiliser des timbres cutanés transdermiques bien connus de l'homme de l'art. Un système à libération transdermique permet une administration continue.
D'autres préparations topiques préférées comprennent les crèmes, les onguents, les lotions, les sprays aérosols et les gels.
En fonction du mode prévu d'administration, les composés peuvent être sous forme solide, semi-solide ou liquide.
Pour les compositions solides, telles que comprimés, pilules, poudres ou granulés à l'état libre ou inclus dans des gélules, le principe actif peut être combiné avec des excipients tels que : a) des diluants, par exemple le lactose, le dextrose, le sucrose, le mannitol, le sorbitol, la cellulose et/ou la glycine ; b) des lubrifiants, par exemple la silice, le talc, l'acide stéarique, son sel de magnésium ou de calcium et/ou le polyéthylèneglycol ; des liants, par exemple le silicate de magnésium et d'aluminium,
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la pâte d'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique et/ou la poly-vinylpyrrolidone ; le cas échéant, d) des désintégrants, par exemple l'amidon, l'agar, l'acide alginique ou son sel de sodium, ou des mélanges effervescents ; et/ou e) des absorbants, colorants, aromatisants et édulcorants.
Pour les compositions semi-solides, telles que suppositoires, l'excipient peut, par exemple, être une émulsion ou suspension grasse, ou à base de polyalkylèneglycol, tel que de polypropylène-glycol.
Les compositions liquides, en particulier injectables ou à inclure dans une capsule molle, peuvent être préparées par exemple par dissolution, dispersion, etc. du composé selon l'invention dans un solvant pharmaceutiquement pur tel que, par exemple, l'eau, une solution saline de chlorure de sodium (NaCl), le sérum physiologique, le dextrose aqueux, le glycérol, l'éthanol, une huile et analogues.
Les composés selon l'invention peuvent également être administrés sous la forme de systèmes de libération du type liposomes ou lipoplexes, tels que sous la forme de petites vésicules unilamellaires, de grandes vésicules unilamellaires et de vésicules multilamellaires. Les liposomes peuvent être formés à partir d'une diversité de phospholipides, contenant du cholestérol, de la stéarylamine ou des phosphatidylcholines. Dans une forme d'exécution, un film de composants liquides peut être hydraté avec une solution aqueuse du médicament pour former une couche lipidique encapsulant le médicament, comme décrit dans US-A- 5 262 564.
Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées et/ou contenir des adjuvants et substances auxiliaires non toxiques tels que des agents de
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conservation, de stabilisation, de mouillage ou d'émulsification, des agents favorisant la dissolution, des sels pour régler la pression osmotique et/ou des tampons. En outre, elles peuvent également contenir d'autres substances présentant un intérêt thérapeutique. Les compositions sont préparées, respectivement, par des procédés classiques de mélange, granulation ou enrobage.
La posologie pour l'administration des composés selon l'invention est choisie selon une diversité de facteurs y compris le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du sujet ; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; l'état des fonctions rénale et hépatique du sujet et la nature du composé particulier, ou sel, employé. Un médecin ou vétérinaire normalement expérimenté déterminera facilement, et prescrira, la quantité efficace du composé voulue pour prévenir, contrarier ou stopper le progrès de l'état médical à traiter.
L'une quelconque des compositions pharmaceutiques ci-dessus peut contenir de 0,1 à 99%, de préférence 1 à 70% de principe actif.
A titre d'exemples, les posologies orales des composés selon l'invention lorsqu'ils sont utilisés pour les effets indiqués, seront comprises entre environ 0,05 et 1000 mg/jour par voie orale et, de préférence fournies sous la forme de comprimés contenant 0,5,1,0, 2,5,5,0, 10,0,15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 et 1000,0 mg de principe actif. Par voie parentérale, les niveaux efficaces des composés selon l'invention seront compris dans la gamme allant de 0,002 mg à 500 mg par kg de poids corporel et par jour.
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Les composés selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de doses quotidiennes uniques, ou la posologie quotidienne totale peut être administrée en deux, trois ou quatre doses par jour.
Dans une application particulière, la présente invention est relative à un agent de diagnostic, pour mise en oeuvre in vitro, constitué par ou refermant au moins un composé selon la présente invention. Le composé selon l'invention possédera alors comme substance d'intérêt (I) un marqueur. Un tel agent de diagnostic peut également être utilisé in vivo.
La présente invention a donc aussi pour objet un kit de diagnostic qui comprend ledit agent de diagnostic. Plus particulièrement, le kit de diagnostic comprend, dans un ou plusieurs récipients, une quantité prédéterminée d'une composition selon l'invention.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe, dans lesquels :
La Figure 1 représente schématiquement les deux méthodes de synthèse de prodrogues PEGylées de la Doxorubicine.
La Figure 2 montre les tests de cytotoxicité de la Doxorubicine, de la bêta-ALAL-Dox, du PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox, du PEG2ooo-DSer-bêta-ALAL-Dox et du PEG2000-(DSer)4-bêta-ALALDox sur les cellules MCF-7/6. La survie des cellules a été estimée par un test de viabilité cellulaire (WST-1, Roche Molecular Diagnostic). Les graphiques 2 A, B, C, D et E représentent la survie des cellules de type MCF 7/6 (en % du
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contrôle) en fonction respectivement du logarithme de la concentration de doxorubicine (A), bêta-ALAL-Dox (B), PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox (C) , PEG2ooo-DSer-bêta-ALAL-Dox (D) et PEG2000- (DSer) 4-bêta-ALAL-Dox (E) .
La Figure 3 représente graphiquement l'évolution de la moyenne des poids corporels en pourcent à partir du début du traitement en jour, de souris athymiques portant des tumeurs de carcinome de colon humain. (#) NaCl, (#) Doxorubicine 6,69 umol/kg, (#) Doxorubicine 8,6 umol/kg, (o) Su-bêtaALAL-Dox 45 pmol/kg, (+) Su-bêta-ALAL-Dox 50 pmol/kg, (x) PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox 1x45 ; 3 x 25 pmol/kg, (*) PEG2000- (DSer)4-ALAL-Dox 1 x 50 ; x 35 pmol/kg.
