FR2856069A1 - Molecules de ciblage et de liberation de composes therapeutiques et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage et la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées, un segment thérapeutique, comprenant le composé biologiquement actif, et un segment de liaison entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, le segment de liaison étant clivable sur le site cible. L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisation, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l'inflammation.
Description
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Molécules de ciblage et de libération de composés thérapeutiques et leur utilisation.
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage et la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées, un segment thérapeutique, comprenant le composé biologiquement actif, et un segment de liaison entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, le segment de liaison étant clivable sur le site cible. L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisations, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l'inflammation.
ETAT DE LA TECHNIQUE Les composés anti-tumoraux sont par principe des composés hautement cytotoxiques, qui sont distribués dans l'ensemble de l'organisme lorsqu'ils sont administrés de façon systémique. Ils produisent des réactions secondaires extrêmement préjudiciables à l'individu. Il y a donc un très grand intérêt à ne distribuer ces composés anti-tumoraux que dans les tissus tumoraux, c'est-à-dire à cibler ces tissus grâce à un vecteur spécifique. Bien que ce problème de toxicité des traitements soit particulièrement aiguë pour le cancer, il est généralisable à un grand nombre de traitements dans lesquels, de façon générale, un minimum d'effet secondaire est recherché pour un effet thérapeutique maximal.
Différents vecteurs ont été proposés et notamment des anticorps monoclonaux dirigés contre des marqueurs spécifiques de la surface des cellules cancéreuses. Ils produisent de
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fait des effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, mais l'amplitude de ces effets peut diminuer au cours du temps.
Un système appelé ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy) consiste en une thérapie dans laquelle un anticorps véhicule une enzyme au site tumoral. Ensuite, une prodrogue est administrée et convertie en molécule active par cette enzyme (US 5,760,072 ; US 5,433,955). Dans cette méthode, seule l'enzyme permettant l'activation de la prodrogue fait l'objet d'un ciblage. La pro-drogue est donc distribuée dans l'ensemble de l'organisme, ce qui n'exclut pas entièrement les réactions secondaires et diminue la dose de pro-drogue effectivement fournie au site tumoral. En outre, cette approche est complexe car requiert l'utilisation de plusieurs types de molécules. Une méthode analogue basée sur le ciblage de l'enzyme capable d'activer la pro-drogue a été décrite dans les demandes (W097/26918 ; WO 98/51787).
D'autre part, divers systèmes de liaison pour la fabrication de pro-drogues, avec une possibilité de ciblage, ont été décrits : par exemple, on trouve des liaisons sulfonamides (W098/00173), des liaisons clivables par la cathepsine B (W098/56425) et des liaisons cinnamates (US20020187992).
Cependant, il existe toujours un fort besoin de molécules ou approches thérapeutiques nontoxiques permettant un ciblage ainsi qu'une activation spécifique d'une pro-drogue à un site pathologique. Ce système permettrait de réduire la dose d'agent actif, d'améliorer l'efficacité, et de diminuer les effets secondaires.
EXPOSE DE L'INVENTION L'objet de la présente invention est de fournir des molécules capables de cibler des tissus présentant une pathologie et d'y libérer de façon spécifique des composés aux propriétés thérapeutiques pour cette pathologie. Grâce aux molécules de l'invention, les composés thérapeutiques exercent leur activité de manière localisée et plus efficace, et offrent des risques d'effets secondaires bien inférieurs.
Les molécules de l'invention peuvent être construites pour cibler différents types de cellules ou de tissus pathologiques, de préférence chez l'homme. Dans un mode préféré de
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mise en oeuvre, l'invention est basée sur le ciblage de cellules apoptotiques, grâce à un élément de ciblage ayant la propriété de se lier aux membranes cellulaires exprimant un lipide chargé négativement, en particulier la phosphatidylsérine (PS). L'apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un phénomène physiologique normal, caractéristique des organismes multicellulaires et présent en particulier chez l'homme. Dans les conditions normales, le taux d'apoptose est cependant faible et les cellules apoptotiques sont très vite phagocytées soit par les cellules voisines, soit le plus souvent par les cellules phagocytaires professionnelles comme les macrophages ou les cellules dendritiques. En outre, les sites apoptotiques sont souvent très dispersés et ne présentent aucune synchronisation. De ce fait, l'apoptose physiologique est généralement indétectable.
L'apoptose est signalée aux cellules phagocytaires par la présence de PS à la surface des cellules apoptotiques, résultant de la perte de l'asymétrie de leur membrane plasmique. La présence d'apoptose détectable est le signe d'un désordre physiologique où les fonctions phagocytaires sont débordées et incapables de faire face à l'accroissement des cellules à éliminer. Des exemples bien connus de tels désordres sont par exemple l'apoptose du muscle cardiaque après un infarctus ou l'apoptose hépatique à la suite d'une infection virale forte ou d'autres affections à caractère aigu. Des cellules en apoptose sont également présentes dans d'autres tissus ou mécanismes pathologiques, tels que l'inflammation et le cancer.
D'autre part, lorsque le tissu pathologique contient peu ou pas suffisamment de cellules cibles capables de retenir massivement les molécules thérapeutiques de l'invention, cellesci peuvent être utilisées en combinaison avec un agent ou un traitement causant ou favorisant l'apoptose au sein du tissu pathologique afin d'augmenter le bénéfice thérapeutique. Par exemple, certains tissu cancéreux jeune (e. g., de petite taille ou nonmétastasés) ne contiennent pas toujours une quantité importante de cellules en apoptose, compte tenu de leur division rapide. Dans ce cas, un agent favorisant l'apoptose (par exemple un anti-tumoral classique) peut être utilisé en combinaison avec les molécules de l'invention, du moins au début du traitement, pour augmenter l'efficacité thérapeutique.
L'avantage de cibler les cellules apoptotiques de l'environnement tumoral, plutôt que de cibler des marqueurs spécifiques de la surface des cellules tumorales (par exemple, grâce à des anticorps monoclonaux), réside dans l'effet cinétique lié à l'administration du composé
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anti-tumoral : dans le premier cas, l'action du composé thérapeutique, s'il est administré de façon continue, produit une augmentation de la cible et donc de la concentration effective dudit composé thérapeutique dans l'environnement tumoral alors que, dans le second cas, la taille de la cible a tendance à diminuer ainsi que la concentration effective du composé thérapeutique. Cet effet cumulatif résultant du ciblage des cellules apoptotiques est également très important pour le contrôle des étapes initiales de la métastase en maintenant une concentration optimale du composé thérapeutique dans les phases finales de régression de la tumeur. La diminution forte de la dose effective de composé anti-tumoral et sa forte localisation dans la région tumorale a bien sur aussi pour effet de réduire considérablement les effets toxiques secondaires sur le patient.
Les molécules de l'invention permettent donc de cibler différents tissus pathologiques et d'y libérer un agent thérapeutique ou biologiquement actif in situ, réduisant ainsi leur effets cytotoxiques indésirables sur les tissus sains.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des molécules chimères comprenant une région de ciblage, une région active et une région de liaison sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique. La région de ciblage est préférentiellement une région ciblant les cellules en apoptose. La région active peut être tout composé thérapeutique, typiquement anti-cancéreux ou anti-inflammatoire. Le composé thérapeutique est typiquement moins actif lorsqu'il est dans la forme d'une molécule chimère de l'invention, que sous une forme libre.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la préparation de médicaments. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. L'invention est utilisable notamment pour le traitement de tumeurs solides ou liquides ou hématopoiétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon, de la prostate, du cerveau, tête-et-cou, du foie, de la peau, le lymphome, le mélanome, etc. Lorsque le composé thérapeutique est un anti-inflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments destinés au
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traitement de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et l'arthrite.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée est un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ciavant.
Ces différents aspects de l'invention seront décrits plus en détails dans la suite du texte.
MOLECULE DE CIBLAGE ET DE LIBERATION DE COMPOSE THERAPEUTIQUE Comme indiqué précédemment, les molécule de l'invention comprennent typiquement trois parties ou domaines fonctionnels liés les uns aux autres, à savoir une région de ciblage (C), une région biologiquement active (A) et une région de liaison (L) sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique. L'agencement des différents éléments peut varier, et notamment selon l'ordre A-L-C ou C-L-A. D'autre part, dans certains modes de réalisation, la région (ou la fonction) L peut être insérée ou comprise au sein de l'une des régions A ou C.
De manière plus préférée :
1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence d'apoptose ;
1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence d'apoptose ;
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2) Le segment de liaison L est une molécule assurant la liaison entre A et C, ladite liaison étant clivable sur le site cible permettant la libération du segment thérapeutique A ;
3) La partie A est une molécule biologiquement active présentant des propriétés thérapeutiques.
3) La partie A est une molécule biologiquement active présentant des propriétés thérapeutiques.
Segment de Ciblage C Le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu présentant une pathologie, ou générées dans ce tissu par un traitement préalable ou combiné. Ce segment de ciblage C est de préférence capable de se lier aux membranes des cellules engagées dans un processus d'apoptose, celles-ci exposant à leur surface des lipides chargés négativement comme la phosphatidylsérine.
Dans un premier mode de réalisation préféré, la partie C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules tumorales ou présentes dans un tissu tumoral ou générées dans ces tissus par un traitement au moyen d'un agent favorisant l'apoptose, par exemple un anti-tumoral (chimiothérapie, radiothérapie, etc.).
Dans un autre mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules présentes dans un tissu inflammatoire et en particulier les cellules neutrophiles qui s'accumulent dans ces tissus et y meurent par apoptose 24 à 48 heures après leur arrivée. Les neutrophiles constituent des appâts pour les molécules de ciblage.
Le terme se lier préférentiellement indique que l'élément de ciblage possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou tissus ne peut être totalement exclue in vivo. La liaison préférentielle assure néanmoins un ciblage des molécules chimères de l'invention vers les sites pathologiques, réduisant la dissémination et les effets secondaires potentiels.
Le segment de ciblage C est de préférence une molécule peptidique. On entend par molécule peptidique toute molécule composée ou comprenant des acides aminés, naturels ou non, éventuellement modifiés, comme par exemple toute protéine ou fragment de
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protéine, un polypeptide ou peptide, naturels ou synthétiques, modifiés ou non. La propriété commune de ces éléments est de pouvoir se lier de manière préférentielle à des cellules caractéristiques de situations pathologiques et, dans un mode plus préféré, aux membranes cellulaires exposant des lipides chargés négativement, notamment la phosphatidylsérine. D'une façon générale, la présente invention prévoit l'utilisation de toute protéine, fragment ou dérivé de protéine répondant à ce critère.
Il existe plusieurs familles de protéines capables de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement. On peut citer notamment la famille des Annexines, les familles de protéines comportant un domaine Clou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine ; les familles de protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE ; encore les protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des (32-Glycoprotéines-I (ssGP-I). Ces protéines, ou des domaines issus ou dérivés de leurs séquences peuvent être utilisés comme élément de ciblage dans les molécules chimères de l'invention. Pour des raisons d'immunogénicité, on choisit de préférence la version humaine de ces protéines ou domaines de protéines. De plus, il convient chaque fois que cela est possible, de sélectionner et d'utiliser le plus petit domaine actif de ces protéines afin d'assurer la meilleure diffusion de la molécule au travers de la micro-vascularisation vers les tissus ciblés et surtout une meilleure biodistribution et élimination par la voie rénale.
Dans un mode de mise en #uvre particulier de la présente invention, l'élément de ciblage comprend une séquence peptidique dérivée des protéines ou fragments de protéines mentionnés plus haut. Ces dérivés présentent au moins 50 % d'identité avec les protéines initiales ou les fragments de celles-ci. De préférence, ils présentent 60 %, 75 %, 90 % ou 95 % d'identité. Certains des domaines de protéines mentionnés, notamment les domaines PH et FYVE, peuvent par ailleurs être mutés de façon à modifier leur spécificité lipidique pour les adapter aux besoins précis du ciblage de cellules en phase apoptotique.
