FR2856070A1 - Molecules pour le ciblage et l'assemblage in situ de proteines therapeutiques et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage, l'assemblage in situ et, éventuellement, la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment thérapeutique comprenant le composé biologiquement actif et dont l'oligomérisation est nécessaire à son activité thérapeutique ; un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées et capable dans certaines conditions d'assurer l'oligmérisation du segment thérapeutique ; et un segment d'oligmérisation du segment thérapeutique. L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisations, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l'inflammation.
Description
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Molécules pour le ciblage et l'assemblage in situ de protéines thérapeutiques et leur utilisation.
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à des molécules chimères permettant le ciblage, l'assemblage in situ et, éventuellement, la libération de composés thérapeutiques chez des mammifères, notamment des humains. Les molécules de l'invention comprennent principalement trois segments ou domaines fonctionnels : un segment thérapeutique comprenant le composé biologiquement actif et dont l'oligomérisation est nécessaire à son activité thérapeutique ; un segment de ciblage, capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées et capable dans certaines conditions d'assurer l'oligmérisation du segment thérapeutique ; et un segment d'oligmérisation du segment thérapeutique.
L'invention concerne également la préparation de ces molécules, des intermédiaires de synthèse ou domaines de celles-ci, des compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs utilisations, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Les molécules et compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées au ciblage de cellules pathologiques engagées dans une voie apoptotique, et au traitement de pathologies ou tissus associés, notamment les cancers et l'inflammation.
ETAT DE LA TECHNIQUE Les maladies inflammatoires chroniques et particulièrement la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et le Psoriasis sont provoquées par un déséquilibre important dans la production dans l'environnement cellulaire d'un certain nombre de molécules de signalisation. L'amplification et la pérennisation du phénomène inflammatoire dans ces maladies résultent d'un équilibre complexe entre un nombre important de protéines aux influences opposées, molécules pro-inflammatoires et molécules anti-inflammatoires.
Les molécules pro-inflammatoires principales sont : TNFa, IL1, IL6, LIF, OSM, IL12, IL15, GM-CSF, MCSF, les chimiokines (IL8, INFy, RANTES) et enfin différents facteurs de croissance comme le FGF, PDGF, VEGF.
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Les molécules anti-inflammatoires principales sont: sTNF-R, IL-lra, IL4, IL10, IL13, ILl 1, TGFa.
Parmi les cytokines pro-inflammatoires, le TNFa, généralement surproduit par les macrophages, joue un rôle central dans la mesure où il amplifie sa propre production et celles des autres cytokines pro-inflammatoires via l'activation de lymphocytes T. Il induit ainsi le cercle vicieux inflammatoire propre aux maladies précitées. Pour les maladies inflammatoires chroniques, le blocage et la séquestration du TNFa peut engendrer un effet thérapeutique favorable et important. Le blocage du TNFa peut s'obtenir principalement, soit à l'aide d'anticorps anti-TNFa, soit à l'aide d'un récepteur soluble au TNFa. Ces récepteurs solubles sont constitués de plusieurs chaines polypeptidiques du récepteur au TNFa contenant le domaine extra-cellulaire avec 3 ou 4 sous-domaines riches en cystéines (CDR). Les chaines polypeptidiques sont liées entre elles par l'intermédiaire de domaine Fc d'anticorps. Ces récepteurs solubles semblent être le moyen le plus efficace à long terme et particulièrement dans le cas du traitement de la polyarthrite rhumatoïde et de la maladie de Crohn.
Cependant, le TNFa est aussi une protéine importante de l'immunité innée et acquise et son blocage général, c'est-à-dire non ciblé, peut avoir des conséquences très gênantes comme le développement d'infections opportunistes ou latentes avec des conséquences graves comme par exemple la réapparition d'une tuberculose. D'autres maladies comme la sclérose cérébrale multiple, l'encéphalo-myélite expérimentale allergique, le lupus ou encore le diabète de type I voient leur amplitude augmenter ou leur déclenchement devenir plus précoce. Il est donc impératif de d'effectuer un ciblage efficace de ce type de molécule effectrices.
De même, les composés anti-tumoraux peuvent être des molécules de la famille des facteurs de nécrose tumorale alpha (TNFa) et utilisent leur propriété pro-apoptotique. Le rôle de ces molécules est en particulier d'induire l'apoptose par leur liaison à leurs récepteurs membranaires et participent d'une façon essentielle à l'homéostasie des cellules du système immunitaire. La voie apoptotique intracellulaire activée est la voie directe par activation de la caspase 8. Ces molécules de la famille du TNF sont actives lorsqu'elles
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peuvent s'assembler en trimère sur leur récepteur et générer ainsi un signal d'apoptose dans la cellule comportant ce récepteur.
Le problème lié à l'utilisation de la plupart de ces molécules est le risque majeur qu'elles pourraient faire courir au patient en cas d'administration systémique (choc septique, dommage hépatique léthal...). Il est donc impératif de cibler ces molécules sous une forme quasi inactive pour ne les rendre actives que dans le voisinage de ce site de ciblage.
EXPOSE DE L'INVENTION L'objet de la présente invention est de fournir des molécules thérapeutiques inactives ou très peu actives à l'état initial de monomère libre mais capables de cibler des tissus présentant une pathologie en se liant spécifiquement à la surface de certaines cellules présentes dans le tissu ciblé. Une fois liées à la surface de ces cellules, ces molécules thérapeutiques sont capables de s'auto-associer pour reconstituer un multimère présentant l'activité thérapeutique pour la pathologie visée. Grâce aux molécules de l'invention, les composés thérapeutiques exercent leur activité de manière localisée et plus efficace, et offrent des risques d'effets secondaires bien inférieurs.
Les molécules de l'invention peuvent être construites pour cibler différents types de cellules ou de tissus pathologiques, de préférence chez l'homme. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'invention est basée sur le ciblage de cellules apoptotiques, grâce à un élément de ciblage ayant la propriété de se lier aux membranes cellulaires exprimant un lipide chargé négativement, en particulier la phosphatidylsérine (PS). L'apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un phénomène physiologique normal, caractéristique des organismes multicellulaires et présent en particulier chez l'homme. Dans les conditions normales, le taux d'apoptose est cependant faible et les cellules apoptotiques sont très vite phagocytées soit par les cellules voisines, soit le plus souvent par les cellules phagocytaires professionnelles comme les macrophages ou les cellules dendritiques. En outre, les sites apoptotiques sont souvent très dispersés et ne présentent aucune synchronisation. De ce fait, l'apoptose physiologique est généralement indétectable.
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L'apoptose est signalée aux cellules phagocytaires par la présence de PS à la surface des cellules apoptotiques, résultant de la perte de l'asymétrie de leur membrane plasmique. La présence d'apoptose détectable est le signe d'un désordre physiologique où les fonctions phagocytaires sont débordées et incapables de faire face à l'accroissement des cellules à éliminer. Des exemples bien connus de tels désordres sont par exemple l'apoptose du muscle cardiaque après un infarctus ou l'apoptose hépatique à la suite d'une infection virale forte ou d'autres affections à caractère aigu. Des cellules en apoptose sont également présentes dans d'autres tissus ou mécanismes pathologiques, tels que l'inflammation et le cancer.
D'autre part, lorsque le tissu pathologique contient peu ou pas suffisamment de cellules cibles capables de retenir massivement les molécules thérapeutiques de l'invention, cellesci peuvent être utilisées en combinaison avec un agent ou un traitement causant ou favorisant l'apoptose au sein du tissu pathologique afin d'augmenter le bénéfice thérapeutique. Par exemple, certains tissu cancéreux jeune (e. g., de petite taille ou nonmétastasés) ne contiennent pas toujours une quantité importante de cellules en apoptose, compte tenu de leur division rapide. Dans ce cas, un agent favorisant l'apoptose (par exemple un anti-tumoral classique) peut être utilisé en combinaison avec les molécules de l'invention, du moins au début du traitement, pour augmenter l'efficacité thérapeutique.
Le tissus inflammatoire est riche en cellules apoptotiques constituées principalement de polymorphonucléaires neutrophiles (PMN) attirés au site inflammatoire par chimiotactisme et dont la durée de vie est très courte, c'est-à-dire de l'ordre de 24-48 heures. Dans le cas des maladies inflammatoires chroniques, ces PMN constituent une cible privilégiée pour l'accumulation et la libération in situ de molécules thérapeutiques spécifiques.
L'avantage de cibler les cellules apoptotiques de l'environnement tumoral, plutôt que de cibler des marqueurs spécifiques de la surface des cellules tumorales (par exemple, grâce à des anticorps monoclonaux), réside dans l'effet cinétique lié à l'administration du composé anti-tumoral : dans le premier cas, l'action du composé thérapeutique, s'il est administré de façon continue, produit une augmentation de la cible et donc de la concentration effective dudit composé thérapeutique dans l'environnement tumoral alors que, dans le second cas, la taille de la cible a tendance à diminuer ainsi que la concentration effective du composé thérapeutique. Cet effet cumulatif résultant du ciblage des cellules
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apoptotiques est également très important pour le contrôle des étapes initiales de la métastase en maintenant une concentration optimale du composé thérapeutique dans les phases finales de régression de la tumeur. La diminution forte de la dose nécessaire de composé anti-tumoral et sa forte localisation dans la région tumorale a bien sur aussi pour effet de réduire considérablement les effets toxiques secondaires sur le patient.
De même, les médicaments actuels utilisés dans les maladies inflammatoires chroniques sont des molécules très actives comportant donc des risques importants d'effets secondaires graves. Il est donc essentiel de pouvoir restreindre leur action à la seule région inflammatoire.
Les molécules de l'invention permettent donc en premier lieu de cibler différents tissus pathologiques et d'y former un agent thérapeutique ou biologiquement actif in situ, réduisant ainsi leur effets cytotoxiques indésirables sur les tissus sains. Eventuellement, l'agent thérapeutique peut également être activé et/ou libéré dans les tissus ciblés Les molécules thérapeutiques visées par la présente invention sont essentiellement des molécules qui requièrent un assemblage en dimères, en trimères ou en oligomères d'ordre supérieur pour devenir actives. La plus part de ces molécules sont, soit des molécules importantes de la signalisation extracellulaire, soit des récepteurs de ces mêmes molécules, et qui exigent un assemblage multimérique, de préférence dimérique ou trimérique, pour leur activité.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des molécules chimères comprenant un segment de ciblage, un segment thérapeutique et un segment d'oligomérisation, dans lesquelles l'oligomérisation de la molécule chimère est nécessaire à l'activité biologique du segment thérapeutique, et le segment d'oligomérisation assure l'oligomérisation des molécules chimères. Le segment de ciblage est capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules ciblées. De préférence, les cellules ciblées sont des cellules engagées dans un processus d'apoptose. Le segment d'oligomérisation peut éventuellement être intégré dans le segment de ciblage. L'oligomérisation de la molécule chimère est induite par la liaison de celle-ci à la surface des cellules cibles. Le segment thérapeutique peut être tout composé thérapeutique, typiquement anti-cancéreux ou anti-inflammatoire, nécessitant une oligomérisation pour être actif. Le composé thérapeutique est typiquement moins actif
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lorsqu'il est sous la forme d'une molécule chimère de l'invention libre, c'est-à-dire non lier à la surface des cellules ciblées. En outre, les molécules chimères peuvent comprendre éventuellement un segment clivable sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé. De plus, les molécules chimères peuvent comprendre un élément masquant l'activité du segment thérapeutique, l'activation du segment thérapeutique se faisant par clivage d'un segment clivable sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé.
Les molécules chimères de l'invention sont tout d'abord conçues pour être monomériques et inactives en l'absence de cellules ou de tissus cibles pour ne devenir actives que sous l'effet de leur assemblage oligomérique provoqué par leur liaison à la cible.
