TWI685347B - 用於在活體中遞送ＲＮＡｉ觸發子至腫瘤細胞之聚結合物 - Google Patents

用於在活體中遞送ＲＮＡｉ觸發子至腫瘤細胞之聚結合物 Download PDF

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Abstract

本發明係關於用於在活體中遞送RNA干擾(RNAi)觸發子至整聯蛋白陽性腫瘤細胞之組合物。該等組合物包含RGD配體靶向之經酶可裂解之二肽-醯胺基苄基-碳酸酯掩蔽劑可逆修飾之兩親性膜活性多胺。修飾掩蔽該聚合物之膜活性，同時可逆性提供生理反應性。該等可逆修飾之多胺(動力學聚結合物或結合物)進一步共價連接至RNAi觸發子。

Description

用於在活體中遞送RNAi觸發子至腫瘤細胞之聚結合物
細胞之複雜膜系統高度限制RNAi觸發子及其他實質上細胞膜不可滲透化合物至活細胞中之遞送。反義RNAi及基因療法中所用之藥物係相對較大之親水性聚合物且通常高度帶負電。該兩種物理特性嚴重限制其橫跨細胞膜之直接擴散。出於此原因，RNAi觸發子遞送之主要障壁係RNAi觸發子橫跨細胞膜遞送至細胞胞質或核。
亦已研發多種轉染試劑，其達成在活體外相當有效地遞送多核苷酸至細胞。然而，使用該等相同轉染試劑在活體中遞送多核苷酸係複雜的且因活體中毒性、不利血清相互作用及較差靶向使得無效。在活體外充分工作之轉染試劑、陽離子聚合物及脂質通常形成大的陽離子靜電粒子且使細胞膜去穩定。活體外轉染試劑之正電荷經由電荷-電荷(靜電)相互作用有利於與核酸締合，由此形成核酸/轉染試劑複合物。正電荷亦有益於媒劑非特異性結合至細胞及膜融合、去穩定或破壞。膜之去穩定有利於實質上細胞膜不可滲透多核苷酸橫跨細胞膜遞送。儘管該等性質有利於在活體外核酸轉移，但其在活體中引起毒性及無效靶向。陽離子電荷引起與血清組份相互作用，其引起多核苷酸-轉染試劑相互作用去穩定、較差生物利用度及較差靶向。可在活體外有效之轉染試劑之膜活性經常在活體中導致毒性。
對於活體中遞送，媒劑(核酸及相關遞送試劑)應較小，直徑小於 100nm且較佳小於50nm。甚至仍可用更小複合物，小於20nm或小於10nm。大於100nm之遞送媒劑在活體中具有至除血管細胞外之細胞之極少通路。藉由靜電相互作用形成之複合物在暴露於生理鹽濃縮物或血清組份時往往聚集或分開。此外，活體中遞送媒劑上之陽離子電荷導致不利血清相互作用及因此較差生物利用度。有趣的是，高負電荷亦可因干擾靶向所需之相互作用、即靶向配體結合至細胞受體而抑制靶向活體中遞送。因此，活體中分佈及靶向期望幾乎中性之媒劑。在未小心調控情況下，在活體中使用時，膜破壞或去穩定活性係有毒的。利用核酸遞送平衡媒劑毒性在活體外較在活體中更易於達成。
Rozema等人(美國專利公開案20080152661、20110207799、20120165393及20120172412)研發適於在活體中遞送多核苷酸之結合物。該等結合物之特徵在於使用可逆之生理上不穩定之掩蔽可逆調控膜活性多胺之膜破壞活性。使用不帶電半乳糖或膽固醇作為靶向配體，Rozema等人已顯示使用該等結合物在活體中遞送多核苷酸至肝細胞。使該等結合物適於將RNAi觸發子靶向癌細胞可提供對抗癌症之另一治療法。
整聯蛋白係一組調介細胞黏附之細胞表面糖蛋白。整聯蛋白係由α及β多肽亞單元構成之異源二聚體。目前，已鑑別11個不同α亞單元及6個不同β亞單元。各個α亞單元與各個β亞單元組合以形成不同整聯蛋白。已顯示α v β3整聯蛋白(玻連蛋白受體)在腫瘤轉移、實體瘤生長(贅瘤形成)及腫瘤血管發生中起作用。整聯蛋白αvβ3在血管發生中起重要作用。其在腫瘤內皮細胞上以及在一些腫瘤細胞上表現。Seftor等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.89(1992)1557-1561)(例如)已顯示α v β3整聯蛋白在黑色素瘤細胞侵襲中之作用。Brooks等人(Cell，第79卷(1994)1157-1164)證實全身性投與αvβ3拮抗劑引起各種組織學不同之人類腫瘤明顯消退。
整聯蛋白αvβ3之腫瘤細胞表現與各種腫瘤類型中之疾病進展相關。αvβ3整聯蛋白在人類腫瘤活檢試樣之血管上而非正常組織中之血管上廣泛表現。在乳癌中，αvβ3整聯蛋白之過表現與骨轉移相關且因應骨橋蛋白誘導增加之腫瘤生長及侵襲。在膠質母細胞瘤中，αvβ3整聯蛋白在腫瘤之侵襲緣處過表現且纖連蛋白之含量增加，此與增強之細胞運動性及細胞凋亡抗性相關。在胰臟腫瘤中，αvβ3整聯蛋白之增加表現與MMP-2之增加活化及淋巴結轉移相關。在前列腺癌細胞中，由於整聯蛋白與附接及遷移過程之間之關聯，αvβ3整聯蛋白之表現引起轉移至骨，該等過程涉及層黏連蛋白、纖連蛋白及骨橋蛋白。
αvβ3整聯蛋白結合至多種含有Arg-Gly-Asp(RGD)之基質大分子。RGD肽序列連接至各種其他化合物以提供αvβ3整聯蛋白結合。因此，已檢查RGD肽用於將化合物靶向αvβ3整聯蛋白陽性腫瘤。然而，許多RGD肽除對RGD依賴性整聯蛋白之親和力相對較低外亦相對無選擇性。舉例而言，結合至α v β3之大部分RGD肽亦結合至α v β5、α v β1及α IIb β3整聯蛋白。
闡述用於在活體中遞送RNAi觸發子至哺乳動物之腫瘤細胞之組合物，其包含：共價連接至RNAi觸發子之整聯蛋白靶向之可逆掩蔽之膜活性多胺。所述組合物遞送RNAi觸發子至腫瘤細胞，其中RNAi觸發子與細胞之內源RNA干擾途徑相互作用以抑制靶基因之表現。
本發明之特徵在於用於在活體中遞送RNA干擾(RNAi)觸發子至腫瘤細胞之組合物，其包含：經掩蔽之兩親性膜活性多胺(遞送聚合物)及RNAi觸發子，其中RNAi觸發子共價連接至遞送聚合物。遞送聚合物包含藉由用一或多種RGD二肽掩蔽劑及視情況一或多種PEG二肽掩蔽劑可逆修飾聚合物胺使得至少50%或至少80%聚合物胺經修飾而掩蔽之兩親性膜活性多胺。遞送聚合物與RNAi觸發子之共價附接之 較佳鍵聯係在生理上不穩定之連接。在一個實施例中，此鍵聯垂直於二肽掩蔽劑鍵聯。向哺乳動物投與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑中之遞送結合物。
在較佳實施例中，闡述包含共價連接至以下之兩親性膜活性多胺之組合物：a)經由二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯可逆生理上不穩定之鍵聯共價連接至複數個RGD配體及空間穩定劑；及b)經由一或多個不穩定共價鍵聯共價連接至一或多個RNAi觸發子。在一個實施例中，二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯垂直於不穩定共價鍵聯。向哺乳動物投與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑中之RNAi觸發子-聚合物結合物。
在較佳實施例中，可逆掩蔽之膜活性多胺(遞送聚合物)包含：藉由多胺之胺與RGD掩蔽劑及空間穩定劑掩蔽劑反應可逆修飾之兩親性膜活性多胺。聚合物胺與掩蔽劑之反應可逆修飾胺以形成可逆之生理上不穩定之共價鍵聯。若修飾基團之裂解儲存胺，則胺可逆經修飾。膜活性多胺之可逆修飾可逆抑制膜活性多胺之膜活性、抑制多胺與血清組份之相互作用，藉此提供增加之循環性質，並在活體中將多胺靶向腫瘤細胞。在掩蔽狀態中，可逆經掩蔽之膜活性多胺不呈現膜破壞性活性。膜活性多胺之膜活性抑制及/或活體中靶向需要修飾>50%聚合物胺。可需要用掩蔽劑可逆修飾超過50%、超過55%、超過60%、超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%或超過90%多胺上之胺以形成最佳遞送聚合物。
本發明之遞送聚合物之經修飾聚合物胺係由以下表示：
Figure 103127144-A0202-12-0004-2
其中R 4 包含RGD配體或空間穩定劑且R 1 及R 2 係胺基酸側鏈。R 1 較佳係疏水性胺基酸之側基。較佳疏水性胺基酸係丙胺酸。於中性pH下，R 2 較佳係親水性不帶電胺基酸之側鏈。較佳親水性不帶電胺基酸係瓜胺酸。活體內在二肽之後在胺基酸與醯胺基苄基之間酶裂解自聚合物移除R 4 且起始消除反應，在該消除反應中醯胺基苄基-胺基甲酸酯經歷自發重排而引起聚合物胺再生。
遞送聚合物進一步共價連接至RNAi觸發子。在一個實施例中，RNAi觸發子經由生理上不穩定之鍵連接至遞送聚合物。在較佳實施例中，連接RNAi觸發子至遞送聚合物之不穩定鍵垂直於連接掩蔽劑至多胺之不穩定鍵。因此，本發明之結合物包含：RNAi觸發子，其共價連接至具有由以下表示之一般形式之可逆經修飾之兩親性膜活性多胺：
Figure 103127144-A0202-12-0005-3
其中N包含RNAi觸發子，L2係可逆之生理上不穩定之鍵聯，例如A1A2-醯胺基苄基-胺基甲酸酯，P包含兩親性膜活性多胺，R包含RGD配體，各自係如本文中所定義，PEG包含聚乙二醇或其他空間穩定劑，L1係生理上不穩定之連接體，y係大於0之整數且z係大於零(0)之整數，其中y及z之和之值係多胺P上存在之胺之數目(如測定為未經修飾之膜活性多胺中之胺之數目)之大於50%。
本發明之化合物通常可使用熟習有機或醫藥化學技術者已知之方法獲得。在結合附圖採用時，自以下詳細說明將明瞭本發明之其他目標、特徵及優勢。
在較佳實施例中，聚合物修飾-L2-R及-L2-PEG具有一般形式：R-A1A2-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-(式2a)且 PEG-A1A2-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-(式2b)。
其中A1A2係二肽，A1係胺基酸，且A2係胺基酸。RGD配體可經由連接體(例如PEG連接體)連接至二肽。較佳空間穩定劑係聚乙二醇(PEG)。A1較佳係疏水性胺基酸。A2較佳係親水性不帶電胺基酸。A1及A2較佳經由醯胺鍵連接。較佳醯胺基苄基係對-醯胺基苄基。胺基甲酸酯係藉由碳酸酯與聚合物胺反應形成。較佳碳酸酯係活化胺反應性碳酸酯。A1A2-醯胺基苄基-胺基甲酸酯鍵聯穩定直至二肽藉由內源蛋白酶在活體中裂解，由此自多胺裂解空間穩定劑或RGD配體。在二肽之後(在A2與醯胺基苄基之間)酶裂解後，醯胺基苄基-胺基甲酸酯經歷自發重排而引起聚合物胺再生。
在一個實施例中，使用有助於RGD配體附接至二肽及掩蔽劑之溶解性之連接體將RGD配體連接至二肽。較佳掩蔽劑具有一般形式：RGD配體-PEG1-二芳基腙-PEG2-二肽-醯胺基苄基-碳酸酯。每一組份皆可使用業內之標準方法(例如醯胺鍵聯之形成)連接。二芳基腙可藉由HyNic(肼基-菸醯胺)基團與芳基醛反應形成。PEG1包含(CH2-CH2-O)n且PEG2包含(CH2-CH2-O)n。n及m獨立地係大於或等於4之整數且n+m之和係12至48。PEG基團有助於RGD配體之溶解及呈遞，藉此改良經修飾多胺之腫瘤靶向。驚人地，二芳基腙亦改良經修飾多胺之活體中功能。在一個實施例中，首先使芳基醛-PEG2-二肽-醯胺基苄基-碳酸酯與多胺反應以形成芳基醛-PEG2-二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。隨後使此化合物與RGD配體-PEG1-HyNic反應以形成：RGD配體-PEG1-二芳基腙-PEG2-二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。
圖1. 顯示(A)二肽掩蔽劑或(B)連接至多胺之二肽掩蔽劑之結構的圖解說明：R1及R2係胺基酸之R基團，R4包含RGD配體或空間穩定劑，-X-係-NH-、-O-或-CH2-，-Y-係-NH-或-O-，-R5係在2、4或6位 處且係-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z係碳酸酯，且-R6在2、3、4、5或6位之每一者處獨立地係氫、烷基或鹵基，由R5佔據之位置除外。
圖2. 顯示各種PEG二肽掩蔽劑之結構之圖解說明：(A)PEG-GlyGly-PABC-PNP、(B)PEG-AsnGly-PABC-PNP、(C)PEG-PheLys-PABC-PNP、(D)PEG-ValCit-PABC-PNP、(E)PEG-AlaAsn-PABC-PNP及(F)PEG-PheLys(CH3)2-PABC-PNP。
圖3. 顯示使用二肽掩蔽劑可逆修飾多胺之圖解說明：R包含RGD配體或PEG，AA係二肽(具有或無保護基團)，R3係胺反應性碳酸酯，且多胺係兩親性膜活性多胺。
圖4. 顯示消除反應之圖解說明，其中醯胺基苄基-胺基甲酸酯經歷引起聚合物胺再生之自發重排：AA(A1A2)係二肽，且R4包含RGD配體或空間穩定劑。
圖5. 顯示PEG二肽掩蔽劑之合成之圖解說明：R包含PEG，且A1及A2係胺基酸(經保護或未經保護)。
圖6. 顯示(A)二肽之NHS酯、(B)Fmoc保護之衍生物之胺基酸H-Asn(DMCP)-OH及H-Lys(MMT)-OH及(C)Fmoc-A1A2-OH之形成之圖解說明：A、A1及A2係胺基酸。
圖7. 顯示(A)Fmoc-AA-PABA及Fmoc-A-PABA之形成及(B)H-Lys(CH3)2-PABA與Fmoc-Phe-NHS之偶合之圖解說明。
圖8. 顯示H-A1A2-PABA及H-A1-PABA之形成之圖解說明。
圖9. 顯示PEGn-A1A2-PABA之形成之圖解說明。
圖10 顯示(A)及(B)PEG-AA-PABC-PNP之形成之圖解說明。
圖11 顯示丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯之RAFT共聚的圖解說明。
圖12 顯示利用疊氮基-PEG-胺之末端聚合物修飾的圖解說明。
圖13.顯示由RGD掩蔽劑之一個實例(RGD配體-PEG1-二胺-二芳 基腙-PEG2-二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺)修飾之多胺的圖解說明。將未由
Figure 103127144-A0202-12-0008-193
明確指示為單元之部分(即RGD配體、PEG1等)之原子視為連接原子且可將其視為至任一側之標記單元之一部分
本發明提供用於在活體中遞送RNA干擾(RNAi)觸發子至表現腫瘤細胞之整聯蛋白的結合物及方法。所述結合物包含共價連接至欲遞送之RNAi觸發子的整聯蛋白靶向之可逆經修飾之膜活性多胺。整聯蛋白靶向係由本文所述RGD配體提供。膜活性多胺之可逆修飾係由本文所述RNA配體及空間穩定劑肽酶可裂解之掩蔽劑提供。肽酶可裂解之鍵聯在不存在蛋白酶下對水解穩定，且提供儲存及活體中循環中之延長穩定性。改良(較長)之循環半衰期有利於拓寬組織(例如腫瘤組織)中之RGD配體調介之累積之機會之窗。RNAi觸發子在活體中之遞送可用於基因表現之治療性抑制(敲除)。
本發明包括具有一般結構之結合物遞送系統：
Figure 103127144-A0202-12-0008-4
其中N係RNAi觸發子，L1係生理上不穩定之鍵聯，P係兩親性膜活性多胺，M1包含經由二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯鍵聯(RGD掩蔽劑)連接至P之RGD配體，且M2包含經由二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯鍵聯(PEG掩蔽劑)連接至P之空間穩定劑。Y及z各自係大於0之整數，前提係y+z之值具有多胺P上之一級胺之數目(如藉由在不存在任何掩蔽劑下P上之胺之量所測定)之大於50%、大於60%、大於70%、大於80%或大於90%之值。在其未經修飾狀態中，P係膜活性多胺。遞送聚合物M1 y-P-M2 z無膜活性。藉由M1及M2之附接之P一級胺之可逆修飾可逆抑制或滅活P之膜活性。應注意，一些小的兩親性膜活性多胺 (例如蜂毒肽)含有少至3至5個一級胺。胺之百分比之改變意欲反映聚合物群體中之胺之百分比之改變。在M1及M2裂解後，多胺之胺再生，藉此將P恢復成其未經修飾之膜活性狀態。
對於腫瘤遞送，y具有等於聚合物P上之一級胺之數目之2-20%的值。更佳地，y具有等於聚合物P上之一級胺之數目之2-10%的值。因此，z具有等於聚合物P上之一級胺之數目之80-98%的值。y(RGD)：z(空間穩定劑)之比率較佳係約1-12：50且更佳約1：20。
在掩蔽狀態中，可逆經掩蔽之膜活性多胺不呈現膜破壞性活性。可需要用二肽掩蔽劑可逆修飾超過50%、超過55%、超過60%、超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%或超過90%之多胺上之胺以形成抑制膜活性並提供細胞靶向功能，即形成可逆經掩蔽之膜活性聚合物(遞送聚合物)。
在一個實施例中，RNAi觸發子經由生理上不穩定之共價鍵聯連接至本發明之遞送聚合物。藉由使用生理上不穩定之鍵聯，RNAi觸發子可自聚合物裂解，從而釋放RNAi觸發子以致力於與細胞組份之功能相互作用。
掩蔽係經由期望掩蔽劑可逆附接至膜活性多胺以形成可逆經掩蔽之膜活性聚合物(即遞送聚合物)完成。除抑制膜活性外，掩蔽劑亦屏蔽聚合物免於非特異性相互作用、降低血清相互作用、增加循環時間及/或提供細胞特異性相互作用，即靶向。
掩蔽劑之基本特徵在於在聚集物中，其抑制聚合物之膜活性。掩蔽劑可屏蔽聚合物免於非特異性相互作用(降低血清相互作用、增加循環時間)。膜活性多胺在未經修飾(未經掩蔽)狀態中具有膜活性且在經修飾(掩蔽)狀態中無膜活性(滅活)。足夠數目之掩蔽劑連接至聚合物以達成期望滅活程度。使用適當聚合物活性分析直接測定藉由掩蔽劑附接之聚合物之期望修飾程度。舉例而言，若在給定分析中，聚 合物具有膜活性，則足夠含量之掩蔽劑連接至聚合物以達成該分析中之膜活性之足夠抑制程度。掩蔽需要修飾聚合物群體上之一級胺之
Figure 103127144-A0202-12-0010-194
50%、
Figure 103127144-A0202-12-0010-198
60%、
Figure 103127144-A0202-12-0010-195
70%、
Figure 103127144-A0202-12-0010-196
80%或
Figure 103127144-A0202-12-0010-197
90%，如藉由在不存在任何掩蔽劑下聚合物上之一級胺之量所測定。期望經掩蔽之聚合物保留水性溶解性。
RGD掩蔽劑之基本特徵在於在聚集物中，將遞送聚合物靶向α v β3整聯蛋白陽性腫瘤細胞。足夠數目之掩蔽劑連接至聚合物以達成腫瘤細胞靶向。靶向可需要修飾聚合物群體上之一級胺之約2%至約20%、約2%至約10%或約3%至約6%，如藉由在不存在任何掩蔽劑下聚合物上之一級胺之數目所測定。
在一個實施例中，適於修飾多胺之形成整聯蛋白靶向之遞送聚合物之RGD掩蔽劑包含：共價連接至二肽-醯胺基苄基-碳酸酯(RGD二肽掩蔽劑)之RGD配體。類似地，適於修飾多胺以形成整聯蛋白靶向之遞送聚合物之空間穩定劑二肽掩蔽劑包含：共價連接至二肽-醯胺基苄基-碳酸酯之空間穩定劑。掩蔽劑具有一般形式：(R 或PEG)-A1A2-醯胺基苄基-碳酸酯.