Le segment de ciblage C peut contenir un ou plusieurs sites de liaison au segment L. La présence de plusieurs sites présente l'avantage de pouvoir distribuer plusieurs molécules thérapeutiques A en une seule fois et d'augmenter dans les mêmes proportions la concentration de A dans l'environnement des tissus touchés par la pathologie concernée.
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Dans un mode de réalisation particulier, la structure de la molécule selon la présente invention est alors : C-(L-A)n ou (A-L)n-C où n # (FI).
Dans un autre mode de réalisation, éventuellement combinable avec le précédent, le segment de ciblage C peut comprendre une répétition de plusieurs polypeptides ou motifs de liaison aux cellules pathologiques ou cibles (désignés CO), afin d'augmenter l'efficacité du ciblage. La formule générale de telles molécules est la suivante : (C0)m-(L-A)n ou (A-L)n-(C0)m (F2) où n et m sont, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 1.
Pour optimiser le comportement in vivo de la molécule thérapeutique, on choisit de préférence m et/ou n = 1 ou 2.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend la séquence d'une annexine, ou d'un fragment ou un dérivé de celle-ci. Le segment de ciblage C comprend de préférence la séquence du coeur à quatre domaines d'une protéine de la famille des annexines. De préférence, l'annexine est de type V, un fragment ou un dérivé de celle-ci. L'annexine d'origine humaine est privilégiée. De préférence, le segment de ciblage C comprend le domaine 1 de cette annexine.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend un domaine de type Clou C2, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine Cl d'un facteur de coagulation, un fragment ou un dérivé de celui-ci. De façon alternative, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine C2 du facteur VIII humain de la coagulation, un fragment ou un dérivé de celui-ci.
Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type CI. De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 1-8, de préférence SEQ ID Nos 2-4, et 6-8, ou un fragment de celui-ci.
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Domaine de type CI du facteur V humain de la coagulation - ClF5-S0 (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 1) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYV AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type CI du facteur V humain de la coagulation C1F5-S1 (SEQ ID No 2) DCRMPLGMST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWLQI DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC C1F5-S2 (SEQ ID No 3) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWWPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYVTEFYV AYSSNQINWQ IFKYNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP LVARYIRISP TRAYNRITLR LELQGC C1F5-S3 (SEQ ID No 4) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWLQI DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC Domaine de type CI du facteur VIII humain de la coagulation - CIF8-SO (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 5) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type CI du facteur VIII humain de la coagulation
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C1F8-S1 (SEQ ID No 6) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QYIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC C1F8-S2 (SEQ ID No 7) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGVKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRYNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC C1F8-S3 (SEQ ID No 8) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWWPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLLARYI RLHPTHYSIR STLRMEVMGC Dans un autre mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type C2. De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 9-16, de préférence SEQ ID Nos 10-12, et 14-16, ou un fragment de celui-ci.
Domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation - C2F5-SO (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 9) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEI DLLKIKKITA IITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation C2F5-S1 (SEQ ID No 10) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQPK ANNNKQWLEV DLLKIKKITA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PFRLKSSMVD KINEGNTNTK GHVKNFPNPP RISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY C2F5-S2 (SEQ ID No 11)
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CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEM DFLKIKKVTA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRQIP KTWNQSITLR LELYGCDIY C2F5-S3 (SEQ ID No 12) CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRLRLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWAEM DLLKIKKITA IITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IITRFIRVIP KTWNQSITIR LELFGCDIY Domaine de type C2 du facteur VIII humain de la coagulation - C2F8-SO (F- V) séquence sauvage (SEQ ID No 13) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur VIII humain de la coagulation C2F8-S1 (SEQ ID No 14) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKEWLQID LQKTMKITGI TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPVSW VHQIALRMEV LGC C2F8-S2 (SEQ ID No 15) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKQWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGFQDSFTPV VNSLDPPLLT IYLRIHPQSW VHQIALRMEV LEC C2F8-S3 (SEQ ID No 16) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV
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LEC Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de type domaine 5 des ss2-Glycoprotéines-I (ss2GP-I) (SEQ ID No 17). De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 17-22, de préférence SEQ ID Nos 18-22, ou un fragment de celui-ci.
Domaine 5 des /32-Glycoprotéines-I humaines - ss2GP-1 séquence sauvage (SEQ ID No 17) TKASCKVPVK KATVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKVSFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCFKEH SSLAFWKTDA SDVKPC Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante :
TJ2ASCKUPU9KJlU,2TUi4U1sU16JmGERU21Jz2U23QEKU2JZ8NGML H G D K U37 S F U40 C J42 N J44 E J46 J47 C J49 Y T D U54 Q C I D G T U61 E V P K C U67 J68 E H S J72 U73 U74 J75 J76 J77 T D A S D V J84 P C (SEQ ID No 18) (S4) où: J2 = K , D, E ; J11, J22, J28, J42, J44, J46, J47, J68, J77, J17 = Q, E ; J84 = K, R ; J49 = S,
T;J72=S,T,M;U7=L,V,I;U9=V,I,T;U12=A,M;U14,U15,U21,U23,U37= V, I, T ; U16, U27, U40 ,U67 = F, Y ; U54 = A, V, I; U61 = I, V, M ; U73, U74,U75,U76 = L, I, F, Y, M, W.
TJ2ASCKUPU9KJlU,2TUi4U1sU16JmGERU21Jz2U23QEKU2JZ8NGML H G D K U37 S F U40 C J42 N J44 E J46 J47 C J49 Y T D U54 Q C I D G T U61 E V P K C U67 J68 E H S J72 U73 U74 J75 J76 J77 T D A S D V J84 P C (SEQ ID No 18) (S4) où: J2 = K , D, E ; J11, J22, J28, J42, J44, J46, J47, J68, J77, J17 = Q, E ; J84 = K, R ; J49 = S,
T;J72=S,T,M;U7=L,V,I;U9=V,I,T;U12=A,M;U14,U15,U21,U23,U37= V, I, T ; U16, U27, U40 ,U67 = F, Y ; U54 = A, V, I; U61 = I, V, M ; U73, U74,U75,U76 = L, I, F, Y, M, W.
De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 19-22 ou un fragment de celui-ci : Polypeptides construits sur la base du domaine 5 des ss2-Glycoprotéines-I humaines GPI-S1 (SEQ ID No 19) TEASCKVPVK RATVVYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKVSFF CRNRERRCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYREH SMLTWWRTDA SDVKPC GPI-S2 (SEQ ID No 20) TEASCKLPTK RMTVVYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKISFF CRNRERRCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYREH SMITWWRTDA SDVKPC
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GPI-S3 (SEQ ID No 21) TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAWWKTDA SDVKPC GPI-S4 (SEQ ID No 22) TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAFWKTDA SDVKPC Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante :
J'.j2.j3.j4.j5~j67~,j8~j9~jlO~H~j)3.jl41S.Q~18~Q~j21~j23~j24~25~j26~j27~8~ U29~J30~J31~R~J33~J34~J3s~J36~B37~J38~J39~U40~J41~J42~J43~U44~J45~J46~J47~J48~J49~R~Jsl~Us2~Js3~ Js4~D-Us6~K-s-Zs9-L- J61- J6z~ J63-J64~Z6s- J66~ J67~U68-J69- J7o~ J71 ~U72-J73-J74~ J7s-J76 (S5) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V, - l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
J'.j2.j3.j4.j5~j67~,j8~j9~jlO~H~j)3.jl41S.Q~18~Q~j21~j23~j24~25~j26~j27~8~ U29~J30~J31~R~J33~J34~J3s~J36~B37~J38~J39~U40~J41~J42~J43~U44~J45~J46~J47~J48~J49~R~Jsl~Us2~Js3~ Js4~D-Us6~K-s-Zs9-L- J61- J6z~ J63-J64~Z6s- J66~ J67~U68-J69- J7o~ J71 ~U72-J73-J74~ J7s-J76 (S5) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V, - l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
De préférence, les acides aminés J peuvent être choisis indépendamment les uns des autres parmi l'ensemble des résidus A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, Orn, F, P, S, T, W, Y, et V, et de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T.
Différentes combinaisons de résidus U et B sont données dans le tableau 1 ci-dessous :
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Tableau 1
<tb>
<tb> U8 <SEP> U11 <SEP> U15 <SEP> U25 <SEP> U29 <SEP> B37 <SEP> U40 <SEP> U44 <SEP> U52 <SEP> U56 <SEP> U68 <SEP> U72
<tb> Ex <SEP> 1 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Ex <SEP> 2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L
<tb> Ex <SEP> 3 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V
<tb> Ex4 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex <SEP> 5 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> V <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F
<tb> Ex <SEP> 8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> ExlO <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> A <SEP> A
<tb> Exil <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb>
A titre d'exemple, le peptide de formule SIpeut être avantageusement une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID No 23-32.
<tb> U8 <SEP> U11 <SEP> U15 <SEP> U25 <SEP> U29 <SEP> B37 <SEP> U40 <SEP> U44 <SEP> U52 <SEP> U56 <SEP> U68 <SEP> U72
<tb> Ex <SEP> 1 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Ex <SEP> 2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L
<tb> Ex <SEP> 3 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V
<tb> Ex4 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
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<tb> Ex6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F
<tb> Ex <SEP> 8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
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<tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb>
A titre d'exemple, le peptide de formule SIpeut être avantageusement une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID No 23-32.
La séquence SIreprésente un type de peptides dans sa forme la plus courte. Il est bien entendu que cette séquence peut comprendre en outre un ou plusieurs acides aminés supplémentaire à l'une ou l'autre des extrémités, par exemple de 1 à 15 acides aminés, en général de 1 à 10 acides aminés pour obtenir une fonctionnalisation supplémentaire. Par exemple, une petite séquence, dite de fonctionnalisation, peut être liée au peptide permettant la fixation au segment L. Cette séquence de fonctionnalisation peut être située à l'extrémité N-terminale de la séquence SI. Elle peut être d'environ 3 acides aminés choisis de préférence parmi G-S-C-, G-S-T-, G-S-P-, G-S-S-, G-S-G-, et G-S-Q-. Elle peut être également d'environ 4 acides aminés, choisis de préférence parmi les séquences G-S-AaC-, G-C-Aa-S-, G-S-Aa-S-, G-C-Aa-C-, et G-C-Aa-S- où Aa est un acide aminé quelconque.
Ces séquences de fonctionnalisation sont avantageuses en ce qu'elles permettent en particulier le marquage aisé par des radio-traceurs comme le 99mTc ou le 18F et permettent, par injection chez l'homme à dose traceuse, de suivre parfaitement in vivo le devenir du médicament, sa bio-distribution et de contrôler sa bonne localisation.
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Par ailleurs la séquence SIpeut être dupliquée au sein d'un même peptide pour produire une molécule présentant une affinité encore plus élevée pour les sites apoptotiques.
Segment de Liaison L Le segment L est une molécule de liaison clivable sur le site cible, et reliant la partie A et la partie C. Le segment L peut être toute molécule ou liaison chimique, de type covalent, y compris des molécules en partie ou totalement de nature peptidique, modifiée ou non, naturelle ou non. Le segment L contient avantageusement une fonction chimique reconnue et clivable dans l'environnement du tissu ou des cellules pathologiques, par exemple par une enzyme ou un ensemble d'enzymes spécifiques de l'environnement des cellules ciblées.
La présence, entre les parties A et C, du segment de liaison L clivable préférentiellement dans l'environnement des cellules ciblées permet une libération locale et ciblée du principe actif et confère aux molécule de l'invention un comportement de type pro-drogue ciblée.
En effet, la molécule est peu active tant qu'elle ne réside pas dans l'environnement des cellules ciblées possédant les enzymes ou autres facteurs de clivage.
Le segment de liaison L peut être simple ou ramifié. L'intérêt d'une ramification est de pouvoir amener et distribuer plusieurs molécules thérapeutiques avec une seule molécule de ciblage C. Dans ce mode de mise en #uvre, la structure générale du segment de liaison est donc L = D(LO)n, où D est un élément de ramification, n est un nombre entier égal ou supérieur à 1 (correspondant au nombre de bras que comporte la ramification), et LO est le lien proprement dit.