Eventuellement, le segment thérapeutique sous forme oligomérique peut être libéré à la surface des cellules cibles. Dans ce cas, la molécule chimérique comprend un segment clivable sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé, celui-ci permettant la libération du segment thérapeutique sous sa forme oligomérique.
D'autre part, le segment thérapeutique peut éventuellement être activé à la surface des cellules cibles. En effet, la molécule chimérique peut comprendre des éléments masquant l'activité du segment thérapeutique. Ces éléments peuvent être éliminés par la présence de segments clivables sensibles à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé entre le segment thérapeutique et lesdits éléments.
Dans un mode de réalisation alternatif, la molécule thérapeutique est une molécule préassemblée en oligomère, de préférence en dimère ou trimère, ciblée et éventuellement libérée et/ou activée dans l'environnement du tissu malade ciblé. De préférence, la molécule thérapeutique assemblée sous forme d'oligomère est inactive avant sa liaison à la cible. De préférence, elle est activée au niveau du site cible. Cette activation est de préférence réalisée par le clivage d'une liaison sensible aux protéases se trouvant dans l'environnement d'un tissu ou d'une cellule en apoptose.
L'invention concerne les acides nucléiques codant pour les molécules chimères selon la présente invention, les vecteurs comprenant ces acides nucléiques, les cellules
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recombinantes comprenant ces acides nucléiques, les cellules portant à leur surface une molécule chimère selon la présente invention.
De plus, la présente invention concerne une méthode de production des molécules chimères selon la présente invention. Cette méthode comprend dans un premier mode de réalisation la synthèse peptidique des molécules chimères, par exemple par la chimie Boc ou Fmoc. Dans un second mode de réalisation, cette méthode comprend la production des molécules chimères recombinantes par transformation d'une cellule hôte avec un acide nucléique codant pour une molécule chimère selon la présente invention, la cellule hôte exprimant la molécule chimère.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules chimères telles que définies ci-avant pour la préparation de médicaments. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. L'invention est utilisable notamment pour le traitement de tumeurs solides, liquides ou hématopoiétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon, du cerveau, tête-et-cou, du foie, de la peau, etc. Lorsque le composé thérapeutique est un antiinflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies aiguës et chroniques comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et la poly-arthrite rhumatoïde.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules chimères telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée est un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus
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d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ciavant.
Ces différents aspects de l'invention seront décrits plus en détails dans la suite du texte.
MOLECULE DE CIBLAGE ET D'ASSEMBLAGE DE PROTEINES AYANT UNE ACTIVITE THERAPEUTIQUE Comme indiqué précédemment, les molécule de l'invention comprennent typiquement trois parties ou domaines fonctionnels liés les uns aux autres, à savoir un segment de ciblage (C), un segment thérapeutique (A) et un segment d'oligomérisation (0).
L'agencement des différents éléments peut varier, et notamment selon l'ordre A-O-C, CO-A, O-A-C ou C-A-O. D'autre part, dans certains modes de réalisation, la région d'oligomérisation (ou la fonction) 0 peut être insérée ou comprise au sein du segment C.
De manière plus préférée :
1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence d'apoptose ;
2) Le segment d'oligomérisation 0 est une molécule capable d'assurer l'oligomérisation de la molécule;
3) Le segment A est une molécule biologiquement active présentant des propriétés thérapeutiques, cette molécule ne présentant une activité thérapeutique essentiellement, de préférence uniquement, sous forme d'oligomère.
1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence d'apoptose ;
2) Le segment d'oligomérisation 0 est une molécule capable d'assurer l'oligomérisation de la molécule;
3) Le segment A est une molécule biologiquement active présentant des propriétés thérapeutiques, cette molécule ne présentant une activité thérapeutique essentiellement, de préférence uniquement, sous forme d'oligomère.
Dans cette invention, le segment A comprend un sous-ensemble d'une molécule oligomérique An, avec généralement n = 2 à 4, de préférence n = 2 ou 3, et seule la forme oligomérique est active au plan thérapeutique. L'oligomérisation de la molécule selon l'invention est initiée par le segment d'oligomérisation 0 qui peut éventuellement compris dans le segment C.
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L'objectif général de la présente invention est donc de produire une molécule thérapeutique utilisable dans tout domaine thérapeutique, de préférence dans les domaines de l'oncologie et de l'inflammation, dont la propriété première est d'être pratiquement inactive lorsqu'elle est à l'état de monomère libre, par exemple dans le milieu sanguin ou le milieu intercellulaire, et de ne devenir active que lorsqu'elle se lie à la surface des cellules ciblées où elle peut s'auto-associer et devenir de ce fait active par le ré-assemblage des segments A. L'association des monomères préférentiellement sur la surface membranaire des cellules cibles est rendu possible par le fait que le coût entropique de l'auto-association est plus élevé dans le milieu tridimensionnel de la solution extracellulaire qu'à la surface du milieu quasi bidimensionnel de la membrane. Il est donc nécessaire de pouvoir ajuster la force des interactions entre monomères de telle sorte qu'elle soit insuffisante pour permettre la formation d'oligomères dans l'espace tridimentionnel mais suffisante pour permettre cette oligomérisation sur l'espace bidimentionnel de la surface membranaire. Cet ajustement s'effectuera de préférence grâce aux propriétés du segment d'oligomérisation O.
On entend ici par oligomérisation la formation d'assemblages non covalents ou covalents et suffisamment stables comprenant deux ou trois monomères, voire plus.
L'assemblage s'effectue par autoassociation des monomères en raison des interactions favorables pouvant se former entre ces monomères. Les monomères peuvent être identiques ou différents. Les assemblages non covalents peuvent être pérennisés par la création ultérieure de lien covalent, par exemple par la formation de ponts disulfures. Ces ponts disulfures peuvent être formés entre les segments d'oligomérisation 0 ou entre les segments de ciblage C ou éventuellement entre un segment d'oligomérisation 0 et un segment de ciblage C. Cependant, la formation de ponts disulfure entre les segments thérapeutiques A n'est pas exclue.
Les molécules chimériques selon la présente invention peuvent s'organiser sous forme d'homo-oligomère ou d'hétéro-oligomère. De préférence, l'invention concerne les molécules chimériques s'organisant sous forme d'homo-oligomères.
De manière plus préférée :
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1) Le segment de ciblage C est une molécule capable de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules engagées dans un processus pathologique, de préférence un processus d'apoptose ;
2) Le segment d'oligomérisation 0, élément d'oligomérisation sur le site cible permettant l'assemblage des segments thérapeutiques A ;
3) Le segment A est généralement une sous unité d'une molécule biologiquement active et ne présentant des propriétés thérapeutiques que lorsque ses sous-unités sont associées .
2) Le segment d'oligomérisation 0, élément d'oligomérisation sur le site cible permettant l'assemblage des segments thérapeutiques A ;
3) Le segment A est généralement une sous unité d'une molécule biologiquement active et ne présentant des propriétés thérapeutiques que lorsque ses sous-unités sont associées .
Le segment 0 peut éventuellement être intégré dans le segment de ciblage C.
Segment de Ciblage C a- Segment de ciblageC passif.
On entend par molécule de ciblage passive une molécule dont la seule fonction est de pouvoir se lier à sa cible tel qu'il est décrit dans les paragraphes suivants.
Le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu présentant une pathologie, ou générées dans ce tissu par un traitement préalable ou combiné. Ce segment de ciblage C est de préférence capable de se lier aux membranes des cellules engagées dans un processus d'apoptose, celles-ci exposant à leur surface des lipides chargés négativement comme la phosphatidylsérine.
Dans un premier mode de réalisation préféré, la partie C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules tumorales ou présentes dans un tissu tumoral ou générées dans ces tissus par un traitement au moyen d'un agent favorisant l'apoptose, par exemple un anti-tumoral (chimiothérapie, radiothérapie, etc.).
Dans un autre mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide capable de se lier préférentiellement à la surface des cellules présentes dans un tissu inflammatoire et en particulier les cellules neutrophiles qui s'accumulent dans ces
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tissus et y meurent par apoptose 24 à 48 heures après leur arrivée. Les neutrophiles constituent des appâts pour les molécules de ciblage.
Le terme se lier préférentiellement indique que l'élément de ciblage possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou tissus ne peut être totalement exclue in vivo. La liaison préférentielle assure néanmoins un ciblage des molécules chimères de l'invention vers les sites pathologiques, réduisant la dissémination et les effets secondaires potentiels.
Le segment de ciblage C est de préférence une molécule peptidique. On entend par molécule peptidique toute molécule composée ou comprenant des acides aminés, naturels ou non, éventuellement modifiés, comme par exemple toute protéine ou fragment de protéine, un polypeptide ou peptide, naturels ou synthétiques, modifiés ou non. La propriété commune de ces éléments est de pouvoir se lier de manière préférentielle à des cellules caractéristiques de situations pathologiques et, dans un mode plus préféré, aux membranes cellulaires exposant des lipides chargés négativement, notamment la phosphatidylsérine. D'une façon générale, la présente invention prévoit l'utilisation de toute protéine, fragment ou dérivé de protéine répondant à ce critère.
Il existe plusieurs familles de protéines capables de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement. On peut citer notamment la famille des Annexines, les familles de protéines comportant un domaine Clou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine ; les familles de protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE ; encore les protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des p2-Glycoprotéines-I (ssGP-I). Ces protéines, ou des domaines issus ou dérivés de leurs séquences peuvent être utilisés comme élément de ciblage dans les molécules chimères de l'invention. Pour des raisons d'immunogénicité, on choisit de préférence la version humaine de ces protéines ou domaines de protéines. De plus, il convient chaque fois que cela est possible, de sélectionner et d'utiliser le plus petit domaine actif de ces protéines afin d'assurer la meilleure diffusion de la molécule au travers de la micro-vascularisation vers les tissus ciblés et surtout une meilleure biodistribution et élimination par la voie rénale.
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Dans un mode de mise en #uvre particulier de la présente invention, l'élément de ciblage comprend une séquence peptidique dérivée des protéines ou fragments de protéines mentionnés plus haut. Ces dérivés présentent au moins 50 % d'identité avec les protéines initiales ou les fragments de celles-ci. De préférence, ils présentent 60 %, 75 %, 90 % ou 95 % d'identité. Certains des domaines de protéines mentionnés, notamment les domaines PH et FYVE, peuvent par ailleurs être mutés de façon à modifier leur spécificité lipidique pour les adapter aux besoins précis du ciblage de cellules en phase apoptotique.
Le segment de ciblage C peut contenir un ou plusieurs sites de liaison au segment thérapeutique A. La présence de plusieurs sites présente l'avantage de pouvoir distribuer plusieurs molécules thérapeutiques A en une seule fois et d'augmenter dans les mêmes proportions la concentration de A dans l'environnement des tissus touchés par la pathologie concernée.
Dans un autre mode de réalisation, éventuellement combinable avec le précédent, le segment de ciblage C peut comprendre une répétition de plusieurs polypeptides ou motifs de liaison aux cellules pathologiques ou cibles, afin d'augmenter l'efficacité du ciblage.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend la séquence d'une annexine, ou d'un fragment ou un dérivé de celle-ci. Le segment de ciblage C comprend de préférence la séquence du coeur à quatre domaines d'une protéine de la famille des annexines. De préférence, l'annexine est de type V, un fragment ou un dérivé de celle-ci. L'annexine d'origine humaine est privilégiée. De préférence, le segment de ciblage C comprend le domaine 1 de cette annexine.
Selon une première variante spécifique de l'invention, le segment de ciblage C comprend un domaine de type Cl ou C2, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Plus particulièrement, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine Cl d'un facteur de coagulation, un fragment ou un dérivé de celui-ci. De façon alternative, l'invention concerne des segments de ciblage C comprenant la séquence d'un domaine C2 du facteur VIII humain de la coagulation, un fragment ou un dérivé de celui-ci.
Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type Cl. De préférence, le segment de ciblage C
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comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 1-8, de préférence SEQ ID Nos 2-4, et 6-8, ou un fragment de celui-ci.
Domaine de type CI du facteur V humain de la coagulation - ClF5-S0 (F- V) séquence sauvage (SEQ ID No 1) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYV AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type CI dufacteur V humain de la coagulation C1F5-S1 (SEQ ID No 2) DCRMPLGMST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWLQI DMQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC C1F5-S2 (SEQ ID No 3) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWWPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWIQV DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYVTEFYV AYSSNQINWQ IFKYNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQFDPP LVARYIRISP TRAYNRITLR LELQGC C1F5-S3 (SEQ ID No 4) DCRMPMGLST GIISDSQIKA SEFLGYWEPR LARLNNGGSY NAWSVEKLAA EFASKPWLQI DLQKEVIITG IQTQGAKHYL KSCYTTEFYI AYSSNQINWQ IFKGNSTRNV MYFNGNSDAS TIKENQLDPP IVARYIRISP TRAYNRPTLR LELQGC Domaine de type Cl du facteur VIII humain de la coagulation - ClF8-S0 (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 5) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS
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TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type CI du facteur VIII humain de la coagulation C1F8-S1 (SEQ ID No 6) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QYIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC C1F8-S2 (SEQ ID No 7) KCQTPMGLAS GHIRDFQITA SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGVKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRYNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC C1F8-S3 (SEQ ID No 8) KCQTPLGMAS GHIRDFQITA SGQYGQWWPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WLKIDLLAPM IIHGIKTQGA RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI FNPPLLARYI RLHPTHYSIR STLRMEVMGC Dans un autre mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de domaine de type C2. De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 9-16, de préférence SEQ ID Nos 10-12, et 14-16, ou un fragment de celui-ci.
Domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation - C2F5-SO (F-V) séquence sauvage (SEQ ID No 9) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEI DLLKIKKITA IITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur V humain de la coagulation C2F5-S1 (SEQ ID No 10) CSTPLGMENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQPK
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ANNNKQWLEV DLLKIKKITA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PFRLKSSMVD KINEGNTNTK GHVKNFPNPP RISRFIRVIP KTWNQSITLR LELFGCDIY C2F5-S2 (SEQ ID No 11) CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRARLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWLEM DFLKIKKVTA VITQGCKSLS SEMYVKSFTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IISRFIRQIP KTWNQSITLR LELYGCDIY C2F5-S3 (SEQ ID No 12) CSTPLGIENG KIENKQITAS SFKKSWWGDY WEPFRLRLNA QGRVNAWQAK ANNNKQWAEM DLLKIKKITA IITQGCKSLS SEMYVKSYTI HYSEQGVEWK PYRLKSSMVD KIFEGNTNTK GHVKNFFNPP IITRFIRVIP KTWNQSITIR LELFGCDIY Domaine de type C2 dufacteur VIII humain de la coagulation - C2F8-SO (F- V) séquence sauvage (SEQ ID No 13) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGC Polypeptides construits sur la base du domaine de type C2 du facteur VIII humain de la coagulation C2F8-S1 (SEQ ID No 14) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKEWLQID LQKTMKITGI TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPVSW VHQIALRMEV LGC C2F8-S2 (SEQ ID No 15) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRAQV NNPKQWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGFQDSFTPV VNSLDPPLLT IYLRIHPQSW VHQIALRMEV LEC
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C2F8-S3 (SEQ ID No 16) CSMPLGMESK AISDAQITAS SYKTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEYLIS SSQDGHQWTL FYQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPFLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LEC Dans un mode préféré de réalisation, le segment de ciblage C est un polypeptide construit sur la base d'une topologie de type domaine 5 des (32-Glycoprotéines-I (p2GP-I) (SEQ ID No 17). De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 17-22, de préférence SEQ ID Nos 18-22, ou un fragment de celui-ci.
Domaine 5 des f32-Glycoprotéines-I humaines -,62GP-I séquence sauvage (SEQ ID No 17) TKASCKVPVK KATVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKVSFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCFKEH SSLAFWKTDA SDVKPC Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante :
TJ2ASCKU7PU9KJi1U12TU,4U15U16Ji7GERU2iJ22U23QEKU27J28NGML HGDKU3SFU4pCJ42NJ44EJ46J4CJ49YTEDUs4QCIDGTU61EVPKCU6 J68 E H S J72U73U74J75J76J77 T D A S D V J84 P C (SEQ ID No 18) (SI) où : J2 = K , D, E ; J11, J22, J28, J42, J44, J46, J47, J68, J77, J17 = Q, E ; J84 = K, R ; J49 = S,
T;J72=S,T,M;U7=L,V,I;U9=V,I,T;U12=A,M;U14,U15,U21,U23,U37= V, I, T ; U16, U27, U40 ,U67 = F, Y ; U54 = A, V, I ; U61 = I, V, M ; U73, U74,U75,U76 = L, I, F, Y, M, W.
TJ2ASCKU7PU9KJi1U12TU,4U15U16Ji7GERU2iJ22U23QEKU27J28NGML HGDKU3SFU4pCJ42NJ44EJ46J4CJ49YTEDUs4QCIDGTU61EVPKCU6 J68 E H S J72U73U74J75J76J77 T D A S D V J84 P C (SEQ ID No 18) (SI) où : J2 = K , D, E ; J11, J22, J28, J42, J44, J46, J47, J68, J77, J17 = Q, E ; J84 = K, R ; J49 = S,
T;J72=S,T,M;U7=L,V,I;U9=V,I,T;U12=A,M;U14,U15,U21,U23,U37= V, I, T ; U16, U27, U40 ,U67 = F, Y ; U54 = A, V, I ; U61 = I, V, M ; U73, U74,U75,U76 = L, I, F, Y, M, W.
De préférence, le segment de ciblage C comprend un polypeptide de séquence choisie parmi SEQ ID Nos 19-22 ou un fragment de celui-ci : Polypeptides construits sur la base du domaine 5 des ss2-Glycoprotéines-I humaines GPI-S1 (SEQ ID No 19) TEASCKVPVK RATVVYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKVSFF CRNRERRCSY
<Desc/Clms Page number 17>
TEDAQCIDGT IEVPKCYREH SMLTWWRTDA SDVKPC GPI-S2 (SEQ ID No 20) TEASCKLPTK RMTWYEGER VRIQEKFKNG MLHGDKISFF CRNRERRCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYREH SMITWWRTDA SDVKPC GPI-S3 (SEQ ID No 21) TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAWWKTDA SDVKPC GPI-S4 (SEQ ID No 22) TKASCKVPTK KMTVVYQGER VKIQEKFKNG MLHGDKISFF CKNKEKKCSY TEDAQCIDGT IEVPKCYKEH SSLAFWKTDA SDVKPC Dans un mode de réalisation préféré, le segment de ciblage C comprend un polypeptide dont la séquence générale est la suivante :
J 1 ~ J2-J3~ J4~ Js-J6-z7-Us-J9-J 1 o-Ul 1-R~ J 13~ J 14-U 1 s~K-G~Xl s--i~ J21 ~E- J23-J24-U2s~ Jz6-J27~ Jz8- Ü29~J30~J31~R~J33~J34~J35~J36~B37~J38~J39~U40~J41~J42~J43~U44~J45~J46~J47~J48~J49~R~Jsl~Us2~J53~ J54-D-U56-K~s-zs9~L-J61- J62~ J63~ J64-Z6s~ J66-J67~U68-J69~ J70-J71-U72- J73-J74-J7s~ J76 (S2) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V, - l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
J 1 ~ J2-J3~ J4~ Js-J6-z7-Us-J9-J 1 o-Ul 1-R~ J 13~ J 14-U 1 s~K-G~Xl s--i~ J21 ~E- J23-J24-U2s~ Jz6-J27~ Jz8- Ü29~J30~J31~R~J33~J34~J35~J36~B37~J38~J39~U40~J41~J42~J43~U44~J45~J46~J47~J48~J49~R~Jsl~Us2~J53~ J54-D-U56-K~s-zs9~L-J61- J62~ J63~ J64-Z6s~ J66-J67~U68-J69~ J70-J71-U72- J73-J74-J7s~ J76 (S2) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, ou des dérivés de ceux-ci, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V, - l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
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De préférence, les acides aminés J peuvent être choisis indépendamment les uns des autres parmi l'ensemble des résidus A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, Orn, F, P, S, T, W, Y, et V, et de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T.
Différentes combinaisons de résidus U et B sont données dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1
Us Un u15 Uzs Uzy B37 U40 U44 Usz u56 u6g Il
Tableau 1
Us Un u15 Uzs Uzy B37 U40 U44 Usz u56 u6g Il
<tb>
<tb> Ex <SEP> 1 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Ex2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L
<tb> Ex3 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V <SEP>
<tb> Ex4 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex5 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> V <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F
<tb> Ex <SEP> 8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex10 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> A <SEP> A
<tb> Exil <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L <SEP>
<tb>
A titre d'exemple, le peptide de formule S2 peut être avantageusement une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID No 23-32.
<tb> Ex <SEP> 1 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Ex2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L
<tb> Ex3 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V <SEP>
<tb> Ex4 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex5 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> V <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F
<tb> Ex <SEP> 8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M
<tb> Ex10 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> A <SEP> A
<tb> Exil <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L
<tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L <SEP>
<tb>
A titre d'exemple, le peptide de formule S2 peut être avantageusement une séquence peptidique choisie parmi les séquences peptidiques SEQ ID No 23-32.
La séquence S2 représente un type de peptides dans sa forme la plus courte. Il est bien entendu que cette séquence peut comprendre en outre un ou plusieurs acides aminés supplémentaire à l'une ou l'autre des extrémités, par exemple de 1 à 15 acides aminés, en général de 1 à 10 acides aminés pour obtenir une fonctionnalisation supplémentaire. Par exemple, une petite séquence, dite de fonctionnalisation, peut être liée au peptide permettant la fixation au segment L. Cette séquence de fonctionnalisation peut être située à l'extrémité N-terminale de la séquence S2. Elle peut être d'environ 3 acides aminés choisis de préférence parmi G-S-C-, G-S-T-, G-S-P-, G-S-S-, G-S-G-, et G-S-Q-. Elle peut être également d'environ 4 acides aminés, choisis de préférence parmi les séquences G-S-Aa-
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C-, G-C-Aa-S-, G-S-Aa-S-, G-C-Aa-C-, et G-C-Aa-S- où Aa est un acide aminé quelconque.
Ces séquences de fonctionnalisation sont avantageuses en ce qu'elles permettent en particulier le marquage aisé par des radio-traceurs comme le 99mTc ou le 18F et permettent, par injection chez l'homme à dose traceuse, de suivre parfaitement in vivo le devenir du médicament, sa bio-distribution et de contrôler sa bonne localisation.
Par ailleurs la séquence S2 peut être dupliquée au sein d'un même peptide pour produire une molécule présentant une affinité encore plus élevée pour les sites apoptotiques. b- Segment de ciblage C actif.
Le segment de ciblage est dit actif lorsqu'il possède, en plus de sa fonction de ciblage, la capacité de s'auto-associer à la surface des cellules cibles telles que définies plus haut pour former des oligomères ou multimères, de préférence des dimères et des trimères.
Cette disposition est plus particulièrement intéressante dans le cas où l'on souhaite ne pas utiliser de segment d'oligomérisation 0 distinct afin de réduire au maximum la taille de la protéine finale.