其中R包含RGD配體，PEG包含其他空間穩定劑之聚乙二醇，A1A2係含有第一胺基酸A1及第二胺基酸A2之二肽，且碳酸酯係活化胺反應性碳酸酯。掩蔽劑碳酸酯與聚合物胺反應產生胺基甲酸酯鍵聯。在碳酸酯與聚合物胺反應之前或在形成胺基甲酸酯鍵聯之後，RNA配體或空間穩定劑可附接至二肽。掩蔽劑穩定連接至聚合物直至二肽藉由內源性蛋白酶在活體中裂解，由此自多胺裂解RGD配體或空間穩定劑。在二肽後之酶裂解(A2與醯胺基苄基之間)後，醯胺基苄基-胺基甲酸酯經歷自發重排而引起聚合物胺再生。RGD配體可經由連接體(例如PEG連接體)連接至二肽。較佳空間穩定劑掩蔽劑不帶電。較佳不帶電空間穩定劑係聚乙二醇(PEG)。較佳二肽由經由醯胺鍵連接 至親水性不帶電胺基酸(A2)之疏水性胺基酸(A1)組成。較佳醯胺基苄基係對-醯胺基苄基。較佳碳酸酯係活化胺反應性碳酸酯。
適於形成本發明之整聯蛋白靶向之遞送聚合物的掩蔽劑具有一般結構：
Figure 103127144-A0202-12-0011-5
其中R 4 包含RGD配體或空間穩定劑，R 3 包含胺反應性碳酸酯部分，且R 1 及R 2 係胺基酸側鏈。R 1 較佳係疏水性胺基酸之側基。較佳疏水性胺基酸係丙胺酸。R 2 較佳係親水性不帶電胺基酸之側鏈。較佳親水性不帶電胺基酸係瓜胺酸。較佳活化碳酸酯係對-硝基酚。然而，容易地用業內已知之其他胺反應性碳酸酯替代對-硝基酚。活化碳酸酯與胺之反應經由如由以下表示之肽酶可裂解之二肽-醯胺基苄基胺基甲酸酯鍵聯將RGD配體或空間穩定劑連接至膜活性多胺：
Figure 103127144-A0202-12-0011-8
其中R 4 、R 1 及R 2 係如上文所述。在二肽之後在胺基酸與醯胺基苄基之間酶裂解自聚合物移除R 4 且觸發消除反應，在該消除反應中醯胺基苄基-胺基甲酸酯經歷自發重排而引起聚合物胺再生。
在另一實施例中，藉由首先用具有以下一般結構之二肽-醯胺基苄基-碳酸酯可逆修飾胺達成RGD配體經由可逆之生理上不穩定之鍵聯附接至多胺：
Figure 103127144-A0202-12-0011-10
其中R7包含適於與含有RGD配體之部分反應且胺反應性較R3之 碳酸酯小之反應基團。R1、R2及R3係如上文所定義。在一個實施例中，R7進一步包含PEG連接部分(本文中亦稱作PEG2)。已發現在二肽與反應基團之間插入PEG連接部分可改良裝配RGD掩蔽劑之溶解性及活體中功能。較佳PEG連接部分係(CH2-CH2-O)4-44。在用含有反應基團(R7)之二肽-醯胺基苄基-碳酸酯修飾聚合物胺後，含有RGD配體之部分經由與反應基團R7反應共價連接。適於連接二肽及含有RGD配體之部分之例示性反應基團部分包括(但不限於)HyNic及醛(包括芳基醛)、「點擊」(click)化學交聯劑(某些疊氮化物及炔烴)。式3之例示性分子係碳酸(4-甲醯基苯甲醛)-PEG-Ala-Cit-ara-胺基苄基酯。
二肽掩蔽劑之二肽(本文中表示為A1A2(或AA))係經由醯胺鍵連接之胺基酸之二聚物。胺基酸(包括α及β胺基酸)已為生物學及化學所熟知且係含有胺基團、羧酸基團及在不同胺基酸之間變化之側鏈的分子。較佳胺基酸係具有通式H2NCHRCOOH之L α-胺基酸，其中R(式3之R1及R2)係有機取代基或側基。較佳L α胺基酸係不帶電之天然胺基酸。在較佳二肽中，A1係疏水性胺基酸且A2係不帶電親水性胺基酸。較佳疏水性胺基酸係苯丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸或色胺酸。較佳不帶電親水性胺基酸係天冬醯胺、麩醯胺酸或瓜胺酸。更佳之疏水性胺基酸係丙胺酸或苯丙胺酸。更佳之不帶電親水性胺基酸係瓜胺酸。儘管二肽較佳，但可在A1與R之間插入其他胺基酸。亦可藉由消除胺基酸A1使用單一胺基酸代替二肽。本發明中所用之任何天然胺基酸在本文中由其常見縮寫提及。
在較佳實施例中，兩親性膜活性多胺藉由與所述二肽-醯胺基苄基-碳酸酯掩蔽劑反應以產生膜非活性遞送聚合物經可逆修飾。二肽掩蔽劑屏蔽聚合物免於非特異性相互作用、增加循環時間、增強特異性相互作用、抑制毒性或改變聚合物之電荷。
本發明之經可逆掩蔽之聚合物包含結構：
Figure 103127144-A0202-12-0013-11
其中：X係-NH-、-O-或-CH2- Y係-NH-或-O- R1較佳係-(CH2)k-苯基(k係1、2、3、4、5、6；k=1苯丙胺酸)、-CH-(CH3)2(纈胺酸)、-CH2-CH-(CH3)2(白胺酸)、-CH(CH3)-CH2-CH3(異白胺酸)、-CH3(丙胺酸)或
Figure 103127144-A0202-12-0013-14
(色胺酸)； R2較佳係氫(甘胺酸)、-(CH2)3-NH-C(O)-NH2(瓜胺酸)、-CH2-C(O)-NH2(天冬醯胺)、-(CH2)2-C(O)-NH2(麩醯胺酸)、-(CH2)4-N-(CH3)2(離胺酸(CH3)2)、-(CH2)k-C(O)-NH2；(k係1、2、3、4、5、6)、-CH2-C(O)-NR'R"(天冬胺酸醯胺)、-(CH2)2-C(O)-NR'R"(麩胺酸醯胺)、-CH2-C(O)-OR'(天冬胺酸酯)或-(CH2)2-C(O)-OR'(麩胺酸酯)，其中R'及R"係烷基R4包含RGD配體或聚乙二醇；且多胺係兩親性膜活性多胺。
儘管上述結構指示連接至聚合物之單一二肽掩蔽劑，但本發明實踐中，50%至100%聚合物胺由二肽掩蔽劑修飾。
在較佳實施例中，本發明之經可逆掩蔽之聚合物包含結構：
Figure 103127144-A0202-12-0013-15
其中R1、R2、R4及多胺係如上文所述。
本發明之經可逆掩蔽之聚合物可藉由使本發明之二肽掩蔽劑與聚合物上之胺反應形成。本發明之二肽掩蔽劑具有結構：
Figure 103127144-A0202-12-0014-17
其中：X、Y、R1、R2及R4係如上文所述R5係在2、4或6位處且係-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z係-鹵基、
Figure 103127144-A0202-12-0014-37
Figure 103127144-A0202-12-0014-19
；且 R6在2、3、4、5或6位之每一者處獨立地係氫、烷基、-(CH2)n-CH3(其中n=0-4)、-(CH2)-(CH3)2或鹵基，由R5佔據之位置除外。
在較佳實施例中，X係-NH-，Y係-NH-，R4包含RGD配體或PEG基團，R5係在4位處，且R6係氫，如下文所示：
Figure 103127144-A0202-12-0014-174
在另一實施例中，式4之R4係R8-(O-CH2-CH2)s-O-Y1-，其中：R8係氫、甲基或乙基；且s係1至150之整數，且Y1係業內適於將PEG基團連接至二肽之連接體。適宜連接體Y1包括(但不限於)：-(CH2)1-3- C(O)-、-Y2-NH-C(O)-(CH2)2-C(O)-(其中Y2係-(CH2)3-)及-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-(p係1至20之整數)。
如本文所用，RGD配體包含大小<1500kDa之兩性離子RGD肽或RGD模擬物，其結合至α v/β 3(αvβ3或αvβ3)整聯蛋白(對其具有親和力)。
如本文所用，RGD肽包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸鹽三肽。RGD肽可在RGD序列之胺基或羧基末端進一步包含其他胺基酸。若存在其他胺基酸，則連續肽序列構成RGD肽。RGD肽可在構象上受限。構象限制通常係藉由肽之環化(例如藉由在RGD序列之胺基及羧基末端添加半胱胺酸胺基酸及在半胱胺酸硫醇之間形成二硫鍵)完成。較佳限制之RGD肽包含胺基酸序列：Xn1CmXn2CXn3RGDXn4CXn5CmXn6(SEQ ID 1)，其中X係天然胺基酸，m係零(0)或一(1)，且n1-n6獨立地係0、1、2或3。若存在(n=1、2或3)，則每一X處之一或多個胺基酸獨立於其他位置處之胺基酸之選擇。在一個實施例中，m、n1、n2及n5各自係一(1)，且n3、n4及n6各自係零(0)。在另一實施例中，m係一(1)，Xn1係丙胺酸，Xn2係天冬胺酸鹽，Xn5係苯丙胺酸，且n3、n4及n6各自係零(0)(ACDCRGDCFC,SEQ ID 2)。RGD肽可具有連接至RGD胺基酸序列之非肽組份。舉例而言，肽之胺基末端可經醯化或連接體可附接至肽之羧基末端。在另一實施例中，m係一(1)，Xn1係醯化丙胺酸，Xn2係天冬胺酸鹽，Xn5係苯丙胺酸，n3、n4及n6各自係零(0)。
如本文所用，RGD模擬物係除RDG肽外之非肽合成分子，其生物模擬RGD肽、整聯蛋白結合蛋白之整聯蛋白結合RGD部分或αvβ3整聯蛋白結合RGD基元之活性決定簇。RGD模擬物可含有一個或兩個經由醯胺鍵連接之天然胺基酸。RGD模擬物可為經修飾之肽，含有非標準胺基酸或非標準胺基酸側鏈。RGD模擬物可具有由以下機構表示肽主鏈：
Figure 103127144-A0202-12-0016-175
其中n係整數。
在一個實施例中，RGD配體包含經由醯胺鍵連接至甘胺酸-天冬胺酸鹽二肽之胍鎓基團。本發明之胍鎓基團具有由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0016-25
其中R9及R10獨立地係氫或烷基且可藉由連接以形成環，且R11係連接胍鎓基團至甘胺酸-天冬胺酸鹽二肽之連接體。胍鎓基團包括上文表示之結構及其共振結構二者。較佳連接體係：-(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)-或-(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)-(C4RR')-，其中：a)每一R皆獨立地係可選的且(若存在)獨立地係氫、烷基或芳基，b)R'係氫、烷基、芳基或NH2，且c)C1、C2及C3可藉由單鍵、單鍵及雙鍵或芳族鍵連接。
儘管於本體提供之結構RGD配體結構中未明確顯示，但眾所周知且瞭解，胍鎓基團於中性或幾乎中性pH(pH 6.5-7.5)下帶正電：
Figure 103127144-A0202-12-0016-27
類似地，儘管本文提供之RGD配體結構中未明確顯示，但眾所周知且瞭解，胺基酸天冬胺酸於中性或幾乎中性pH(pH 6.5-7.5)下帶負電：
Figure 103127144-A0202-12-0016-30
發現附接至RGD配體之天冬胺酸鹽胺基酸之苯氧基可改良在活 體中將多胺靶向腫瘤細胞。較佳RGD配體包含胍鎓-甘胺酸-天冬胺酸鹽-4-胺基苯氧基化合物。較佳胍鎓-甘胺酸-天冬胺酸鹽-4-胺基苯氧基化合物包含由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0017-31
其中R13係：
Figure 103127144-A0202-12-0017-176
較佳胍鎓係
Figure 103127144-A0202-12-0017-34
或
Figure 103127144-A0202-12-0017-36
及其共振結構。
在另一實施例中，含有RGD配體之部分包含由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0017-38
其中：R14係
Figure 103127144-A0202-12-0017-177
或
Figure 103127144-A0202-12-0017-178
，且 A包含連接體。連接體將RGD模擬物連接至另一分子(例如二肽醯胺基苄基-碳酸酯)，提供增加溶解性，或提供共價鍵聯至另一分子之方式。
在一個實施例中，連接體A包含：
Figure 103127144-A0202-12-0018-45
其中n係0、1、2或3； Y不存在或係
Figure 103127144-A0202-12-0018-49
Z不存在，係
Figure 103127144-A0202-12-0018-47
或
Figure 103127144-A0202-12-0018-48
m係0、1、2、3或4，且PEG(圖13中之PEG1)係(CH2-CH2-O)4-44，且R12包含能夠與R7反應以形成共價鍵聯之反應基團。
單獨組份、PEG、反應基團等中之每一者皆可使用業內容易獲得之方法(包括但不限於醯胺鍵之形成)組合(共價連接)。在一個實施例中，反應基團R12可經由二胺(例如離胺酸)連接至PEG。離胺酸之羧基可附接至固體載體以有助於RGD配體之合成。隨後使用末端及ε-胺以連接PEG基團及反應基團。反應基團R12經選擇以易於與式3之反應基團R7反應以形成共價鍵聯。適於與R12及R7一起使用之反應基團對可選自包含以下之對：疊氮化物及膦、疊氮化物及炔烴、硝酮及炔烴、四嗪及辛烷、四嗪及環丙烯、四嗪及異腈、二-烯及烯烴、醛及肼、醛及胺基氧基、醛及醯肼、酮及肼、酮及胺基氧基及酮及醯肼。較佳反應基團係：
Figure 103127144-A0202-12-0018-50
在較佳實施例中，含有RGD配體之部分包含由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0019-51
其中：R14、n、Y、Z、m、PEG及R12各自係如上文所定義。
反應基團R12可用於將RGD配體附接至可逆之生理上不穩定之連接體(例如二肽連接體)以產生RGD掩蔽劑。在一個實施例中，RGD掩蔽劑包含由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0019-52
其中R14係如上文所定義之含有胍鎓之部分，A'包含含有PEG之連接體，R1較佳係疏水性胺基酸之側基，R2較佳係親水性不帶電胺基酸之側鏈(於中性pH下)，且R3係胺反應性碳酸酯。在一個實施例中，連接體A'包含具有4-48個乙氧基單元之PEG基團。在另一實施例中，連接體A'包含具有4-44個伸乙基單元之第一PEG(PEG1)基團及具有4-44個伸乙基之第二PEG(PEG2)基團，該等PEG基團由二醯基肼或其他鍵聯化學結構隔開。在一個實施例中，二醯基腙經由二胺(例如離胺酸)連接至第一PEG基團。二芳基腙可藉由HyNic(肼基-菸醯胺)基團與芳基醛反應形成。
在另一實施例中，連接體A'包含藉由以下物質之反應形成之鍵聯：疊氮化物與膦、疊氮化物與炔烴、硝酮與炔烴、四嗪與辛烯、四嗪與環丙烯、四嗪與異腈、二-烯與烯烴、醛與肼、醛與胺基氧基、醛與醯肼、酮與肼、酮與胺基氧基或酮與醯肼。
膜活性多胺藉由RGD掩蔽劑之附接之修飾產生可逆經修飾之多 胺。在一個實施例中，藉由RGD掩蔽劑修飾之膜活性多胺包含由以下表示之結構：
Figure 103127144-A0202-12-0020-53
其中R14、R1、R2及A'係如上文所定義。在一個實施例中，在二肽連接至兩親性膜活性多胺後，RGD附接至二肽。在一個實施例中，首先使芳基醛-PEG2-二肽-醯胺基苄基-碳酸酯與多胺反應以形成芳基醛-PEG2-二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。隨後使此化合物與RGD配體-PEG1-二胺-HyNic反應以形成：RGD配體-PEG1-二胺-二芳基腙-PEG2-二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺(參見圖13)。
本文所用術語肽具有業內常見含義：由肽(醯胺)鍵(即在一個胺基酸之羧基與另一胺基酸之胺基反應時形成之共價化學鍵)連接之L α胺基酸單體的短鏈。
本文所用片語天然胺基酸具有業內常見含義。本文所用片語標準胺基酸具有業內常見含義：直接由遺傳密碼中之三聯密碼子編碼之天然L α胺基酸。適於與本發明一起使用之膜活性聚合物的非限制性實例已先前闡述於美國專利公開案US20080152661、US20090023890、US20080287630、US20110207799、US20130121954及US20130317079(其每一者皆以引用方式併入本文中)中。適宜兩親性膜活性多胺可為小的肽，例如蜂毒肽。
使用本文所述肽酶可裂解之連接體可逆修飾聚合物胺。若修飾基團之裂解引起胺再生，則胺經可逆修飾。掩蔽劑之活化碳酸酯與聚合物胺之反應經由肽酶可裂解之二肽-醯胺基苄基胺基甲酸酯鍵聯將 RGD配體或空間穩定劑連接至聚合物，如圖3中所示。
可在RGD配體及二肽掩蔽劑之合成及結合期間使用保護基團。若存在，可在修飾兩親性膜活性多胺之前或之後移除保護基團。
利用二肽掩蔽劑可逆修飾足夠百分比之聚合物胺會抑制膜活性多胺之膜活性。二肽-醯胺基苄基-胺基甲酸酯鍵聯易受蛋白酶(或肽酶)裂解影響。在存在蛋白酶下，苯胺鍵經裂解，從而產生直接經歷1,6消除反應以釋放游離聚合物之中間體(圖4)。在消除反應後，游離聚合物未經修飾且保存膜活性。