Il en découle que le composé faisant l'objet de la présente invention possède l'une des deux formules générales suivantes selon l'ordre dans lequel se succèdent les différentes parties :
C-D-(L0-A)n (F4A) (A-LO)n-D-C (F4B)
C-D-(L0-A)n (F4A) (A-LO)n-D-C (F4B)
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Le segment L (ou LO) peut être de nature variée, comme une liaison ou molécule chimique, et en particulier de nature peptidique.
Dans un mode de mise en #uvre préféré, le segment L est un lien peptidique clivable sensible aux protéases (ou autres enzymes), dénommées dans la suite du texte protéases intervenantes , plus spécifiquement sur-exprimées soit à la surface des cellules présentant la pathologie, soit libérées dans l'environnement des cellules ciblées, soit encore libérées par les cellules en phase apoptotique.
Les cellules tumorales et inflammatoires, ainsi que, par exemple, les cellules stromales recrutées dans l'environnement de celles-ci, sont connues pour excréter une variété de protéases intervenantes, en particulier des métallo-protéases de la matrice extra-cellulaire (MMP), des urokinases, les protéases spécifiques du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs (ADAM), etc. Des exemple de séquences clivées par ces protéases sont données dans le Tableau 2. Ces protéases intervenantes jouent un rôle important dans l'évolution de la tumeur ou du tissu inflammatoire et notamment dans l'envahissement des tissus environnants et la formation de métastases, ou l'envahissement par les cellules spécialisées de réaction inflammatoire. Par exemple, le taux de MMP dans l'environnement tumoral ou inflammatoire est bien supérieur à celui présent dans un tissu normal car, en particulier, le contrôle de l'expression de ces MMP dépend de l'action de certaines cytokines. Il donc possible de mettre à profit ce différentiel d'expression pour amplifier le principe du ciblage du composé anti-tumoral ou antiinflammatoire en ne permettant l'activation de ce composé qu'aux sites de ciblage. Des pro-drogues simples ont déjà été conçues mais elle ne résolvent pas le problème de la distribution uniforme du médicament dans l'ensemble de l'organisme car il n'y a pas d'accumulation de la pro-drogue au sein du tissu cancéreux ou inflammatoire. Au contraire, dans la présente invention, on propose un moyen d'accumuler le principe antitumoral ou anti-inflammatoire uniquement dans le tissu tumoral ou inflammatoire comportant déjà des cellules en voie d'apoptose, et de rendre actif le médicament essentiellement dans ce tissu. Autrement dit, l'ensemble C-L ou L-C constitue un système de vectorisation-activation de composés anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. Cet ensemble répond donc au double impératif suivant : réduire la concentration effective moyenne du médicament dans l'organisme, c'est à dire réduire les effets toxiques
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secondaires, et restreindre l'action du médicament au seul tissu intéressant, c'est à dire augmenter son efficacité.
Le segment de liaison clivable L (ou LO) est donc un lien au moins partiellement peptidique comportant une séquence reconnue et clivée par une protéase intervenante majoritairement présente dans le tissu ciblé. Le lien L ou LO peut donc être représenté comme comprenant deux parties, L1-L2, conçues de telle sorte que les protéases intervenantes clivent la liaison peptidique du lien entre L1 et L2 et que la molécule libérée L2-A ou A-L1, selon les molécules choisies, soit une molécule active au plan thérapeutique, de préférence au moins autant que la molécule initiale A. La longueur des parties Ll et L2 peut être optimisée en fonction de l'accessibilité nécessaire au site actif des protéases intervenantes, avec la contrainte de limiter autant qu'il se peut la taille finale de la molécule finale pour les raisons évoquées plus haut. Pour tenir compte de toutes les possibilités associées à la structure finale du composé thérapeutique, A-L-C ou C-L-A, la structure la plus générale proposée pour le lien L est la suivante :
L = D-(L1-L2)n (F5A)
L = (L1-L2)n-D (F5B) où D, Ll, L2 et n ont la définition donnée plus haut.
L = D-(L1-L2)n (F5A)
L = (L1-L2)n-D (F5B) où D, Ll, L2 et n ont la définition donnée plus haut.
La liaison entre les différents éléments fonctionnels des molécules de l'invention peut être réalisée par toute méthode de couplage chimique, enzymatique ou génétique connue en soi de l'homme du métier. Ainsi, il peut s'agir de liaisons chimiques, peptidiques, nucléiques, etc. Les groupements peuvent être couplés entre-eux par des liaisons maléimides, succinimide, intéine, biotine, amine, amide, carboxyliques, phosphate, ester, éther, etc.
Dans une variante de l'invention, le lien L est lié à la molécule C (et/ou A) par un groupe maléimide, connu pour sa réaction rapide et totale avec un groupe thiol porté par un résidu cystéine accessible du segment de ciblage C (et/ou de la molécule A).
Dans une autre variante, le lien L est lié à la molécule C (et/ou A) par réaction du groupe carboxylique terminal du peptide L avec un groupe amino porté par le segment thérapeutique A (ou de ciblage C).
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Dans une autre variante de réalisation, le segment de liaison L est couplé à l'extrémité Cterminale (dans le cas d'une molécule H2N-L-A) ou N-terminale (dans le cas d'une molécule A-L-COOH) du segment C au moyen d'une intéine. L'intérêt de ce mode de construction de la molécule finale, par rapport au mode précédant utilisant une liaison par groupe maléimide, est qu'il préserve la possibilité de disposer d'une cystéine libre dans la molécule, pour une autre fonctionalisation ou pour un radio-marquage éventuel pour le suivi du médicament. Il y a en effet un grand intérêt thérapeutique à pouvoir suivre et contrôler au moyen de l'imagerie la bio-distribution et la cinétique de cette bio-distribution pour ce type de médicament ciblé.
Dans certains modes de réalisation, le segment L (ou la fonction de clivage) fait partie de l'élément C ou A. Il peut s'agir par exemple d'une extension N-terminale ou C-terminale du segment C ou A, notamment lorsque ce dernier est de nature peptidique.
Les molécules de l'invention peuvent être assemblées en une ou plusieurs étapes, selon les techniques de couplage mises en #uvre. Ainsi, une molécule de type C-L peut être réalisée dans un premier temps, puis couplée avec une ou plusieurs molécules thérapeutiques A.
Alternativement, lorsque les liaisons entre les segments fonctionnels font appel à des réactions chimiques différentes, une synthèse ou un assemblage simultanée sont possibles.
Etant donnée la taille du segment de liaison (généralement de environ cinq à environ vingt résidus, pour un segment de nature peptidique), la version purement peptidique du lien L est de préférence obtenue par synthèse directe, en utilisant notamment les synthétiseurs de peptides courants et les méthodes classiques de synthèse, notamment en phase solide.
L'avantage de la synthèse directe du lien est qu'elle autorise l'utilisation de résidus aminoacides non naturels permettant ainsi une meilleure adaptation de la séquence aux protéases intervenantes. Cette séquence de reconnaissance peut en outre être modifiée par rapport à la séquence naturelle de reconnaissance par une enzyme ou un facteur de clivage, par exemple pour lui conférer une meilleure affinité ou spécificité envers la protéase en question.
La longueur du segment de liaison peut être adaptée par l'homme du métier en fonction des besoins et de la nature des segments C et A. De manière générale, on utilise un segment de liaison assez court et essentiellement non immunogène. Il s'agit typiquement
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d'un segment de nature peptidique comprenant de 3 à 20 résidus d'acides aminés, de préférence de 3 à 15, encore plus préférentiellement de 4 à 12. Dans certains cas, comme indiqué ci-après, il peut être intéressant de modifier la longueur du segment L, notamment pour éloigner la partie peptidique du segment C ou A, ou pour créer des molécules à fonction particulière (pénétration dans la cellule, action sur cellules voisines, etc.).
Ainsi, il peut y avoir avantage à ce que le lien L ou LO contienne une partie d'espacement pour éloigner le site de clivage (et la partie peptidique) du segment de ciblage C. Dans ce cas L ou LO peut prendre l'une des deux structures suivantes : L'1-L"1-L2 (F6A) L1-L"2-L'2 (F6B) où, dans l'un et l'autre cas : - L'1est un groupe d'espacement non-peptidique et L"l la partie peptidique proprement dite; - L'2 est un groupe d'espacement non-peptidique et L"2 la partie peptidique proprement dite.
Le groupe d'espacement non peptidique peut être choisi parmi toute molécule chimique synthétique, de préférence stable chimiquement et peu immunogène. Il peut s'agir notamment d'un polymère, par exemple de type polyoxyéthylène, dextran, polyéthylèneimine, etc. Un exemple préféré est le polyoxyéthylène, fonctionnalisé ou non. Dans les formules ci-dessus, L" 1-L2 et Ll-L"2 peuvent représenter le même peptide. Par ailleurs, le nombre de résidus des segments peptidiques L"1-L2 ou L1-L"2 peut varier de quatre à plus de vingt, la valeur optimale étant de l'ordre de six.
Dans un exemple particulier de mise en oeuvre, le segment de liaison clivable répond à la formule suivante :
L (ou LO) = -(CH2-CH2-0)m-(CH2)n-CO-L"l -L2 (F7A)
L (ou LO) = L1-L''2-NH-(CH2)n -(OCH2-CH2)m- (F7B) où m est un nombre entier supérieur ou égal à 0 et L"l et L"2 un peptide dont la séquence comprend au mois un site de clivage par une des protéases généralement présentes dans l'environnement ciblé. On notera que L"1-L2 et Ll-L"2 peuvent représenter le même peptide. Le nombre de résidus des segments peptidiques L' ' 1 -L2 ou Ll-L"2 peut varier de quatre à plus de vingt, la valeur optimale étant de l'ordre de six.
L (ou LO) = -(CH2-CH2-0)m-(CH2)n-CO-L"l -L2 (F7A)
L (ou LO) = L1-L''2-NH-(CH2)n -(OCH2-CH2)m- (F7B) où m est un nombre entier supérieur ou égal à 0 et L"l et L"2 un peptide dont la séquence comprend au mois un site de clivage par une des protéases généralement présentes dans l'environnement ciblé. On notera que L"1-L2 et Ll-L"2 peuvent représenter le même peptide. Le nombre de résidus des segments peptidiques L' ' 1 -L2 ou Ll-L"2 peut varier de quatre à plus de vingt, la valeur optimale étant de l'ordre de six.
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On présente dans les exemples suivants un ensemble de séquences peptidiques pour L" 1 L2 ou L1-L"2 répondant aux divers critères donnés dans l'ensemble du texte qui précède :
J-n--J0-B1-B2-J3-Jc (S6) où : * J-n--J0-B1représente indifféremment les segments L"1 et Ll ; * B2-J3--Jc représente indifféremment les segments L2 et L"2 ; * la liaison peptidique B1-B2 est la liaison clivée par les protéases intervenantes.
J-n--J0-B1-B2-J3-Jc (S6) où : * J-n--J0-B1représente indifféremment les segments L"1 et Ll ; * B2-J3--Jc représente indifféremment les segments L2 et L"2 ; * la liaison peptidique B1-B2 est la liaison clivée par les protéases intervenantes.
* n et c peuvent varier de 0 à environ 10 et dépendent de l'extrémité choisie pour la liaison au segment A ; l'extrémité liée à A, la valeur de n ou c sera faible et de préférence égale à 0 (J3 seulement présent) et pour l'extrémité opposée la valeur de n ou c n'est pas limitée et les résidus correspondants seront choisis en fonction de la spécificité des protéases intervenantes ciblées.