La Figure 4 représente graphiquement l'évolution de la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV) en pourcentage à partir du début du traitement en jour, des groupes de souris athymiques portant des tumeurs de carcinome de colon humain traités par rapport au contrôle (NaCl). (#) NaCl, (#) Doxorubicine 6,69 umol/kg, (#) Doxorubicine 8,6 umol/kg, (o) Su-bêta-ALAL-Dox 45 umol/kg, (+) Su-bêta-ALAL-Dox 50 umol/kg, (x) PEG2000- (DSer)4-ALAL-Dox 1x45 ; 3 x 25 umol/kg, (*) PEG2000-(DSer)4- ALAL-Dox 1 x 50 ; x 35 umol/kg.
La Figure 5 représente l'inhibition de la première et de la seconde phase de croissance de tumeurs LS-174T par la Doxorubicine (Dox), PEG2000- (DSER)4-ALAL-Dox et Su-bêtaALAL-Dox aux doses respectives de 6,69 umol/kg, 1 x 50 + 3 x 35 umol/kg, et 50 pmol/kg, en comparaison avec la solution contrôle de NaCl 0,9% (w/v). Toutes les souris ont reçu 4 injections i.v. aux jours 0,7, 14, et 21. Les rapports T/C minimals des médianes (T/C min. ) des volumes tumoraux relatifs (RTV) sont donnés comme paramètre d'efficacité maximale. Les différences des temps pour un doublement des médianes des RTV des groupes traités en
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comparaison au groupe contrôle (T - C) ainsi que les SGD (retards de croissance spécifiques) sont calculés à partir de la régression linéaire de la phase de croissance pour déterminer le degré d'activité selon les critères établis par l'EORTC. Le rapport des pentes des régressions linéaire de l'évolution des médianes des RTV des groupes traités par rapport au groupe contrôle (Pente T/C), exprimé en pourcent, sont donnés à titre de paramètre de comparaison de vitesse de croissance.
Exemple 1 : Matériel & méthodes
1. 1) Les lignées cellulaires
Cellules MCF 7/6' : un variant de la lignée MCF-7 (Michigan Cancer Foundation Engel et al., 1978) qui a été obtenue en 1970 à partir d'une effusion pleurale chez une patiente atteinte d'un adénocarcinome du sein (Soule et al, 1973). Ces cellules proviennent du laboratoire du Professeur Mareel à Gand (Laboratoire de Cancérologie Expérimentale, Hôpital universitaire de Gand, Belgique).
Cellules LNCaP : isolées en 1977 par Horoszewic et al., à partir d'une biopsie au niveau de nodules lymphatiques supraclaviculaires d'un patient atteint d'un carcinome métastatique de la prostate. Cette lignée provient de l'ATCC (American Type Culture Collection. USA).
Lignée cellulaire LS-174T : variant de la lignée LS180, provenant d'une femme atteinte d'un adénocarcinome du colon. Ces cellules forment très rapidement des tumeurs après une inoculation dans des souris athymiques. Ces cellules proviennent de l'ECACC (European Collection of Cells Cultures. UK).
1. 2) Les agents anticancéreux pour l'étude chimiothérapeutique
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La Doxorubicine est fournie par Meiji Seika Kaisha Ltd. (Tokyo, Japon), la succinyl-bêta-Ala-Leu-Ala-LeuDoxorubicine (Su-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) (Fernandez et al., 2001) et le PEG2000- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ont été synthétisés.
1. 3) Les animaux
Des souris femelles NMRI, nu/nu (de 5 semaines à la livraison par les élevages JANVIER) ont été utilisées.
Toutes les manipulations des animaux se font conformément aux recommandations de l'UKCCCR (United Kingdom Co-ordinating Committee on Cancer Research ; et al., 1998) et de la FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations ; Nicklas et al., 2002 ; Rehbinder et al., 2000 ; Rehbinder et al., 1996) sur l'utilisation et le bien-être des animaux dans les études de chimiothérapie expérimentales.
2) Synthèse de dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine
La synthèse de dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine a été réalisée en utilisant deux méthodes différentes "A" et "B" (Figure 1).
Les dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine synthétisés selon l'une ou l'autre des deux méthodes sont les suivants : - PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (1) - PEG2000- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (2) - PEG2000- (DSer) -bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (3)
Figure img00270001

- PEG2000-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (4) - PEG2ooo-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (5)
Les composés 1,3 et 4 ont été synthétisés selon la méthode A . Les composés 2 et 5 selon la méthode B .
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Remarque : les prodrogues Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine et bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine ont été décrites dans la demande de brevet WO 96/05863.
2. 1) Méthode de synthèse A
Le principe de cette méthode est la PEGylation en solution d'un composé NH2-peptide-Doxorubicine. Au produit NH2-peptide-Doxorubicine (préalablement obtenu après trois étapes de synthèse, voir figure 1) dissout dans un mélange chloroforme/méthanol (4:1), sont ajoutés 1,5 équivalents molaires de mPEG2000-SPA (mPEG2ooo-succinimidyl propionate ester) (Nektar) dissout dans le mélange chloroforme/méthanol (4: 1) et 5 uL de diisopropyléthylamine (DIPEA).
Après environ 48 à 72 heures, le produit final de la réaction est analysé par chromatographie HPLC (voir paragraphe 2. 2 ci-dessous).
Les produits (3) et (4) sont extraits au dichlorométhane à pH 4 (utilisation de l'acide lactique).
Les produits s'accumulent dans la phase organique. Ils sont ensuite concentrés par évaporation sous vide avant d'être lyophilisés.
2. 2) Méthode de synthèse B : synthèse peptidique sur support solide (SPPS) par la chimie Fmoc (Fluorenyl-Lmethoxycarbonyl)
Le principe de cette méthode est la synthèse de la séquence peptidique PEGylée sur support polymérique solide (résine de type Wang) et ensuite le couplage entre le PEG2000-peptide-OH obtenu et la Doxorubicine.
Le principe de la SPPS est d'accrocher successivement sur un support solide (résine de type Wang) les différents acides aminés du peptide attendu selon des procédures connues de l'homme de l'art (Merrifield, 1963 et 1965 ; Steward et Young, 1969).
Synthèse peptidique sur support solide.