在存在過量掩蔽劑下，膜活性多胺可結合至掩蔽劑。在投與遞送聚合物之前可自結合之遞送聚合物移除過量掩蔽劑。
如本文所用，「空間穩定劑」係非離子性親水性聚合物(天然、合成或非天然)，相對於不含空間穩定劑之聚合物，其防止或抑制其附接之聚合物之分子內或分子間相互作用。空間穩定劑妨礙其附接之聚合物致力於靜電相互作用。靜電相互作用係由於正電荷與負電荷之間之吸引力，兩種或更多種物質之非共價締合。空間穩定劑可抑制與血液組份之相互作用，且因此抑制網狀內皮組織系統之調理、吞噬及攝取。因此，空間穩定劑可增加其附接之分子之循環時間。空間穩定劑亦可抑制聚合物聚集。較佳空間穩定劑係聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。如本文所用，較佳PEG可具有約1-500個或2-25個乙二醇單體。如本文所用，較佳PEG亦可具有約85-20,000道爾頓(Da)、約85-1000Da之平均分子量。如本文所用，在水溶液中，相對於不含空間穩定劑之聚合物，空間穩定劑防止或抑制其附接之聚合物之分子內或分子間相互作用。
「配體」增強其附接之結合物之藥物動力學或生物分佈性質以改良結合物之細胞-或組織-特異性分佈及細胞特異性攝取。配體增強分子與靶細胞之締合。因此，配體可增強其附接之結合物之藥物動力 學或生物分佈性質以改良結合物之細胞分佈及細胞攝取。配體與細胞或細胞受體之結合可起始內吞作用。配體可為單價、二價、三價、四價或具有更高價。
如本文所用，膜活性多胺能夠破壞質膜或溶酶體/內吞膜。此膜活性係RNAi觸發子之細胞遞送之基本特徵。然而，在活體中投與聚合物時，膜活性導致毒性。多胺亦易於在活體中與許多陰離子組份相互作用，從而導致不期望生物分佈。因此，多胺之膜活性之可逆掩蔽係活體中使用所必需。
在一個實施例中，膜活性多胺包含：藉由含胺單體及含有疏水性基團之單體之無規聚合形成之兩親性聚合物。含胺單體含有側接一級胺基團。疏水性單體含有側接疏水性基團。疏水性基團可為具有1至6個碳原子之低碳數疏水性基團或具有超過6個碳原子之高碳數疏水性基團。較佳疏水性基團可選自包含以下之列表：丙基、丁基、異丙基及異丁基。胺基團對疏水性基團之比率經選擇以形成具有膜破壞活性之水溶性聚合物，較佳
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1個胺單體/疏水性單體。在一個實施例中，聚合物將具有50-80%胺單體且更佳55-75%胺單體。疏水性基團可選自由以下組成之群：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可為直鏈、具支鏈或環狀。疏水性基團較佳係僅含有碳及氫原子之烴。然而，可允許維持疏水性可包括(例如)氟之取代或雜原子。
「兩親性」或兩性分子性聚合物已眾所周知且在業內公認且具有親水性(極性、水溶性)及疏水性(非極性、親脂性、水不溶性)基團或部分。
「水性基團」在定性方面指示化學部分偏好水。通常，該等化學基團具有水溶性，且在水下係氫鍵供體或受體。水性基團可帶電或不帶電。帶電可帶正電(陰離子)或帶負電(陽離子)或二者(兩性離 子)。水性基團之實例包括以下化學部分：碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、醯胺、烷氧基醯胺、羧酸、硫及羥基。
「疏水性基團」在定性方面指示化學部分避水。通常，該等化學基團無水溶性，且往往不形成氫鍵。親脂性基團溶解於脂肪、油、脂質及非極性溶劑中且具有極小或無形成氫鍵之能力。含有兩(2)個或更多個碳原子之烴、某些經取代烴、膽固醇及膽固醇衍生物係疏水性基團及化合物之實例。
疏水性基團較佳係僅含有碳及氫原子之烴。然而，可允許維持疏水性炔包括(例如氟)之非極性取代或非極性雜原子。該術語包括脂族基團、芳族基團、醯基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可為直鏈、具支鏈或環狀。術語疏水性基團亦包括：固醇、類固醇、膽固醇及類固醇及膽固醇衍生物。
如本文所用，關於兩親性聚合物，部分定義為在一個共價鍵斷裂且由氫置換時衍生之分子。舉例而言，在丁基胺中，碳與氮鍵之間之斷裂及用氫置換產生氨(親水性)及丁烷(疏水性)。若1,4-二胺基丁烷在氮-碳鍵處裂解且經氫置換，則所得分子再次為氨(2×)及丁烷。然而，由於疏水性部分之形成需要兩個鍵斷裂，故認為1,4,-二胺基丁烷並無兩親性。
如本文所用，表面活性聚合物降低水之表面張力及/或與其他相之界面張力，且因此，於液體/氣體界面處積極被吸附。表面活性之性質通常係由於物質之分子具有兩親性或兩性分子性之事實。
如本文所用，「膜活性」聚合物係表面活性、兩親性聚合物，其能夠誘導對生物膜之以下效應中之一或多者：容許不透膜分子進入細胞或橫跨膜之膜改變或破壞、膜中之孔形成、膜之分裂或膜之破壞或溶解。如本文所用，膜或細胞膜包含脂質雙層。膜之改變或破壞可藉由在至少一個以下分析中之聚合物之活性在功能上定義：紅血球裂 解(溶血)、脂質體洩漏、脂質體融合、細胞融合、細胞裂解及內體釋放。可引起細胞膜裂解之膜活性聚合物亦稱作溶膜聚合物。將優先引起質膜上之內體或溶酶體破壞的聚合物視為內體裂解性。膜活性聚合物對細胞膜之效應可為瞬時的。膜活性對膜具有親和力且引起雙層結構變性或變形。膜活性聚合物可為合成或非天然兩親性聚合物。
如本文所用，膜活性聚合物不同於一類稱作細胞滲透肽之聚合物或由化合物(例如衍生自HIV TAT蛋白質之富含精胺酸之肽、控制觸角之基因肽、VP22肽、細胞穿透肽(transportan)、富含精胺酸之人工肽、小的富含胍鎓之人工聚合物及諸如此類)表示之聚合物。儘管細胞穿透化合物似乎將一些分子橫跨膜自脂質雙層之一側輸送至脂質雙層之另一側而明顯地無需內吞作用且未破壞膜之完整性，但尚未瞭解其機制。
RNAi觸發子至細胞之遞送係由破壞質膜或內部囊泡膜(例如內體或溶酶體)或使其去穩定(包括在膜中形成孔，或破壞內體或溶酶體囊泡，藉此允許囊泡之內容物釋放至細胞胞質中)之膜活性聚合物調介。
本發明之兩親性膜活性多胺共聚物係兩種或更多種單體物質之共聚產物。在一個實施例中，本發明之兩親性膜活性雜聚物具有一般結構：-(A)a-(B)b-
其中，A含有側接一級胺官能基且B含有側接疏水性基團。a及b係>0之整數。聚合物可係無規、嵌段或交替聚合物。可允許納入其他單體。
如本文所用，「內體裂解性聚合物」係因應內體特異性環境因素(例如裂解性酶之存在)能夠引起內體破壞或裂解或可自細胞內部膜包覆之囊泡(例如內體或溶酶體)釋放正常細胞膜不可滲透化合物(例如 RNAi觸發子)的聚合物。內體裂解性聚合物經歷其內體中之物理-化學性質變化。此變化可為由於電荷、疏水性或親水性變化之聚合物之溶解性或與其他化合物或膜相互作用之能力的改變。將本發明之可逆經掩蔽之膜活性多胺視為內體裂解性聚合物。
如本文所用，「蜂毒肽」係在蜜蜂毒液中天然存在之小的兩親性膜活性肽(美國專利公開案20120165393)。蜂毒肽可自生物來源分離或其可為合成的。合成聚合物藉由化學製程「由人」調配或製造且並非由天然生物製程生成。如本文所用，蜂毒肽涵蓋蜂毒肽家族之可在(例如)以下物種之毒液中發現之天然蜜蜂毒液肽：西方蜜蜂(Apis mellifera)、東方蜜蜂(Apis cerana)、額斑黃胡蜂(Vespula maculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、墨胸胡蜂(Vespa velutina nigrithorax)、長腳蜂屬(Polistes sp.)HQL-2001、小蜜蜂(Apis florae)、大蜜蜂(Apis dorsata)、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)、亞非馬蜂(Polistes hebraeus)。如本文所用，蜂毒肽亦涵蓋具有與天然蜂毒肽相同或類似之胺基酸序列之合成肽。特定而言，蜂毒肽胺基酸序列涵蓋彼等示於表1中者。合成蜂毒肽可含有天然L形式胺基酸或對映異構D形式胺基酸(逆轉型)。然而，蜂毒肽應含有基本上所有L形式或所有D形式胺基酸，但可具有附於胺基或羧基末端之相對立構中心之胺基酸。蜂毒肽胺基酸序列亦可反轉(反轉型)。反轉型蜂毒肽可具有L形式胺基酸或D形式胺基酸(逆反轉)。兩個蜂毒肽亦可共價連接以形成蜂毒肽二聚物。蜂毒肽可具有除掩蔽劑外之附接至胺基末端或羧基末端之修飾基團，其增強組織靶向或有利於在活體中循環。
鍵聯或「連接體」係兩個原子之間經由一或多個共價鍵將一個目標化學基團或片段連接至另一目標化學基團或片段之連接。舉例而言，鍵聯可將掩蔽劑、多核苷酸或RNAi觸發子連接至聚合物。不穩定鍵聯含有不穩定鍵。鍵聯可視情況包括增加兩個結合原子之間之距 離之間隔體。間隔體可進一步為鍵聯增加撓性及/或長度。間隔體可包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及糖。間隔體基團已為業內熟知且前述列表並不意欲限制本發明之範疇。
「不穩定鍵」係除至氫原子之共價鍵外之共價鍵，其能夠在不使同一分子中之其他共價鍵斷裂或裂解之條件下選擇性斷裂或裂解。更特定而言，不穩定鍵係在適當條件下較同一分子中之其他非不穩定共價鍵不穩定(熱力學)或更快速斷裂(動力學)的共價鍵。分子內之不穩定鍵之裂解可引起形成兩個分子。對於彼等熟習此項技術者，通常以鍵裂解之半衰期(t½)(鍵裂解一半所需之時間)論述鍵之裂解或不穩定性。因此，不穩定鍵涵蓋可較分子中之其他鍵更快速地選擇性裂解之鍵。
如本文所用，「生理上不穩定之鍵」係在哺乳動物體內通常遇到之條件或類似於彼等在哺乳動物體內遇到者之條件下可裂解之不穩定鍵。生理上不穩定之鍵聯基團經選擇，使得在某些生理條件中存在時，其經歷化學轉變(例如，裂解)。
如本文所用，細胞生理上不穩定之鍵係在哺乳動物細胞內條件下可裂解之不穩定鍵。哺乳動物細胞內條件包括化學條件，例如哺乳動物細胞中發現或類似於彼等於哺乳動物細胞中遇到者之pH、溫度、氧化或還原條件或試劑及鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括存在通常在哺乳動物細胞中存在之酶活性，例如來自蛋白水解或水解酶。細胞生理上不穩定之鍵亦可因應醫藥上可接受之外源試劑之投與裂解。
術語「多核苷酸」或核酸或多核酸係業內稱作含有至少兩個核苷酸之聚合物之術語。核苷酸係多核苷酸聚合物之單體單元。具有小於120個單體單元之多核苷酸經常稱作寡核苷酸。天然核酸具有去氧 核糖-或核糖-磷酸酯主鏈。非天然或合成多核苷酸係在活體外或在無細胞之系統中聚合之多核苷酸且含有相同或類似鹼基但可含有除天然核糖或去氧核糖-磷酸酯主鏈外之類型之主鏈。可使用業內任何已知技術合成多核苷酸。業內已知之多核苷酸主鏈包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷二醯胺、嗎啉基及天然核酸之磷酸酯主鏈之其他變體。鹼基包括嘌呤及嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、阿糖胞苷、尿嘧啶、次黃嘌呤及天然類似物。嘌呤及嘧啶之合成衍生物包括(但不限於)在核苷酸上放置新反應基團(例如但不限於胺、醇、硫醇、羧酸酯及烷基鹵)之修飾。術語鹼基涵蓋DNA及RNA之已知鹼基類似物中之任一者。多核苷酸可含有核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何適宜組合。多核苷酸可在活體外聚合物，其可重組，含有嵌合序列或該等基團之衍生物。多核苷酸可在5'端、3'端或5'及3'端處包括末端帽部分。帽部分可為(但不限於)倒置去氧無鹼基部分、倒置去氧胸苷部分、胸苷部分或3'甘油基修飾。
RNAi觸發子經由RNA干擾(RNAi)之生物過程抑制基因表現。RNAi觸發子包含雙鏈RNA或RNA樣結構，其通常含有15至50個鹼基對且較佳18至25個鹼基對且具有與細胞內之表現靶基因中之編碼序列相同(完美互補)或幾乎相同(實質上互補)之核鹼基序列。RNAi觸發子包括(但不限於)：短的干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、部分雙鏈(meroduplex)及dicer受質(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。
RNAi觸發子包含至少兩個彼此部分、實質上或完全互補之序列。在一個實施例中，兩個RNAi觸發子序列包含含有第一序列之有義鏈及包含第二序列之反義鏈。在另一實施例中，兩個RNAi觸發子序列包含兩條一起包含第一序列之有義鏈及包含第二序列之反義鏈，其中有義鏈及反義鏈一起形成部分雙鏈(表2及4)。有義鏈可經由連接 體分子(例如多核苷酸連接體或非核苷酸連接體)連接至反義鏈。
反義鏈包含與由靶基因編碼之mRNA之一部分互補之核苷酸序列，且互補區之長度最佳小於30個核苷酸。RNAi觸發子有義鏈包含與AAT mRNA之至少一部分具有至少90%一致性之序列。RNAi觸發子在遞送至表現靶基因之細胞後會抑制該靶基因在活體外或在活體中之表現。
RNAi觸發子分子可包括天然核苷酸或可包括至少一種經修飾之核苷酸或核苷酸模擬物。本發明之RNAi觸發子有義及反義鏈可藉由業內充分確立之方法合成及/或修飾。RNAi觸發子分子核苷或核苷酸鹼基可由含有磷酸酯(天然)或含有非磷酸酯(非天然)之共價核苷間鍵聯來連接，即RNAi觸發子分子可具有天然或非天然寡核苷酸主鏈。在另一實施例中，RNAi觸發子在核苷酸鹼基之間含有非標準(非磷酸酯)鍵聯。
經修飾之核苷酸包括(但不限於)：2'修飾、2'-O-甲基核苷酸、2'-去氧-2'-氟核苷酸、2'-去氧核苷酸、2'-胺基核苷酸、2'-烷基核苷酸、末端3'至3'鍵聯、倒置去氧胸苷、包含5'-硫代磷酸酯基團、硫代磷酸酯鍵聯、二硫代磷酸酯基團之核苷酸；包含非天然鹼基之核苷酸、鎖定核苷酸、橋接核苷酸、肽核酸、非鎖定核苷酸(本文中表示為NUNA)、嗎啉基核苷酸及無鹼基核苷酸。不必均勻修飾給定化合物中之所有位置。相反，可在單一RNAi觸發子化合物中或甚至在其單一核苷酸中納入一個以上修飾。核糖2'修飾可與經修飾之核苷鍵聯組合。
RNAi觸發子分子亦可包含懸垂部分，即通常未配對之懸垂核苷酸，其並不直接參與通常由本文中定義之有義鏈及反義鏈之對之核心序列形成之雙螺旋結構。
RNAi觸發子可含有1至5個獨立地在有義鏈及反義鏈中之每一者 上之鹼基的3'及/或5'懸垂部分。在一個實施例中，有義鏈及反義鏈二者皆含有3'及5'懸垂部分。在一個實施例中，一條鏈鹼基之一或多個3'懸垂部分核苷酸與另一鏈之一或多個5'懸垂部分核苷酸配對。在另一實施例中，一條鏈鹼基之一或多個3'懸垂部分核苷酸與另一鏈之一或多個5'懸垂部分核苷酸配對。RNAi觸發子之有義及反義鏈可含有或可不含有相同數目之核苷酸鹼基。反義及有義鏈可形成雙螺旋，其中僅5'端具有鈍端，僅3'端具有鈍端，5'及3'端皆係鈍端，或5'端及3'端皆不為鈍端。在另一實施例中，懸垂部分中之一或多個核苷酸含有硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、去氧核苷酸倒置(3'至3'連接)之核苷酸或係經修飾之核糖核苷酸或去氧核苷酸。
已知miRNA序列之列表可參見由研究機構(例如尤其Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center及European Molecule Biology Laboratory)維持之數據庫。已知有效之siRNA序列及同源結合位點亦在有關文獻中重複表示。藉由業內已知之技術容易地設計並產生RNAi分子。另外，存在增加發現有效之特定序列基元之機會的計算工具(Pei等人2006,Reynolds等人2004，Khvorova等人2003,Schwarz等人2003，Ui-Tei等人2004，Heale等人2005，Chalk等人2004，Amarzguioui等人2004)。
RNAi觸發子調節由基因編碼之RNA之表現。由於多個基因可彼此共享一定程度之序列同源性，故RNAi觸發子可經設計以靶向一類具有足夠序列同源性之基因。因此，RNAi觸發子可含有與在不同基因靶標中共享或對於特定基因靶標獨特之序列具有互補性的序列。因此，RNAi觸發子可經設計以靶向若干基因之間具有同源性之RNA序列之保守區，藉此靶向基因家族(例如，不同基因異型體、剪切變體、突變體基因等)中之若干基因。在另一實施例中，RNAi觸發子可 經設計以靶向對單一基因之特定RNA序列獨特之序列。