Le tableau suivant donne un exemple d'ensemble de séquences B1-B2 reconnues et clivées par les différentes protéases intervenantes et utilisables préférablement pour un segment L clivable :
Tableau 2
Tableau 2
<tb>
<tb> B1 <SEP> B2 <SEP> Exemple <SEP> de <SEP> protéase <SEP> concernée
<tb> Val/Ala/Leu/Met <SEP> X <SEP> Elastase <SEP> des <SEP> neutrophiles
<tb> Leu/Tyr/Phe <SEP> X <SEP> Cathepsine <SEP> G
<tb> Ala <SEP> Leu
<tb> Leu <SEP> Val <SEP> Protéinase <SEP> 3 <SEP> (neutrophiles)
<tb> Val <SEP> Cys
<tb> Gly <SEP> Leu/Ile <SEP> Collagénases <SEP> : <SEP> MMP-1, <SEP> -2,-8, <SEP> -9, <SEP> -13
<tb> Gly <SEP> Val <SEP> MMP2, <SEP> MMP-9
<tb> Gly/Ala/Asn/Glu/ <SEP> Hydrophobes <SEP> MMP-3
<tb> Gln/Pro/Arg/His/Asn <SEP> naturels <SEP> ou <SEP> non
<tb> Polaires <SEP> : <SEP> Hydrophobes
<tb> Arg/Asp/Glu/Gln/Thr/Asn <SEP> Hydrophobes <SEP> MMP-7
<tb> Hydrophobe: <SEP> Ala
<tb> Ala <SEP> Val <SEP> ADAM
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> ADAM-17 <SEP> (TACE) <SEP>
<tb> Ar <SEP> Phe
<tb>
Les séquences J-1-J0 et J3-J4 qui encadrent le site de clivage B1-B2 interviennent dans les interactions du lien avec la protéase visée et donc sur la vitesse de la réaction enzymatique de coupure de la liaison B1-B2. Les résidus J-1, Jo, J3 et J4 de S5 seront avantageusement choisis dans les ensembles suivants :
<tb> B1 <SEP> B2 <SEP> Exemple <SEP> de <SEP> protéase <SEP> concernée
<tb> Val/Ala/Leu/Met <SEP> X <SEP> Elastase <SEP> des <SEP> neutrophiles
<tb> Leu/Tyr/Phe <SEP> X <SEP> Cathepsine <SEP> G
<tb> Ala <SEP> Leu
<tb> Leu <SEP> Val <SEP> Protéinase <SEP> 3 <SEP> (neutrophiles)
<tb> Val <SEP> Cys
<tb> Gly <SEP> Leu/Ile <SEP> Collagénases <SEP> : <SEP> MMP-1, <SEP> -2,-8, <SEP> -9, <SEP> -13
<tb> Gly <SEP> Val <SEP> MMP2, <SEP> MMP-9
<tb> Gly/Ala/Asn/Glu/ <SEP> Hydrophobes <SEP> MMP-3
<tb> Gln/Pro/Arg/His/Asn <SEP> naturels <SEP> ou <SEP> non
<tb> Polaires <SEP> : <SEP> Hydrophobes
<tb> Arg/Asp/Glu/Gln/Thr/Asn <SEP> Hydrophobes <SEP> MMP-7
<tb> Hydrophobe: <SEP> Ala
<tb> Ala <SEP> Val <SEP> ADAM
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> ADAM-17 <SEP> (TACE) <SEP>
<tb> Ar <SEP> Phe
<tb>
Les séquences J-1-J0 et J3-J4 qui encadrent le site de clivage B1-B2 interviennent dans les interactions du lien avec la protéase visée et donc sur la vitesse de la réaction enzymatique de coupure de la liaison B1-B2. Les résidus J-1, Jo, J3 et J4 de S5 seront avantageusement choisis dans les ensembles suivants :
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J-1= résidu polaire de préférence Jo = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe et tout résidu aminoacide non naturel hydrophobe.
J3 = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe J4 = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe ou tout résidu non-naturel hydrophobe ou absent Les autres résidus, J-2--J-n et J5--Jc peuvent être n'importe quel résidu aminoacide naturel ou non naturel selon les besoins.
D'autre part, la longueur et/ou les propriétés du segment de liaison peuvent être ajustées, par exemple pour construire une molécule permettant au composé thérapeutique A d'interagir avec ou de pénétrer dans une cellule voisine de la cellule cible sur laquelle le segment C la conduit. Dans ce cas, par exemple, le segment de liaison L: - doit être suffisamment long pour atteindre les cellules voisines. Pour ce type de lien on choisit de préférence un oligomère chimique, par exemple de type polyoxyéthylène, comprenant un nombre suffisant de monomères pour que la longueur du lien soit d'environ 80 à 200 angstrôm, typiquement de 130 à
150 angstrôm; et/ou - comprend un domaine permettant ou facilitant le passage de A dans la membrane cellulaire et, le cas échéant, une région de clivage sensible aux enzymes intra-cellulaires.
150 angstrôm; et/ou - comprend un domaine permettant ou facilitant le passage de A dans la membrane cellulaire et, le cas échéant, une région de clivage sensible aux enzymes intra-cellulaires.
Dans ce mode de réalisation, le lien possède avantageusement l'une des deux structures suivantes :
L ou LO = LE-LTM-L3-A (F9A)
L ou LO = A-L3-LMT-LE (F9B) où LE est une partie essentiellement extracellulaire du lien, LTM une partie transmembranaire et L3 une fonction ou un élément clivable par les protéases ou les estérases intra-cellulaires (e. g., cytosoliques).
L ou LO = LE-LTM-L3-A (F9A)
L ou LO = A-L3-LMT-LE (F9B) où LE est une partie essentiellement extracellulaire du lien, LTM une partie transmembranaire et L3 une fonction ou un élément clivable par les protéases ou les estérases intra-cellulaires (e. g., cytosoliques).
La partie LE est préférentiellement suffisamment hydrophile pour permettre une solvatation convenable en milieu aqueux afin d'obtenir une structure suffisamment étendue.
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La partie LTM, d'une longueur au moins égale à environ 40 , être préférentiellement suffisamment amphiphile pour que, d'une part, sa structure dans le milieu aqueux extracellulaire reste faiblement compacte et que, d'autre part, elle puisse traverser le milieu hydrophobe de la membrane plasmique.
La composition chimique de LE et LMT pourra par exemple être la suivante : LE = -[O-(CH2)p-O]- (F10) LMT = -[O-(CH2)q-O]- (Fil) où q et p sont des nombres entiers différents de 0, q > p de telle sorte que, pour LMT, l'environnement lipidique de la membrane soit au plan énergétique plus favorable que l'environnement aqueux. Les valeurs p = 2 et 5 # q # 3 sont préférables.
Comme indiqué précédemment, l'élément de ciblage peut être synthétisé par des techniques connues en soi de la chimie ou de la biologie. L'élément C-L constitue par ailleurs un objet particulier de l'invention.
Segment Thérapeutique A L'invention peut être mise en #uvre avec tout type de molécule thérapeutique susceptible d'être associé au segment C. Il peut s'agir de composés chimiques, de médicaments, petites molécules, etc. ) de composés peptidiques, nucléiques, lipidiques, etc.
D'une façon générale, le segment thérapeutique A est une molécule présentant une activité biologique. De préférence, cette activité biologique est réduite (ou inexistante) lorsque le segment thérapeutique est lié aux segments de liaison L et de ciblage C. De ce fait, l'activité biologique s'exprime surtout dans l'environnement des tissus pathologiques, après ciblage et clivage in vivo.
Les composés thérapeutiques peuvent avoir des propriétés variées, dans des domaines thérapeutiques variés. Il peut s'agir de médicaments déjà connus, ou de molécules nouvelles ou en développement. Il peut s'agir de composés dont le mode d'action implique une pénétration dans les cellules ou dont l'action implique uniquement une interaction à la surface de la membrane plasmique. Les composés A préférés de l'invention sont des antitumoraux ou anti-inflammatoires.
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Composés anti-tumoraux Dans un mode de réalisation particulier, la molécule biologiquement active présente des propriétés anti-tumorales. A peut être n'importe quelle molécule anti-tumorale ou un dérivé actif de ces mêmes molécules. La seule contrainte est que ces composés antitumoraux puissent être liés chimiquement au reste de la molécule de vectorisation.
Comme il a été décrit plus haut, A peut être libérée dans le milieu extra-cellulaire et diffuser de façon passive ou active à l'intérieur des cellules voisines ou bien être amenée dans ces cellules par un lien du type LE-LMT puis libérée par l'action de protéases ou estérases endogènes.
Un exemple de composé anti-tumoral est constitué par les molécules de la famille des antracyclines et de leurs dérivés.
Ces molécules d'antracycline comportent un sucre aminé. Le groupe amino est avantageusement utilisé pour la liaison au segment L (par exemple à la partie L2 ou LMT) du lien défini plus haut.
Un autre exemple de composé anti-tumoral est constitué par les molécules de la famille des TNF[alpha] ou dérivés de ceux-ci. Ces molécules agissent sur des récepteurs de surface des cellules et induisent l'apoptose.
Parmi les molécules de la famille des TNFa, le facteur TRAIL ou Apo2L (P~W 19777) est probablement le plus intéressant dans la mesure où les cellules normales semblent protégées de son action alors que les cellules tumorales y sont sensibles et peuvent être sélectivement éliminées par l'action de cette cytokine pro-apoptotique. Ce facteur peu donc être très utile dans les cancers dit solides ce qui implique un ciblage efficace pour éviter au maximum les effets secondaires dus à la présence de ces molécules dans le milieu sanguin. Comme toutes les molécules de la famille du TNF, TRAIL est initialement une protéine membranaire associée en trimère et seule la partie extracellulaire est active. Cette partie extracellulaire, TRAIL-Do, ou un ensemble contenant TRAIL-Do, peut donc être ciblé grâce au segment C et libéré dans l'espace inter-cellulaire grâce à l'action des
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protéases intervenantes sur le lien clivable L qui relie C et TRAIL-Do. La molécule thérapeutique ainsi constituée possède la structure suivante :
C-L' 1 -L" 1 -L2-( TRAIL-Do) (selon la formule F6A) (TRAIL-Do)-Ll-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) Un avantage de l'une ou l'autre de ces dispositions est que l'assemblage en trimère des molécules de la famille des TNF, nécessaire à la liaison à leurs récepteurs, est gêné par la présence des segments de ciblage et de liaison. Ainsi la molécule reste faiblement active tant que le lien n'est pas clivé par une protéase intervenante. Pour bénéficier de cet avantage particulier il faut que le lien clivable ait une longueur suffisamment faible tout en conservant une accessibilité convenable aux protéases intervenantes.
C-L' 1 -L" 1 -L2-( TRAIL-Do) (selon la formule F6A) (TRAIL-Do)-Ll-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) Un avantage de l'une ou l'autre de ces dispositions est que l'assemblage en trimère des molécules de la famille des TNF, nécessaire à la liaison à leurs récepteurs, est gêné par la présence des segments de ciblage et de liaison. Ainsi la molécule reste faiblement active tant que le lien n'est pas clivé par une protéase intervenante. Pour bénéficier de cet avantage particulier il faut que le lien clivable ait une longueur suffisamment faible tout en conservant une accessibilité convenable aux protéases intervenantes.
Un autre exemple de cytokine, très intéressante pour le traitement de certains cancers et notamment le mélanome et le gliome intracrânien, est l'Interleukine-4 (IL4,1310839).
Malheureusement, étant donnés ses effets secondaires importants, cette protéine ne peut pas être utilisée sans être convenablement ciblée. La liaison à un segment de ciblage C de l'IL4 humaine ou de l'une de ses isoformes ou encore d'un ensemble contenant l'une de ces protéines, par l'intermédiaire d'un segment clivable permet de constituer une molécule thérapeutique intéressante en oncologie :
C-L' 1 -L" 1 -L2-(IL4) (selon la formule F6A) (IL4)-L1-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) D'autres exemples de composés anti-tumoraux sont notamment : a) Le méthotrexate :
C-L' 1 -L" 1 -L2-(IL4) (selon la formule F6A) (IL4)-L1-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) D'autres exemples de composés anti-tumoraux sont notamment : a) Le méthotrexate :
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Le méthotrexate est un composé anti-tumoral couramment utilisé pour le traitement des tumeurs cancéreuses. Il s'agit d'un analogue de l'acide folique qui agit d'abord comme un faux substrat en inhibant la déhydrofolate réductase (DHFR). Il agit aussi par inhibition indirecte de la thymidilate synthétase (TS).