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Les peptides synthétiques sont obtenus par synthèse peptidique sur support solide dans un réacteur de synthèse manuelle (AnaSpec), par la chimie du groupe Fmoc, par exemple. Toutes les résines utilisées (AnaSpec ou Novabiochem) lors de la synthèse sur support solide sont des résines Wang possédant le premier acide aminé protégé préattaché avec une substitution initiale donnée par le fournisseur entre 0,4 et 0,7 mmol/g de résine. Les acides aminés Fmoc ont été fournis par AnaSpec ou Novabiocem, avec les groupement protecteurs sur la chaîne latérale comme suit : trityl (Asn, Cys, Gln, et His), Acm (Cys), Boc (Lys et Trp), 0-tert-Butyl (Asp et Glu), tert-Butyl (Ser, Thr, Tyr) et Pbf (Arg). Les différents polyéthylèneglycols de poids moléculaire désiré (PEG-SPA) sont obtenus sous forme d'un ester pré-activé hydroxysuccinimidyl (OSu) chez Nektar. La déprotection du groupe Fmoc est effectuée par traitement à la pipéridine dans la diméthylformamide (DMF). L'agent de couplage utilisé lors de la synthèse est le HCTU (3-oxide de 1H-Benzotriazolium 1-[bis(diméthylamino)méthylène]-5chlorohexafluorophosphate (1-) ) ou HBTU (2- (lH-benzotriazole-1- yl)-1,-1,-3,-3-tétraméthyluroniumhexafluorophosphate) ou
Figure img00290001

HATU (0-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,-N,-N',-N'- tétraméthyluroniumhexafluorophosphate) dans la DMF. Des cycles standards de couplage des acides aminés sont effectués comme suit : 3 x 30 secondes, lavages à la DMF ; x 2 minutes puis 1 x 7 minutes, déprotection par la pipéridine diluée à 20% dans la DMF ; x 20 secondes, lavages à la DMF ; x 15 minutes de couplage avec l'acide aminé (2 eq.), l'agent de couplage (2 eq.) et DIPEA (4 eq.) suivi de 3 x 30 secondes de lavages à la DMF. L'abaissement de la substitution de la résine initiale commerciale est effectuée par l'ajout de 0,5 à 0,3 équivalents molaires du premier Fmoc-AA-OH à coupler selon la séquence voulue
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(substitution finale souhaitée de l'ordre de 0,1 à 0,22 mmol/g) suivi de l'acétylation des groupes aminés restants (Virender et al., 1981). Le couplage de chaque acide aminé est vérifié par un test de Kaiser bien connu de l'homme de l'art (Kaiser et al. 1970) . Après ajout de tous les acides aminés selon la séquence désirée, la PEGylation sur le support solide Wang est obtenue par couplage de 2 x 2 jours de la forme active ester PEG-SPA (Nektar) et DIPEA.
La coupure chimique du lien covalent rattachant le peptide PEGylé du support solide Wang est obtenue avec un mélange constitué d'acide trifluoroacétique(TFA) :eau:triisopropylsilane (TIS) dans les proportions 95 :2,5:2,5, ajouté sur la résine bien sèche dans le réacteur de synthèse manuelle et pour trois heures. Le peptide PEGylé est précipité à l'éther glacé, centrifugé, lavé à l'éther avant d'être lyophilisé.
Analyse par chromatographie HPLC
Le peptide acide est analysé par chromatographie HPLC avec une colonne (phase inverse) de type VYDAC (C8,5 um, 250 x 4,6 mm), avec un premier solvant (solvant A) constitué de 0,1 % d'acide Trifluoroacétique (TFA) dans de l'eau et un second solvant (solvant B) constitué de 0,1 % de TFA dans l' acétonitrile (ACN) , avec un gradient de 0 % à 70 % en 25 minutes pour le solvant B.
2.3) Exemples de synthèse : synthèses du PEG2000- (DSer)4-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (2) et du PEG2ooo-AlaLeu-Ala-Leu-Doxorubicine (5)
Figure img00300001

Au PEG2ooo-peptide-OH (PEGZOOO- (DSer) 9-Ala-Leu-Ala-Leu-OH ou PEG2ooo-Ala-Leu-Ala-Leu-OH) obtenu par synthèse sur support solide sont ajoutés 1,2 équivalents molaires de Doxorubicine.HCl dissoute dans la DMF et 3,2 équivalents molaires de DIPEA. Le mélange est protégé de la lumière et agité pendant 15 minutes à température ambiante avant
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l'ajout d'1,3 équivalents molaires d'HATU (agent de couplage, PE Biosystem). La réaction est suivie par analyse par chromatographie HPLC (point 2. 3. ci-dessus) pendant environ 3 heures. Lorsque la réaction est complète, le solvant est évaporé sous vide. Le produit résiduel est repris dans l'eau et extrait au dichlorométhane. Le produit (2) s'accumule préférentiellement dans la phase organique tandis que le produit (5) est principalement récupéré dans la phase aqueuse. La phase organique contenant le produit (2) est concentrée par évaporation sous vide et le produit est précipité à l'éther à température ambiante. Le précipité obtenu est dissout dans l'eau avant d'être lyophilisé . La phase aqueuse contenant le produit 5 est récupérée, congelée dans un bain d'acétone et de carboglace et lyophilisée.
Avant lyophilisation, les produits ont été analysés par HPLC (voir point 2. 2 ci-dessus).
3) Préparation des solutions de produits pour les cultures cellulaires
Les produits utilisés pour les expériences de culture cellulaire in vitro sont la Doxorubicine, la bêta-Ala-LeuAla-Leu-Doxorubicine, le PEG2000- (DSer)4-bêta-Ala-Leu-AlaLeu-Dox. (1), le PEG2ooo- (DSer) -bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox .
(3), le PEG2ooo-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (4) et PEG2000-AlaLeu-Ala-Leu-Dox. (5).
Les produits sont dissous dans un volume minimum d'eau et stérilisés par filtration au travers d'un filtre d'une porosité de 0,22 m. La concentration des solutions est déterminée par mesure de l'absorbance à 495 nm.
4) Cultures cellulaires
Le milieu de culture utilisé pour les trois types cellulaires mentionnés ci-dessus est le RPMI 1640 avec Glutamax-1 contenant 10 % de sérum de bovin f#tal (milieu sérique) (SBF; Gibco-BRL).