Cette propriété est plus particulièrement intéressante dans le cas où le segment A comprend une sous-unité d'une molécule pro-apoptotique comme les molécules de la famille des facteurs de nécrose tumorale constituées de trois sous-unités qui doivent être assemblée pour former une molécule active. Certaines molécules de cette famille et en particulier les ligands inducteurs de l'apoptose (TRAIL) sont plus particulièrement intéressant pour la thérapie anti-tumorale.
Cette propriété est aussi particulièrement intéressante dans le cas où le segment A comprend une sous-unité d'un récepteur d'une molécule impliquée dans l'initiation ou le développement du processus inflammatoire comme par exemple les cytokines et notamment les molécules de la famille du facteur de nécrose tumorale a (TNFa). Ces récepteurs ne sont capables de lier leur molécule cible et donc de la séquestrer que lorsque ses sous-unités sont assemblées correctement sous forme de dimère ou de trimère. L'effet de cette séquestration est de réduire la progression du phénomène inflammatoire.
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Dans un mode particulier de la présente invention, on se propose tout d'abord de provoquer la formation de multimères, de préférence de dimères ou de trimères, du segment A grâce au segment C et ce, spécifiquement lorsque les parties C se lient à la surface membranaire des cellules cible, de préférence du tissu inflammatoire ou du tissu cancéreux, et en particulier des cellules en phase apoptotique. Le principe est maintenant décrit.
Il est possible, par des mutations appropriées, de générer des interactions intermoléculaires entre les segments C des molécules chimériques de façon à provoquer leur autoassociation. On peut de plus moduler la force de ces interactions de telle sorte que les segments C ne puissent s'auto-associer de façon substantielle que lorsque ces molécules se trouvent liées à une membrane chargée négativement. Ceci est rendu possible comme il a été dit plus haut par le fait que le coût entropique de l'auto-association est plus élevé dans le milieu tridimensionnel de la solution extra-cellulaire qu'à la surface du milieu quasi bidimensionnel de la membrane. Dans l'environnement extracellulaire et en l'absence de membrane chargée négativement, la molécule chimérique reste majoritairement sous forme de monomère et est inactive. Son action non-spécifique est alors très limitée et peu susceptible de générer des effets secondaires. Par contre, lorsque le segment C de la molécule thérapeutique se lie à la membrane des cellules cibles, le coût entropique d'autoassociation est réduit et les segments C peuvent s'assembler et permettre la reconstitution d'une molécule thérapeutique ou d'un récepteur dont chaque sous-unité est contenue dans le segment A.
Dans un premier mode de réalisation, le segment C actif comprend la mini-protéine construite sur la base d'une topologie de domaine d'annexine telle que définie plus haut et modifiée de telle sorte qu'elle puisse s'associer par une surface hydrophobe conçue pour être complémentaire et permettre la dimérisation du segment C.
Ce mode d'interaction et de dimérisation de deux segments C indépendants mime le mode d'interaction qui existe entre les domaines 1 et 4 d'une part et les domaines 2 et 3 d'autre part de toutes les protéines de la famille des annexines. Ce mode résulte d'un choix judicieux des résidus des deux sous-segments J24-S31 et J66-J73 de la séquence S2 qui vont
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constituer l'interface d'interaction entre les deux monomères ainsi que divers autres résidus comme les résidus B37, J74 et suivants.
Un exemple de choix de résidus est donné dans le tableau 2.
Tableau 2
j24 u25 11 1 1 1 1 1 1 u J6 j'" i u i
j24 u25 11 1 1 1 1 1 1 u J6 j'" i u i
<tb>
<tb> E <SEP> I <SEP> L <SEP> T <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> S/T <SEP> E <SEP> V <SEP> V <SEP> V/A <SEP> A/T/S <SEP> L <SEP> L <SEP> K
<tb> B37 <SEP> J74 <SEP> J75 <SEP> J76 <SEP>
<tb> R <SEP> P/G <SEP> D/E
<tb> L/I/M <SEP> P/G <SEP> L/I/V <SEP> D/E/R/K
<tb>
Ainsi, l'invention concerne donc une molécule chimérique comportant un segment de ciblage C comprenant la séquence S2 dans laquelle on trouve :
E en J24, J66, 1 en U25,L en J26, J28, U29, J71, et U72; T en J27 ; V en J30, J67,
et 168 ; S ou T en J31 ; V ou A en J69 ; A, T ou S en J ; K en J ;P ou G en J74 ; R en B37 et D ou E en J75; ou, E en J24, J66, I en U25, L en J26, J28, U29, J1, et UZ ; T en JZ ; V en J3 , J6, etJ68 ; S ou T en J3 ; V ou A en J69; A, T ou S en J ; K en J ;P ou G en
J74; L, I, ou M en B37 ; L, I, ou V en J75; et D, E, R, ou K en J76.
<tb> E <SEP> I <SEP> L <SEP> T <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> S/T <SEP> E <SEP> V <SEP> V <SEP> V/A <SEP> A/T/S <SEP> L <SEP> L <SEP> K
<tb> B37 <SEP> J74 <SEP> J75 <SEP> J76 <SEP>
<tb> R <SEP> P/G <SEP> D/E
<tb> L/I/M <SEP> P/G <SEP> L/I/V <SEP> D/E/R/K
<tb>
Ainsi, l'invention concerne donc une molécule chimérique comportant un segment de ciblage C comprenant la séquence S2 dans laquelle on trouve :
E en J24, J66, 1 en U25,L en J26, J28, U29, J71, et U72; T en J27 ; V en J30, J67,
et 168 ; S ou T en J31 ; V ou A en J69 ; A, T ou S en J ; K en J ;P ou G en J74 ; R en B37 et D ou E en J75; ou, E en J24, J66, I en U25, L en J26, J28, U29, J1, et UZ ; T en JZ ; V en J3 , J6, etJ68 ; S ou T en J3 ; V ou A en J69; A, T ou S en J ; K en J ;P ou G en
J74; L, I, ou M en B37 ; L, I, ou V en J75; et D, E, R, ou K en J76.
Dans un second mode de réalisation possible, l'oligomérisation est effectuée par le remplacement d'un ou plusieurs résidus de surface judicieusement positionnés d'un segment C quelconque par un résidu cystéine de façon à générer la formation d'un pont disulfure permettant la dimérisation. Le milieux extracellulaire oxydant et l'effet de concentration et d'orientation lié à l'accumulation de la molécule chimérique à la surface des cellules cibles favorisent la formation de ces oligomères, plus particulièrement à une échelle de temps de l'ordre de 30 minutes. Par exemple, dans l'ensemble de séquences S2, l'un des résidus J27 ou J70 peut être remplacé par une cystéine pour l'obtention de dimères. Si ces deux résidus sont simultanément remplacés par une cystéine, des oligomères covalents d'ordre bien supérieurs à deux sont obtenus.
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Segment d'oligomérisation 0: Le segment C n'ayant seulement qu'une fonction de ciblage, c'est-à-dire de liaison aux cellules ciblées, la fonction d'oligomérisation de la molécule chimère doit être assurée par le segment d'oligomérisation O. Cependant, la présente invention n'exclue pas la possibilité que les segments C et 0 comportent tous deux la capacité d'assurer l'oligomérisation de la molécule.
Les propriétés d'oligomérisation 0 sont analogues à celles décrites plus haut pour un segment de ciblage C actif: le segment 0 doit pouvoir s'associer en multimère, de préférence en dimère ou en trimère.
Le segment d'oligomérisation 0 est un polypeptide qui permet d'établir des interactions entre segments d'oligomérisation pour former des oligomères à la surface des celulles ciblées. Ce segment peut être produit à partir de molécules formant des multimères. Ce segment 0 peut être une séquence d'immunoglobuline (par exemple, région constante), une crémaillère à leucine (Leucine Zipper), une région hydrophobe, une région hydrophile, un polypeptide comprenant une fonction thiol libre, un domaine protubérance into cavity décrite dans le brevet US 5,731,168, etc... L'homme du métier dispose d'une littérature fournie sur ce domaine. La demande de brevet WO 96/37621 décrit des domaines de multimérisation issus des protéines p53, PF4, TSP-4, COMP, thrombosporine, histone 3, histone 4, les facteurs associés aux protéines de liaison de la TATA Box (TAFII).
On choisira de préférence des séquences peptidiques capables de se structurer en hélice et de s'associer en structure oligomériques dite super enroulée (Coiled-coils, Leucine-Zippers ...). Ce type de structure et leurs méthodes d'ingéniérie sont connus de l'homme du métier et bien documentés (Lupas, 1997, Curr Opin Struct Biol. 7,388-393). Notamment, la littérature enseigne à l'homme du métier comment controler les ordres d'oligomérisation et le type d'oligomérisation (homo-oligomère ou hétéro-oligomère).
Ces hélices comportent une répétition d'un motif à sept résidus dont la position est donnée par la séquence générique suivante : (a-b-c-d-e-f-g)n (SCC-1)
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Les résidus a et d sont des résidus hydrophobes (h) et les autres résidus sont généralement polaires (p) : (h-p-p-h-p-p-p)n Les résidus h constituent l'interface apolaire entre les hélices dans l'assemblage super enroulé.
Le grand intérêt de ces séquences est que l'on peut non seulement faire varier la force des interactions conduisant aux structures associées, c'est-à-dire modifier l'équilibre monomère-oligomère, mais on peut aussi faire varier le degré d'oligomérisation, c'est-àdire sélectionner par exemple la forme trimère plutôt que la forme dimère.
De préférence, le segment de laison comprendra au moins 2 motifs à sept résidus (SCC-1), de préférence entre 2 et 6 motifs, de manière encore plus préférée 3 ou 4 motifs.
De très nombreuses protéines (3-5% du génome) comportent des segments en hélice d'oligomérisation, souvent de dimérisation. La famille la plus étudiée de peptides formant des structures super enroulées est constituée par le segment de dimérisation appelé leucine zipper de facteurs de transcription et notamment d'un facteur de transcription de la levure, le GCN4.
L'objectif de la présente invention est d'associer à un segment de ciblage C un segment d'oligomérisation appartenant à la famille des peptides capables de former des structures super enroulées destinées à reconstituer par association l'activité fonctionnelle du segment A.
Dans un premier mode de réalisation préférée, on choisira la séquence du segment 0 parmi les séquences homologue des crémaillères à leucine Leucine-Zippers des facteurs de transcription dont la séquence la plus générale est la suivante, adoptant la nomenclature de la séquence SCC-1 :
X~~~ri2yno aib2C3d4esf6g7 a8b9codllel2fl3g14 alsbi6cudi8ei9f2og2i a22b23C24d25e26f27g28 a29b30C31 t1t2---ty (SCC-2)
X~~~ri2yno aib2C3d4esf6g7 a8b9codllel2fl3g14 alsbi6cudi8ei9f2og2i a22b23C24d25e26f27g28 a29b30C31 t1t2---ty (SCC-2)
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* n-1--n-x sont des résidus N-terminaux de 0 destinés à assurer la liaison avec le segment C ; * t1t2---ty sont des résidus C-terminaux de 0 destinés à assurer la liaison avec le segment A ; * x et y sont choisis de telle sorte que respectivement l'assemblage de 0 ne soit pas gêné par le segment C et l'assemble du segment A se soit pas gêné par l'assemblage de L, une valeur de 3 étant une valeur avantageusement optimale ; * les résidus de liaison n et t peuvent avantageusement être des résidus glycine afin d'assurer une bonne flexibilité entre les segments C et 0 d'une part et les segments
O et A d'autre part.
O et A d'autre part.
* les résidus de liaison nx à a1 peuvent facultativement comporter deux résidus cystéine selon le motif Cys-X-Cys pour permettre dans certaines applications la formation de ponts disulfure afin de pérenniser la structure super enroulée, X étant n'importe quel résidu.