術語「互補性」係指藉由傳統Watson-Crick或其他非傳統類型，多核苷酸與另一多核苷酸序列形成氫鍵之能力。在提及本發明之多核苷酸分子時，多核苷酸分子與其靶標(效應子結合位點)或互補序列之結合自由能足以容許進行多核苷酸之有關功能，例如，酶mRNA裂解或轉譯抑制。核酸分子之結合自由能之測定已為業內所熟知(Frier等人1986，Turner等人1987)。互補性%指示可與第二多核苷酸序列形成氫鍵(例如，Watson-Crick鹼基配對)之第一多核苷酸分子中之連續鏈中之鹼基之%(例如，10個中之5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。完美互補意指多核苷酸序列之連續鏈中之所有鹼基將與第二多核苷酸序列中之相同數目之連續鹼基氫鍵結。
抑制、下調或敲除基因表現意指，基因之表現(如藉由自基因轉錄之RNA之含量或自RNA轉譯之多肽、蛋白質或蛋白質亞單元之含量量測)降低低於在不存在本發明之RNAi觸發子-結合物下觀察者。利用由本發明組合物遞送之RNAi觸發子之基因表現之抑制、下調或敲除較佳低於在存在對照無活性核酸(即具有混雜序列或滅活錯配之核酸)下或在不存在RNAi觸發子與經掩蔽聚合物結合下觀察到之含量。
RNAi觸發子與遞送聚合物之鍵聯
在一個實施例中，RNAi觸發子經由生理上不穩定之鍵或連接體連接至遞送聚合物。生理上不穩定之連接體經選擇，使得其在某些生理條件中存在時經歷化學轉換(例如，裂解)，(例如，細胞胞質之還原環境中之二硫鍵裂解)。藉由生理上不穩定之鍵聯之裂解之觸發子自聚合物之釋放有利於觸發子與適當細胞組份之相互作用用於活化。
RNAi觸發子-聚合物結合物係藉由將觸發子共價連接至聚合物形成。該聚合物經聚合或修飾，使得其含有反應基團A。RNAi觸發子亦 經聚合或修飾，使得其含有反應基團B。反應基團A及B經選擇，使得其可使用業內已知之方法經由可逆共價鍵聯連接。
RNAi觸發子與聚合物之結合可在存在過量聚合物下實施。由於RNAi觸發子及聚合物在結合期間可帶相反電荷，故過量聚合物之存在可減少或消除結合物之聚集。或者，可使用過量載劑聚合物(例如聚陽離子)。可在向動物或細胞培養物投與結合物之前自結合聚合物移除過量聚合物。或者，可向動物或細胞培養物共投與過量聚合物與結合物。
活體中投與
在藥理學及毒性學中，投與路徑係使藥物、流體、毒物或其他物質與身體接觸之途徑。一般而言，投與藥物及核酸用於治療哺乳動物之方法已為業內所熟知且可適於本發明組合物之投與。本發明化合物可經由任何適宜路徑(最佳非經腸)在近似適於該路徑之製劑中投與。因此，本發明化合物可藉由注射(例如靜脈內、肌內、皮內、皮下或腹膜內)投與。因此，本發明亦提供包含醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。
非經腸投與路徑包括使用注射器及針或導管之血管內(靜脈內、動脈內)、肌內、實質內、皮內、皮下、皮膚下、腫瘤內、腹膜內、鞘內、硬膜下、硬膜外及淋巴管內注射。本文中之血管內意指在稱作連接體內之組織或器官之血管之管狀結構內。在管狀結構之腔內，體液流至身體部分或自其流出。體液之實例包括血液、腦脊髓液(CSF)、淋巴液或膽汁。血管之實例包括動脈、小動脈、毛細血管、微靜脈、血竇、靜脈、淋巴管、膽管及唾液管或其他外分泌腺。血管內路徑包括經由血管(例如動脈或靜脈)遞送。血液循環系統提供醫藥之全身性擴散。
在醫藥上可接受之載劑溶液中注射期望組合物。醫藥上可接受 的係指自藥理學/毒性學角度來看對哺乳動物可接受之彼等性質及/或物質。片語醫藥上可接受的係指在投與哺乳動物時生理上可耐受且通常不產生過敏或其他不利或毒性反應的分子實體、組合物及性質。較佳地，本文所用術語醫藥上可接受的意指已獲得聯邦或州政府管理機構批准或已列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認藥典中可用於動物(且更具體而言用於人類)中。
該等載劑亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保防止微生物存在。該等組合物中亦可期望包括等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由引入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長效吸收。
治療效應
RNAi觸發子可出於研究目的進行遞送或以產生治療上之細胞變化。RNAi觸發子之活體中遞送可用於研究試劑且用於多種治療、診斷、靶驗證、基因組發現、遺傳改造及藥物基因組應用。已揭示RNAi觸發子遞送引起抑制肝細胞中之內源基因表現。在遞送RNAi觸發子後量測之報告(標記)基因表現之程度指示在遞送其他RNAi觸發子後基因之類似表現程度之合理預期。由熟習此項技術者認為有益之治療程度因疾病不同而不同。舉例而言，血友病A及B分別係因缺乏X連接之凝血因子VIII及IX引起。其臨床過程大大受因子VIII或IX之正常血清含量之百分比影響：<2%，嚴重；2-5%，中等；且5-30%，輕度。因此，嚴重患者中之循環因子之正常含量自1%增加至2%可視為有益。大於6%之含量防止自發流血而非彼等繼發於手術或損傷者。類似地，基因之抑制無需100%以提供治療益處。熟習基因療法技術之人員將基於標記基因結構之足夠程度合理地預期對疾病具有特異性 之基因之有益表現程度。在血友病實例中，若標記基因經表現以產生與因子VIII之正常含量之2體積%相當之含量的蛋白質，則可合理地預期編碼因子VIII之基因亦可以類似程度表現。因此，報告基因或標記基因用作一般細胞內蛋白質之表現的有用範例。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量量可變以便獲得可有效達成對特定患者有期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與模式，而對患者無毒。所選劑量量取決於各種藥物動力學因素，包括本發明所用特定組合物之活性、投與路徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康狀況及先前病史及醫學領域熟知的類似因素。
如本文所用，在活體中意指在有機體內部發生且更特定而言與部分或死亡者相反，在全活多細胞有機體(動物)(例如哺乳動物)之活組織中或其上實施的過程。
如本文所用，「醫藥組合物」包括本發明結合物、醫藥載劑或稀釋劑及調配所需之任何其他基質或試劑。
如本文所用，「醫藥載劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類。較佳地，載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。
實例
實例1. PEG蛋白酶(肽酶)可裂解掩蔽劑之合成. 除NaHCO3水溶液中之胺基酸之偶合及矽基去保護外之所有反應皆係在無水條件下使用新鮮無水溶劑實施。管柱純化係在矽膠上使用指定洗脫劑進行。質譜(MS)係使用電噴霧離子化獲得。
在PEG PEG-AA-PABC-PNP之活性碳酸對-硝基苯基-對-醯基醯胺 基苄基酯衍生物之製備中，利用PEG之NHS酯或醯化二肽基-對-醯基胺基苯甲醇前體之胺基末端。在以下步驟中，將苄基羥基轉化成碳酸對-硝基苯基酯，之後自胺基酸移除保護基團。在一些應用中，在對硝基酚(PNP)-碳酸酯用於修飾某些聚合物時，在聚合物修飾之前移除保護基團(參見圖5)。
合成始於H-A1A2-PABA(表2)衍生物之製備。該等加合物係利用由Dubowchik等人(2002)所述之合成方案進行一些修飾來獲得。Fmoc保護之胺基酸、Fmoc-A1-OH係藉由在二環己基碳化二亞胺(DCC)與N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之反應中轉化成N-羥基琥珀醯亞胺酯、Fmoc-A1-NHS來活化。在添加之NaHCO3水溶液存在下使該等反應性NHS-酯與經保護之胺基酸A2偶合以保持胺基具有反應性。對於1e及1f(表2)之製備，使用市售五氟苯基酯(OPfp)替代NHS酯進行偶合。
Fmoc二肽1a-h之合成.
a)AA之NHS酯係自各別胺基酸與NHS及DCC製得且未經額外純化即使用(圖5A)。
對於Fmoc-Ala-NHS，向Fmoc-Ala-OH(412mg,1.32mmol)及NHS(160mg,1.38mmol)於DCM(13ml)中之冰冷溶液中添加DCC(286mg,1.38mmol)，攪拌30min，且隨後於20℃下攪拌16h(小時)。過濾出固體二環己基脲(DCU)並在真空中移除溶劑。
對於Fmoc-Asn(DMCP)-NHS，向Fmoc-Asn(DMCP)-OH(298mg,0.68mmol)及NHS(83mg,0.72mmol)於DCM(13ml)中之冰冷溶液中添加DCC(148mg,0.72mmol)，攪拌30min，且隨後於20℃下攪拌16h。過濾出固體DCU並在真空中移除溶劑。
對於Fmoc-Gly-NHS，於0℃下將Fmoc-Gly-OH(891mg,3mmol)及NHS(380mg,3.3mmol)在THF(10ml)中攪拌5min並用THF(5ml) 中之DCC溶液(650mg,3.15mmol)處理。在30min內移除冷卻浴並將反應混合物於20℃下攪拌10h。過濾出固體DCU，用THF洗滌並在旋轉蒸發器上移除溶劑。將產物稱重並溶解於DME中以製得0.2mM溶液。
對於Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS，向Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-OH(487mg,1mmol)及NHS(127mg,1.1mmol)於THF(5ml)中之冰冷溶液中添加DCC(217mg,1.05mmol)，攪拌15min且隨後於20℃下攪拌10h。如針對Fmoc-Gly-NHS所述進行處理。
對於Fmoc-Phe-NHS，向Fmoc-Phe-OH(2.11g,5.45mmol)及NHS(664mg,5.77mmol)於DCM(50ml)中之冰冷溶液中添加DCC(1.181g,5.72mmol)，攪拌30min，且隨後於20℃下攪拌10h。過濾出固體DCU並在真空中移除溶劑。
對於Fmoc-Val-NHS，向Fmoc-Val-OH(339mg,1mmol)及NHS(127mg,1.1mmol)於DCM(13ml)中之冰冷溶液中添加DCC(227mg,1.1mmol)，攪拌30min，且隨後於20℃下攪拌16h。過濾出固體DCU並在真空中移除溶劑。
b)胺基酸H-Asn(DMCP)-OH及H-Lys(MMT)-OH係自有用之Fmoc保護之衍生物製得(參見圖5B)。
H-Asn(DMCP)-OH. 將Fmoc-Asn(DMCP)-OH(576mg,1.32mmol)在DMF(9ml)中與Et3N(3.7ml,26.4mmol)一起攪拌15h。於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物與醚(30ml)一起研磨三次並在真空中乾燥。產率，271mg(96%)。MS：643.6[3M+1]+；451.3[2M+Na]+；429.5[2M+1]+；236.7[M+Na]+；215.3[M+1]+；132.8[M-DMCP+1]+。
H-Lys(MMT)-OH. 將Fmoc-Lys(MMT)-OH(4.902g,7.65mmol)於DMF(100ml)中與Et3N(32ml，30當量，229.4mmol)一起攪拌10h。 於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物與醚一起研磨兩次並在真空中乾燥。產率，3.1g(97%)。MS(負模式)：455,453.3[M+Cl]-；417.8[M-1]-。
c)Fmoc-A1A2-OH之合成. (圖5C.)對於Fmoc-GlyGly-OH 1a，將甘胺酸(75mg,1mmol)及NaHCO3(100mg,1.2mmol)溶解於H2O(10ml)及二甲氧基乙烷(DME)(5ml)中。添加DME中之Fmoc-Gly-NHS溶液(5ml,1mmol)。添加THF(2.5ml)，對混合物進行超音波處理以使其均勻並攪拌20h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，用H2O中之EtOAc及5% KHCO3溶液處理殘餘物。將產物用EtOAc萃取四次，於pH=3下用鹽水洗滌，乾燥(Na2SO4)，濃縮並在真空中乾燥。產率，321mg(90%)。MS：775.0[2M+2Na]+；377.4[M+Na]+；355.1[M+1]+。
對於Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-OH 1b，將甘胺酸(75mg,1mmol)及NaHCO3(84mg,1mmol)溶解於H2O(2ml)、THF(4ml)與DME(5ml)之混合物中。添加DME中之Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS溶液(5ml,1mmol)並攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，添加20ml 0.1M MES緩衝液(pH=5)，之後添加EtOAc(25ml)。將反應混合物在冰上攪拌並用5% KHSO4溶液酸化至pH=5。將產物用EtOAc萃取四次，於pH=5下用鹽水沖洗，乾燥(Na2SO4)，濃縮並在真空中乾燥。產率，528mg(96%)。MS：567[M+Na]+；562[M+NH4]+；545.0[M+1]+；427.1[M-2PhiPr]+。
對於Fmoc-Asn(DMCP)Gly-OH 1c，係自Fmoc-Asn(DMCP)-NHS及H-Gly-OH如上文針對1b所述製得。產率，96%。MS：987.4[2M+1]+；516.3[M+Na]+；494.4[M+1]+；412.2[M-DMCP+1]+。
對於Fmoc-PheLys(MMT)-OH 1d，係自Fmoc-Phe-NHS及H-Lys(MMT)-OH如上文針對1b所述製得。產率，94%。MS：788.5[M+1]+,273.1[M-MMT+1]+。
對於Fmoc-PheCit-OH 1e：
i)向含有L-瓜胺酸(1.80g,10.26mmol)及NaHCO3(0.86g,10.26mmol)於H2O(40ml)及THF(20ml)之混合物中之溶液中添加DME(40ml)中之Fmoc-Phe-NHS(4.96g,10.26mmol)。將反應物攪拌15h。過濾來自活化之殘餘DCC並在旋轉蒸發器上移除有機溶劑。向殘餘物中添加H2O(100ml)及iPrOH(10ml)。將懸浮液用5% KHSO4酸化至pH=3，將產物用EtOAc：iPrOH=9：1溶液(3×,500ml)萃取，用鹽水：iPrOH=9：1之混合物(2×,50ml)洗滌，乾燥(Na2SO4)，過濾並濃縮，並用油幫浦乾燥。與醚一起研磨，從而得到純產物1e。產率，3.84g(68%)。MS：545.6[M+Na]+；528.5[M-H2O]+；306.3[M-Fmoc+H2O]+。
ii)向H-Cit-OH(184mg,1.05mmol)及NaHCO3(88.2mg,1.05mmol)於H2O(2.6ml)中之溶液中添加Fmoc-Phe-OPfp(553mg,1mmol)於THF(5ml)中之溶液。添加THF(2ml)以使得溶液均勻並攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除THF，將殘餘物用H2O(10ml)及iPrOH(1ml)稀釋並用3% HCl酸化至pH=1。將產物用EtOAc：iPrOH=9：1溶液萃取5次，用鹽水：iPrOH=9：1之混合物沖洗，乾燥(Na2SO4)並在真空中濃縮。與醚一起研磨，從而得到313mg純產物1e(57%)。
Fmoc-AlaCit-OH 1f係自Fmoc-Ala-NHS及H-Cit-OH如上文針對1e-(a)所述製得。產率，77%。MS：959.8[2M+Na]+；938.1[2M+1]+；491.4[M+Na]+；469.9[M+1]+。
粗製Fmoc-ValCit-OH 1g係自Fmoc-Val-NHS及H-Cit-OH如上文針對1b所述製得。藉由與醚一起研磨進行最終純化。總產量，76%。MS：1060.3[2M+3Na]+；1015.7[2M+Na]+；519.7[M+Na]+；497.9[M+1]+。
Fmoc-Ala-Asn(DMCP)-OH 1h係自Fmoc-Ala-NHS及H- Asn(DMCP)-OH如上文針對1b所述製得。產率，95%。MS：530.2[M+Na]+；508.2[M+1]+；426.0[M-DMCP+1]+。
與對胺基苄醇之偶合、Fmoc-AA-PABA及Fmoc-A-PABA 2a-m之製備 .