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5) Tests de cytotoxicité
Les tests de cytotoxicité de la Doxorubicine et dérivés ont été réalisés avec les cellules MCF-7/6 et les cellules LNCaP.
Les cellules sont décrochées par trypsinisation, comptées puis ensemencées dans des plaques à 96 puits dans 200 L de milieu sérique.
Les cellules sont incubées durant 24 heures à 37 C avant de recevoir les produits à tester :
Doxorubicine,
Bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox,
PEG2ooo-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (5),
PEG2ooo-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (4),
PEG2ooo-DSer-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (3),
PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (1) dilués à différentes concentrations dans du milieu de culture sérique. Après une incubation de 48 heures en présence des différents composés, les cellules sont finalement post-incubées à 37 C durant 24 heures en présence de milieu sérique uniquement. Après cette période d'incubation, un test de viabilité cellulaire est effectué (WST-1, Roche Molecular Biochemical).
6) Tests de stabilité et d'hydrolyse des dérivés PEGylées de prodrogues de la Doxorubicine
6. 1) Effet de la PEGylation sur la réactivation d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales
Des cultures sub-confluentes des cellules tumorales (MCF-7/6, LS-174T, LNCaP) ont été lavées deux fois avec une solution de tampon phosphate salin et du milieu de culture frais sans sérum contenant 0,02% d'albumine sérique bovine (100 L/cm2) est ajouté. Après 24h d'incubation, le milieu conditionné est récupéré, centrifugé pendant 10 minutes à 300
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g, tamponné avec du Tris-HCl 1 M pH 7,5 (1 vol tampon + 19 vol milieu) et concentré 20 fois par ultrafiltration (seuil de coupure de 10 kDa) (Tris : Trishydroxyméthylaminométhane) .
La réactivation des dérivés PEGylés de la prodrogue peptidique de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales a été comparée à celle de la prodrogue initiale, bêta-ALAL-Dox, qui est hydrolysée en Leu-Dox et Doxorubicine lors d'une incubation dans du milieu conditionné par des cellules tumorales. Les composés sont dilués à 20 M dans le milieu conditionné et incubés pendant 6 à 18 heures à 37 C dans un bain thermostaté. L'hydrolyse des composés est quantifiée par analyse HPLC (voir point 7.1 ci-dessous).
Les prodrogues PEGylées suivantes ont été utilisées :
PEG350-bêta-ALAL-Dox
PEG750-bêta-ALAL-Dox PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox
PEGsooo-bêta-ALAL-Dox
6. 2) Stabilité dans le milieu de culture
PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (1), PEG2000- bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox.(4) et bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (contrôle) sont dilués à 20 M dans 500 L de milieu sérique. Les échantillons sont distribués dans des plaques à 24 puits et incubés à 37 C dans une atmosphère saturée en eau et contenant 5 % de C02. Pour chaque produit, une extraction (Méthode d'extraction à l'acétonitrile voir point 7. 3 ci-dessous) est réalisée en triplicat au temps 0 et après 1,2, 6 et 24 heures d'incubation. Les échantillons sont ensuite analysés par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessous).
6. 3) Stabilité dans le sang total humain
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PEG2ooo- (DSer)4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (1) , PEG2ooo-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (4), bêta-Ala-Leu-Ala-LeuDox et Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ont été dilués à 20 M dans 500 L de sang total humain (conservé à 4 C dans un tube citraté stérile de 5 mL après la collecte). Les tubes contenant les échantillons sont incubés à 37 C. Une extraction (Méthode d'extraction à l'acétonitrile voir point 7. 3 ci-dessous) de chaque produit est réalisée en triplicat au temps 0 et après 1,2, 4 et 6 heures d'incubation.
7) Méthodes analytiques
7. 1) Extraction basique
Dans des tubes contenant 2,5 mL d'un mélange organique chloroforme/méthanol (4 :1), sont ajoutés 25 uL d'échantillon à extraire, 500 uL d'eau et 100 uL de standard interne (prolyl-daunorubicine à 3,45 uM). Après addition du tampon basique (600 L de tampon borate 0,5 M, pH 9,8), chaque tube est agité immédiatement pendant 5 secondes puis centrifugé pendant 10 minutes à 1800 g.
La phase organique est récupérée et séchée sous air comprimé . Les échantillons sont dissous en ajoutant 500 uL d'un mélange contenant 30% d' acétonitrile et 10% de tampon formiate d'ammonium (pH 4) . Les échantillons sont ensuite filtrés et analysés par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessous) .
7. 2) Extraction à l'acétonitrile
Dans des tubes contenant 50 uL d'échantillon à extraire, sont ajoutés 10 L de standard interne (prolyldaunorubicine) et 50 uM et 150 L d'acétonitrile. Les tubes sont agités et centrifugés pendant 10 minutes à 13000 g. Le surnageant est analysé par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessous) .
7. 3) Analyse chromatographique par HPLC
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Tous les échantillons de produits (PEG2ooo-bêta-Ala- Leu-Ala-Leu-Dox . (4), PEG2000- (DSer)4-bêta-Ala-Leu-Ala-LeuDox (1), PEG2ooo-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (5), bêta-Ala-Leu-AlaLeu-Dox et Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) sont analysés par chromatographie HPLC en utilisant le système HP1100 (Agilent) avec une colonne (phase inverse) de type VYDAC (C8,5 um, 250 x 4,6 mm) . La Doxorubicine et ses dérivés sont détectés par fluorescence (Lambdaexc. = 235 nm ; Lambdaem. = 560 nm) et sont identifiés grâce à leur temps de rétention relatifs respectifs par rapport à un standard interne. Leurs concentrations sont calculées en se basant sur la surface intégrée de leurs pics sur les chromatogrammes HPLC.
Les courbes de stabilité obtenues (évolution de la concentration en fonction du temps) permettent d'évaluer la stabilité des produits. Et dans le cas des tests d'hydrolyse, un tableau récapitulatif de la quantité de LeuDox et de Dox générés après 6 heures d'incubation permet d'évaluer l'hydrolyse des dérivés PEGylés par les enzymes libérées par les cellules tumorales.