Dans la séquence SCC-2, les résidus a et d sont majoritairement des résidus hydrophobes mais l'ordre d'oligomérisation peut être modifié par l'introduction d'un résidu polaire à l'une au moins des positions a ou d. Les résidus a et d seront donc choisis parmi l'ensemble suivants selon les applications souhaitées : Leu, Ile, Val, Met, Thr, Ser, Gln, Asn. Un résidu polaire comme le résidu Gln de la liste précédente placé par exemple en a8 permet de favoriser la formation d'un trimère.
Les résidus de rang e et g sont des résidus polaires, mais certains peuvent être avantageusement choisis parmi les ensembles suivants afin de stabiliser la structure super enroulée par la formation de ponts salins entre les hélices constituant cette structure : e = Arg, Lys ; et g = Glu, Asp et inversement.
Les résidus de rang b et c sont de préférence des résidus polaires et seront choisis de préférence pour générer le moins possible de réaction immunitaire.
D'autres segments de protéine sont aussi connue pour former des hélices super enroulées, et en particulier de protéines de la matrice extracellulaire. L'avantage de ces protéines est
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leur très faible caractère immunogène de principe. Nous retenons particulièrement les protéines de la famille des matrilines qui possèdent un segment de type hélice super enroulée conduisant à une structure trimérique.
Les séquences spécifiques retenues correspondent à la région C-terminale des matrilines humaines Ml à M4 : (SCC-3) -3 1 8 15 22 29 36 defg abcdefg abcdefg abcdefg abcdefg abcdefg abcd Consensus Ml : DPCA CESLVKF QAKVEGL LQALTRK LEAVSKR LAILENT VV-- SEQ ID No33 M2 : DQCK CENLIMF QNLANEE VRKLTQR LEEMTQR MEALENR LRYR SEQ ID No34 M3 : DACG CEATLAF QDKVSSY LQRLNTK LDDILEK LKINEYG QIHR SEQ ID No35 M4 : SPCE CESLVEF QGRTLGA LESLTLM AQLTARL EDLENQL ANQK SEQ ID No36 Dans un mode de réalisation préféré, le segment d'oligomérisation comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 33-36 ou un fragment de celles-ci d'au moins 14 acides aminés, de préférence d'un moins 21 acides aminés.
D'une façon plus générale on pourra choisir une séquence parmi l'ensemble suivant, défini à partir d'une séquence analogue à la séquence générale SCC-2 :
n-x--n-2n-lno aib2C3d4e5f6g7 a8b9ClOdlle12f13g14 alsb6cI7dseI9f2og21 a22b23C24d25e26f27g28 a29b30C31 d32e33f34g35a36totlt2-~~ty avec : nx--n2 = tous résidus, de préférence Gly; n-1 = Cys, Ser ou tout résidu hydrophobe ; no = n'importe quel résidu selon les besoins ; a1 = Cys, Ser ; b2 = Glu, Gln, Asp, Asn ;
C3 , b9 en, fi3, g14, bi6, Cl7, e19, f2o, g21, b23, C24, e26, f27, b301 f34, g35 = n'importe quel résidu de préférence polaire selon les besoins ; d4 = Leu, Ile, Thr ; e5 = Leu, Ile, Val ; f6 = n'importe quel résidu selon les besoins ; g7 = Phe, Tyr ; a8 = Ala, Leu, Ile, Val, Thr et de préférence Gln ;
n-x--n-2n-lno aib2C3d4e5f6g7 a8b9ClOdlle12f13g14 alsb6cI7dseI9f2og21 a22b23C24d25e26f27g28 a29b30C31 d32e33f34g35a36totlt2-~~ty avec : nx--n2 = tous résidus, de préférence Gly; n-1 = Cys, Ser ou tout résidu hydrophobe ; no = n'importe quel résidu selon les besoins ; a1 = Cys, Ser ; b2 = Glu, Gln, Asp, Asn ;
C3 , b9 en, fi3, g14, bi6, Cl7, e19, f2o, g21, b23, C24, e26, f27, b301 f34, g35 = n'importe quel résidu de préférence polaire selon les besoins ; d4 = Leu, Ile, Thr ; e5 = Leu, Ile, Val ; f6 = n'importe quel résidu selon les besoins ; g7 = Phe, Tyr ; a8 = Ala, Leu, Ile, Val, Thr et de préférence Gln ;
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c10, g28, = n'importe quel résidu de préférence polaire et chargé positivement selon les besoins ; d11= Ala, Leu, Ile, Val, Thr ; a1 5 = Leu, Ile ou Val ; dis = Ile, Val et de préférence Leu ; a22 = Ala, Leu, Ile, Val ; d25, a29, = Ala, Leu, Ile, Val, Met, Thr ; c31 = n'importe quel résidu de préférence hydrophobe selon les besoins ; d32 = Ala, Leu, Ile, Val, Met, Thr, Ser, Asn, Asp, Glu, Gln ; e33 = n'importe quel résidu de préférence polaire et chargé négativement selon les besoins ; a36 = Ala, Leu, Ile, Val, Met, Thr, Gln ; segment t0t1t2---ty = tous résidus, de préférence des résidus polaires et des Gly ; On notera le rôle particulier joué par les résidus n-1 et ai. Lorsque ces résidus sont simultanément des cystéines, la formation de ponts disulfures interchaîne favorise et stabilise l'assemblage en trimère. Un avantage particulier de la présence de ponts disulfures potentiels est d'ordre cinétique. Avant l'injection chez l'homme ou l'animal, le composé thérapeutique peut être maintenu monomérique après réduction des ponts disulfures qui auraient pu se former. Après injection, la cinétique de re-formation des ponts disulfures dans le milieu extracellulaire qui est oxydant n'est pas très rapide, ce qui permet aux monomères d'atteindre leur cible et de s'accumuler sur celle-ci. L'effet de concentration sur la surface des cellules apoptotiques qui en résulte favorise la formation des trimères par auto-association puis l'établissement des ponts disulfures qui pérennisent ainsi les assemblages trimériques. L'utilisation de cystéines judicieusement placées peuvent être aussi utilisées pour pérenniser des structures dimériques ou plus généralement oligomériques.
Dans un mode de réalisation particulier, il y aura un avantage à remplacer le résidu a8 par un résidu hydrophobe pour favoriser la formation de dimères par rapport à la formation de trimères favorisée lorsque a8 est le résidu polaire Gln.
Dans un autre mode de réalisation particulier, certain résidus, notamment hydrophobes, pourront être remplacés par des résidus non-naturels parmi lesquels des résidus où certains
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atomes d'hydrogène de la chaîne latérale sont remplacés par des atomes de fluor. Les dérivés trifluorés ou hexafluorés de la leucine ou de la valine sont des exemples de tels résidus.
Segment clivable Lc Dans un mode particulier supplémentaire de réalisation, il y aura avantage à ajouter un segment clivable Le sensible à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé. De préférence, ce segment clivable Lc sera placé de tel sorte à séparer le segment de ciblage C des segments d'oligomérisation 0 et thérapeutique A.
Ce segment clivable Lc est destiné à être clivé par les protéases produites par les cellules de l'environnement inflammatoire ou tumoral et nommées ici protéases intervenantes .
Cet élément permet d'assurer la libération in situ des molécules thérapeutiques dont l'activité dépend de leur état d'oligomérisation.
Les protéases de l'environnement inflammatoire ou tumoral sont essentiellement des protéine de la famille des métallo-protéases de dégradation de la matrice extracellulaire assez spécifiquement exprimées dans ces environnements. Dans ce dernier mode de réalisation, la molécule thérapeutique de la présente invention a l'une des structures générales suivantes : C-Lc-O-A A-O-Lc-C
C-Lc-A-0 0-A-Lc-C Les cellules tumorales et inflammatoires, ainsi que, par exemple, les cellules stromales recrutées dans l'environnement de celles-ci, sont connues pour excréter une variété de protéases intervenantes, en particulier des métallo-protéases de la matrice extra-cellulaire (MMP) (Tableau 3), des urokinases, une protéase spécifique du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs, etc. Ces protéases intervenantes jouent un rôle important dans l'évolution de la tumeur ou du tissu inflammatoire et notamment dans l'envahissement des tissus environnants et la formation de métastases, ou l'envahissement par les cellules spécialisées de la réaction
C-Lc-A-0 0-A-Lc-C Les cellules tumorales et inflammatoires, ainsi que, par exemple, les cellules stromales recrutées dans l'environnement de celles-ci, sont connues pour excréter une variété de protéases intervenantes, en particulier des métallo-protéases de la matrice extra-cellulaire (MMP) (Tableau 3), des urokinases, une protéase spécifique du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs, etc. Ces protéases intervenantes jouent un rôle important dans l'évolution de la tumeur ou du tissu inflammatoire et notamment dans l'envahissement des tissus environnants et la formation de métastases, ou l'envahissement par les cellules spécialisées de la réaction
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inflammatoire. Par exemple, le taux de MMP dans l'environnement tumoral ou inflammatoire est bien supérieur à celui présent dans un tissu normal car, en particulier, le contrôle de l'expression de ces MMP dépend de l'action de certaines cytokines.
Le segment clivable Lc est donc un lien au moins partiellement peptidique comportant une séquence reconnue et clivée par une protéase intervenante majoritairement présente dans le tissu ciblé. Le lien Lc peut donc être représenté comme comprenant deux parties La-Lb, conçues de telle sorte que les protéases intervenantes clivent la liaison peptidique du lien entre La et Lb. La longueur des parties La et Lb peut être optimisée en fonction de l'accessibilité nécessaire au site actif des protéases intervenantes, avec la contrainte de limiter autant qu'il se peut la taille finale de la molécule pour les raisons évoquées plus haut.
Dans certains modes de réalisation, le segment supplémentaire Lc fait partie de l'élément C ou O. Il peut s'agir par exemple d'une extension N-terminale ou C-terminale du segment C ou 0, notamment lorsque ce dernier est de nature peptidique.
On présente dans les exemples suivants un ensemble de séquences peptidiques pour La-Lb répondant aux divers critères donnés dans l'ensemble du texte qui précède :
J-n--J0-B1-B2-J3-Jc (S6) où : * J-n-J0-B1 représente le segment La ; * B2-J3--Jc représente le segment Lb; * la liaison peptidique B1-B2 est la liaison clivée par les protéases intervenantes.
J-n--J0-B1-B2-J3-Jc (S6) où : * J-n-J0-B1 représente le segment La ; * B2-J3--Jc représente le segment Lb; * la liaison peptidique B1-B2 est la liaison clivée par les protéases intervenantes.
* n et c peuvent varier de 0 à environ 10 et dépendent de l'extrémité choisie pour la liaison au segment A ; pour l'extrémité liée à A, la valeur de n ou c sera faible et de préférence égale à 0 (J3 seulement présent) et pour l'extrémité opposée la valeur de n ou c n'est pas limitée.