Le méthotrexate contient un aminoacide, l'acide glutamique, qui peut être inséré dans l'extrémité N-terminale d'un peptide de lien clivable selon la formule (F6B) ou (F4B). b) Le méthoxyestradiol Le 2-méthoxyestradiol (1,3,5 (10)-oestratriène-2,3,17p-triol 2-méthyl ether) appelé 2ME2, est un sous-produit du métabolisme des #strogènes ayant la propriété de bloquer la croissance des cellules endothéliales en division rapide et des cellules tumorales. c) les taxanes : Les molécules de cette famille ont pour effet le blocage du cycle cellulaire en G2 et M par leur action sur les cytosquelette microtubulaire. Il en résulte une inhibition de la réorganisation normale nécessaire au déroulement de l'interphase de la mitose.
Les taxanes, et particulièrement le docetaxel, comportent des fonctions utilisables pour des modifications permettant son incorporation à l'extrémité d'un peptide clivable par les protéases intervenantes de l'environnement tumoral.
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LES TAXANES d) les antipyrimidines sucre modifies : La cytosine arabinoside (Ara-C) ou cytarabine ou Aracytine est le représentant principal de cette famille. D'autres molécules de cette famille sont la difluoro-déoxy-cytidine (Gemcitabine). e) Les agents alkylants : Dérivés des moutardes à l'azote , ces agents ont donné naissance à divers composés anti-tumoraux agissant sur les acides nucléiques et donc dans l'espace intra-cellulaire. Il s'agit en particulier le Melphalan et le Chlorambucil, deux agents alkylants bifonctionnels intéressant pour liaison aisée à un lien peptidique clivable.
Le Melphalan est la Phenylalanine-Moutarde (L-PAM) est aminoacide non naturel qui peut être introduit facilement au début ou à la fin de la synthèse peptidique d'un lien clivable par protéases intervenantes :
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Le Chlorambucil ne comporte qu'une fonction carboxylique et ne pourra être introduit directement dans un peptide qu'en fin de synthèse du lien peptidique clivable par les protéases intervenantes et à l'extrémité N-terminale.
Par l'utilisation d'un segment de lien bivalent comme l'éthanolamine ou le diamino- éthane, ce composé pourra aussi être introduit à l'extrémité C-terminale du lien peptidique clivable.
Dans les deux cas la molécule libérée dans l'environnement tumoral est un dérivé aminoacide hydrophobe comme par exemple le Leu-Melphalan ou le Chlorambucil-Leu.
Ces composés peuvent traverser facilement de façon passive la membrane plasmique des cellules tumorales et agir sur les acides nucléiques soit directement puisque la fonction alkylante n'est pas modifiée soit après clivage de l'aminoacide supplémentaire par les peptidases ou estérases endogènes.
Composés anti-inflammatoires Dans un autre mode de réalisation particulier, la molécule biologiquement active présente des propriétés anti-inflammatoires.
Libération de peptides dérivés du segment N-terminal de l'annexine I.
Un exemple de tels composés est un peptide, nommé ici NTA1, aux propriétés antiinflammatoires identique à ou dérivé du segment N-terminal de l'annexine I. Les propriétés anti-inflammatoires de ce peptide résultent probablement de son action sur le récepteur du fMLP inhibant ainsi que le chimiotactisme et l'activation des cellules phagocytaires et en particulier leur dégranulation et leur production de métabolites toxiques de l'oxygène.
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La séquence du segment N-terminal de l'annexine 1 humaine est la suivante : AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVKSSKGGP (SEQ ID No 33) Dans un mode plus général de réalisation, le peptide anti-inflammatoire dérivé du segment N-terminal de l'annexine I sera avantageusement choisi parmi les séquences suivantes :
1 5 10 15 20 25 30 1 1 1 1 1 1 1 AMVSEFLKQAWFhaNpEQEYhpoVKooKGGP (S7) (SEQ ID No 34) IN YYIE E DCVQTTQSSHVV C LD Q IKSS TYS M L NC CVP EA GG La séquence soulignée représente une séquence dite consensus possédant les propriétés anti-inflammatoires recherchées. Sous chaque résidu variable de cette séquence est indiquée une liste de résidus pouvant remplacer celui indiqué dans la séquence consensus : a résidu acide ; h résidu hydrophobe ; p résidu polaire ; o Thr ou Ser de préférence.
1 5 10 15 20 25 30 1 1 1 1 1 1 1 AMVSEFLKQAWFhaNpEQEYhpoVKooKGGP (S7) (SEQ ID No 34) IN YYIE E DCVQTTQSSHVV C LD Q IKSS TYS M L NC CVP EA GG La séquence soulignée représente une séquence dite consensus possédant les propriétés anti-inflammatoires recherchées. Sous chaque résidu variable de cette séquence est indiquée une liste de résidus pouvant remplacer celui indiqué dans la séquence consensus : a résidu acide ; h résidu hydrophobe ; p résidu polaire ; o Thr ou Ser de préférence.
Il est également possible de choisir une séquence plus courte pour NTA1. On peut ainsi supprimer les huit à treize premiers résidus. On pourra utiliser en particulier utiliser la séquence: ENEEQEYVQTVKSSKGGP (SEQ ID No 35) (S8) Toutes les mutations correspondant à ce fragment et indiquées pour la séquence (S7) seront utilisables dans la séquence S8.
Il existe dans l'environnement inflammatoire au moins une protéase susceptible de cliver spécifiquement le segment NTA1 au niveau de l'un des deux résidus Lysine 25 ou 28 présents dans sa partie N-terminale -Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-. Ces protéases sont normalement responsables de la libération in vivo du segment N-terminal de l'annexine I.
Dans un premier mode simple de réalisation, le peptide NTA1 ou une version judicieusement mutée est simplement intégré à la partie N-terminale du segment C pour
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former la protéine thérapeutique : NTA1-C. Le segment C est pris ici dans son acceptation la plus large et définie plus haut.
Dans un second mode de réalisation, le peptide NTA1 ou une version judicieusement mutée est relié au segment C par l'intermédiaire d'un lien simple clivable par une protéases intervenantes selon la formule F6A ou F6B ou d'un lien multiple comportant un élément de ramification D comme défini plus haut (F5A, F5B).
Dans un autre mode de réalisation, la partie A peut aussi contenir une répétition de l'une des séquences choisi pour le segment NTAI afin d'augmenter la concentration locale du peptide anti-inflammatoire et donc son efficacité.
Pour optimiser le comportement in vivo de la molécule thérapeutique, on choisira de préférence m = 2.
Dans un autre mode de réalisation, il peut être avantageux de lier le segment NTA1 à l'extrémité C-terminale du segment C. Pour cette réalisation, on utilisera un lien bifonctionnel de façon à relier entre elles les extrémité C-terminales de C et NTA1 :
Libération de Cytokines anti-inflammatoires.
Libération de Cytokines anti-inflammatoires.
Les maladies inflammatoires chroniques, et particulièrement la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et le Psoriasis, sont provoquées par un déséquilibre important dans la production dans l'environnement cellulaire d'un certain nombre de molécules de signalisation. L'amplification et la pérennisation du phénomène inflammatoire dans ces maladies résultent d'un équilibre complexe entre un nombre important de protéines aux influences opposées, molécules pro-inflammatoires et molécules anti-inflammatoires.
Parmi les cytokines jouant un rôle anti-inflammatoire, l'interleukine 10 (IL10) (SwissProt, P22301), ou sur l'une quelconque de ses isoformes, est la plus intéressante par l'effet régulateur qu'elle produit sur la réaction inflammatoire. Mais comme beaucoup de molécules de la signalisation de la réaction inflammatoire, l'ILlO possède de multiples
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fonctions dont des fonctions de stimulation du système immunitaire. Il est donc très avantageux de cibler cette protéine au site inflammatoire proprement dit de façon à localiser strictement son action.
L'ILlO agit en tant qu'homodimère sur son récepteur hétéro tétramérique. La structure tridimensionnelle de l'ILlO et du complexe avec son récepteur, l'ILlOR, offre un avantage supplémentaire. En effet, la structure du complexe IL10-IL10R, montre que les extrémités N et C-terminale de l'ILlO sont relativement proches dans sa structure. De plus l'extrémité N-terminale est enfouie au c#ur du récepteur et l'extrémité C-terminale est située dans la région de dimérisation de cette cytokine. De ce fait, le blocage par le segment C-L ou L-C de l'une des extrémités N ou C-terminale de l'ILlO, interdit la formation du complexe et finalement bloque son action. L'activation de l'IL10 ne peut donc se faire que par l'action des protéases intervenantes de l'environnement inflammatoire qui ont pour effet de libérer cette cytokine exclusivement dans cet environnement.
Le même raisonnement peut être appliqué à une autre cytokine anti-inflammatoire, l'IL13 (P35225) ou à l'une de ses isoformes.
La molécule thérapeutique basée sur l'ILlO ou l'IL13 possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de l'ILlO ou de l'IL13 : C-L' 1 -L" 1-L2-(IL10/IL13) (selon la formule F6A) (IL10/IL13)-L1-L''2-L'2-C (selon la formule F6B) Le site de clivage des protéases intervenantes est prévu entre L" 1 et L" 1 ou entre L"2 et L'2. La longueur du segment résiduel L"1-L2 ou Ll-L"2 est telle qu'elle ne gêne pas la formation du complexe IL10-1L10R ou IL13-1L13R[alpha]1/2. Il est aisé d'ajuster la séquence effective de l'ILlO pour satisfaire cette contrainte. Dans l'un et l'autre cas le segment Ll ou L2 peut être absent.
Libération d'inhibiteurs de Cytokines pro-inflammatoires.
Le segment thérapeutique A peut être sélectionné parmi les inhibiteurs non activants des récepteurs membranaires des cytokines pro-inflammatoires.
Il existe des inhibiteurs naturels de certaines cytokines et notamment de l'interleukine 1 (IL1), une cytokine pro-inflammatoire dont l'incidence dans les maladies inflammatoires vient immédiatement après celle du TNFa qui est la cytokine dont le rôle est central.
L'inhibiteur soluble du récepteur de l'ILl, l'ILIR, est une petite protéine, le sILIRa
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(Swiss-Prot P18510), qui agit en se liant au IL1R ans l'activer, bloquant ainsi de l'ILl.
L'efficacité du sILIRa a été testée dans divers maladies et en particulier dans l'arthrite rhumatoïde et se montre relativement actif. Cependant les doses utilisées chez les malades en injections sous cutanées sont énormes, de 30mg à 150mg. La pharmacocinétique est par ailleurs défavorable puisque le temps de demie-vie dans la circulation n'est que de 21 min, ce qui est très faible pour une utilisation thérapeutique dans le cas de l'arthrite rhumatoïde.
Comme précédemment pour l'ILlO, l'ensemble C-L-(ILlRa) ou (ILlRa)-L-C est totalement inactif. En effet, la structure du complexe ILIRa-ILIR montre que les extrémités N et C-terminale de l'ILIRa sont très proches dans la structure et sont enfouies au c#ur du récepteur. De ce fait, l'activation de l'inhibiteur ne peut se faire que par l'action des protéases intervenantes de l'environnement inflammatoire qui ont pour effet de libérer l'inhibiteur exclusivement dans cet environnement.
La molécule thérapeutique basée sur l'ILIRa ou sur l'une quelconque de ses isoformes, possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de l'ILIRa : C-L'l-L"l-L2-(ILlRa) (selon la formule F6A) (ILIRa)-Ll-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) Le site de clivage des protéases intervenantes est prévu entre L" 1 et L" 1 ou entre L"2 et L'2. La longueur du segment résiduel L"1-L2 ou Ll-L"2 est telle qu'elle ne gêne pas la formation du complexe ILl-lLIRa. Comme pour l'ILIO, il est aisé d'ajuster la séquence effective de l'ILIRa pour satisfaire cette contrainte. Dans l'un et l'autre cas le segment L1 ou L2 peut être absent.
Libération de médicaments anti-inflammatoires.
Il existe de nombreuses molécules non peptidiques possédant des propriétés antiinflammatoires importantes comme les Glucocorticoïdes, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), le Méthotrexate.