使產物1a-h與對胺基苄醇(PABA)在2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)存在下偶合以形成2a-h。亦製備僅一個胺基酸附接至PABA部分之4種代表性3 j-l(圖7A)。
對於Fmoc-GlyGly-PABA 2a，將1a(318mg,0.9mmol)及PABA(220mg,1.8mmol)於DCM(17ml)及MeOH(6ml)中之溶液與EEDQ(444mg,1.8mmol)一起攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，將殘餘物與Et2O一起研磨並過濾出產物並在真空中乾燥。產率，348mg(84%)。
對於Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-PABA 2b，將1b(524mg,0.96mmol)及PABA(142mg,1.55mmol)於DCM(10ml)中之溶液與EEDQ(357mg,1.44mmol)一起攪拌10h。如上文針對2a所述進行處理。產率，462mg(74%)。
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-PABA 2c係如上文針對2a所述製得。產率，64%。MS：621.5[M+22]+；599.3[M+1]+。
Fmoc-PheLys(MMT)-PABA 2d係如上文針對2b所述製得。產率，70%。
對於Fmoc-PheCit-PABA 2e，將1e(5.98g,10.97mmol)及PABA(2.70g,21.95mmol)於DCM(150ml)及McOH(50ml)中之溶液用EEDQ(5.43g,21.95mmol)處理並攪拌15h。如上文針對2a所述進行處理。產率，6.14g(86%)。MS：650.7[M+1]+；527.3[M-PABA+1]+。
對於Fmoc-AlaCit-PABA 2f，將1f(2.89g,6.17mmol)及PABA(1.52g,12.34mmol)於DCM(45ml)及MeOH(15ml)中之溶液用EEDQ (3.05g,12.34mmol)處理並攪拌15h。如上文針對2a所述進行處理。產率，4.56g(74%)。MS(ES，負模式)：307.4[M-263.6-1]-；349.9[M-Fmoc-1]-；610,608.4[M+HCl-1]-。
Fmoc-ValCit-PABA 2g係如上文針對2b所述製得。(98%)。
Fmoc-AlaAsn(DMCP)-PABA 2h係如上文針對2a所述製得。產率，59%。MS：613.2[M+1]+；531.4[M-DMCP+1]+；408.2[M-205+1]+。
對於Fmoc-Lys(CH3)2-PABA 2i，將Fmoc-Lys(CH3)2-OH．HCl鹽(433mg,1mmol)及PABA(246mg,2mmol)溶解於DCM(10ml)及MeOH(1.5ml)中，冷卻至5℃並添加EEDQ(495mg,2mmol)。移除冷卻浴且將反應混合物於RT(室溫)下攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，將殘餘物與Et2O一起研磨，並過濾出粗產物。將其重新溶解於DCM(2ml)及MeOH(1ml)之混合物中並藉由逐滴至Et2O(40ml)中再次沈澱。過濾產物並在真空中乾燥。產率，448mg(83%)。
對於Fmoc-Leu-PABA 2j，將Fmoc-Leu-OH(353mg,1mmol),EEDQ(495mg,2mmol)及PABA(222mg,1.8mmol)於DCM(10ml)中之溶液攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，將殘餘物溶解於Et2O(40ml)中，在乾冰上冷藏2h並藉由離心分離固體。在管柱上純化所得粗物質，洗脫劑梯度為CHCl3中之MeOH(1-2%)。產率，444mg(97%)。MS：459.4[M+1]+。
Fmoc-Asn(DMCP)-PABA 2k係如針對2j所述製得。在處理中，代替管柱純化，在移除DCM後，將殘餘物與Et2O一起研磨，冷藏至0℃並過濾出粗產物。將此處理再重複一次，之後在真空中乾燥。產率，77%。MS：542.5[M+1]+。
對於Fmoc-Cit-PABA 2l，將Fmoc-Cit-OH(345.7mg,0.87mmol)及PABA(214mg,1.74mmol)於DCM(10ml)及MeOH(4ml)中之溶液 用EEDQ(430mg,1.74mmol)處理並攪拌15h。將固體產物與醚一起研磨三次，並將產物過濾並乾燥。產率，288mg(67%)。MS：502.3[M+1]+；485.5[M-H2O+1]+；263[M-Fmoc-H2O+1]+；179.0[M-306+1]+；120.2[M-365.3+1]+。
產物2m係使用不同方案製得：H-Lys(CH3)2-PABA衍生物3與Fmoc-Phe-NHS偶合(圖7B)。
對於Fmoc-PheLys(CH3)-PABA 2m，藉由與Et3N(3.5ml)一起在DMF(11ml)中攪拌10h使Fmoc-Lys(CH3)2-PABA(2i)(448mg,0.83mmol)之Fmoc去保護。於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物以獲得粗產物3i。將此產物溶解於DMF(7ml)中，添加Fmoc-Phe-NHS(482mg,0.996mmol)，之後添加DIEA(0.42ml,2.2mmol)並將混合物攪拌10h。於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除具有DIEA之溶劑以獲得粗製2m，其未經額外純化即使用。MS：549.4[M+1]+。
H-AA-PABA 3a-h、m及H-A-PABA 3j-l之製備(圖7).
如上文針對3i所述將Fmoc-衍生物2a-h、j-l用DMF中之Et3N處理，之後在真空中濃縮並乾燥。將粗產物溶解於DMF中以製得0.1M溶液且其未經額外純化即使用。
Figure 103127144-A0202-12-0040-54
Figure 103127144-A0202-12-0041-55
蛋白酶可裂解之PEG-掩蔽試劑之製備.
將H-AA-PABA 3b、e、g、h、j、k-m中之任一者之胺基用PEG-酸之NHS酯(DIEA，DMF，5-10h)醯化，以產生22a-k。隨後將產物22a-k中之羥基轉化成碳酸對-硝基苯基酯((PNP)2CO、二噁烷或THF，40℃至60℃，10h)以產生23a-k。對於23a、d、g，藉由用TFA水溶液(TFA/H2O=3：1，5℃，2-3h)處理移除Asn及Glu之保護基團以獲得期望產物24a-c。
PEGn-AA-PABA 22a-k之製備(圖9).
產物22a(n=11，AA=GluGly)，將3b於DMF中之0.1M溶液(3.5ml,0.35mmol)與PEG11-NHS酯(240mg,0.35mmol)及DIEA(0.061ml,0.35mmol)一起攪拌10h。於40℃/油幫浦下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物並在管柱上純化產物，洗脫劑：CHCl3：MeOH：AcOH=38：2：1。產率，274mg(78%)MS：1015.6[M+NH4]+,998.7[M+1]+。
產物22b(n=11，AA=PheCit)。向3e(0.88mmol)及DIEA(167μl,0.96mmol)於DMF(3ml)中之溶液中添加PEG11-NHS酯(0.80mmol)於 DMF(3ml)中之溶液。將混合物攪拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將粗製物自CHCl3：MeOH(5ml)在Et2O(45ml)中沈澱並在管柱上純化，洗脫劑梯度為CHCl3中之MeOH(10-16%)。產率，420mg(53%)。MS：1015.9[M+H2O]+；998.8[M+1]+；981.1[M-H2O]+。
產物22c(n=11，AA=ValCit)。產物22f係自粗製3g(自300mg 0.5mmol 2g獲得)、PEG11-NHS酯(298mg,0.435mmol)及DIEA(0.09ml,0.522mmol)如針對22a所述製得。於40℃/油幫浦下在旋轉蒸發器上濃縮後，將產物懸浮於MeOH：DCM=1：1混合物(6ml)中，超音波處理，過濾並沈澱至Et2O(50ml)中。分離固體並再次重複該程序。在真空中移除殘餘溶劑。產率，283mg(60%)。MS：951.5[M+1]+。
產物22d(n=11，AA=AlaAsn(DMCP))。向3h(0.56mmol)及DIEA(116μl,0.67mmol)於DMF(3ml)中之溶液中添加PEG11-NHS酯(0.56mmol)於DMF(3ml)中之溶液。將混合物攪拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物溶解於CHCl3：MeOH=1：1混合物(5ml)中並沈澱至冷藏(0℃)之Et2O(45ml)中。在管柱上純化固體，洗脫劑梯度為DCM中之MeOH(3-14%)。產率，261mg(49%)。MS：983.7[M+Na]+；979.1[M+NH4]+；961.8[M+1]+；943.9[M-H2O+1]+。
產物22e(n=11，AA=PheLys(Me2))。產物22e係如針對22a所述製得。使用HPLC管柱Nucleodur C-18,250×4.6進行純化，洗脫劑ACN-H2O(0.1% TFA)自15%增加至30%。MS：998.1[M+1]+。在Dowex 1×8樹脂上使分離之產物脫鹽，洗脫劑係H2O。產率，40%。
產物22f(n=11,AA=Leu)。產物22f係如針對22a所述製得且在管柱上純化，洗脫劑：CHCl3：EtOAc：MeOH：AcOH=9：7：2：0.04。產率，48%。MS：824.9[M+NH4]+。
產物22g(n=11,AA=Asn(DMCP)。將粗製3k(自419mg、0.77mmol 2k獲得)、Peg11NHS酯(200mg,0.292mmol)及DIEA(0.06ml,0.35mmol)在DCM(5ml)中攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除溶劑並在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH AcOH=4.5：3.5：1：0.02。產率，254mg(37%)。MS：891.1[M+1]+。
產物22h(n=11 AA=Cit)。向3l(0.50mmol)及DIEA(104μl,0.60mmol)於DMF(2.5ml)中之溶液中添加PEG11-NHS酯(0.50mmol)於DMF(2.5ml)中溶液。將混合物攪拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物溶解於CHCl3：MeOH=1：1混合物(5ml)中並沈澱至Et2O(45ml)中。再重複沈澱兩次且產物未經額外純化即使用。產率，340mg(80%)。MS：869.4[M+NH4]+；851.9[M+1]+。
產物22i(n=23，AA=PheCit)。向3e(0.72mmol)及DIEA(130μl,0.74mmol)於DMF(3ml)中之溶液中添加PEG23-NHS酯(0.60mmol)於DMF(3ml)中之溶液。將混合物攪拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物溶解於CHCl3：MeOH=1：1混合物(5ml)中並沈澱至Et2O(45ml)中。在管柱上純化固體產物，洗脫劑梯度為CHCl3中之MeOH(7-12%)。產率，487mg(53%)。MS：1555.2[M+Na]+；1544.7[M+NH4]+；1527.7[M+1]+。
產物22j(具有平均MW 1000之PEG。AA=PheCit)。將mPEG-1000-醇(Fluka)(0.173g,0.173mmol)、碳酸N,N-二琥珀醯亞胺基酯(62mg,0.242mmol)及TEA(0.101ml,0.726mmol)之混合物於MeCN(1ml)中攪拌16h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物並將粗製殘餘物溶解於CHCl3(10ml)中。將有機層用H2O(1ml,pH=5)、隨後鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥並濃縮，以得到PEG-1000-NHS碳酸酯。將此產物與3e(0.121mmol)及DIEA(30μl,0.173mmol)一起在DMF(1ml)中攪 拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物溶解於CHCl3：MeOH=1：1混合物(5ml)中並沈澱至Et2O(45ml)中。再重複沈澱兩次且產物未經額外純化即使用。產率，134mg(79%)。
產物22k(n=23，AA=ValCit)。向3g(1.0mmol)及DIEA(183μl,1.04mmol)於DMF(4ml)中之溶液中添加PEG23-NHS酯(0.87mmol)於DMF(4ml)中之溶液。將混合物攪拌16h，過濾並於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物溶解於CHCl3：MeOH=1：1混合物(5ml)中並沈澱至Et2O(45ml)中。再重複沈澱兩次且產物未經額外純化即使用。產率，1.0g(77%)。MS：1496.1[M+NH4]+；1479.3[M+1]+。
PEG-AA-PABC-PNP 23a-k(圖10A)
對於產物23a(n=11，AA=Glu(2PhiPr)Gly)，將DCM(15ml)中之產物22a(274mg,0.274mmol)在黑暗中與(PNP)2CO(418mg,1.372mmol)及DIEA(0.143ml,0.823mmol)一起攪拌15h。在旋轉蒸發器上移除溶劑且在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3中之4% MeOH、0.2%AcOH。產率，260mg(81%)。MS：1180.7[M+NH4]+。
對於產物23b(n=11，AA=PheCit)，將22b(419mg,0.42mmol)、(PNP)2CO(766mg,2.52mmol)及DIEA(263μl,1.52mmol)於二噁烷(4ml)中之溶液在黑暗中於50℃下攪拌15h且在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。藉由於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上DMF之兩個連續蒸發移除殘餘DIEA並在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH(4.5：5：0.5)，之後CHCl3：MeOH(9：1)。產率，390mg(80%)。MS：1181.2[M+NH4]+,1164.2[M+1]+。
對於產物23c(n=11，AA=ValCit)，將22c(273mg,0.287mmol)、(PNP)2CO(874mg,2.88mmol)及DIEA(0.3ml,1.72mmol)於 1,4-二噁烷(22ml)中之溶液在黑暗中於50℃下攪拌24h。於40℃/油幫浦下在旋轉蒸發器上移除溶劑且在管柱上純化產物，洗脫劑：CHCl3：EtOAc：MeOH=16：3：1，之後CHCl3中之12-15% MeOH。產率，163mg(51%)。MS：1116.0[M+1]+。
產物23d(n=11，AA=AlaAsn(DMCP))係如23b之製備中所述製得。在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH(9：2：1)。產率，77%。MS：1144.0[M+NH4]+；1127.3[M+1]+。
產物23e(n=11,AA=PheLys(Me)2)係如針對23a所述製得且在管柱上純化，洗脫劑：CHCl3中之10% MeOH、0.2%AcOH。產率，63%。MS：1163.1[M+1]+。
產物23f(n=11，AA=Leu)係如針對23c所述僅使用5當量(PNP)2CO及3當量DIEA施加熱24h製得。在管柱上純化產物，洗脫劑梯度為CHCl3中之MeOH(7-12%)。產率，75%。MS：972[M+1]+。
產物23g(n=11，AA=Asn(DMCP))係如針對23f所述製得且粗產物未經額外純化即用於下一步驟。MS：1073.4[M+18]+。
對於產物23h(n=11，AA=Cit)，將22h(340mg,0.40mmol)、(PNP)2CO(608mg,2.00mmol)及DIEA(208μl,1.20mmol)於DCM(4ml)中之溶液在黑暗中於30℃下攪拌15h且在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。藉由於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上DMF之兩個連續蒸發移除殘餘DIEA並在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH(7：2.5：0.5)，之後CHCl3中之MeOH(8-14%)之梯度。產率，390mg(80%)。MS：1034.3[M+NH4]+；1016.9[M+1]+。
產物23i(n=23，AA=PheCit)係如23b之製備中所述製得且在管柱上純化，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH(4.5：5：0.5)，之後CHCl3中之MeOH(6-12%)之梯度。產率，86%。MS：1711.4[M+NH4]+；1694.4[M+1]+。
產物23j(PEG 1000K AA=PheCit)係如23b之製備中所述製得且在管柱上純化，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH(4.5：5：0.5)，之後CHCl3中之MeOH(6-12%)之梯度。產率，72%。
產物23k(n=23,AA=ValCit)係如23b之製備中所述製得，且利用HPLC純化產物。管柱：Luna(Phenomenex)5u，C-8,100 A。移動相：ACN-H2O(F3CO2H 0.01%)，ACN梯度30-37%，31min。產率：530mg(48%)。MS：1666.4[M+Na]+；1644.2[M+1]+。PEG-AA-PABC-PNP 24a-c，AA去保護(圖10B)。
產物24a(n=11，AA=GluGly)。將產物23a(250mg,0.215mmol)在CHCl3之3% TFA溶液(16ml)中攪拌35min，在旋轉蒸發器上濃縮且在真空中乾燥。產率，224mg(100%)。MS：1062.6[M+NH4]+；1045.9[M+1]+。
產物24b(n=11，AA=AlaAsn-PABC-PNP)。將化合物23d在TFA：DCM(3：1)之混合物中攪拌1.5h並於20℃下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。在管柱上純化產物，洗脫劑梯度為CHCl3中之MeOH(6-12%)。產率，30%。MS：1066.7[M+Na]+,1062.0[M+NH4]+；1045.2[M+1]+。
產物24c(n=11，AA=Asn)。將具有23g(160mg,0.143mmol)之反應燒瓶冷藏至0℃並添加TFA：H2O(9：1)之冷混合物(12.5ml)。將混合物攪拌1.5h並用冷H2O(50ml)稀釋。於20℃下繼續攪拌20min。過濾出沈澱並用H2O沖洗。於40℃下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物並在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH：AcOH=4.5：3.5：1.2：0.02。產率，43mg(30%)。MS：974.0[M+1]+。
Figure 103127144-A0202-12-0047-56
實例2. RGD配體之合成. A. RGD-PEG-硫酸酯：
1.RGD模擬物編號1-PEG8-硫酸酯，MW 982.1。
Figure 103127144-A0202-12-0047-179
 n=8
2. RGD模擬物編號2-PEG8-硫酸酯，MW 1022.2。
Figure 103127144-A0202-12-0048-58
 n=8
3. RGD模擬物編號3-PEG8-硫酸酯，MW 1080.2。
Figure 103127144-A0202-12-0048-59
 n=8
4. RGD模擬物編號3-PEG12-硫酸酯，MW 1212.4。
Figure 103127144-A0202-12-0048-180
 n=12
B. RGD-HyNic：
1. RGD模擬物編號1-PEG12-HyNic，MW 1272。
Figure 103127144-A0202-12-0048-62
 n=12
2. RGD模擬物編號1a-HyNic，MW 802.8。
Figure 103127144-A0202-12-0049-63
3. RGD模擬物編號1b-HyNic，MW 830.9(RGD)。
Figure 103127144-A0202-12-0049-181
C. RGE-PEG 12 -HyNic(對照).MW 1282.
Figure 103127144-A0202-12-0049-66
 n=12
D. RGD肽-HyNic：RGD4C,[NH2-ACDCRGDCFCG-Lys(e-6-HyNic)；SEQ ID 5]，MW 1407.83。
Figure 103127144-A0202-12-0049-69
實例3.兩親性膜活性多胺之可逆修飾. 蛋白酶可裂解掩蔽劑至含胺聚合物之鍵聯-胺基甲酸對-醯基醯胺基苄基酯鍵聯之形成.