8) Etude in vivo de la réactivation tumorale des dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine
La réactivation tumorale de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine (Su-bêta-ALAL-Dox) a été évaluée sur des souris athymiques portant des xénogreffes de carcinome de colon humain LS-174T. Les dérivés PEGylés suivants ont été utilisés : PEG2000-bêta-ALAL-Dox et PEG2000- bêta-ALAL-Dox.
Les souris ont reçu une injection i. v. (intra veineuse) bolus des différents composés à la dose de 69 pmol/kg. Les animaux ont été sacrifiés 2 et 72h après l'injection et les molécules actives (Leu-Dox + Dox)
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accumulées dans la tumeur ont été quantifiées par chromatographie HPLC (voir point 7. 3 ci-dessus).
9) Etude chimiothérapeutique dans un modèle de xénogreffe ectopique sous-cutané
Les études de chimiothérapie expérimentales ont été réalisées sur des souris athymiques porteuses de tumeurs d'origine humaine LS-174T (carcinome de colon humain) préalablement greffées en sous-cutané.
Les souris sont sélectionnées et réparties dans les différents groupes de l'étude de façon à avoir une répartition des volumes tumoraux équitable. Les différents traitements sont assignés aux groupes formés de façon aléatoire.
Les traitements (Doxorubicine, de succinyl-bêta-Ala- Leu-Ala-Leu-Dox, et de PEG2000-(DSer)4-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (2) ) sont administrés par voie i. v aux jours 0,7, 14 et 21.
Lors de ces injections, Les animaux reçoivent un volume constant de 10 l/g de produit (Workman et al., 1998). Après l'injection, les signes cliniques sont suivis régulièrement (chaque heure durant le premier jour et quotidiennement jusqu'à la fin de l'étude), ainsi que le poids qui est mesuré en même temps que le volume tumoral. La croissance de la tumeur est contrôlée 2 fois par semaine en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse deux diagonales perpendiculaires de la tumeur (la plus grande et la plus petite).
Pour déterminer l'évolution du volume tumoral des différents groupes, la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV pour "relative tumor volume") qui expriment en pourcent l'évolution des médianes des volumes tumoraux par rapport au jour 0 est calculée. Pour estimer l'effet des différents traitements, l'inhibition de la croissance est déterminée en calculant le rapport entre la médiane du RTV des groupes
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traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage (T/C(%)).
La valeur du rapport T/C la plus faible est utilisée comme paramètre pour estimer l'efficacité maximale des produits utilisés.
La durée d'inhibition de la croissance de la tumeur a été évaluée en calculant le retard de croissance entre les groupes traités et le groupe contrôle (T - C) pour un doublement (DT pour Doubling Time ) des médianes des RTV.
Le retard de croissance spécifique (SGD pour Specific Growth Delay ) est également calculé à partir du temps nécessaire pour un doublement de la médiane du RTV dans les différents groupes de l'étude. SGD est donc égal à (DTtraité - DTcontrôle) / (DTcontrôle) .
L'activité de la Doxorubicine, de la succinyl-bêtaAla-Leu-Ala-Leu-Dox, et de PEG2000-(DSer)4-Ala-Leu-Ala-LeuDox (2) a été évaluée en se basant sur les critères recommandés par l'EORTC (European Organisation for Research and Treatment of Cancer) (Boven et al., 1992 ; Langdon et al., 1994) et présentés dans le tableau I. Cependant, la façon d'estimer l'efficacité des composés a été adaptée étant donné que les critères proposés dans la littérature (Boven et al., 1992) ne sont valables que pour des tumeurs qui présentent une croissance linéaire monophasique. La tumeur utilisée est caractérisée par une croissance en 2 phases ; la phase terminale (phase 2) étant beaucoup plus rapide que la première phase (phase 1). Pour ces raisons, les retards de croissance (T - C) et les retards de croissance spécifique (SGD) ont été calculés à partir des régressions linéaires des différentes phases qui caractérisent la croissance des tumeurs.
Le tableau 1 ci-dessous montre l'évaluation de l'efficacité d'un agent chimiothérapeutique selon les
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critères recommandés par l'EORTC (Boven et al., 1992 ; Langdon et al., 1994). Echelle d'activité : - = aucune activité ; (+) activité très faible ; + = activité faible ; ++ = activité modérée ;+++ = activité importante ; ++++ = activité très importante.
Tableau 1
Figure img00380001
<tb>
<tb> Critères <SEP> de <SEP> l'EORTC <SEP> Activité
<tb> SGD <SEP> < <SEP> 1,0 <SEP> et <SEP> T/C <SEP> > <SEP> 50% <SEP> - <SEP>
<tb> SGD <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> ou <SEP> T/C <SEP> < <SEP> 50% <SEP> (+) <SEP>
<tb> SGD <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> et <SEP> T/C <SEP> < <SEP> 50% <SEP> +
<tb> SGD <SEP> > <SEP> 1,5 <SEP> et <SEP> T/C <SEP> < <SEP> 40% <SEP> ++ <SEP>
<tb> SGD <SEP> > <SEP> 2,0 <SEP> et <SEP> T/C <SEP> < <SEP> 25% <SEP> +++ <SEP>
<tb> SGD <SEP> > <SEP> 3,0 <SEP> et <SEP> T/C <SEP> < <SEP> 10% <SEP> ++++ <SEP>
<tb>
Exemple 2 : Effet de la PEGylation sur la réactivation d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales
Les composés bêta-ALAL-Dox, PEG350-bêta-ALAL-Dox,
Figure img00380002

PEG75o-bêta-ALAL-Dox, PEG2000-bêta-ALAL-Dox et PEGsooo-bêta-ALAL- Dox (20 uM) ont été incubés pendant 6 heures dans du milieu conditionné de cellules tumorales MCF-7/6 ou LS-174T. La réactivation des prodrogues (libération de Doxorubicine et de Leu-Dox) a été mesurée par chromatographie HPLC.
Le tableau 2 ci-dessous représente l'hydrolyse de la prodrogue bêta-ALAL-Dox et de ses dérivés PEGylés. Les résultats représentent les concentrations de Doxorubicine (Dox) et de Leucine-Doxorubicine (L-Dox) et sont exprimés comme la valeur moyenne obtenue à partir de trois expériences indépendantes l'écart type (n=9).