Le tableau suivant donne un exemple d'ensemble de séquences B1-B2 reconnues et clivées par les différentes protéases intervenantes et utilisables préférablement pour un segment Lc clivable :
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Tableau 3
<tb>
<tb> B1 <SEP> B2 <SEP> Exemple <SEP> de <SEP> protéase <SEP> concernée
<tb> Val/Ala/Leu/Met <SEP> X <SEP> Elastase <SEP> des <SEP> neutrophiles
<tb> Leu/Tyr/Phe <SEP> X <SEP> Cathepsine <SEP> G
<tb> Ala <SEP> Leu
<tb> Leu <SEP> Val <SEP> Protéinase <SEP> 3 <SEP> (neutrophiles)
<tb> Val <SEP> Cys
<tb> Gly <SEP> Leu/Ile <SEP> Collagénases <SEP> : <SEP> MMP-1,-2,-8-,-9,-13
<tb> Gly <SEP> Val <SEP> MMP2, <SEP> MMP-9
<tb>
<tb> B1 <SEP> B2 <SEP> Exemple <SEP> de <SEP> protéase <SEP> concernée
<tb> Val/Ala/Leu/Met <SEP> X <SEP> Elastase <SEP> des <SEP> neutrophiles
<tb> Leu/Tyr/Phe <SEP> X <SEP> Cathepsine <SEP> G
<tb> Ala <SEP> Leu
<tb> Leu <SEP> Val <SEP> Protéinase <SEP> 3 <SEP> (neutrophiles)
<tb> Val <SEP> Cys
<tb> Gly <SEP> Leu/Ile <SEP> Collagénases <SEP> : <SEP> MMP-1,-2,-8-,-9,-13
<tb> Gly <SEP> Val <SEP> MMP2, <SEP> MMP-9
<tb>
Gly/AlalAsniGlu/ #>,, m /A / Hydrophobes .,,# ~ Gln/Pro/Arg/ naturels ou non MMP-3 TT... naturels His/Asn
<tb>
<tb> Polaires <SEP> : <SEP> Hydrophobes
<tb> Arg/Asp/Glu/Gln/Thr/Asn <SEP> naturels <SEP> ou <SEP> non <SEP> MMP-7
<tb>
<tb> Polaires <SEP> : <SEP> Hydrophobes
<tb> Arg/Asp/Glu/Gln/Thr/Asn <SEP> naturels <SEP> ou <SEP> non <SEP> MMP-7
<tb>
Hydrophobe: naturels Hydrophobe: Ala
<tb>
<tb> Ala <SEP> Val <SEP> ADAM
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> ADAM-17 <SEP> (TACE) <SEP>
<tb> Arg <SEP> Phe
<tb>
Les séquences J-1-J0 et J3-J4 qui encadrent le site de clivage B1-B2 interviennent dans les interactions du lien avec la protéase visée et donc sur la vitesse de la réaction enzymatique de coupure de la liaison BI-B2. Les résidus J-1, Jo, J3 et J4 de S2 seront avantageusement choisis dans les ensembles suivants : J-1 = résidu polaire de préférence Jo = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe et tout résidu aminoacide non naturel hydrophobe.
<tb> Ala <SEP> Val <SEP> ADAM
<tb> Asn <SEP> Val <SEP> ADAM-17 <SEP> (TACE) <SEP>
<tb> Arg <SEP> Phe
<tb>
Les séquences J-1-J0 et J3-J4 qui encadrent le site de clivage B1-B2 interviennent dans les interactions du lien avec la protéase visée et donc sur la vitesse de la réaction enzymatique de coupure de la liaison BI-B2. Les résidus J-1, Jo, J3 et J4 de S2 seront avantageusement choisis dans les ensembles suivants : J-1 = résidu polaire de préférence Jo = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe et tout résidu aminoacide non naturel hydrophobe.
J3 = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe J4 = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Phe ou tout résidu non-naturel hydrophobe ou absent Les autres résidus, J-2--J-n et J5--Jc peuvent être n'importe quel résidu aminoacide naturel ou non naturel selon les besoins.
Par définition, on désignera par 02 un lien formant spécifiquement des dimères et par 03 un lien formant spécifiquement des trimères. c) Segment thérapeutique A Dans un premier mode de réalisation, le segment A comprend une sous unité d'une molécule qui possède la propriété d'être active sous la forme multimérique, de préférence sous la forme de dimère ou de trimère.
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Plus particulièrement, le segment A comprend une sous unité d'une molécule de la famille générale des cytokines ou un fragment ou dérivé de celle-ci. Il s'agit en particulier des segments extracellulaires THD (pour TNF homology Domain ), des protéines de la super-famille des facteurs de nécrose tissulaire (TNF). Il peut s'agir aussi de certaines autres cytokines, notamment certaines interleukines comme l'IL 10 ou l'IL 13.
Notamment, le segment A peut comprend une sous-unité d'un récepteur oligomérique ou un fragment ou dérivé de celui-ci. Ce récepteur peut être par exemple, mais de façon nonexhaustive, un récepteur à une hormone, à une lipoprotéine, à une cytokine (facteurs de croissance, les interleukines, les interférons), les chimiokines. Plus particulièrement, le segment A peut comprendre une sous-unité d'un récepteur à IL1 ou IL6 ou un fragment ou dérivé de celui-ci.
Dans un second mode de réalisation, le segment A comprend une sous unité d'un récepteur quelconque des cytokines mentionnées dans le paragraphe précédent, ou un fragment ou dérivé de celle-ci, et notamment les TNFR, récepteurs des cytokines de la familles du TNF.
(http://www. gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamilyltnfinfo.html) Les TNFR ont eux aussi une structure trimérique qui permet d'accueillir le ligand TNF. La trimérisation de ces récepteurs est assurée à la fois par leur segment trans-membranaire et par leur partie extracellulaire. Généralement, les parties extracellulaires isolées s'associent difficilement en trimères et nécessitent des éléments supplémentaires pour la formation d'un assemblage trimérique. Pour la présente invention, les éléments supplémentaires sont justement les segments 0 et/ou C définis plus haut.
(http://www. gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamilyltnfinfo.html) Les TNFR ont eux aussi une structure trimérique qui permet d'accueillir le ligand TNF. La trimérisation de ces récepteurs est assurée à la fois par leur segment trans-membranaire et par leur partie extracellulaire. Généralement, les parties extracellulaires isolées s'associent difficilement en trimères et nécessitent des éléments supplémentaires pour la formation d'un assemblage trimérique. Pour la présente invention, les éléments supplémentaires sont justement les segments 0 et/ou C définis plus haut.
La description ci-dessous est focalisée sur les trimères. Cependant, la présente invention considère tout autant la formation de dimères, tout particulièrement pour les applications de leurres de cytokines.
Les segments A comprenant le premier type de molécules (molécules de la famille du TNF) seront utilisés plutôt dans le domaine de la thérapie anti-cancéreuse. Les segments A comportant le second type de molécules (famille des TNFR) seront utilisés plutôt dans le domaine de la thérapie anti-inflammatoire.
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a) Peptides à propriétés anti-tumorales Les composés anti-tumoraux visés par la présente invention sont des molécules de la famille des facteurs de nécrose tumorale alpha (TNF[alpha]) et utilisent leur propriété proapoptotique. A ce jour, environ 23 séquences de protéines de la famille des facteurs humains de nécrose tumorale ont été découvertes.
Ces molécules de la famille du TNF sont actives lorsqu'elles peuvent s'assembler en trimère sur leur récepteur et générer ainsi un signal d'apoptose dans la cellule comportant ce récepteur. Leur pré-assemblage en trimère à l'aide du segment de multimérisation 0 est donc un élément capable d'augmenter considérablement leur activité.
Le problème lié à l'utilisation de la plus part de ces molécules est le risque majeur qu'elles pourraient faire courir au patient en cas d'administration systémique (choc septique, dommage hépatique létal...). Il est donc impératif de cibler ces molécules sous une forme quasi inactive pour ne les rendre actives que dans le voisinage de ce site de ciblage.
Parmi les molécules de la famille des TNFa , le facteur TRAIL ou Apo2L (P~W19777) est probablement le plus intéressant dans la mesure où les cellules normales semblent protégées de son action alors que les cellules tumorales y sont sensibles et peuvent être sélectivement éliminées par l'action de cette cytokine. Ce facteur peut être utile non seulement dans les cancers dit liquides , c'est-à-dire impliquant la prolifération de cellules lymphoïdes, mais également dans les cancers dit solides , ce qui implique un ciblage efficace pour éviter au maximum les effets secondaires dus à la présence de ces molécules dans le milieu sanguin. Dans la mesure où les extrémités N-terminale et Cterminale des TNF sont très proches l'une de l'autre, la molécule thérapeutique peut prendre alors l'une des deux formes suivantes : C-O3- (TRAIL) (TRAIL)-O3-C où C est un segment de ciblage et 0 un segment d'oligomérisation comme définis plus haut.
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De préférence, le segment correspondant à TRAIL comprend au minimum le fragment sauvage (119-280) dont la séquence est la suivante : Fragment TRAIL (SEQ ID No 37) PQRVAAHITG TRGRSNTLSS PNSKNEKALG RKINSWESSR SGHSFLSNLH LRNGELVIHE KGFYYIYSQT YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQ YIYKYTSYPD PILLMKSARN SCWSKDAEYG LYSIYQGGIF ELKENDRIFV SVTNEHLIDM DHASFFGAFL VG Pour augmenter la stabilité thermodynamique, il est avantageux de remplacer certain résidus du c#ur de la protéine, des résidus inaccessibles au solvant, par d'autres résidus.
Un exemple est donné par la séquence artificielle suivante : Fragment dérivé de TRAIL (SEQ ID No 38) PQRVTVHITG TRGRSNTLSS PNTKNEKALG RKINTWESSR SGHTFLSNIH IRNGEIVIHE KGFYYIYTQT YFRFQEEIKE NTKNDKQMVQ YIYKYTSYPD PILLMKSARN TCWSKDAEYG LYSIYQGGIF EIKENDRIFV VVTNEHLIDM DHASFFGVFL VG Ainsi, l'invention concerne une molécule chimère dans laquelle le segment thérapeutique A comprend, ou consiste en, une molécule de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains, un fragment ou un dérivé de celle-ci. De préférence, le segment A comprend, ou consiste en, le facteur TRAIL, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le segment A comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID No 37 ou 38, de préférence SEQ ID No 38. b) Peptides à -propriétés anti-inflammatoires.
Les maladies inflammatoires chroniques et particulièrement la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et le Psoriasis sont provoquées par un déséquilibre important dans la production dans l'environnement cellulaire d'un certain nombre de molécules de signalisation. L'amplification et la pérennisation du phénomène inflammatoire dans ces maladies résultent d'un équilibre complexe entre un nombre important de protéines aux influences opposées, molécules pro-inflammatoires et molécules anti-inflammatoires.
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Les molécules pro-inflammatoires principales sont: TNFa, IL1, IL6, LIF, OSM, IL12, IL15, GM-CSF, MCSF, les chimiokines (IL8, INFy, RANTES) et enfin différents facteurs de croissance comme le FGF, PDGF, VEGF.
Les molécules anti-inflammatoires principales sont: sTNF-R, IL-Ira, IL4, IL10, IL13, IL11, TGF[alpha].
Parmi les cytokines pro-inflammatoires, le TNFa, généralement surproduit par les macrophages, joue un rôle central dans la mesure où il amplifie sa propre production et celles des autres cytokines pro-inflammatoires via l'activation de lymphocytes T. Il induit ainsi le cercle vicieux inflammatoire propre aux maladies précitées. Pour les maladies inflammatoires chroniques, le blocage et la séquestration du TNFa peut engendrer un effet thérapeutique favorable et important. Le blocage du TNFa peut s'obtenir principalement soit à l'aide d'anticorps anti-TNFa soit à l'aide d'un récepteur soluble au TNFa. Le second moyen semble le plus efficace à long terme et particulièrement dans le cas du traitement de la polyarthrite rhumatoïde et de la maladie de Crohn.
Cependant le TNFa est aussi une protéine importante de l'immunité innée et acquise et son blocage général, c'est-à-dire non ciblé peut avoir des conséquences très gênantes comme le développement d'infections opportunistes ou latentes avec des conséquences graves comme par exemple la réapparition d'une tuberculose. D'autres maladies comme la sclérose cérébrale multiple, l'encéphalo-myélite expérimentale allergique, le lupus ou encore le diabète de type 1 voient leur amplitude augmenter ou leur déclenchement devenir plus précoce. Il est donc impératif d'effectuer un ciblage efficace de ce type de molécule effectrices.