A. RGD-PEG-硫酸酯.
於RT下將Cy3標記之聚合物與SPDP-PEG24-FCit-對-硝基酚以期望比率在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中合併1h。隨後於RT下使SPDP-PEG24-FCit修飾之聚合物與PEG12-FCit以1：8之重量比(聚合物：PEG12-FCit)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後使用 sephadex G-50離心管純化經修飾之聚合物。
Figure 103127144-A0202-12-0050-73
 SPDP-PEG24-FCit(n=23)
Figure 103127144-A0202-12-0050-75
 PEG12-FCit(n=11)
於RT下利用羥基胺以1：5之莫耳比(RGD-PEG-硫酸酯模擬物：羥基胺)在PBS(pH 7.4)中使RGD-PEG-硫酸酯模擬物去醯化2h。
於RT下將經修飾之聚合物與去醯化RGD-PEG-硫酸酯模擬物以1：1之重量比(聚合物：RGD)在PBS(pH 7.4)中合併最少4h以形成聚合物RGD結合物。使用sephadex G-50離心管純化聚合物-RGD結合物。
藉由使用吡啶2-硫酮之8.08×103 M-1 cm-1之消光係數量測343nm處之聚合物-RGD結合物之吸光度定量結合效率。
Figure 103127144-A0202-12-0050-76
(*在sephadex G-50純化之前)
Figure 103127144-A0202-12-0051-78
將聚合物-RGD結合物用等滲葡萄糖溶液稀釋至期望濃度。
Figure 103127144-A0202-12-0051-79
B. RGD-PEG-HyNic.
於RT下將Cy3標記之聚合物與醛-PEG12/24-TFP(Quanta Biodesign編號10082)以期望比率在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中合併1h。隨後於RT下使醛-PEG12/24-TFP修飾之聚合物與PEG12-FCit以1：8之重量比(聚合物：PEG12-FCit)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後使用sephadex G-50離心管純化經修飾之聚合物。
Figure 103127144-A0202-12-0051-80
 醛-PEG24-TFP(n=12或24)
於RT下將經修飾之聚合物與RGD-HyNic模擬物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD)在50mM MES(pH 5.0)緩衝液中合併最少4h以形成聚合物RGD結合物。使用sephadex G-50離心管純化聚合物-RGD結合物。
藉由使用雙-芳基腙鍵之2.9×101 M-1 cm-1之消光係數量測354nm處之聚合物-RGD結合物之吸光度定量結合效率。
Figure 103127144-A0202-12-0051-81
將聚合物-RGD結合物用等滲葡萄糖溶液稀釋至期望濃度。
Figure 103127144-A0202-12-0052-83
實例4. 用PEG蛋白酶可裂解掩蔽劑修飾多胺. 使對-醯基醯胺基苄醇衍生物之活化(胺反應性)碳酸酯與兩親性膜活性多胺之胺基在H2O中於pH>8下反應，以產生胺基甲酸對-醯基醯胺基苄基酯。
Figure 103127144-A0202-12-0052-84
R1包含PEG，R2係兩親性膜活性多胺，AA係二肽(經保護或未經保護)，且Z係胺反應性碳酸酯。
向×mg聚合物中添加等滲葡萄糖中之12×mg HEPES游離鹼。向緩衝聚合物溶液添加DMF中之2×至16×mg 200mg/ml二肽掩蔽劑。在一些應用中，用2×mg二肽掩蔽劑修飾聚合物，之後附接siRNA。隨後用6×至8×mg二肽掩蔽劑進一步修飾聚合物-siRNA結合物。
實例5. 結合物調配. A. 使用RGD-PEG-硫酸酯及PEG-二肽掩蔽劑之siRNA遞送結合物之形成.
於RT下使指示聚合物與SMPT以1：0.015之重量比(聚合物：SMPT)在5mM HEPES(pH8.0緩衝液)中反應1h。
隨後於RT下使SMPT修飾之聚合物與SPDP-PEG24-FCit以期望比率反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與PEG12-FCit以1：2之重量比(聚合物：PEG12-FCit)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與SATA-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：SATA-siRNA)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接 siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與PEG12-FCit以1：6之重量比(聚合物：PEG12-FCit)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。使用sephadex G-50離心管純化所得結合物。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：1之重量比(聚合物：RGD-PEG-硫醇)在PBS(pH 7.4)中反應最少4h將去醯化RGD-PEG-硫酸酯結合至經修飾之聚合物以形成RGD-結合物。使用sephadex G-50離心管純化結合物。如上文所述測定RGD靶向配體結合效率且發現為3.5及21個RGD配體/42K未經修飾之聚合物。
B. 使用RGD-PEG-HyNic及PEG-二肽掩蔽劑之siRNA遞送結合物之形成.
1)方案1. 於RT下使指示聚合物與SMPT以1：0.015之重量比(聚合物：SMPT)在5mM HEPES(pH8.0緩衝液)中反應1h。
隨後於RT下使SMPT修飾之聚合物與醛-PEG-二肽掩蔽劑(醛-PEG12-FCit或醛-PEG24-ACit)以期望比率反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與PEG12-二肽掩蔽劑(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：2之重量比(聚合物：PEG)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與SATA-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：SATA-siRNA)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：6之重量比(聚合物：PEG)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。使用sephadex G-50離心管純化所得結合物。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD-HyNic模擬物)在50mM MES(pH 5.0緩衝液)中反應最少4h將RGD-HyNic(實例2B)附接至經修飾之聚合物以形成全遞送結合物。使用sephadex G-50離心管純化結合物。如上文所述測定RGD配體附接效 率。
2)方案2.於RT下使指示聚合物與SMPT以1：0.015之重量比(聚合物：SMPT)在5mM HEPES(pH 8.0緩衝液)中反應1h。
隨後於RT下使SMPT修飾之聚合物與醛-PEG-二肽掩蔽劑(醛-PEG24-ACit)以1：0.5之重量比(聚合物：PEG)及與PEG-二肽掩蔽劑(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：2之重量比(聚合物：PEG)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與SATA-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：SATA-siRNA)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：6之重量比(聚合物：PEG)在100mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD-HyNic)在69mM鹽酸溶液(HCl)中反應過夜將RGD-HyNic(實例2B)附接至經修飾之聚合物以形成全結合物。如上文所述測定RGD配體附接效率。
3)方案3. 於RT下使指示聚合物與SMPT以1：0.015之重量比(聚合物：SMPT)在5mM HEPES(pH 8.0緩衝液)中反應1h。
隨後於RT下使SMPT修飾之聚合物與醛-PEG-二肽掩蔽劑(醛-PEG24-ACit)以1：0.5之重量比(聚合物：PEG)及與PEG-二肽掩蔽劑(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：2之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與SATA-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：SATA-siRNA)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1：6之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES(pH 9.0緩 衝液)中反應1h。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD-HyNic模擬物)在100mM MES游離酸溶液中反應過夜將RGD-HyNic(實例2B)附接至經修飾之聚合物以形成全遞送結合物。如上文所述測定RGD靶向配體結合效率。
4)方案4. 於RT下使指示聚合物與疊氮基-PEG4-NHS以1：0.015之重量比(聚合物：疊氮基)在5mM HEPES(pH 8.0緩衝液)中反應1h。
隨後於RT下使疊氮基修飾之聚合物與醛-PEG-二肽掩蔽劑(醛-PEG24-ACit)以1：0.5之重量比(聚合物：PEG)及與PEG-二肽掩蔽劑(PEG12-ACit)以1：2之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與炔烴-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：炔烴-siRNA)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-ACit)以1：6之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD-HyNic模擬物)在100mM乙酸鈉-乙酸緩衝液溶液(pH 5.0)中反應過夜將RGD-HyNic(實例2B)附接至經修飾之聚合物以形成全遞送結合物。如上文所述測定RGD靶向配體結合效率。
5)方案5. 於RT下使單疊氮化物-聚合物與醛-PEG-二肽掩蔽劑(醛-PEG24-ACit)以1：0.5之重量比(聚合物：PEG)及與PEG-二肽掩蔽劑(PEG12-ACit)以1：2之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應1h。隨後於RT下使經修飾之聚合物與炔烴-siRNA以1：0.2之重量比(聚合物：炔烴-siRNA)在50mM HEPES(pH 9.0緩衝液)中反應過夜以附接siRNA。接下來，於RT下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-ACit)以1：6之重量比(聚合物：PEG)在50mM HEPES (pH 9.0緩衝液)中反應1h。
藉由於RT下與經修飾之聚合物以1：0.7之重量比(聚合物：RGD-HyNic模擬物)在100mM乙酸鈉-乙酸緩衝液溶液(pH 5.0)中反應過夜將RGD-HyNic(實例2B)附接至經修飾之聚合物以形成全遞送結合物。如上文所述測定RGD靶向配體結合效率。
實例6. 活體外細胞結合.將腫瘤細胞以50,000/ml以2ml接種至6孔板中之蓋玻片上24h。向細胞中逐滴添加5μg/ml Cy3標記之RGD-PEG-硫酸酯或Cy3標記之RGD-PEG-HyNic(方案1-5)修飾之聚合物(50μl 0.2mg/ml，RGD-PEG，RGD編號1)並將細胞於37℃下培育24h。將細胞用PBS洗滌2次並固定於10%福爾馬林(formalin)中溶液或30min。在固定後，將細胞用PBS洗滌2次。
將細胞分別用Alexa Fluor 488鬼筆環肽(phalloidin)(2單元/ml)及ToPro-3碘化物(0.2μM)染色20min以對肌動蛋白及核進行染色；之後用PBS洗滌2次。用Vectashield封固劑將蓋玻片安裝至載玻片且隨後利用Zeiss LSM 710雷射掃描共焦顯微鏡捕獲螢光信號。藉由細胞內Cy3螢光之存在測定RDG修飾之多胺之細胞攝取。各種類型之腫瘤細胞中之Cy3信號強度概述於下表4中(5：最高；1：最低)。
Figure 103127144-A0202-12-0056-85
Figure 103127144-A0202-12-0057-86
實例7. 活體中腫瘤追蹤. 經由尾靜脈投與將100-200μg(200μl 0.5mg/ml或1mg/ml)等滲葡萄糖中之Cy3標記之RGD(硫醇-RGD編號1)/PEG修飾之Lau 1005-116C-1(54%乙基乙氧基胺丙烯酸酯/46%丙烯酸丁酯RAFT共聚物，部分1，104k保護之MW，76k去保護之MW，1.2 PDI)注射至具有人類腫瘤異種移植物之免疫缺陷小鼠中。注射後4h，將動物處死並收穫腫瘤。藉由在10%福爾馬林溶液培育最少4h固定全腫瘤。隨後將腫瘤浸沒至30%蔗糖溶液中過夜或直至平衡為止。將飽和腫瘤在液氮中急速冷凍，並在載玻片(VWR superfrost加 上微小載玻片)上冰凍切片成7μm切片。隨後於RT下將切片用Alexa Fluor 488鬼筆環肽(2單元/ml)及ToPro-3碘化物(0.2μM)染色20min。在染色後，將切片用PBS洗滌2次並在頂部使用Vectashield封固劑安裝蓋玻片並利用Zeiss LSM 710雷射掃描雷射共焦顯微鏡觀察。獲取代表性影像以圖解說明Cy3螢光之組織及細胞分佈。在A498腫瘤模型中，RGD修飾之聚合物深度滲透至腫瘤組織中並進入腫瘤細胞，此與腫瘤植入之位置(皮下、肝或腎)無關。對照聚合物(無RGD(僅PEG)或RGE修飾)主要保留於脈管系統中，而不進入腫瘤細胞。在肝植入之HepG2腫瘤模型中，觀察到強RGD-結合物滲透至腫瘤組織中。
實例8. 活體中腫瘤mRNA敲除. 經由尾靜脈投與將等滲葡萄糖(500μg；300μl 1.67mg/ml)中之RGD-靶向結合物注射至具有人類腫瘤異種移植物之免疫缺陷小鼠中。注射後72h，處死動物並收穫腫瘤。使腫瘤組織在三重試劑(Tri reagent)(Molecular Research Center)中均質化以分離總RNA。藉由使用定量RT-PCR測定相對mRNA敲除。
實例9. 原位腎細胞癌(RCC)腫瘤小鼠模型. 使A498細胞(ATCC)在補充有10% FBS(Invitrogen)之MEM(Invitrogen)中生長。使786-O RCC細胞(ATCC)在1×MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen)及補充有10% FBS之RPMI(Invitrogen)中生長。收集細胞，計數並與基質膠基質HC(BD Biosciences，30體積%)在冰上混合。
將雌性無胸腺裸小鼠用約3%異氟烷麻醉並放置於右側臥位處。在左肋中切開小的(0.5-1cm)縱向腹部切口。使用潤濕棉簽，自腹膜抬出左腎並輕柔穩定。在即將注射之前，向1.0ml注射器填充細胞/基質膠混合物並將27號針導管附接至注射器尖端。隨後將填充注射器附接至注射器幫浦(Harvard Apparatus，PHD2000型)並預處理以移除空氣。在尾極附近之腎囊正下方插入附接至注射器之27-號針導管之尖 端且隨後將針之尖端沿囊3-4mm小心地向顱前進。使用注射器幫浦將10μl含有約200,000個細胞之2.5：1(vol：vol)細胞/基質膠混合物之等份試樣緩慢注射至腎實質內。將針留在腎中15-20秒以確保注射完成。隨後自腎移除針並將棉簽放置在注射位點上30秒以防止細胞洩漏或流血。隨後將腎輕柔地放回腹部中並閉合腹壁。植入後三(3)週，藉由安樂死後可視檢查及量測評價腫瘤進展。對於大多數研究而言，在腫瘤量測通常係約4-8mm時，在植入後5至6週使用腫瘤小鼠。
實例10.皮下(SQ)腫瘤. 對於SQ腫瘤植入，藉由將小鼠放置於具有3%異氟烷之誘導室中誘導麻醉。在麻醉後，將小鼠放置於布簾上並經由頭錐體補充3%異氟烷麻醉。將小鼠定位於其側面(右側或左側)並向相對肋中實施注射。在即將注射之前，向1.0ml注射器填充細胞/基質膠混合物並將27號針導管附接至注射器尖端。隨後將填充注射器附接至注射器幫浦(Harvard Apparatus，PHD2000型)並預處理以移除空氣。在皮膚層正下方肋中插入針並以250μl/分鐘之速率注射細胞(10μl或20μl)。在注射後，移除針並將小鼠放置於由放置於籠下方之水夾套加熱墊供熱之回收籠中。在動物重新獲得正常活性程度後，使其返回至其圈養槽。
實例11. 肝腫瘤模型.將HepG2細胞與2個表現載體(pMIR85人類胎盤分泌之鹼性磷酸酶(SEAP)載體及pMIR3新黴素/卡那黴素(kanamycin)抗性基因載體)共轉染，以形成具有穩定SEAP表現之細胞系。使細胞在補充有10% FBS及300μg/ml G418之DMEM中生長。使HT-29結腸癌細胞在補充有10% FBS之McCoy之5A培養基中生長。對於腫瘤植入，收集細胞，計數並與基質膠(BD Biosciences，40體積%)混合。將無胸腺裸小鼠用約3%異氟烷麻醉並放置於胸骨側臥位處。在劍狀軟骨正下方切開小的(1-2cm)中線腹部切口。使用潤濕棉簽，輕柔地自腹部取出左肝葉。使左肝葉輕柔地收縮並將注射器針插入左 葉中部。在即將注射之前，向1.0ml注射器填充細胞/基質膠混合物並將27號針導管附接至注射器尖端。隨後將填充注射器附接至注射器幫浦(Harvard Apparatus，PHD2000型)並預處理以移除空氣。在肝囊正下方約0.5cm斜向下插入注射器針。使用注射器幫浦將10μl含有100,000個細胞之細胞/基質膠混合物注射至肝中。將針留在肝中15-20秒以確保注射完成。隨後自肝移除針並將棉簽放置在注射位點上以防止細胞洩漏或流血。基質膠/細胞混合物形成在移除針後可見且不消失之團塊。隨後將肝葉輕柔地放回腹部中並閉合腹壁。對於HepG2腫瘤小鼠，在腫瘤植入後每週收集一次血清並使其經受SEAP分析以監測腫瘤生長。對於大多數研究而言，在基於SEAP值預測腫瘤量測通常為約4-8mm時，在植入後4至5週使用腫瘤小鼠。對於HT-29腫瘤小鼠而言，基於歷史觀察，在腫瘤通常達到4-8mm長及寬時，在植入後5至6週使用腫瘤小鼠。
實例12. 定量實時PCR分析.在定量PCR之製備中，遵循製造商之方案自三重試劑(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)中均質化之組織試樣分離總RNA。使用高容量cDNA逆轉錄套組(Life Technologies)逆轉錄約500ng RNA。對於人類(腫瘤)Aha1表現，在一式三份雙重反應中使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Life Technologies)或VeriQuest Probe Master Mix(Affymetrix)來使用對人類Aha1(分析ID：Hs00201602_m1)及CycA(部分編號：4326316E)之預製造之TaqMan基因表現分析。對於人類(腫瘤)EG5表現，在一式三份雙重反應中使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Life Technologies)或VeriQuest Probe Master Mix(Affymetrix)來使用對人類EG5(分析ID：Hs00189698_m1)及CycA(部分編號：4326316E)之預製造之TaqMan基因表現分析。藉由使用7500 Fast或StepOnePlus實時PCR系統(Life Technologies)實施定量PCR。使用△△CT方法以計算相 對基因表現。
實例13.活體中腎細胞癌腫瘤基因之敲除.藉由使用RGD模擬物編號1-PEG-硫酸酯或RGD模擬物編號1-PEG-HyNic形成RGD靶向之siRNA遞送結合物。利用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit(利用RGD模擬物編號1-PEG-HyNic使用1號方案)或SPDP-PEG24-FCit(利用RGD-PEG-硫酸酯)及100μg Aha1 siRNA修飾500μg Lau 41648-106聚合物。如所述生成具有腎RCC腫瘤之小鼠且用Aha1結合物之單一尾靜脈注射處理。注射後72h使小鼠無痛致死且遵循製造商之建議使用Trizol試劑自腎腫瘤製備總RNA。與僅用遞送緩衝液處理之小鼠相比，藉由如所述RT-qPCR測定相對Aha1 mRNA含量。無靶向配體或RGE對照配體調配之結合物呈現基因表現降低25-35%。RGD靶向之結合物呈現腫瘤Aha1表現之50-70%基因減少(n=3或4)。
Figure 103127144-A0202-12-0061-87
用非靶向結合物(無配體或RGE模擬物(陰性對照配體))處理之動物中之基因敲除可能係經由增強之滲透及滯留(EPR)效應之腫瘤中之結合物被動累積之結果(Torchilin,2011)。結合物之長血清穩定性及循環容許經由EPR腫瘤大量累積。儘管如此，與被動靶向之結合物相比，RGD靶向之結合物呈現基因表現額外降低20-40%。
實例14.活體中腎細胞癌腫瘤基因之敲除. 使用RGD模擬物編號 1-PEG及1號方案形成RGD模擬物編號1靶向之siRNA遞送結合物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit及100μg Aha1 siRNA修飾500μg Lau 41648-106聚合物。使用RGD模擬物編號1-PEG-HyNic作為該等試樣之靶向配體。如所述生成含有轉移性(皮下)及原位腎RCC腫瘤之小鼠且用Aha1結合物之單一尾靜脈注射處理。注射後72h使小鼠無痛致死且遵循製造商之建議使用Trizol試劑自腎腫瘤製備總RNA。藉由如上文所述RT-qPCR測定腫瘤植入位點處之相對人類(腫瘤)Aha1 mRNA含量且將其正規化至僅注射遞送緩衝液之小鼠。RGD靶向之結合物呈現腫瘤Aha1表現之基因減少40-50%(n=3或4)。
Figure 103127144-A0202-12-0062-89
實例15. RDG靶向之siRNA遞送結合物將siRNA遞送至多腫腫瘤類型。侵襲肝之癌症包括源自肝組織之癌症(例如肝細胞癌，HCC)及源自其他組織(例如結腸、肺、腎或乳房)之轉移性癌症。將已知在活體外表現αvβ3整聯蛋白且結合至RGD-結合物之各種癌細胞類型植入肝中。使用RGD模擬物編號1-HyNic或RDG模擬物編號1-PEG-硫酸酯形成RGD靶向之siRNA遞送結合物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit(1號或5號方案)或8×PEG12-FCit-/0.5×SPDP-PEG24-FCit(使用RGD-PEG-硫酸酯方案)及100μg Aha1 siRNA修飾500μg Lau 41648-106聚合物。隨後用單一劑量之藉由尾靜脈注射投與之Aha1 siRNA遞送結合物處理具有腫瘤之小鼠。注射後72h使小鼠無痛致死且遵循製造商之 建議使用Trizol試劑自肝腫瘤製備總RNA。對於每一腫瘤類型，將腫瘤Aha1 mRNA含量正規化至僅服用遞送緩衝液之小鼠中之腫瘤。RGD靶向之結合物呈現腫瘤Aha1基因表現降低50-60%(n=3或4)。
Figure 103127144-A0202-12-0063-90
實例16. 利用不同聚合物種類之RGD-結合物調配.