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Tableau 2
Figure img00390001
<tb>
<tb> Types <SEP> cellulaires
<tb> MCF-7/6 <SEP> LS-174T
<tb> Composés <SEP> testés <SEP> DOX <SEP> L-DOX <SEP> DOX <SEP> L-DOX
<tb> ( M) <SEP> ( M) <SEP> ( M) <SEP> ( M)
<tb> bêta-ALAL-Dox <SEP> 1,45 <SEP> 8,14 <SEP> 0,22 <SEP> 5,26 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 07 <SEP> 0,27 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP>
<tb> PEG350-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0,62 <SEP> 3,29 <SEP> 0,00 <SEP> 2,59 <SEP>
<tb> 0,02 <SEP> 0,28 <SEP> 0,14
<tb> PEG750-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0,19 <SEP> 1,62 <SEP> ~ <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 2,00 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0,12
<tb> PEG2000-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 1,31
<tb> 0,45 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP>
<tb> PEGsooo-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0,66 <SEP> ~ <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0,34 <SEP> ~
<tb> 0,45 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb>
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessus montrent que la réactivation des prodrogues et donc la libération des molécules actives (Leu-Dox + Doxorubicine) est inhibée d'autant plus que le poids moléculaire du PEG augmente. La PEGylation de la prodrogue de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) empêche sa réactivation par les peptidases tumorales. Cette inhibition est corrélée avec la taille du PEG. Les inventeurs ont émis l'hypothèse que cette inhibition est probablement la conséquence d'un phénomène d'encombrement stérique qui limite l'accessibilité du site de clivage.
Exemple 3 : Etude in vivo de la réactivation tumorale de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine
La réactivation tumorale in vivo de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) a été évaluée chez un modèle de souris athymique portant des xénogreffes de tumeurs de carcinome de colon humain LS- 174T.
Le tableau 3 ci-dessous représente la moyenne (obtenue sur 18 souris) des concentrations en Dox et Leu-Dox
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accumulées au niveau des tumeurs à 2 et 72 heures après l'injection du composé testé.
Tableau 3
Figure img00400001
<tb>
<tb> Concentrations <SEP> (nnmol/mg) <SEP> au
<tb> niveau <SEP> des <SEP> tumeurs <SEP> LS-174T
<tb> 2 <SEP> heures <SEP> 72 <SEP> heures
<tb> après <SEP> après
<tb> injection <SEP> injection
<tb> Composés <SEP> testés <SEP> DOX <SEP> Leu-DOX <SEP> DOX <SEP> Leu-DOX
<tb> PEG2000-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0,38 <SEP> ~ <SEP> 0,78 <SEP> 1,71 <SEP> 0,12 <SEP>
<tb> 0,14 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0,5 <SEP> 0,07
<tb> PEG2oooo-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0,76 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP>
<tb> 0,09 <SEP> 0,05 <SEP> 0,14 <SEP> 0,02
<tb> Su-bêta-ALAL-Dox <SEP> 1,93 <SEP> 4,64 <SEP> 5,41 <SEP> 0,05 <SEP>
<tb> 0,50 <SEP> 0,50 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0,02
<tb>
Le tableau ci-dessus montre que dans les deux cas,
Figure img00400002

le PEG2000-bêta-ALAL-Dox et le PEG2000-bêta-ALAL-Dox sont moins réactivés en Dox et Leu-Dox que le contrôle Su-bêtaALAL-Dox. La PEGylation de cette prodrogue de la Doxorubicine diminue donc sévèrement la réactivation au niveau des tumeurs.
Exemple 4 : Effet de l'insertion d'un espaceur sur la réactivation par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales de prodrogues PEGylées de la Doxorubicine
Des prodrogues de bêta-ALAL-Dox (20 uM) ont été incubées pendant 6 à 18 heures dans du milieu conditionné de cellules tumorales LS-174T ou LNCaP. La réactivation des prodrogues (libération de Doxorubicine et de Leu-Dox) a été mesurée par chromatographie HPLC.
Deux espaceurs ont été testés : - quatre résidus DSerine ((DSer)4)
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- insertion de résidus acide 6-aminohexanoïque (ou acide aminocaproïque qui est un acide aminé hydrophobe de plus grande longueur que la sérine), noté Ahx.
Le tableau 4 ci-dessous représente l'hydrolyse de la prodrogue Su-bêta-ALAL-Dox (contrôle) et des dérivés PEGylés de bêta-ALAL-Dox. Les résultats représentent les pourcentages de Doxorubicine et Leu-Doxorubicine libérées par rapport au contrôle (n=3).
Tableau 4
Figure img00410001
<tb>
<tb> Types <SEP> cellulaires
<tb> LS-174T <SEP> LNCaP <SEP>
<tb> Composés <SEP> testés <SEP> Dox <SEP> + <SEP> Leu-Dox <SEP> Dox <SEP> + <SEP> Leu-
<tb> (%) <SEP> Dox <SEP> (%)
<tb> Su-bêta-ALAL-Dox <SEP> 100,00 <SEP> 1,18 <SEP> 100
<tb> PEG200o-bêta-ALAL-Dox <SEP> Il,52 <SEP> ~ <SEP> 1,15 <SEP> 32
<tb> PEG2000- <SEP> (Ahx) <SEP> 3-bêta-ALAL-Dox <SEP> 10,14 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG2000- <SEP> (DSer) <SEP> 4-bêta-ALAL-Dox <SEP> 22,35 <SEP> ~ <SEP> 1,61 <SEP> 66
<tb> PEGsooo-bêta-ALAL-Dox <SEP> 1, <SEP> 98 <SEP> ~ <SEP> 0,29 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG5000-Ahx-bêta-ALAL-Dox <SEP> 3, <SEP> 07 <SEP> ~ <SEP> 0,20 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG5000- <SEP> (Ahx) <SEP> 2-bêta-ALAL-Dox <SEP> 1, <SEP> 29 <SEP> ~ <SEP> 0,49 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG20000-bêta-ALAL-Dox <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP> ~ <SEP> 0,40 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG20000- <SEP> (Ahx) <SEP> -bêta-ALAL-Dox <SEP> 0,49 <SEP> ~ <SEP> 0,20 <SEP> Non <SEP> testé
<tb> PEG20000- <SEP> (Ahx) <SEP> 2-bêta-ALAL-Dox <SEP> 1,43 <SEP> ~ <SEP> 0,34 <SEP> Non <SEP> testé
<tb>
Les résultats du tableau ci-dessus montrent à nouveau que l'hydrolyse des dérivés PEGylés diminue significativement par rapport à celle de la Su-bêta-ALAL-Dox.