Il existe au moins deux façons d'inhiber l'action des molécules de la famille du TNF : il faut piéger ces molécules grâce à des formes solubles des récepteurs qui jouent le rôle de leurres et les empêchent d'atteindre leur récepteur membranaire soit il faut bloquer ces récepteurs, sans les activer.
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Récepteurs de cytokines de la famille du TNF : de leurres.
Leurres simples pour les cytokines de lafamille du TNF : On prendra pour exemple le cas des récepteurs du TNFa et à la LTa. Ces deux cytokines partagent les deux mêmes récepteurs, le TNFR1 et TNFR2.
Dans un premier mode de réalisation, on se propose d'utiliser tout ou partie du segment extracellulaire du récepteur TNFR1, c'est-à-dire du récepteur de 55 kDa dit p55 (NA P 1943 8).
Dans un second mode de réalisation, on se propose d'utiliser tout ou partie du segment extracellulaire du récepteur TNFR2, c'est-à-dire du récepteur de 75 kDa dit p75 (NA P20333).
Ces deux récepteurs présentent quatre domaines extracellulaires CDR (Cystein Rich Domain), CRD1, CRD2, CRD3 et CRD4 parmi lesquels CRD1 est le domaine N-terminal, le plus éloigné de la surface membranaire. Seules les domaines CRD2 et CRD3 sont directement impliqués dans la liaison du TNFa ou de la LTa. Les leurres de la présente invention devront donc contenir au moins ces deux domaines liés au segment 0 par leur extrémité C-terminale mais pourront aussi contenir les trois premiers domaines voire les quatre domaines si nécessaire. D'une façon générale, on appellera ici peptide PCRDX tout peptide comprenant tout ou partie du segment extracellulaire d'un récepteur X de la famille des récepteur des cytokines de la famille du TNF. Les domaines présents dans ces leurres peuvent également contenir un certain nombre de mutations pour améliorer leur propriétés biochimiques et leur comportement et leur efficacité in vivo. Ce type de leurre devront être lés à des segments C-O ou C capables d'assurer leur ciblage et leur assemblage trimérique.
Un leurre simple est donc assemblé de la façon suivante : PCRDX-O3-C où C est un segment de ciblage passif et 03 un segment d'oligomérisation comme définis plus haut.
Les séquences minimum devant être retenues de préférence pour des leurres construit à partir du TNFR1 et du TNFR2 sont respectivement :
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PCRDmin-TNFRl : SEQ ID No 39 CTKCHKGTYL YNDCPGPGQD TDCRECESGS FTASENHLRH CLSCSKCRKE MGQVEISSCT VDRDTVCGCR KNQYRHYWSE NLFQCFNCSL CLNGTVHLSC QEKQNTVCT PCRDmin-TNFR2 : SEQ ID No 40 CSKCSPGQHA KVFCTKTSDT VCDSCEDSTY TQLWNWVPEC LSCGSRCSSD QVETQACTRE QNRICTCRPG WYCALSKQEG CRLCAPLRKC RPGFGVARPT GTETSDVVCK PCA D'autres couples Leurres-Cytokines de la famille du TNF peuvent être avantageusement produits. Il existe plusieurs autres cytokines de la super famille du TNF impliquées dans diverse maladies autoimmunes et inflammatoires. Il est en particulier intéressant de développer des leurres ciblés pour les cytokines suivantes : LTa, LTap2, LIGHT, FasL, CD27L, CD30L, CD40L et OX40L, pour ne citer que les plus importants.
Pour la lymphotoxine LTa déjà mentionnée, il existe un troisième récepteur le HVEM (pour Herpes Virus Entry Mediator ; NA Q92956). Ce récepteur est aussi partagé par LIGHT. La lymphotoxine mixte LT[alpha]ss2 possède sont récepteur propre, le LTss-R lui-même partagé par LIGHT. Les autres cytokines CD27L, CD30, CD40L et OX40L possèdent leur propre récepteur.
Tous les récepteurs des cytokines de la famille du TNF sont des homotrimères dont la structure est proche de celle des TNFR. La conception de leurres solubles pour les cytokines correspondantes, à partir de la partie extracellulaire de ces récepteurs, suit donc le même principe que celui utilisé avec les TNFR1 et TNFR2.
Ainsi, l'invention concerne une molécule chimère dans laquelle le segment thérapeutique A comprend, ou consiste en, le segment extracellulaire d'un récepteur d'une cytokine de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains, un fragment ou un dérivé de celui-ci. De préférence, le fragment comprend au moins les domaines CRD2 et CRD3 du segment extracellulaire. De préférence, la cytokine est sélectionnée parmi le groupe constitué de TNFa, LTa, LT[alpha]ss2, LIGHT, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, et OX40L. Par exemple, le récepteur à une cytokine de la famille du TNF peut être sélectionné parmi le groupe constitué de TNFR1, TNFR2, HVEM, et LTp-R. De préférence, le segment A
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comprend, ou consiste en, le segment extracellulaire d'un récepteur TNFR1 ou TNFR2, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le segment A comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID No 39 ou 40.
Leurres simples libérables pour les cytokines de lafamille du TNF : Il peut être avantageux de libérer les leurres pour permettre une meilleure diffusion dans les tissus inflammatoires. Cette libération s'effectuera grâce à la présence d'un lien supplémentaire Lc clivable par une quelconque des protéases intervenantes, de préférence entre le segment 0 et le segment C : PCRDX-O3-Lc-C Dans ce mode particulier de réalisation, il est préférable d'introduire des cystéines dans le segment d'oligomérisation 0 pour pérenniser l'assemblage en trimère.
Réalisation de leurres ciblés et activables pour les cytokines de lafamille du TNF : Pour rendre un leurre pour cytokine totalement inoffensif en dehors du site inflammatoire, il convient de bloquer l'extrémité N-terminale du segment actif PCRDX par un élément clivable uniquement au site inflammatoire. En effet, la liaison de la cytokine s'effectue par la partie N-terminale du leurre et le blocage de cette extrémité par un élément représentant, par son volume, une gêne stérique interdit cette liaison. La construction suivante permet de réaliser cet objectif : C-Lc-PCRDX-03 où Lc est un lien clivable conçu de telle sorte que le fragment restant relié à l'extrémité Nterminale du segment PCRDX soit le plus court possible, C un segment de ciblage et un segment d'oligomérisation trimérisable comportant des cystéines pour la pérennisation de la structure trimérique.
L'action de la molécule thérapeutique s'effectue en plusieurs temps : après injection sous forme de trimères préassemblés inactifs, la molécule se fixe sur les cellules apoptotiques du site inflammatoire où elle est rendue ultérieurement active seulement après l'action des protéases intervenantes.
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Réalisation d'inhibiteurs des récepteurs membranaires de la famille des TNFR.
L'homotrimérisation stricte des domaines extracellulaires en l'absence du ligand est un élément important du fonctionnement correct des TNFR. Cette trimérisation du récepteur vide est assurée essentiellement par un segment N-terminal comprenant le domaine extracellulaire CRD1. Les interactions protéine-protéine sont très spécifiques et évitent ainsi la formation d'hétérotrimères dus à la présence de récepteurs différents à la surface d'une même cellule. On met à profit cette propriété pour produire de nouveaux inhibiteurs spécifiques de n'importe quelle protéines membranaires de la famille des TNFR.
Ces inhibiteurs utilisent aussi un peptide PCRDX comprenant au moins le domaine CRD1 d'un TNFR quelconque X pour bloquer la trimérisation de celui-ci de façon très spécifique et donc bloquer sa fonction. En se liant à une sous unité membranaire du TNFR (monomère), le peptide PCRDX libre bloque la trimérisarion de cette sous unité membranaire sans activer le récepteur puisque celui-ci ne peut plus acquérir sa structure trimérique.
La liste suivante donne des exemples de séquence minimum que contiennent préférentiellement les divers segments PCRDX possibles utilisables comme inhibiteur de la trimérisation du TNFR1 et du TNFR2 : Inhibiteur du TNFR1 : SEQ ID No 41 DSVCPQGKYI HPQNNSICCT KCHKGTYLYN DCPGPGQDTD CRECESGSFT ASENHLRHCL SS Inhibiteur du TNFR2 : SEQ ID No 42 PGTCRLREYY DQTAQMCCSK CSPGQHAKVF CTKTSDTVCD SCEDSTYTQL WNWVPECLSS Etant donnée la grande homologie de structure des TNFR, l'homme de l'art n'aura aucun mal à déterminer la séquence minimum qu'il convient d'utiliser pour un quelconque TNFRX.
Ces séquences peuvent être mutées, notamment dans la région d'interaction avec les récepteurs TNFR1 et du TNFR2 originaux, afin d'augmenter leur affinité avec ces récepteurs. Des séquences analogues provenant de n'importe quel récepteur de cytokines
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de la famille des TNF peuvent être utilisées pour produire des inhibiteurs spécifiques de ces récepteurs.
La forme monomérique de PCRDX est susceptible d'être naturellement en équilibre avec la forme trimérique ce qui n'est pas avantageux car cette forme trimérique est de fait inactive car peu propice à une interaction avec le récepteur membranaire correspondant. Pour assurer une efficacité maximale à l'inhibiteur PCRDX, il est donc nécessaire de favoriser exclusivement sa forme dimérique. La présente invention propose plusieurs voies possibles pour la production d'un inhibiteur dimérique. a) Ciblage et libération d'un inhibiteur PCRDX dimérique.
La forme de la molécule thérapeutique est alors la suivante : C-Lc-02- PCRDX où C est un segment de ciblage, Lc est un segment clivable par une protéases intervenantes et 0 un segment d'oligomérisation assurant la dimérisation du segment thérapeutique PCRDX.
Dans ce mode de réalisation, le segment 0 est une torsade d'hélice coiled-coil dont la séquence est choisie parmi les séquences proposées plus haut et modifiée de telle sorte qu'elle comporte au moins un résidu cystéine dont le rôle est de former un pont disulfure pérennisant l'assemblage en dimère de ce segment O.
Dans un mode particulier d'utilisation, comme il a été dit plus haut, les ponts disulfures peuvent être initialement réduits ou leur formation bloquée de façon à n'injecter chez l'animal ou chez l'homme qu'une molécule monomérique, d'activité plus faible, de taille mimimale et présentant de ce fait moins d'effet secondaires. La formation progressive des ponts disulfures se fait alors essentiellement sur la cible par la dimérisation associée à l'interaction du segment C avec le membrane chargée négativement.
Dans un mode direct d'utilisation, la molécule thérapeutique sera pré-assemblée par formation des ponts disulfures avant l'injection chez l'animal ou chez l'homme.
L'avantage de ce mode d'utilisation est que la libération du segment thérapeutique 0PCRDX n'entre pas en compétition avec la formation d'un dimère actif.
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b) Ciblage sans libération d'un inhibiteur PCRDX dimérique.
Il peut être avantageux de cibler simplement la molécule thérapeutique. Dans ce cas, on produira simplement la molécule suivante, ne comportant pas de segment clivable :
C-O2-PCRDX où 0 est un segment d'oligomérisation non clivable assurant comme précédemment la dimérisation du segment PCRDX. c) Ciblage et libération d'un inhibiteur PCRDX dimérique activable.
C-O2-PCRDX où 0 est un segment d'oligomérisation non clivable assurant comme précédemment la dimérisation du segment PCRDX. c) Ciblage et libération d'un inhibiteur PCRDX dimérique activable.