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a) Les Glucocorticoïdes : Initialement, les Glucocorticoïdes sont des molécules hormonales naturelles produites par l'organisme et interviennent dans de nombreux processus physiologiques. Leur action est strictement intracellulaire et intervient par leur liaison à des récepteurs nucléaires induisant la transcription d'un certain nombre de gènes, d'où le rôle complexe de ces hormones à de multiples étapes de la réaction inflammatoire. L'utilisation des Glucocorticoïdes et de leurs dérivés non naturels comme médicament est donc toujours très délicate alors que leur efficacité peut être très grande. Leur ciblage et leur libération stricte dans l'environnement inflammatoire sont donc cruciaux.
Les Glucocorticoïdes sont des molécules stéroïdiennes, donc assez hydrophobes, et leurs action s'effectue au niveau du noyau cellulaire après diffusion passive à travers la membrane plasmique. Pour une utilisation comme médicament ciblé, les Glucocorticoïdes peuvent donc être simplement libérés dans l'environnement inflammatoire.
Toutes ces molécules comportent des fonctions chimiques, par exemple des groupes hydroxyles, permettant leur greffage sur des molécules peptidiques et en particulier sur un segment L clivable par des protéases intervenantes comme pour les composés antitumoraux.
La molécule thérapeutique basée sur les Glucocorticoïdes possède l'une des structures générales suivantes, selon le choix fait pour le positionnement de la molécule par rapport au segment de ciblage :
C-L' 1-L" 1-L2-(O-Glucocorticoïde) (selon la formule F6A) (Glucocorticoïde-O)-Ll-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) Sous cette forme ces molécules sont totalement inactives.
C-L' 1-L" 1-L2-(O-Glucocorticoïde) (selon la formule F6A) (Glucocorticoïde-O)-Ll-L"2-L'2-C (selon la formule F6B) Sous cette forme ces molécules sont totalement inactives.
L'action des protéases intervenantes libère soit la molécule L"1-L2-(O-Glucocorticoïde) soit la molécule (Glucocorticoïde-O)-Ll-L"2, c'est à dire une pro-drogue qui doit diffuser passivement dans les cellules environnantes où elles seront traitées par les protéases et estérases endogènes pour libérer finalement la molécule active.
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Dans cette application particulière de la présente invention, il est donc important que les segments L''1-L2 ou Ll-L"2 soit hydrophobes et les plus court possibles, compte tenu des capacités de clivage des protéases intervenantes. Il est avantageux de limiter à deux le nombre de résidus voire à un le nombre de résidus dans L" 1 ou L"2. Il peut être aussi avantageux de ne pas introduire les segment L1 ou L2. b) Les anti-inflammatoires non stéroïdiens : Les anti-inflammatoires non stéroïdiens forment une des classes de médicament les plus prescrits. Ce sont pour la plus part des inhibiteurs des cyclo-oxygénases (COX-1 et COX- 2), des enzymes importantes intervenant dans le métabolisme de l'acide arachidonique. Ce sont des médicament généralement réservés au traitement des maladies inflammatoires sévères et utilisés à des doses généralement très élevées et donc génératrices d'effets secondaires indésirables. Parmi les AINS, il existe une classe de composés possédant une fonction carboxylique utilisable pour leur greffage sur des molécules peptidiques et en particulier sur un segment L clivable par des protéases intervenantes comme pour les composés anti-tumoraux ou anti-inflammatoires mentionnés plus haut. Parmi ces composés on mentionnera l'Aspirine, l'Olsalazine, le Diclofénac, l'Etodolac, le Sulindac, l'Idométacine, le Ténidap et l'ensemble des dérivés de l'acide propionique comme l'Ibuprofène, l'acide Tiaprofénique, le Naproxène, le Kétoprofène et d'une façon générale profénides . D'autres familles de composés sont aussi utilisables, les acides anthraniniliques et apparentés comprenant le groupe des fénamates comme l'acide méfénamique, le groupe des dérivés de l'acide nicotinique comme l'acide niflumique.
Comme l'ensemble de ces composés anti-inflammatoires sont des acides carboxyliques, ils devront être fixés à l'extrémité N-terminale du lien peptidique clivable selon la formulation suivante :
Cette configuration est avantageuse en ce qu'elle permet l'introduction de la molécule d'AINS directement en fin de synthèse peptidique en phase solide du segment L"2-L'2.
Cette configuration est avantageuse en ce qu'elle permet l'introduction de la molécule d'AINS directement en fin de synthèse peptidique en phase solide du segment L"2-L'2.
Dans ce mode de réalisation, le segment L"2 devra être suffisamment court et hydrophobe pour permettre la diffusion passive du segment actif (AINS)-CONH-L"2 à travers la membrane plasmique des cellules cibles.
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Si, pour des raisons particulières, il est nécessaire d'utiliser l'extrémité C-terminale selon la formule : C-L'1-L"1-L2-(AINS), le segment L2 devra dans ce cas être bi-fonctionnel et hydrophobe comme par exemple l'aminoéthanol : L2 = H2N-CH2-CH2-OH. c) Le méthotrexate Le méthotrexate possède également des propriétés anti-inflammatoires et peut être utilisé de la même façon que pour ses propriétés anti-tumorales décrites plus haut.
Réalisation d'inhibiteurs des récepteurs membranaires de la famille des TNFR.
L'homotrimérisation stricte des domaines extracellulaires en l'absence du ligand est un élément important du fonctionnement correct des TNFR. Cette trimérisation du récepteur vide est assuré essentiellement par un segment N-terminal comprenant le domaine extracellulaire CRD 1. Les interactions protéine-protéine sont très spécifiques et évitent ainsi la formation d'hétérotrimères dus à la présence de récepteurs différents à la surface d'une même cellule. On met à profit cette propriété pour produire de nouveaux inhibiteurs spécifiques de n'importe quelle protéines membranaires de la famille des TNFR.
Ces inhibiteurs utilisent un peptide, nommé ici PCRDX, comprenant au moins le domaine CRD1 d'un TNFR quelconque X pour bloquer la trimérisation de celui-ci de façon très spécifique et donc bloquer sa fonction : en se liant à une sous unité membranaire du TNFR (monomère), le peptide PCRDX libre, sous la forme de monomère ou de dimère, bloque la trimérisarion de cette sous unité membranaire sans activer le récepteur puisque celui-ci ne peut plus acquérir sa structure trimérique.
Dans un mode de réalisation simple, on pourra utiliser un peptide PCRDX, ou une version mutée de ce domaine, lié au segment C par un lien L1-L2 clivable par l'une des protéases intervenantes généralement présentes dans l'environnement inflammatoire de façon à ne libérer l'inhibiteur qu'au site inflammatoire ciblé. La structure générale de la molécule thérapeutique de la présente invention est donc :
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C-L1-L2-PCRDX ou PCRDX-L1-L2-C Où le clivage s'effectue entre Ll et L2.
La structure C- L1-L2-PCRDX est directement active car elle laisse libre l'extrémité Cterminale du CRD1 permettant sa liaison au CRD1 d'un récepteur cellulaire.
La structure PCRDX- L1-L2-C possède l'avantage supplémentaire de ne rendre actif le segment CRD1 que lorsque celui-ci est libéré par le clivage du segment L1-L2 limitant ainsi d'autant le risque d'effets secondaires. En effet dans cette configuration l'extrémité C-terminale du PCRDX est encombrée par la présence du segment L1-L2-C, inadapté à toute interaction avec un domaine extracellulaire d'un TNFR, rendant ainsi plus difficile sont interaction avec celui-ci. L'activité est recouvrée par le clivage du lien L1-L2.
La liste suivante donne des exemples de séquence minimum que doivent contenir les divers segments PCRDX possibles utilisables comme inhibiteur de la trimérisation du TNFR1 et du TNFR2 : Inhibiteur du TNFRI DSVCPQGKYI HPQNNSICCT KCHKGTYLYN DCPGPGQDTD CRECESGSFT ASENHLRHCL SS (SEQ ID No 36) Inhibiteur du TNFR2 PGTCRLREYY DQTAQMCCSK CSPGQHAKVF CTKTSDTVCD SCEDSTYTQL WNWVPECLSS (SEQ ID No 37) Ces séquences peuvent être mutées, notamment dans la région d'interaction avec les récepteurs TNFR1 et du TNFR2 originaux, afin d'augmenter leur affinité avec ces récepteurs.
Des séquences analogues provenant de n'importe quel récepteur de cytokines de la famille des TNF peuvent être utilisées pour produire des inhibiteurs spécifiques de ces récepteurs.
Le lien clivable Ll-L2 peut être avantageusement choisi parmi les séquences peptidiques reconnues et clivées par les protéases spécifiques dont le rôle est de libérer la partie extracellulaire des TNFR membranaires ou des précurseurs membranaires des TNF. Ces protéases appartiennent à la famille des ADAM déjà mentionnées. Parmi ces protéases, on
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choisira en particulier la protéase ADAM-17 ou TACE spécifique de la libération du TNFa et du TNFss (LTp) et on choisira en conséquence la séquence du segment L1-L2 de telle sorte qu'il contienne l'une des séquence suivantes : L1*L2 = SPLAQA*VRSSSR (SEQ ID No 38) ou fragments de celle-ci, PLAQA*VRSSS (SEQ ID No 39), LAQA*VRSS (SEQ ID No 40), AQA*VRS (SEQ ID No 41), QA*VR (SEQ ID No 42), ou toute combinaison des groupes de séquences situées de part et d'autre du site de clivage marqué par une astérisque comme par exemple . PLAQA*VRS (SEQ ID No 43) ou AQA*VRSS (SEQ ID No 44), etc.
UTILISATIONS DES MOLECULES DE CIBLAGE ET DE LIBERATION DE COMPOSE THERAPEUTIQUE Les molécules de l'invention peuvent être construites pour cibler différents types de cellules ou de tissus pathologiques, de préférence chez l'homme. Elles peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments et/ou dans des méthodes de traitement thérapeutique.
Ainsi, un objet particulier de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une molécule chimère telle que définie ci-avant pour la préparation d'un médicament. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires.
Lorsque le composé thérapeutique A est un anti-inflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisée pour la préparation de médicaments destinés à des pathologies aiguës comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et l'arthrite.
Lorsque le composé thérapeutique A est un anti-cancéreux, l'invention est utilisable pour le traitement de différentes tumeurs, notamment de tumeurs solides ou liquides ou hématopoïétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon et
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du rectum, du cerveau, des méninges, de l'estomac, de l'oesophage, du foie, du pancréas, de la vessie, tête-et-cou, des appareils reproductifs mâles ou femelles, de la peau, etc.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent comprendre tout excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, tel que sel, solutés, etc. Il peut s'agir de solutions salines, tamponnées, isotoniques, d'eau, etc. Les compositions peuvent comprendre, en outre, d'autres agents actifs, utilisés en combinaison, de manière simultanée, séparée ou espacée dans le temps.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules de ciblage telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée et un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ciavant.
Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, réduction de la taille d'une tumeur ou de la progression de la pathologie, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, diminution du site inflammatoire), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc. ). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.
Pour la mise en #uvre des méthodes thérapeutiques définies ci-avant, le composé thérapeutique peut être utilisé à différentes doses et selon différents protocoles.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de
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préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-tumorale, intradermique, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées. L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.
EXEMPLES Example 1 :Exemple de réalisation de segments L clivables pour la libération de composés anti-tumoraux et anti-inflammatoires : Si le segment L est uniquement peptidique et ne contient que des résidus naturels, il sera de préférence intégré dans le segment C à son extrémité N ou C-terminale par les méthodes classique de la biologie moléculaire. Il pourra cependant être intégré si nécessaire au segment A si celui est peptidique et obtenu par biologie moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, il y aura avantage à préparer de façon extemporanée le segment L ou l'ensemble L-A sous une forme réactive pour une liaison ultérieure au segment C. Un exemple intéressant se présente dans le cas où un groupe thiol amené par un résidu Cystéine est présent dans le segment C, de préférence loin du site de liaison de C aux membranes chargées négativement. Ce groupe thiol permet, par une réaction chimique simple, rapide et totale, de lier l'ensemble L-A muni du groupe fonctionnel maléimide.