L'insertion de quatre résidus D-sérine entre le PEG et bêta-ALAL-Dox augmente de deux fois la libération de la Doxorubicine et de Leu-Dox par rapport aux dérivés PEGylés avec un PEG2000 sans espaceur ou avec 3 résidus Ahx, après incubation des composés dans le milieu conditionné de cellules LS-174T
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L'insertion des résidus acide aminohexanoïque (acide aminé hydrophobe) n'augmente pas la réactivation des dérivés PEGylés de la prodrogue par rapport à aux dérivés sans espaceur.
Exemple 5 :Tests de cytotoxicité de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine
Les cellules tumorales MCF-7/6 ont été cultivées pendant 48 heures en milieu sérique contenant des concentrations croissantes de Doxorubicine, bêta-ALAL-Dox, PEG2000- bêta-ALAL-Dox, PEG2ooo-DSer-bêta-ALAL-Dox ou PEG2000- (DSer)4-bêta-ALAL-Dox. Elles sont ensuite post-incubées pendant 24 heures en présence de milieu sérique. La cytotoxicité des produits est estimée par un test de viabilité cellulaire (WST-1, Roche Molecular Diagnostic).
Les résultats de 3 expériences indépendantes sont présentés à la Figure 2.
Les valeurs d'ICso (concentration inhibitrice à 50%) de la Doxorubicine et du composé bêta-ALAL-Dox sont respectivement 0,045 M et 158,48 uM ce qui confirme le caractère de prodrogue de la bêta-ALAL-Dox. La comparaison des valeurs moyennes d'ICso obtenues pour les composés bêtaALAL-Dox et PEG2000-bêta-ALAL-Dox indiquent que la PEGylation inhibe la réactivation de la prodrogue puisque le PEG2000-bêtaALAL-Dox n'est pas cytotoxique jusqu'à une concentration de 500 uM. Les prodrogues comportant un espaceur moléculaire (DSer ou (DSer)4) entre le PEG et bêta-ALAL-Dox, (PEG2ooo-DSer- bêta-ALAL-Dox et PEG2000- (oser) 4-bêta-ALAL-Dox) sont cytotoxiques, et PEG2000- (DSer) 4-bêta-ALAL-Dox a même une activité identique (ICso = 251,19 uM) à celle de la prodrogue non PEGylée, bêta-ALAL-Dox.
Ces résultats montrent que l'insertion de 4 résidus Dsérine entre le PEG et la bêta-ALAL-Dox permet la
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réactivation de la prodrogue PEGylée. En revanche, la prodrogue PEGylée sans espaceur n'est pas réactivable.
Exemple 6 :Etude d'efficacité de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox
L'activité anti-tumorale de PEG2000- (DSer)4-ALAL-Dox a été testée sur un modèle de souris athymiques portant des xénogreffes ectopiques de tumeur humaine de type LS-174T.
Le PEG2000-(DSer)4-ALAL-Dox a été administré une première fois par i. v. bolus aux doses de 50 pmol/kg et 45 pmole/kg.
Une mortalité a été observée aux deux doses administrées.
Les doses administrées ont été diminuées à partir du jour 7 . Le PEG2000-(DSer)4-ALAL-Dox a été injecté à 35 pmol/kg et 25 umol/kg (1 fois par semaine pendant 3 semaines). Les autres composés ont été administrés par injection i. v. bolus une fois par semaine pendant 4 semaines (doxorubicine 6,69 et 8,6 umol/kg, Su-bêta-ALALDox 45 et 50 umol/kg).
La Figure 3 représente l'évolution de la moyenne des poids corporels en pourcent à partir du début du traitement en jour. A partir de la deuxième semaine, aucune perte de poids significative n'a été observée dans les groupes traités à la Doxorubicine et au PEG2000-(DSer)4-ALAL-Dox. Une légère perte de poids a été observée dans les groupes traités à la Su-bêta-ALAL-Dox. Dans ce dernier cas, la perte de poids maximale est de 10 % au jour 32 dans les deux groupes traités.
La Figure 4 représente l'évolution de la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV) des groupes de souris traités (T) par rapport au contrôle (C) (NaCl). Bien qu'administrés à des doses en dessous la dose maximale tolérée (MTD), tous les produits testés ont une activité antitumorale.
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Durant le traitement, il a été observé deux phases de croissance tumorale (Figure 5). Lors de la première phase de croissance, l'activité du PEG2000- (oSer) 4-ALAL-Dox (1 x 50 + 3 x 35 pmol/kg) est comparable à celle de la Doxorubicine (6,69 umol/kg) et est inférieure à celle de la Succinylbêta-ALAL-Dox (50 umol/kg). En revanche, lors de la deuxième phase de croissance, le PEG2000-(DSer)4-ALAL-Dox est plus actif que la Doxorubicine est aussi actif que la Subêta-ALAL-Dox. Globalement, il a été observé que les produits Su-bêta-ALAL-Dox (T/C min = 26,6% ; retard de croissance spécifique (SGD = 3,02) et PEG2000-(DSer)4-ALALDox (T/C min- 38% ; SGD = 1,58) sont plus actifs que la Doxorubicine.
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Claims (32)

REVENDICATIONS
1) Composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m, dans laquelle : - I est une substance d'intérêt active sur des cellules cibles, - A est un groupement augmentant le temps de demi-vie de B-I dans l'appareil circulatoire, - E-B est un groupe de liaison entre A et I, où : . B est une structure clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement à proximité ou au niveau desdites cellules cibles, . E est un groupe espaceur hydrophile, stable dans l'appareil circulatoire, qui éloigne A de B de façon à permettre ou faciliter le clivage de B à proximité ou au niveau desdites cellules cibles et ainsi permettre ou faciliter la libération de I ou la libération de I avec un reste de B, - n est un nombre entier compris entre 1 et soit le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, soit le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - m est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - p est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de I, sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, avec quand p = 1, n = m et quand m = 1, n = p.
2) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I est fixé directement à une ou plusieurs structures B par une liaison covalente.