Le mode de réalisation d'un inhibiteur de TNFR activable utilise le même principe que celui défini plus haut pour un leurre activable. Le blocage de l'extrémité C-terminale du segment PCRDX par un élément représentant une gêne stérique importante interdit son interaction avec le TNFR. La structure d'un tel inhibiteur est alors la suivante : O2-PCRDX-Lc-C Un exemple de réalisations utilisant un segment 02 basée sur une séquence dérivée de la matriline Ml (SEQ ID 33) est donné par les séquences suivante : Inhibiteurs du TNFR1 (SEQ ID No 43) correspondant à O-A-Lc ACESLVKFLAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTGGDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYL YNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSSNVLG-(segment C) (SEQ ID No 44) correspondant à O-A-Lc ASESLVKFLAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTGGDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYL YNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSSNVLG-(segment C) Inhibiteur du TNFR2 (SEQ ID No 45) correspondant à O-A-Lc ACESLVKFLAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTGGPGTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAK VF CTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSSNVLG-(segment C) (SEQ ID No 46) correspondant à O-A-Lc ASESLVKFLAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTGGPGTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAK VF CTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSSNVLG-(segment C) où la séquence du segment de ciblage C est choisi parmi les séquences définis plus haut.
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Ainsi, l'invention concerne une molécule chimère dans laquelle le segment thérapeutique A comprend, ou consiste en, le domaine CRD1du segment extracellulaire d'un récepteur d'une cytokine de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains, ou un dérivé de celui-ci. De préférence, la cytokine est sélectionnée parmi le groupe constitué de LTa, LTap2, LIGHT, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, et OX40L. Par exemple, le récepteur à une cytokine de la famille du TNF peut être sélectionné parmi le groupe constitué de TNFR1, TNFR2, HVEM, et LTp-R. De préférence, le segment A comprend, ou consiste en, le domaine CRD1 du segment extracellulaire d'un récepteur TNFR1 ou TNFR2, ou un dérivé de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le segment A comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID No 41 ou 42. Notamment, l'invention concerne une molécule chimère comprenant une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID No 43-46.
De manière générale, lorsque la présente invention divulgue une séquence polypeptidique, elle concerne également un polynucléotide codant pour ce polypeptide ainsi que tout vecteur ou cellule hôte le contenant.
FIGURES Figure 1 : figure 1 illustre les molécules thérapeutiques sous forme de trimère, chaque molécule présentant un segment de ciblage C, un segment d'oligomérisation 0, et un segment thérapeutique TRAIL. Nter et Cter indique les extrémités N-terminale et Cterminale de la molécule. Lc représente une liaison clivable. Les traits pointillés indiquent d'éventuels ponts disulfures. Les boites en tiret indiquent que la présence des segments Le est optionnelle.
Figure 2 : figure 2 illustre les molécules thérapeutiques Leurres simples ou libérables pour les cytokines de la famille du TNF sous forme de trimère, chaque molécule présentant un segment de ciblage C, un segment d'oligomérisation 0, et un segment thérapeutique PCRDX. Nter et Cter indique les extrémités N-terminale et C-terminale de la molécule. Lc représente une liaison clivable. Les traits pointillés indiquent d'éventuels
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ponts disulfures. Les boites en tiret indiquent que la présence des segments Le est optionnelle.
Figure 3 : figure 3 illustre les molécules thérapeutiques Leurres activables pour les cytokines de la famille du TNF sous forme de trimère, chaque molécule présentant un segment de ciblage C, un segment d'oligomérisation 0, et un segment thérapeutique PCRDX. Nter et Cter indique les extrémités N-terminale et C-terminale de la molécule. Le représente une liaison clivable. Les traits pointillés indiquent d'éventuels ponts disulfures.
Les boites en tiret indiquent que la présence des segments Le est optionnelle.
Figure 4 : figure 4 illustre les molécules thérapeutiques Inhibiteurs des récepteurs des cytokines de la famille du TNF sous forme de dimère, chaque molécule présentant un segment de ciblage C, un segment d'oligomérisation 0, et un segment thérapeutique PCRDX. Nter et Cter indique les extrémités N-terminale et C-terminale de la molécule. Le représente une liaison clivable. Les traits pointillés indiquent d'éventuels ponts disulfures.
Les boites en tiret indiquent que la présence des segments Le est optionnelle.
Claims (28)
- REVENDICATIONS 1- Molécule comprenant un segment de ciblage C, un segment thérapeutique A et un segment d'oligomérisation 0, dans laquelle : - l'oligomérisation de ladite molécule est nécessaire à l'activité thérapeutique du segment A ; - le segment de ciblage C est capable de se lier préférentiellement aux membranes de cellules engagées dans un processus d'apoptose ; et, - le segment d'oligomérisation 0 assure l'oligomérisation de ladite molécule.
- 2- Molécule selon la revendication 1, dans laquelle ladite oligomérisation de ladite molécule est induite par la liaison de ladite molécule à la surface des cellules cibles.
- 3- Molécule selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit segment d'oligomérisation 0 est intégré dans ledit segment de ciblage.
- 4- Molécule selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite oligomérisation du segment thérapeutique A comprend la formation d'au moins un pont disulfure entre les segments d'oligomérisation 0 et/ou de ciblage C.
- 5- Molécule selon l'une des revendications 1-4, dans laquelle ledit segment 0 comprend au moins une séquence peptidique capable de se structurer en hélice et de s'associer en structure oligomérique dite super enroulée.
- 6- Molécule selon la revendication 5, dans laquelle ledit segment 0 comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 33-36 ou un fragment de celles-ci d'au moins 14 acides aminés, de préférence d'un moins 21 acides aminés.
- 7- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C est capable de se lier aux membranes comportant des lipides dont la charge électrostatique totale est négative, notamment la phosphatidylsérine.
- 8- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend la séquence peptidique suivante :<Desc/Clms Page number 43>J 1- J2- J3- J4- Js- J6-Z7-Us- J9- J 1 o-U 11-R- J 13- J i 4-U 1 s-K-G-X 1 s-G-T- J21-E- J23- J24-U2s- J26- J27J28~U29~J30~J31 ~R~J33~J34~J3s~J36~B37-J38~J39-U40~J41 ~J42~J43 ~U44~J4s~J46~J47~J48-J49~R~Js 1 ~ Us2-Js3-Js4-D-Us6-K-S-zs9-L-J61-J62-J63-J64~z6s-J66-J67-U68-J69-J70-J71-U72-J73-J74-J7s-J76 (S2) dans laquelle J, Z, U, X, et B représentent des acides aminés tels que : - les acides aminés J sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les acides aminés naturels, de telle manière qu'au moins 50 % d'entre eux sont des résidus polaires choisis parmi R, N, D, C, Q, E, G, H, K, Orn, P, S, T et Y, - les acides aminés U sont choisis parmi A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé X18 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi A, N, C, Q, G, H, I, L, M, F, S, T, W, Y et V, - l'acide aminé B37 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi R, A, C, G, I, L, M, F, W, Y, et V, - l'acide aminé Z7 est choisi indépendamment des autres acides aminés de la séquence parmi D et E, - les acides aminés Z59 et Z65 sont choisis indépendamment parmi E, D, K, et R, les exposants indiquant la position des acides aminés dans la séquence.
- 9- Molécule selon la revendication 8, caractérisée en ce que les acides aminés U et B sont choisis suivant un des exemples exposés ci-dessous :
<tb><tb> Exl2 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L<tb> Exil <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L<tb> ExlO <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> A <SEP> A<tb> Ex9 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex8 <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex7 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> V <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> F<tb> Ex <SEP> 6 <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> I <SEP> F <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex <SEP> A <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> I <SEP> R <SEP> V <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> M<tb> Ex4AL <SEP> M <SEP> L <SEP> L <SEP> R <SEP> 1 <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> 1 <SEP> M <SEP><tb> Ex <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> M <SEP> V<tb> Ex <SEP> 2 <SEP> A <SEP> I <SEP> I <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> I <SEP> L<tb> Ex <SEP> V <SEP> L <SEP> M <SEP> I <SEP> L <SEP> R <SEP> I <SEP> Y <SEP> L <SEP> L <SEP> V <SEP> L<tb> U8 <SEP> U11 <SEP> U15 <SEP> U25 <SEP> U29 <SEP> B37 <SEP> U40 <SEP> U44 <SEP> U52 <SEP> U56 <SEP> U68 <SEP> U72<tb><Desc/Clms Page number 44> - 10- Molécule selon l'une des revendications 1-8, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi le groupe constitué des séquence SEQ ID Nos 23-32.
- 11- Molécule selon la revendication 8, caractérisée en ce que le segment C comprend la séquence S2 dans laquelle on trouve :
E en J24 > J66, 1 en U25 L en p6 p8 u29, r7] et U72 ; T en j27 V en j30@J67, et J68 ; S ou T en J31;V ou A en J69 ; A, T ou S en J70; K en J73; P ou G en J74; R en B37 et D ou E en J75; ou,E en J24, J66, 1 en U25, L en J26, J28, U29, J71, et J72; T en J27; V en J30,J67, et J68; S ou T en J31;V ou A en J69 ; A, T ou S en J70; K en J73; P ou G en J74; L, I, ou M en B37; L, I, ou V en J75; et D, E, R, ou K enJ76. - 12- Molécule selon l'une des revendications 1-7, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend la séquence de tout ou partie d'une annexine, d'un domaine de type Clou C2 des facteurs de coagulation sanguine, d'un domaine V d'une protéine de la famille des 2-Glycoprotéines-I, d'un domaine de type FYVE, d'un domaine de type PH, ou un fragment de celui-ci.
- 13- Molécule selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit segment de ciblage C comprend une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 1-16 et 17-22, de préférence SEQ ID Nos 2-4, 6-8, 10-12, 14-16 et 19-22 ou un fragment de celle-ci.
- 14- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit segment A présente une activité anti-tumorale.
- 15- Molécule selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit segment A comprend une cytokine de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains, ou un fragment de celle-ci, de préférence le facteur TRAIL.
- 16- Molécule selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit segment A comprend la séquence SEQ ID No 37 ou 38, de préférence SEQ ID No 38.<Desc/Clms Page number 45>
- 17- Molécule selon l'une des revendications 1-13, caractérisée en ce que ledit segment A présente une activité anti-inflammatoire.
- 18- Molécule selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit segment A comprend le segment extracellulaire d'un récepteur d'une cytokine de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains, ou un fragment de celui-ci.
- 19- Molécule selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit segment A comprend au moins les domaines extracellulaires CRD2 et CRD3 d'un récepteur des cytokines de la famille des TNF.
- 20- Molécule selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit segment A comprend la séquence SEQ ID No 39 ou 40.
- 21- Molécule selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit segment A comprend le domaine CRD1 du segment extracellulaire d'un récepteur d'une cytokine de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) humains.
- 22- Molécule selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit segment A comprend la séquence SEQ ID No 41 ou 42.
- 23- Molécule selon l'une des revendications 15,18, 19 et 21, caractérisée en ce que ladite cytokine est sélectionnée parmi le groupe constitué de TNFa, LTa, LTap2, LIGHT, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, et OX40L.
- 24- Molécule selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite cytokine est TNFa.
- 25- Molécule selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite molécule comprend en outre un segment clivable Le comprenant une séquence reconnue et clivée par une protéase majoritairement présente dans le tissu ciblé, plus particulièrement choisie parmi une métallo-protéase de la matrice extra-cellulaire, une urokinase, et une protéase spécifique du clivage du segment extracellulaire des cytokines membranaires ou de leurs récepteurs.<Desc/Clms Page number 46>
- 26- Molécule selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite molécule comprend en outre un élément masquant l'activité dudit segment A, le dit élément étant éliminé par clivage dudit segment clivable Lc.
- 27- Composition pharmaceutique comprenant une molécule selon l'une des revendications précédentes.
- 28- Utilisation d'une molécule selon l'une des revendications 1-26 pour la fabrication d'un médicament.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005003177A3 (fr) | 2006-05-11 |
| WO2005003177A2 (fr) | 2005-01-13 |
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