Le protocole de synthèse est décrit dans la figure 1. Le fragment L consiste en un peptide protégé lié à une résine acide-labile rink via la stratégie FMOC bien connue de l'homme de l'art. Le fragment réactif possède la propriété de former une liaison covalente avec un groupe nucléophile - ici le groupe SH d'une Cystéine - de la protéine C. Le groupe réactif peut être un bromoacétamide ou, comme ici et de façon plus avantageuse, un groupe maléimide. Le groupe espaceur entre le maléimide et le peptide L peut être un groupe alkyl, alkoxy ou poly alkoxy terminé par une fonction carboxylique pour le couplage à L.
Dans l'exemple de la figure 1, le segment thérapeutique est un composé anti-tumoral de la famille de antracycline, la doxorubicine. Dans la figre 1, AA représente n'importe quelle
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séquence d'aminoacides pouvant constituer un lien clivable. L'exemple décrit ci-dessous correspond à la séquence AA = Gly-Ser-Gly-Val-Leu.
Synthèse du Fmoc-Leu-Résine rink acide (1) : 5 g de résine rink 100-200 Mesh (approximativement 0,35-0,80 mmole/g), Fmoc-Leu-OH (3,2 mmoles) et la DCCI (3,37 mmoles) sont agités pendant 5 minutes de 0 C à 5 C dans 50 ml de DCE, puis 60 mg de DMAP (0,5 mmole) sont ajoutés et après 20 minutes supplémentaires à 5 C, 275 l de N-méthylmorpholine (2,5 mmoles) sont ajoutés. Le mélange est agité pendant 4 heures. La résine filtrée est lavée avec 40 ml (pour 30 s chaque fois) par les solvants suivants : 3 fois méthanol, 3 fois DCE, 3 fois DMA. Les groupes hydroxyle non réagis de la résine sont bloqués avec l'anhydride acétique (13,5 mmoles) dans 3 ml de pyridine et 15 ml de DMA puis la résine est lavée comme suit (40 ml chaque fois) : 2 fois isopropanol, 3 fois DMA, 2 fois isopropanol, 6 fois DCE, 2 fois isopropanol, 3 fois DMA, 3 fois isopropanol. La résine est ensuite séchée sous vide et a un contenu en Fmoc d'environ 0,35 mmole/g.
Synthèse du Fmoc-Gly-Ser(Trt)-Gly-Val-Leu-Résine rink acide (2) : Lavage et enlèvement du groupe Fmoc à température ambiante : 1 g de Fmoc-Leu-Résine rink acide (0,35 mmole) est traité de la façon suivante chaque fois 3 minutes avec 20 ml de 1 fois isopropanol, 4 fois DMA, 6 fois 20% pipéridine dans le DMA, 2 fois DMA, 1 fois isopropanol, 4 fois DMA.
Couplage Fmoc-AAn-OH : DIEA (3,5 mmoles) dans 10 ml de DMA est ajouté à la résine. Après le gonflement de la résine, les aminoacides protégés par le Fmoc (1,75 mmoles) et le HBTU (1,72 mmoles) dans du DMA sont ajoutés. Après 40 minutes la résine est rincée avec 4 fois 40 ml de DMA.
Synthèse du H-Gly-Ser(Trt)-Gly-Val-Leu-Résine rink acide (3) : La forme N-terminale libre du peptide protégé et lié à la résine est obtenu par le protocole de clivage et lavage identique au protocole (2) .
Synthèse du composé réactif (4) :
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A 1 g de résine (3) (3,5 mmoles dans le DMA) on ajoute 3,5 mmoles de DIEA, 1,75 mmoles de N-maléoyl-ss-alanine et 1,72 mmoles de HBTU. Après 2 heures, la résine est lavée avec 4 fois 20 ml de DMA puis séchée sous vide.
Séparation du peptide protégé de la résine pour obtenir (5) : La résine est dispersée dans le DCM et traitée par 20 ml de mélange de clivage AcOH/DCM (10/90 v/v) pendant une heure puis est filtrée, lavée 3 fois avec 20 ml de mélange de clivage puis 3 fois 20 ml de DMA pour extraire le peptide de la résine. De l'hexane (15 fois le volume) est ajouté au filtrat pour enlever l'acide acétique sous forme azéotrope. Le peptide protégé résultant est séché sous vide et purifié par chromatographie flash .
Couplage du peptide protégé au composé anti-tumoral doxorubicine : A l'abri de la lumière, on ajoute au composé (5) (0,3 mmole dans 2 ml de DMA), 3 mmoles de DIEA, 0,3 mmole de HBTU et 0,3 mmole de Doxorubicine. Après 2 heures, le solvant est évaporé et le produit brut est dilué dans l'acétonitrile, purifié par chromatographie flash sur gel de silice.
Synthèse du composé final (7) : A l'abri de la lumière, le composé (6) est dilué dans une solution à 1% de TFA et 5% de triéthylsilane dans le DCM. Après 2 heures, le produit brut est évaporé sous vide puis dissout dans l'acétonitrile, purifié par HPLC et lyophylisé.
Exemple 2 : Synthèse d'un lien mixte peptidique et non-peptidique pour la libération de composés anti-tumoraux.
La partie non peptidique du lien est introduit à l'aide du composé (12), obtenu selon le schéma de la figure 2, en remplacement de la N-maléoyl-ss-alanine utilisée dans la synthèse précédente (figure 1). Le schéma de la figure 2 décrit un lien de structure générale et le protocole qui suit décrit le cas particulier m=1, n=2, o=l.
A une solution de 2- (2-aminoethoxy)-éthanol mmol) (8) dans 100 ml de dichlorométhane, on ajoute au goutte à goutte à 0 C une solution de t-butylpyrocarbonate (47. 55 mmol) dans 50 ml de dichlorométhane. On laisse remonter à température ambiante
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et après deux heures, on évapore à sec le mélange réactionnel. On obtient le carbamate désiré (9) sous forme d'une huile incolore.
A une solution de PPH3/DIAD (7. 5 mmol) dans 25ml de THF fraîchement distillé est ajouté, à 0 C, l'alcool néopentylique (7. 5 mmol), le carbamate précèdent (9) (7. 5 mmol) et le maléimide (7. 5 mmol). On laisse ensuite la réaction à température ambiante pendant la nuit. Le brute réactionnel est évaporé à sec puis flash chromatographié sur silice pour donner le produit attendu (10).
A une solution du carbamate précédent (10) (6. 5 mmol) dans 40 ml de dichlorométhane est ajouté 30 ml d'acide trifluoroacétique. La mixture est laissée aux ultrasons 10 minutes puis agitée à température ambiante 1 heure. Les solvants sont évaporés et le résidu lavé au chloroforme (3x) et à l'éther (4x). Le produit obtenu (11) sous forme de trifluoroacétate est utilisé tel quel à l'étape suivante.
Au sel de trifluoroacétate du produit précèdent (11) (6 mmol) en suspension dans le dichlorométhane (30mL), est ajouté à température ambiante le DIEA (12 mmol). Après une heure, on ajoute l'anhydride diglycolique (6.5 mmol). Après deux heures, on évapore à sec et on purifie le produit (12) par flash chromatographie sur silice.
Le composé (12) est ensuite utilisé comme le composé N-maléoyl-ss-alanine pour la synthèse d'un lien clivable mixte selon le protocole décrit dans la Figure 1 pour les composés (5) et (6).
Exemple 3 : Construction et production anti-inflammatoire NTAI-C.
Deux constructions sont proposées qui correspondent l'une à la version longue de NTA1 nommé NTA11, selon la séquence S7 (Seq ID 33) et l'autre à la version courte, nommé NTAlc, selon la séquence S8 (Seq ID 35).
NTAlc +: 5'P-CGAAAACGAAGAACAGGAATACGTTCAGACCGTTAAATCTTCTAAAGGTGGTCCGG-3' (SEQ ID No 45) NTAlc-:
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5'P-GATCCCGGACCACCTTTAGAAGATTTAACGGTCTGAACGTATTCCTGTTCTTCGTTTTCGGGCC- 3' (SEQ ID No 46)
N TA1l + : 5'P- CGCTATGGTTTCTGAATTCCTGAAACAGGCTTGGTTCATCGAAAACGAAGAACAGGAATACGTTCAGAC CGTTAAATCTTCTAAAGGTGGTCCGG-3' (SEQ ID No 47) NTA11-: 5'P- GATCCCGGACCACCTTTAGAAGATTTAACGGTCTGAACGTATTCCTGTTCTTCGTTTTCGATGAACCAA GCCTGTTTCAGGAATTCAGAAACCATAGCGGGCC-3' (SEQ ID No 48)
Ban II + : 5'-GCGCTGTTAGCGGGTCCATTAAGTTCTGTC-3' (SEQ ID No 49) Ban II - : 5'-GACAGAACTTAATGGACCCGCTAACAGCGC-3' (SEQ ID No 50) Les plasmides pGEX 6P1 utilisés sont commerciaux (Amersham biosciences) ainsi que les enzymes (Biolabs) utilisés : BamH I, EcoR I, Ban II, T4 DNA Ligase, CIP, T4 kinase.
N TA1l + : 5'P- CGCTATGGTTTCTGAATTCCTGAAACAGGCTTGGTTCATCGAAAACGAAGAACAGGAATACGTTCAGAC CGTTAAATCTTCTAAAGGTGGTCCGG-3' (SEQ ID No 47) NTA11-: 5'P- GATCCCGGACCACCTTTAGAAGATTTAACGGTCTGAACGTATTCCTGTTCTTCGTTTTCGATGAACCAA GCCTGTTTCAGGAATTCAGAAACCATAGCGGGCC-3' (SEQ ID No 48)
Ban II + : 5'-GCGCTGTTAGCGGGTCCATTAAGTTCTGTC-3' (SEQ ID No 49) Ban II - : 5'-GACAGAACTTAATGGACCCGCTAACAGCGC-3' (SEQ ID No 50) Les plasmides pGEX 6P1 utilisés sont commerciaux (Amersham biosciences) ainsi que les enzymes (Biolabs) utilisés : BamH I, EcoR I, Ban II, T4 DNA Ligase, CIP, T4 kinase.
Construction de NTAlc-C et NTA1l-C dans pGEX 6P Le vecteur d'expression utilisé est le vecteur pGEX 6P1 (Amersham-Biosciences). Ce vecteur permet l'expression de la protéine d'intérêt fusionnée à la GST à son extrémité Nter. La protéine d'intérêt est récupérée sans protéine de fusion après digestion par la PreScission. La séquence codante du segment C (provenant du vecteur pGEX2T, construit au laboratoire) sera insérée dans ce vecteur entre les sites BamH I et EcoR I. Le segment NTAII ou NTAlc sera ensuite inséré sous forme de cassettes dans le vecteur pGEX 6P contenant la séquence codante du segment C entre les sites Ban II et BamH I.
Le vecteur pGEX 6P possède deux sites Ban II. La première étape consiste donc à rendre ce site unique afin de l'utiliser comme site de clonage du segment NTAI. Le site Ban II situé en position 3890 est enlevé par une étape de mutagenèse dirigée silencieuse (kit Quick Change, Stratagène, oligos Ban II + et Ban II -) en suivant les recommandations du fournisseur. Le plasmide pGEX-6P-mut est alors obtenu.
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La séquence codante du segment C est extraite du plasmide pGEX2T par digestion enzymatique à l'aide des enzymes de restriction BamH I et EcoR I (Biolabs). Brièvement, 20 g d'ADN est digéré séquentiellement par 200 U d'enzyme, à 37 C pendant la nuit. Après chaque digestion, l'ADN est purifié après migration sur gel d'agarose à l'aide du kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (Amersham-Biosciences). 20 g de plasmide pGEX-6P-mut est également digéré dans les mêmes conditions par BamH I et EcoR I afin d'obtenir le vecteur dans lequel les séquences codantes seront insérées. Afin d'éviter une recircularisation du vecteur, celui-ci est déphosphorylé par une incubation de 2h à 37 C en présence de 2 U de CIP (Biolabs). Le vecteur pGEX-6P-mut , ouvert en BamH 1 / EcoR I et déphosphorylé, est ensuite purifié à l'aide du kit Amersham. La ligation de la séquence codante du segment C (10 moles d'insert pour 1 mole de vecteur) dans le vecteur pGEX-6P-mut est ensuite réalisée par incubation de 2h à température ambiante en présence de 400 U de T4 DNA ligase (Biolabs). Les plasmides pGEX-6P-mut contenant la séquence codante du segment C sont alors obtenus.