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3) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I est fixé à une ou plusieurs structures B par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
4) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la taille de E est équivalente à de l'ordre de 1 à 100 acides aminés.
5) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend de 1 à 100, de préférence de 1 à 20 et tout préférentiellement de 2 à 10, acides aminés identiques ou différents, choisi(s) dans le groupe comprenant les acides aminés naturels en conformation D et les acides aminés non codés génétiquement.
6) Un composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le (s) dit (s) acide (s) aminé (s) est (sont) choisi (s) parmi la D-glutamine, la D-asparagine, la D-sérine, la Dhistidine, la D-thréonine, le D-acide aspartique, le D-acide glutamique, D-lysine, D-arginine.
7) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi : (D-sérine)x, (D-thréonine) où x est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 2 et 10, et tout préférentiellement entre 2 et 6.
8) Un composé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que E est un peptidomimétique, un pseudopeptide ou un peptoïde.
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9) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend au moins un groupement choisi parmi des chaînes alkyles substituées, polyalkylglycols, polysaccharides, polyols, polycarboxylates, poly(hydro)ester.
10) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille de E est d'autant plus importante que le poids moléculaire de A est important.
11) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend un ou plusieurs acides aminés selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 et au moins un groupement selon l'une des revendications 9 ou 10.
12) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A présente en outre des propriétés de solubilisation dans l'eau, le sang ou le sérum dudit composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m.
13) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A présente en outre des propriétés de ciblage dudit composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m vers lesdites cellules cibles.
14) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est en outre un agent à activité thérapeutique ou agent à activité diagnostique.
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15) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est hydrophile ou amphipatique.
16) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est choisi parmi les polypeptides, immunoglobulines, albumine, polysaccharides, polymères, copolymères.
17) Un composé selon la revendication 16, caractérisé en ce que A est choisi parmi un polyalkylène glycol, polyalkylène oxide, polyalkylène imine, des copolymères du chlorure de vinyle.
18) Un composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que A est choisi parmi un polyéthylène glycol, un polyéthylène oxide, un polyéthylène imine, le styrène sulfonate de sodium (NaSS), le maléate de sodium et de butyle (MMBE), le méthacrylate d'hydroxypropyle ou N-(2hydroxypropyl) méthacrylamide (HPMA), le méthacrylate de méthyle (MMA), le poly-[N-(2-hydroxyéthyl)-L-glutamine] (PHEG), le poly-[N-(hydroxyéthyl)-DL-aspartamide] (PHEA).
19) Un composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que A est un polyéthylène glycol d'une taille comprise en 200 et 50000 Da, de préférence entre 350 et 20000 Da et tout préférentiellement entre 1000 et 10000.
20) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est clivable sélectivement par une enzyme présente dans l'environnement des cellules choisies dans le groupe comprenant les cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules
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endothéliales néoangiogéniques des tumeurs et des métastases tumorales, macrophages, monocytes, lymphocytes ou polynucléaires infiltrants les tumeurs et les métastases tumorales.
21) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est choisi parmi les oligopeptides, oligosaccharides, les chaînes lipidiques.
22) Composé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la structure B est choisie parmi les séquences peptidiques suivantes : L-alanine-L-leucine-L-alanine-Lleucine, L-alanine-L-tyrosine-L-glycine-L-glycine-Lphenylalanine-L-leucine .
23) Un Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est clivable par une enzyme choisie dans le groupe comprenant les peptidases, les endopeptidases, les enzymes lysosomiales, les lipases, les glycosidases.
24) Un composé selon la revendication 23, caractérisé en ce que B est clivable par une peptidase sélectivement présente dans l'environnement des cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques, macrophages, monocytes, lymphocytes ou polynucléaires.
25) Un composé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la peptidase spécifique des cellules tumorales est choisie dans le groupe comprenant la Néprilysine (CD10), la Thimet oligopeptidase (TOP), le Prostate Spécifie Antigen (PSA), la plasmine, la légumaïne, les collagènases,
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l'urokinase, les cathepsines, les métallopeptidases de matrice.
26) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que I est choisi dans le groupe comprenant un agent chimique, un polypeptide, un acide nucléique, un antibiotique, un virus ou un marqueur, éventuellement couplé à une substance vectrice.
27) Un composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que I est un agent à activité thérapeutique antitumorale, anti-angiogénique ou anti-inflammatoire.
28) Un composé selon la revendication 27, caractérisé en ce que I est choisi dans le groupe comprenant les anthracyclines, la doxorubicine, la daunorubicine, les dérivés d'acide folique, les alcaloïdes vinca, la calichéamycine, le mitoxanthrone, la cytosine arabinoside, l'adénosine arabinoside, la fludarabine phosphate, le melphalan, les bléomycines, les mitomycines, la Lcanavanine, les taxoïdes, la camptothécine, l'hydrochlorure de 9-diméthylaminométhyle-hydroxy-camptothécine, les inhibiteurs du protéasome, les inhibiteurs de la farnesyltransférase (FTI), les épothilones, les maytansinoïdes, le discodermolide, la fostréicine, les dérivés du platine, les duocarmycines, la combretastatine, les épipodophyllotoxines, les peptides BH3, les peptides p53, les caspases, le granzyme B, les ribozymes, le facteur de nécrose tumoralealpha (TNF-alpha), l'interféron alpha (IFN-alpha), l'interféron gamma (IFN-gamma), l'interleukine 1 (IL-1), IL- 2, IL-6, les antagonistes de l'IGF-1.
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29) Composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que I est un marqueur choisi dans le groupe comprenant la coumarine, la 7-amido trifluoraméthyle coumarine, la paranitroanilide, la 8-naphtylamide et la 4-méthoxy naphtylamide, la fluoroscéine, la biotine, la rhodamine et leurs dérivés, les agents utilisés en scintigraphie.
30) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs substances de ciblage capables de vectoriser ledit composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m vers lesdites cellules cibles.
31) Un composé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la ou lesdites substance(s) de ciblage est (sont) couplée(s) au composé de formule (A)p-(E-B)n-(I)m au niveau d'un ou plusieurs groupements A.
32) Composition pharmaceutique, de diagnostic ou de traçage, caractérisée en ce quelle comprend en tant que principe actif au moins un composé selon quelconque des revendications 1 à 31.
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