聚合物Emi 1034-68C-1
聚合物Emi 1034-81F-1
聚合物LH 1073-20C-1
使用RGD模擬物編號1b及2號方案形成RGD模擬物編號1靶向之siRNA遞送結合物，用8×PEG12 ACit/0.5×醛-PEG24-ACit及80μg Aha1 siRNA修飾400μg Emi 1034-68C-1、Emi 1034-81F-1或LH 1073-20C-1聚合物。使用RGD模擬物編號1b作為該等調配物之靶向配體。隨後用單一劑量之藉由尾靜脈注射投與之Aha1結合物處理具有原位RCC腫瘤之小鼠。注射後72h使小鼠無痛致死且遵循製造商之建議使用Trizol試劑自肝腫瘤製備總RNA。將腫瘤Aha1 mRNA含量正規化至僅服用遞送緩衝液之小鼠中之腫瘤。
Figure 103127144-A0202-12-0064-91
實例17. 具有ACit或FCit二肽掩蔽試劑之RGD-結合物調配物. 使用RGD模擬物編號1b及2號方案形成RGD模擬物編號1靶向之siRNA遞送結合物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG12-FCit(對FCit二肽掩蔽之遞送結合物)或8×PEG12-ACit/0.5×醛-PEG24-ACit(對於ACit二肽掩蔽之遞送結合物)及80μg Aha1 siRNA修飾400μg Emi 1034-68C-1聚合物。使用RGD模擬物編號1b-HyNic作為該等調配物之靶向配體。隨後用單一劑量之藉由尾靜脈注射投與之Aha1 siRNA遞送結合物處理具有原位RCC腫瘤之小鼠。注射後72h使小鼠無痛致死且遵循製造商之建議使用Trizol試劑自肝腫瘤製備總RNA。將腫瘤Aha1 mRNA含量正規化至僅服用遞送緩衝液之小鼠中之腫瘤。ACit或FCit siRNA遞送結合物之間之基因敲除功效無明顯差異。對於ACit或FCit結合物，RGD靶向之結合物分別呈現腫瘤Aha1基因表現降低51%或53%(n=3)。
Figure 103127144-A0202-12-0064-92
實例18. siRNA. siRNA具有以下序列： AhaI siRNA：
有義：(NH2C6)GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)(SEQ ID 3)
反義：pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT(SEQ ID 4)
p=磷酸酯
核苷酸之前之d=2'-去氧
s=硫代磷酸酯鍵聯
核苷酸之後之f=2'-F取代
小寫字=2'-O-CH3取代
在固體相上藉由習用亞磷醯胺化學在作為固體載體之ÄKTA Oligopilot 100(GE Healthcare,Freiburg,Germany)或Mermade 12(Bioautomation,Plano Texas)及可控孔玻璃(CPG)上實施RNA合成。
實例19.炔烴二硫鍵有義鏈RNA結合物之合成. 於-80℃下使用EtOH中之乙酸鈉(0.3M)沈澱5' C-6胺基修飾之粗製有義鏈RNA(3.4mg,506nmol)，凍乾，並溶解於300μL 0.2M NaHCO3(pH 8-9)中。將二苯并環辛炔-N-羥基琥珀醯亞胺基(二苯并環辛炔-S-S-N-羥基琥珀醯亞胺基酯(DBCO-NHS)，項目號761532 Aldrich)(2.86mg,5060nmol)溶解於286μL DMF中並添加至RNA溶液中。將反應混合物充分混合並使其於RT下進行2h。使用RP-HPLC監測反應。在反應完成後，將反應混合物乾燥並使用RP-HPLC純化。以45%產率(229nmol)製備RNA結合物。藉由RP-HPLC測定RNA結合物之純度(純度：96.6%)並藉由MALDI-TOF/TOF確認身份(計算之質量7164.0；觀察之質量：7164.8)。
實例20. 4-(Fmoc-4-胺基苯氧基)丁酸之合成.
Figure 103127144-A0202-12-0066-93
A. 3之合成：將對-硝基-酚(2)(7.5g,53.9mmol)與4-溴丁酸乙基酯(8.45ml,5.9mmol)及K2CO3(7.5g,5.4mmol)在DMF(75ml)中合併並於100℃下攪拌2h。移除DMF並將粗製物稀釋於2N NaOH與甲醇之3：1混合物之混合物中並於RT下攪拌4h。用6M HCl酸化反應混合物。收集白色沈澱(10.9g，90%產率)。[1H-NMR(400MHz,DMSO)δ：12.165(bs,1 H)δ：8.175(AA’,J=Hz,2 H)δ：7.120(AA’,J=Hz,2 H),δ：4.122(t,J=6.8Hz,2 H),δ：2.379(t,J=6.8Hz,2H),δ：1.975(p,J=6.8Hz,2H)]
B. 4之合成：將3(37.1g,mmol)與甲酸銨(35g,mmol)一起溶解於MeOH(1L)中並添加10% Pd/C(Degussa型)(3.5g)。將混合物於65℃下回流過夜。用矽藻土過濾反應物，以產生紅褐色固體(30.5g，95%產率)。[1H-NMR(400MHz,DMSO),δ：6.609(AA’,J=Hz,2 H)δ：6.470(AA’,J=Hz,2 H),δ：3.790(t,J=6.8Hz,2 H),δ：2.288(t,J=7.2Hz,2 H),δ：1.832(p,J=7.2Hz,2 H)]
C. 4-(Fmoc-4-胺基苯氧基)丁酸(1)之合成：將4(5.1g,26mmol) 溶解於飽和碳酸氫鈉水溶液與THF之6：4混合物(300ml)中以製備白色漿液。添加Fmoc-OSu(8.82g,26.1mmol)並將反應物攪拌4h。移除丙酮，酸化反應物並收集米色沈澱並在1N HCl中研磨，以產生9.6g產物(88%產率，分子量389.40066)。[1H-NMR(400MHz,DMSO)δ：9.508(bs,1Hz),δ：7.885(d,J=7.6,2Hz,2H),δ：7.727(d,J=6.8Hz,2H),δ：7.389-7.32(bm,7H),δ：7.328(dd,J=6.8,6.4Hz,2H),δ：6.828(d,J=7.6Hz,2H),δ：4.435(d,J=6.0Hz,2H),δ：4.275(t,J=6.4Hz,1H),δ：3.897(t,J=6.0Hz,2H),δ：2.335(t,J=7.2Hz,2H),δ：1.885(p,J=7.2Hz)]
所用試劑：二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇(MeOH)、H2O(HPLC級)、丙酮、對-硝基酚、4-溴丁酸乙基酯、碳酸鉀、Pd/C(Degussa型)係自Sigma Aldrich購得且原樣使用。Fmoc-OSu係自Novabiochem購得。
實例21.胍基-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG 12 -HyNic-Boc之合成.
Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH 2
A. Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH(2). 將Fmoc-Gly-OH(CAS 29022-11-5)(1.57g,5.28mmol)溶解於THF(30ml)中並設置在冰水浴中攪拌。向溶液中添加NHS(0.668g,5.81mmol)及DCC(1.2g,5.81mmol)，攪拌5min，並移除冰浴。將反應混合物於20℃下攪拌16h，冷卻至0℃並保持1h，隨後過濾，濃縮並在真空中乾燥。將粗產物溶解於THF(20ml)中並添加至H-Asp(2-PhiPr)-OH(CAS 200336-86-3)(1.328g,5.28mmol)及NaHCO3(600mg,7.14mmol)於H2O(30ml)中之溶液。添加1,2-二甲氧基乙烷(DME,30ml)以使溶液均勻並攪拌16h。在旋轉蒸發器上移除THF及DME，將殘餘物用H2O(150ml)稀釋並用3% HCl酸化至pH=3，以產生Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH(2)。將 產物用EtOAc萃取5次，用鹽水沖洗，乾燥(Na2SO4)並在真空中濃縮並乾燥。產率，2.54g。粗產物用於下一步驟，假定100%產率。
Figure 103127144-A0202-12-0068-94
B. Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc(3).將二肽2(1.168g,2.2mmol)溶解於DCM(20ml)中並設置在冰水浴中攪拌。向溶液中添加NHS(291mg,2.53mmol)及DCC(522mg,2.53mmol)，於0℃下攪拌5min且隨後於20℃下攪拌16h。將反應混合物在冰浴上冷卻1h，過濾並在真空中濃縮並乾燥。將所得NHS衍生物溶解於DCM(15ml)中並添加至4-[3-(Boc-胺基)丙-1-基氧基]-苯胺(APOA-Boc,644mg,2.42mmol)(Quelever、Frederic.及Kraus Organic & Biomolecular Chemistry,1(10),1676-1683；2003)及TEA(175μl,1.25mmol)之溶液。將反應物於20℃下攪拌3h並添加1,4-二噁烷(10ml)。在真空中移除所有揮發物。將殘餘物溶解於EtOAc(200ml)中，用5% KHSO4(2×40ml)、水(1×40ml)、濃碳酸氫鈉溶液(1×40ml)及鹽水(1×40ml)洗滌。將有機層乾燥(Na2SO4)，隨後在真空中濃縮並乾燥。產率，1.714g。粗產物，Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc(3)用於下一步驟中，假定100%產率。
Figure 103127144-A0202-12-0068-95
C. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOAHCl鹽(4).將化合物3(800mg,1.02mmol)用HCl於二噁烷(4M,22ml)中之冰冷溶液處理並於0℃下攪拌45min。移除冷卻浴並濃縮懸浮液。將殘餘物懸浮於CHCl3(2.5ml)中，添加二乙醚(45ml)，且分離固體。將4-[3-(胺基)丙-1-基氧基]-苯胺(APOA)衍生物之HCl鹽之再沈澱程序重複兩次且在真空中乾燥產物。 產率：557mg(92%)。
Figure 103127144-A0202-12-0069-97
D. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH-Boc(5)。於0℃下向含有Boc-Peg12-CO2H(Quanta Biodesign Limited 10761,803mg,1.12mmol)於DCM(8ml)中之溶液中添加NHS(193mg,1.68mmol)，之後添加DCC(346mg,1.68mmol)。移除冷卻並繼續攪拌24h。將反應混合物冷藏至-20℃，過濾並濃縮。將NHS衍生物用化合物4(667mg,1.12mmol)及DIEA(154μl,0.89mmol)於DMF(14ml)中之溶液處理，攪拌16h，過濾並濃縮。藉由急驟SiO2層析用DCM：MeOH：乙酸(92.5：7：0.5)洗脫純化所得粗製殘餘物。產率：575mg(41%)。
Figure 103127144-A0202-12-0069-98
E. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH2(6).將化合物5(140mg,0.11mmol)用TFA(3ml)及H2O(1ml)處理。將混合物攪拌20min，用冷H2O稀釋並在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將殘餘物與Et2O一起研磨3次，在真空中乾燥且未經進一步純化即使用。產率：115mg(90%)。
Figure 103127144-A0202-12-0069-99
F. H2N-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc(7).向含有6(105mg,0.091mmol)及DIEA(31μl,0.18mmol)於DCM(3ml)中之溶液中添加Boc-HyNic-NHS(Abrams,M.J.、Juweid,M.、Tenkate,C.I.、Schwartz,D.A.、Hauser,M.M.、Gaul,F.E.、Fuccello,A.J.、 Rubin,R.H.、Strauss,H.W.、Fischmann,A.J.J.Nucl.Med.31,2022-2028,1990)。(35mg,0.10mmol)。
Figure 103127144-A0202-12-0070-102
將混合物攪拌16hr，用MeOH中之乙胺(30μl,2.0M)處理，並攪拌額外3h(以驟冷過量未反應之Boc-HyNic-NHS)。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。將粗製殘餘物溶解於DMF(3ml)中，隨後用TEA(400μl)處理並攪拌16h。在旋轉蒸發器上利用油幫浦真空移除所有揮發物。利用製備型HPLC使用Thermo Aquasil C18管柱(5u,100Å)用ACN(0.1%甲酸)於H2O(0.1%甲酸)中之梯度(18-43%)經30min洗脫純化粗產物。產率：36mg(34%)。
Figure 103127144-A0202-12-0070-104
G. 3-胍基苯甲酸-NHS酯(1).向3-胍基苯甲酸(1g,4.65mmol；Chandrakumar,N.等人，美國專利5,773,646)於DMF(25ml)中之攪拌溶液中添加NHS(589mg,5.12mmol)，攪拌5min，隨後向反應混合物中添加DCC(1.056g,5.12mmol)。繼續攪拌2h，隨後將反應混合物冷卻至-20℃並保持30min，過濾出產物，用冷DMF洗滌，且在真空中使用油幫浦乾燥。產率：1.283g(100%)。
Figure 103127144-A0202-12-0070-107
 8，RGD模擬物編號1-PEG-HyNic，n=12
H. 胍基-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc(8).將含有7(36mg,0.031mmol)及NaHCO3(13mg,0.155mmol)之H2O(1ml)及THF(0.9ml)之混合物用3-胍基苯甲酸之NHS酯(1)(19.5mg,0.071mmol)處理並攪拌22h。隨後用H2O稀釋混合物並在旋轉蒸發器上移除THF。於pH=3(1% HCl)下將殘餘物懸浮於水(3ml)中並過濾出固體雜質。在真空中濃縮產物，將粗製殘餘物用H2O(0.8ml)、丙酮(0.8ml)及TFA(1.8ml)之混合物處理並攪拌40min。在完成後，將溶液用丙酮(2ml)稀釋並在旋轉蒸發器上移除所有揮發物。利用製備型HPLC使用Thermo Aquasil C18管柱(5u,100Å)用ACN(0.1%甲酸)於H2O(0.1%甲酸)中之梯度(18-43%)經30min洗脫純化所得粗產物。產率：34mg(89%)。
實例22. RGD配體之固體相合成.
Figure 103127144-A0202-12-0071-109
二甲基甲醯胺(DMF)、六氫吡啶、二氯甲烷(DCM)、二乙醚(Et2O)、H2O(HPLC級)、乙腈(ACN)(HPLC級)、三乙胺(TEA)、F3CCO2H(TFA)及三異丙基矽烷(TIPS)。PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基-六氟磷酸鏻鹽)係自Oakwood Products公司購得。Rink醯胺MBHA樹脂、Fmoc-Gly-OH及Fmoc-Asp(tBu)-OH係自Novabiochem購得。使用業內之標準技術合成4-(N-Fmoc對-胺基苯氧基)-丁酸及二-boc間-胍基苯甲酸。燒結之聚丙烯注射器係自Torviq購得。溶劑A係H2O：F3CCO2H 100：0.1 v/v。溶劑B係CH3CN：F3CCO2H 100：0.1 v/v。
Fmoc-Lys(HyNic)-OH係如前文所述合成。
Figure 103127144-A0202-12-0072-113
Figure 103127144-A0202-12-0072-114
A. 肽合成. 將Rink醯胺MBHA樹脂放置於燒結之聚丙烯注射器中並在使用之前在DCM中攪動2h。使用以下標準固體相肽合成。藉由將10ml(/1mmol樹脂)六氫吡啶：DMF溶液(20：80 v/v)浸泡20min實施Fmoc去保護。藉由將樹脂用4當量Fmoc-胺基酸、4當量PyBOP及10當量以0.1M濃度於DMF中之DMF中之三乙胺浸泡40min實施醯胺偶合。
將Fmoc-Lys(HyNic)-OH、4-(N-Fmoc對-胺基苯氧基)-丁酸、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH及Fmoc-3-胺基苯甲酸依序偶合至樹脂上。使用MALDI-TOF分析檢查醯胺偶合之進展。實施4-(N-Fmoc對-胺基苯氧基)-丁酸之Fmoc去保護40min以確保完全Fmoc-去保護。將Fmoc-Asp(tBu)-OH殘餘物雙倍偶合以確保在Fmoc-天冬胺酸與4-(胺基苯氧基)-丁酸殘餘物之胺基部分之間之醯胺形成。在TFA：H2O：TIPS：丙酮(92.5：2.5：2.5：2.5 v/v/v/v)溶液中實施樹脂之裂 解2h。使用吹入空氣以將TFA溶液減少至約10體積%，且將肽沈澱至Et2O中。將沈澱重新溶解於A：B(1：1 v/v)溶劑混合物中並使用反相HPLC純化。
B. 肽純化. 在配備有Phenomenex Gemini C18(250×21.2mm，5μm粒子)管柱之製備級Shimadzu HPLC上使用10-30% B溶劑梯度經20min實施純化(至>90%均勻性)。經50min使用10-60% B梯度在配備有Waters xBridge C18(4.6×250mm，5μm粒子)管柱之分析型Shimadzu HPLC上評定純度。凍乾HPLC部分，從而產生TFA鹽形式之純化肽。
實例23. A. PEG 12/24 -FCit-PABOC-PNP之合成.