Les cassettes NTA11 et NTAlc sont obtenues par hybridation de 100 pmol des oligos complémentaires (NTAlc + / NTAlc - et NTA11 + / NTA11 -) à 95 C pendant 5 min dans un tampon Tris HC1 20 mM pH7,5 ; NaCl 300 mM ; EDTA 1 mM. Les extrémités 5' des cassettes sont ensuite phosphorylées par une incubation à 37 C pendant 2h en présence de 50 U de T4 polynucléotide kinase (Biolabs). L'enzyme est inactivée par incubation à 65 C pendant 20 min.
La dernière étape consiste à digérer les plasmides pGEX-6P-mut la séquence codante du segment C par Ban II et BamH 1 afin d'insérer les cassettes. 20 g d'ADN est digéré séquentiellement par 50 U de Ban II et 100 U de BamH I, à 37 C pendant la nuit. Après chaque digestion, l'ADN est purifié après migration sur gel d'agarose à l'aide du kit Amersham. La déphosphorylation des vecteurs est réalisée par incubation à 37 C pendant lh en présence de 10 U de CIP, afin d'éviter leur recircularisation lors de l'étape de ligation. La ligation des cassettes dans les vecteurs est réalisée comme décrite précédemment. On obtient donc les séquences NTAlc-C et NTA11-C clonées dans le vecteur pGEX-6P-mut.
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Après chaque construction les séquences d'ADN sont vérifiées avec le kit de séquençage Big Dye Terminator, Perkin-Elmer Applied Biosystems, sur un séquenceur Perkin-Elmer Abiprism 310, selon le protocole du fournisseur.
Expression de NTAlc-C et NTA11-C chez E. coli L'expression est réalisée chez une souche d'E. coli BL21 gold (Stratagène) à 30 C. Les bactéries sont mises en culture dans un milieu Luria Berthani (Gibco) contenant 150 mg/L d'ampicilline. Lorsque la turbidité des cultures atteint une densité optique à 600 nm (D06oo) de 0,6, l'expression des protéines est induite par l'ajout de 1 mM IPTG (Sigma) et maintenue pendant 4h. Les bactéries sont alors centrifugées à 5,000 rpm (centrifugeuse JLA1.8000, Beckman) pour 10 min à 4 C et re-suspendues dans 20 mL de tampon S complet (20 mM Tris-HCl pH 7,6 ; mM NaCI ; 1 mM EDTA ; glycérol (v/v) ; 1 % triton XI 00 (v/v)) supplémenté avec 0,1 mM de PMSF (Sigma) en éthanol ; 0,5 mM de DTT (Sigma) et 50 mg de lysozyme (Sigma). Après une incubation d'lh à 4 C, les extraits sont homogénéisés par 10 sonications de 1 min (amplitude 65%, 1 sec sonication, 1 sec repos) avec un repos d'1min entre chaque sonication. Les protéines présentes dans la fraction soluble (surnageant) sont alors récupérées par centrifugation à 20,000 g, pendant 45 min à 4 C.
Purification de NTAlc-C et NTA1l-C sur colonne GSTrap 10 mL de la fraction soluble est prélevée et diluée dans 20 mL de tampon de liaison (50 mM Tris-HCl pH7,5 ; 150 mM NaCI). Les protéines sont alors purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne GSTrap Fast Flow (Amersham-Biosciences). Une colonne de 5 mL est préparée suivant les instructions du fabricant. L'échantillon protéique (30 mL) est chargé sur la colonne et cette dernière est lavée avec 10 volumes de tampon de liaison. Après un lavage supplémentaire avec 10 volumes de tampon de coupure (50 mM Tris-HCl pH7,5 ; 150 mM NaCI ; 1 mM EDTA ; 1 mM DTT), la protéine est incubée directement sur la colonne avec 100 U de PreScission (Amersham-Biosciences) à 4 C pendant 20h. La protéine d'intérêt sans partenaire de fusion est ensuite récupérée par lavage avec 15 mL de tampon de coupure.
Purification de NTAlc-C et NTA11-C par gel filtration Une colonne HiLoad 26/60 Superdex 75 (300 mL) (Amersham-Biosciences) est équilibrée à l'aide de 2 volumes de tampon A (bicarbonate d'ammonium 150 mM pH 7,9). La
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protéine issue de la purification par GSTrap est alors injectée, et son élution est réalisée avec 2 volumes de tampon A. La protéine ainsi purifiée est aliquotée, lyophilisée et conservée à 20 C.
Figures Figure 1 : de la prodrogue avec AAn = Gly-Ser-Gly-Val-Leu comme substrat pour la MMP2, MMP3 et MMP9 et la N-maleoyl-beta-alanine comme segment réactif de liaison.
Figure 2 : Synthèse du lien non-peptidique long en remplacement du lien court de la Nmaleoyl-beta-alanine utilisé dans le protocole précédent. Synthèse à partir de la 2-(2aminoethoxy)-éthanol (8) (m=l, n=2, o=l) Abbreviations : AcOH : acide acétique ; DCCI : N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide; DCE : 1,2 Dichloroéthane ; DCM : Dichlorométhane ; DIEA : Diisopropylsilane; DMA : Diméthylacétamide ; DMAP : 4-Diméthylaminopyridine ; HBTU : 2-(lH-Benzotriazole-l- yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate ; TFA : acid trifluoroacetique
Claims (18)
- REVENDICATIONS 1- Molécule comprenant trois segments : - un segment de ciblage C capable de se lier aux membranes de cellules engagées dans un processus d'apoptose ; - un segment thérapeutique A comprenant un composé biologiquement actif ; et - un segment de liaison L entre le segment de ciblage et le segment thérapeutique, ladite liaison étant clivable in vivo dans l'environnement d'un tissu ou d'une cellule en apoptose.
- 2- Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une fonction chimique reconnue et clivée par une enzyme ou un ensemble d'enzymes spécifiques de l'environnement des cellules ciblées.
- 3- Molécule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une séquence reconnue et clivée par une protéase majoritairement présente dans le tissu ciblé, plus particulièrement choisie parmi une métallo-protéase de la matrice extracellulaire, une urokinase, et une protéase spécifique du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs.
- 4- Molécule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit segment de liaison L comprend une séquence sélectionnée en ce qu'elle contient au moins un couple de résidus B1-B2 donné dans le tableau suivant :<Desc/Clms Page number 47>
où X est résidu aminoacide quelconque naturel ou non.<tb><tb> Hydrophobe: <SEP> Ala<tb> Polaires <SEP> : <SEP> Arg/Asp/Glu/Gln/Thr/Asn <SEP> Hydrophobes <SEP> naturels<tb> Gly/Ala/Asn/Glu/Gln/Pro/Arg/His/Asn <SEP> Hydrophobes <SEP> naturels <SEP> ou <SEP> non<tb> Arg <SEP> Phe<tb> Asn <SEP> Val<tb> Ala <SEP> Val<tb> Gly <SEP> Val<tb> Gly <SEP> Leu/Ile<tb> Val <SEP> Cys<tb> Leu <SEP> Val<tb> Ala <SEP> Leu<tb> Leu/Tyr/Phe <SEP> X<tb> Val/Ala/Leu/Met <SEP> X<tb> B1 <SEP> B2<tb> - 5- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C est capable de se lier aux membranes comportant des lipides dont la charge électrostatique totale est négative, notamment la phosphatidylsérine.
- 6- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage comprend la séquence peptidique suivante :
J 1-J2-J3-J4-Js~ J6~Z7~Us-J9~ J lo~U 11-R~J 13~ J14-U1 s~K~G~Xl s~G-.h-J2 yE~ J23~ J24-Uzs~ Jz6~ Jz7J28~lJ29~J30~J31-Fl-J33~J34~J35~J36~1337~J38~J39~lJ40~J41-J42~J43~lJ44~J45~J46~J47~J48~J49-Fl-J51~lJ52J53~Js4~D~Us6~K~S~z59~L-J61-J62-J63-J64-z6s~J66-J67~U68~J69J70~J71~U72~J73-J74~J7s-J76 (SI) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V,<Desc/Clms Page number 48>- l'acide aminé B@ est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence. - 7- Molécule selon la revendication 6, caractérisée en ce que les acides aminés U et B sont choisis suivant un des exemples exposés ci-dessous :
<tb><tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L<tb> Exil <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L<tb> ExlO <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> A <SEP> A <SEP><tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> 1 <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> 1 <SEP> M <SEP><tb> Ex8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F<tb> Ex6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex5 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> V <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex <SEP> 4 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex <SEP> 3 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V <SEP><tb> Ex2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L<tb> Ex <SEP> 1 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L <SEP><tb> U8 <SEP> U11 <SEP> U15 <SEP> U25 <SEP> U29 <SEP> B37 <SEP> U40 <SEP> U44 <SEP> U52 <SEP> U56 <SEP> U68 <SEP> U72<tb> - 8- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi le groupe constitué des séquence SEQ ID Nos 23-32.
- 9- Molécule selon l'une des revendications 1-5, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend la séquence de tout ou partie d'une annexine, d'un domaine de type Cl ou C2 des facteurs de coagulation sanguine, d'un domaine V d'une protéine de la<Desc/Clms Page number 49>famille des 2-Glycoprotéines-I, d'un domaine de type FYVE, d'un domaine de type PH, ou un fragment ou un dérivé présentant au moins 50 % d'identité.
- 10- Molécule selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 1-16 et 17-22, de préférence SEQ ID Nos 2-4, 6-8, 10-12, 14-16 et 19-22 ou un fragment de celle-ci.
- 11- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A présente une activité anti-tumorale.
- 12- Molécule selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A est sélectionné parmi le groupe constitué d'une molécule de la famille des TNFa ou dérivés de ceux-ci (TRAIL-Do), d'une molécule d'IL4 humaine ou de l'une de ses isoformes, d'une molécule de la famille des anthracyclines ou l'un de ces dérivés actifs, de préférence la doxorubicine, d'une molécule de taxane comme le paclitaxel ou le docetaxel ou l'un de ces dérivés actifs, d'une molécule de méthotrexate ou l'un de ces dérivés actifs, du 2-méthoxyestradiol ou l'un de ces dérivés actifs, de molécules de la famille des antipyrimidines comme la cytosine arabinoside ou la difluoro-déoxy-cytidine ou l'un de ces dérivés actifs, de molécules de la famille des agents alkylants dérivés des moutardes à l'azote comme la phénylalanine-moutarde (Melphalan) ou d'un dérivé comme le Chlorambucyl.
- 13- Molécule selon l'une des revendications 1-10, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A présente une activité anti-inflammatoire.
- 14- Molécule selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit segment thérapeutique A est sélectionnée parmi le groupe constitué par un segment N-terminal de l'annexine 1 humaine, en particulier NTA1, les cytokines anti-inflammatoires, et en particulier l'IL 10 et l'IL13 ou l'un de leurs mutants appropriés, les inhibiteurs non activants des récepteurs<Desc/Clms Page number 50>membranaires des cytokines pro-inflammatoires comme en particulier l'inhibiteur du récepteur de l'ILl ou un mutant approprié de cet inhibiteur, les glucocorticoïdes, les antiinflammatoires non stéroïdiens ou de leurs dérivés considérés comme des inhibiteurs des enzymes cylo-oxygénase 1 et 2, et le Méthotrexate, un inhibiteur des récepteurs membranaires de la famille des TNFR, en particulier des peptides contenant ou moins le domaine extracellulaire CRD1 correspondant.
- 15- Composition pharmaceutique comprenant une molécule selon l'une des revendications précédentes.
- 16- Utilisation d'une molécule selon l'une des revendications 1-14 pour la fabrication d'un médicament.
- 17- Utilisation d'une molécule selon la revendication 11 ou 12 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
- 18- Utilisation d'une molécule selon la revendication 13 ou 14 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie inflammatoire.
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