Figure 103127144-A0202-12-0073-116
1)二肽前體之製備：
a)Fmoc-FCit-OH
Figure 103127144-A0202-12-0073-184
向H-Cit-OH(Sigma-Aldrich C7629)(184mg,1.05mmol)及 NaHCO3(88.2mg,1.05mmol)於H2O(2.6ml)中之溶液中添加Fmoc-Phe-OPfp(EMD NovaBiochem 852226)(553mg,1mmol)於THF(5ml)中之溶液。添加THF(2ml)以使得溶液均勻並攪拌10h。在旋轉蒸發器上移除THF，將殘餘物用H2O(10ml)及iPrOH(1ml)稀釋並用3% HCl酸化至pH=1。將產物用9：1 EtOAc：iPrOH溶液萃取5次，用鹽水：iPrOH之9：1混合物沖洗，乾燥(Na2SO4)並在真空中濃縮並乾燥。與醚一起研磨，從而得到313mg純產物(57%)。可使用類似條件製備Fmoc-ACit-OH。
b)Fmoc-FCit-PAB-OH
Figure 103127144-A0202-12-0074-120
將Fmoc-FCit-OH(5.98g,10.97mmol)及PABA(2.70g,21.95mmol)於DCM(150ml)及MeOH(50ml)中之溶液用EEDQ(5.43g,21.95mmol)處理並於20℃下攪拌15h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物，將殘餘物與Et2O一起研磨，且過濾出產物並在真空中乾燥。產率，6.14g(86%)。可使用類似條件製備Fmoc-ACit-PAB-OH。
c)H2N-FCit-PAB-OH(相同條件用於製備H2N-A-Cit-PAB-OH)
Figure 103127144-A0202-12-0075-121
藉由與Et3N(3.5ml)在DMF(11ml)中一起攪拌10h使Fmoc-FCit-PAB-OH(0.83mmol)去保護。於40℃/油幫浦真空下在旋轉蒸發器上移除所有揮發物以獲得粗產物，其未經額外純化即使用。
B. PEG 12 -FCit-PABC-PNP之製備. (FCit=苯丙胺酸-瓜胺酸)
Quanta Biodesign產物編號：10262
Figure 103127144-A0202-12-0075-123
Quanta Biodesign產物編號：10304
Figure 103127144-A0202-12-0075-125
1. PEG12-FCit-PAB-OH
Figure 103127144-A0202-12-0075-127
向H2N-FCit-PAB-OH(0.88mmol)及DIEA(167μl,0.96mmol)於 DMF(3ml)中之溶液中添加PEG12-NHS(Quanta Biodesign10262)或PEG24-NHS(Quanta Biodesign 10304)(0.8mmol)於DMF(3ml)中之溶液。將混合物攪拌16h，過濾並濃縮。將粗製物自CHCl3：MeOH(1：1,5ml)沈澱至Et2O(45ml)中並未經額外純化即使用。產率：420mg(53%)。
ii)PEG12-FCit-PABC-PNP
Figure 103127144-A0202-12-0076-129
將含有PEG12/24-FCit-PAB-OH(419mg,0.42mmol)、(PNP)2CO(Sigma-Aldrich 161691)(766mg,2.52mmol)及DIEA(263μl,1.52mmol)於二噁烷(4ml)中之溶液在黑暗中於50℃下攪拌15h。在旋轉蒸發器上移除所有揮發物並藉由自DMF蒸發移除殘餘DIEA。在管柱上純化產物，洗脫劑CHCl3：EtOAc：MeOH=4.5：5：0.5，之後CHCl3中之MeOH(12-15%)之梯度。產率：390mg(80%)。
實例24. 兩親性膜活性多胺合成.
A. 丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯之RAFT共聚(圖11).對於其他膜活性聚合物，A亦可為經保護之乙基、丙基或丁基胺基之丙烯酸酯。B可為高碳酸疏水性(10-24個碳原子，顯示C18)丙烯酸酯、低碳數疏水性(1-6個碳原子，顯示C4)丙烯酸酯或低碳酸、高碳數疏水性丙烯酸酯之組合。
由胺丙烯酸酯/C3甲基丙烯酸酯組成之共聚物係如下合成。稱重 單體及RAFT試劑並以指示比率置入乙酸丁酯中。添加AIBN(偶氮雙-異丁腈)並於RT下使氮鼓泡通過反應物1h。隨後於80℃下將反應混合物放置至油浴中15h。隨後用己烷沈澱聚合物，且使用DCM/己烷溶劑系統進一步分步沈澱(參見下文)。隨後在減壓下乾燥聚合物。於RT下將聚合物用乙酸中之7ml 2M HCl去保護30min。30min後，向反應混合物中添加15ml水，並將混合物轉移至3.5kDa MWCO透析管道中。將聚合物利用NaCl透析過夜且隨後利用dH2O再透析一天。隨後經由凍乾移除水，並將聚合物溶解於dH2O中。
B.丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯之無規共聚. 如下合成由胺丙烯酸酯/Cn甲基丙烯酸酯組成之共聚物。稱重單體，以指示比率置入二噁烷中。添加AIBN(偶氮雙-異丁腈)並於RT下使氮鼓泡通過反應物1h。隨後於60℃下將反應混合物放置於油浴中3h。隨後在減壓下乾燥聚合物。藉由GPC純化聚合物。其後，於RT下將聚合物部分用乙酸中之7ml 2M HCl去保護30min。30min後，向反應混合物中添加15ml水，並將混合物轉移至3.5kDa MWCO透析管道中。將聚合物利用NaCl透析過夜且隨後利用dH2O再透析一天。隨後經由凍乾移除水，並將聚合物溶解於dH2O中。
C.水溶性、兩親性、膜活性聚(乙烯基醚)多胺三元聚合物之合成.在氮氣層下在無水二氯甲烷中向爐乾燥之圓底燒瓶中添加X mol%胺保護之乙烯基醚(例如，2-乙烯基氧基乙基鄰苯二甲醯亞胺)。向此溶液中添加Y mol%低碳數疏水性基團(例如，丙基、丁基)乙烯基醚及視情況Z mol%高碳數疏水性基團(例如，十二烷基、十八烷基)乙烯基醚(圖1)。將溶液放置於-50℃至-78℃浴中，並使2-乙烯基氧基乙基鄰苯二甲醯亞胺沈澱。向此溶液中添加10mol% BF3．(OCH2CH3)2並使反應於-50℃至-78℃下進行2-3h。藉由添加甲醇溶液中之氫氧化銨終止聚合。在減壓下使聚合物乾燥且隨後放入1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中。添加 20mol當量肼/鄰苯二甲醯亞胺以自胺移除保護基團。將溶液回流3h且隨後在減壓下乾燥。將所得固體溶解於0.5mol/L HCl中並回流15-min以形成聚合物之鹽酸鹽，用蒸餾水稀釋並再回流一小時。隨後將溶液用NaOH中和，冷卻至RT，轉移至分子纖維素管道，利用蒸餾水透析並凍乾。可使用尺寸排除或其他層析進一步純化聚合物。根據標準程序使用管柱(包括分析型尺寸排除層析及多角光散射尺寸排除層析(SEC-MALS))估計聚合物之分子量。
D. 聚合物Ant-41658-111：
1)單體合成. 2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)(AIBN，基團起始劑)、4-氰基-4-(苯基硫代甲醯基硫基)戊酸(CPCPA、RAFT試劑)及乙酸丁酯係自Sigma Aldrich購得。過濾甲基丙烯酸丙酯單體(Alfa Aesar)以移除抑制劑。
在配備有攪拌棒之2L圓底燒瓶中，將2-(2-胺基乙氧基)乙醇(21.1g,202.9mmol,Sigma Aldrich)溶解於350ml二氯甲烷中。在單獨1L燒瓶中，將BOC酐(36.6g,169.1mmol)溶解於660ml二氯甲烷中。2L圓底燒瓶裝配有加料漏斗且經6h向燒瓶中添加BOC酐溶液。將反應物攪拌過夜。在2L分離漏斗中，將產物各自用300ml 10%檸檬酸、10% K2CO3、飽和NaHCO3及飽和NaCl洗滌。將產物BOC保護之2-(2-胺基乙氧基)乙醇經Na2SO4乾燥，重力過濾，並使用旋轉蒸發及高真空蒸發DCM。
在配備有攪拌棒且用氬沖洗之500ml圓底燒瓶中，添加BOC保護之2-(2-胺基乙氧基)乙醇(27.836g,135.8mmol)，之後添加240ml無水二氯甲烷。添加二異丙基乙基胺(35.5ml,203.7mmol)，並將系統放置於乾冰/丙酮浴中。使用10ml二氯甲烷稀釋丙烯醯氯(12.1ml,149.4mmol)，並逐滴添加至氬沖洗之系統中。將系統保持於氬下並使其達到RT並攪拌過夜。將產物各自用100ml dH2O、10%檸檬酸、10% K2CO3、飽和NaHCO3及飽和NaCl洗滌。將產物丙烯酸BOC-胺基乙基乙氧基酯(BAEEA)經Na2SO4乾燥，重力過濾，並使用旋轉蒸發蒸發DCM。經由使用7.5cm直徑管柱之管柱層析在29cm二氧化矽上純化產物。所用溶劑系統係己烷中之30%乙酸乙酯。Rf：0.30。收集各部分並使用旋轉蒸發及高真空移除溶劑。以74%產率獲得BAEEA。將BAEEA儲存於冷凍器中。
Figure 103127144-A0202-12-0079-130
2)聚合：製備AIBN(1.00mg/ml)及RAFT試劑(4-氰基-4(苯基硫代甲醯基硫基)戊酸(CPCPA),10.0mg/ml)於乙酸丁酯中之溶液。單體莫耳進料比係75 BAEEA：25甲基丙烯酸丙酯(CAS：2210-28-8)與0.108 CPCPA RAFT試劑及0.016 AIBN觸媒(總共0.00562mol)。
向具有攪拌棒之20ml玻璃小瓶中添加BAEEA(1.09g,4.21mmol)(A)、甲基丙烯酸丙酯(.180g,1.41mmol)(B)、CPCPA溶液(.170ml,.00609mmol)(C)、AIBN溶液(.150ml,.000915mmol)及乙酸丁酯(5.68ml)。將小瓶用橡膠帽密封並使用長注射器針與第二短注射器針作為出口使溶液用氮鼓泡1h。移除注射器針並使用油浴將系統加熱至80℃並保持15h。使溶液冷卻至RT並轉移至50ml離心管，之後向溶液中添加己烷(35ml)。將溶液以4,400rpm離心2min。小心地傾析上清液層並用己烷沖洗底部(固體或凝膠狀)層。隨後將底層重新溶解於DCM(7ml)中，沈澱於己烷(35ml)中並再離心一次。傾析上清液並用己烷沖洗底層，之後將聚合物在減壓下乾燥若干小時。經由MALS獲得分子量：73,000(PDI 1.7)；使用H1NMR獲得聚合物組合物：69：31胺：烷基。
分步沈澱.將乾燥之沈澱產物溶解於DCM(100mg/ml)中。添加己烷直至恰好達到濁點之後(約20ml)。離心所得乳狀溶液。將底層(佔聚合物之約60%之稠液體)萃取並完全沈澱至己烷中。藉由進一步添加己烷亦完全沈澱剩餘上部溶液。將兩個部分離心，其後，將聚合物分離並在真空下乾燥。部分1：Mw 87,000(PDI 1.5)；部分2：Mw 52,000(PDI 1.5-1.6)。
MALS分析. 將約10mg聚合物溶解於0.5ml 89.8%二氯甲烷、10%四氫呋喃、0.2%三乙胺中。使用附接至使用Jordi 5μ 7.8×300混合床LS DVB管柱之Shimadzu Prominence HPLC之Wyatt Helos II多角光散射檢測器量測分子量及多分散性(PDI)。粗製聚合物：MW：73,000(PDI 1.7)，部分1：MW 87,000(PDI：1.5)，部分2：MW 52,000(PDI 1.5-1.6)
使純化BOC保護之聚合物與乙酸(7ml)中之2M HCl反應0.5h以移除BOC保護基團並產生胺。向反應物中添加15ml dH2O，將溶液轉移至3500 MW截止值纖維素管道中，利用高鹽透析24h，隨後利用dH2O透析18h。將內容物凍乾，隨後以20mg/ml之濃度溶解於DI H2O中。於2℃至8℃下儲存聚合物溶液。
E.聚合物Lau24B係如上文製得，只是單體進料比係72.5 BAEEA：27.5甲基丙烯酸丙酯。
F. Ant-129-1基本上係如上文所述製得，只是使用以下單體：
Figure 103127144-A0202-12-0080-131
Figure 103127144-A0202-12-0081-132
Figure 103127144-A0202-12-0081-133
對於N-Boc-胺基-丙基-丙烯酸酯(BAPA)，在配備有攪拌棒且用氬沖洗之500ml圓底燒瓶中，添加3-(BOC-胺基)1-丙醇(TCI)(135.8mmol)，之後添加240ml無水二氯甲烷。添加二異丙基乙基胺(203.7mmol)，並將系統放置於乾冰/丙酮浴中。使用10ml二氯甲烷稀釋丙烯醯氯(149.4mmol)，並逐滴添加至氬沖洗之系統中。將系統保持於氬下並使其達到RT並攪拌過夜。將產物各自用100ml dH2O、10%檸 檬酸、10% K2CO3、飽和NaHCO3及飽和NaCl洗滌。將產物丙烯酸BOC-胺基丙基酯(BAPA)經Na2SO4乾燥，重力過濾，並使用旋轉蒸發蒸發DCM。經由使用7.5cm直徑管柱之管柱層析在29cm二氧化矽上純化產物。所用溶劑系統係己烷中之30%乙酸乙酯。Rf：0.30。收集各部分並使用旋轉蒸發及高真空移除溶劑。以74%產率獲得BAPA。將BAPA儲存於冷凍器中。
G. 聚合物Lau41648-106. 基於總單體莫耳，單體莫耳進料比係80 BAEEA：20甲基丙烯酸丙酯(CAS：2210-28-8)及3% AIBN觸媒。向具有攪拌棒之50ml玻璃管中添加BAEEA(6.53g,25.2mmol)(A)、甲基丙烯酸丙酯(0.808g,6.3mmol)(B)、AIBN(0.155g,0.945mmol)及二噁烷(34.5ml)。化合物A及B係如上文實例16Ai中所述製得。一式三份設置反應。使用長吸管使每一溶液用氮鼓泡1h。移除吸管並小心地封蓋每一管。隨後使用油浴將每一溶液於60℃下加熱3h。使每一溶液冷卻至RT並在圓底中合併。在減壓下乾燥粗製聚合物。經由MALS獲得之分子量：55,000(PDI 2.1)；使用H1NMR獲得之聚合物組合物：74：26胺：烷基。
Figure 103127144-A0202-12-0082-134
GPC分級分離. 將乾燥之粗製聚合物以50mg/ml放入75%二氯甲烷、25%四氫呋喃及0.2%三乙胺中。隨後將聚合物在Jordi Gel DVB 104Å-500mm/22mm管柱上使用5ml/min之流速及10ml注射物分級分離。自15-17min收集較早部分，且自17-19min收集較晚部分。部分15-17：Mw 138,000(PDI 1.1)；部分17-19：Mw 64,000(PDI 1.2)。
MALS分析. 將約10mg聚合物溶解於0.5ml 89.8%二氯甲烷、10%四氫呋喃、0.2%三乙胺中。使用附接至使用Jordi 5μ 7.8×300混合床LS DVB管柱之Shimadzu Prominence HPLC之Wyatt Helos II多角光散射檢測器量測分子量及多分散性(PDI)。粗製聚合物：MW：55,000(PDI 2.1)，部分15-17：MW 138,000(PDI：1.1)，部分17-19：MW 64,000(PDI 1.2)。
使純化BOC保護之聚合物與乙酸(7ml)中之2M HCl反應0.5h以移除BOC保護基團並產生胺。向反應物中添加15ml dH2O，將溶液轉移至3500 MW截止值纖維素管道中，利用高鹽透析24h，隨後利用dH2O透析18h。將內容物凍乾，隨後以20mg/ml之濃度溶解於DI H2O中。於2℃至8℃下儲存聚合物溶液。
H. 聚合物DW1360. 胺/丁基/十八烷基聚(乙烯基醚)三元聚合物係自2-乙烯基氧基乙基鄰苯二甲醯亞胺(5g,23.02mmol)、丁基乙烯基醚(0.665g,6.58mmol)及十八烷基乙烯基醚(0.488g,1.64mmol)單體合成。在氬氣層下在36ml無水二氯甲烷中向含有磁力攪拌棒之200ml爐乾燥之圓底燒瓶中添加2-乙烯基氧基乙基鄰苯二甲醯亞胺。向此溶液中添加丁基乙烯基醚及正十八烷基乙烯基醚。將單體於RT(RT)下完全溶解以獲得澄清之均勻溶液。隨後將含有澄清溶液之反應容器放置於藉由向ACS級變性醇及乙二醇之1：1溶液中添加乾冰生成之-50℃浴中且容許形成鄰苯二甲醯亞胺單體之可視沈澱。在冷卻約1.5min後，添加BF3．(OCH2CH3)2(0.058g,0.411mmol)以起始聚合反應。在 聚合起始後，鄰苯二甲醯亞胺單體溶解。使反應於-50℃下進行3h。藉由添加甲醇中之5ml 1%氫氧化銨停止聚合。隨後藉由旋轉蒸發移除溶劑。
隨後將聚合物溶解於30ml 1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中。向此溶液中添加肼(0.147g,46mmol)並將混合物加熱回流3h。隨後藉由旋轉蒸發移除溶劑且隨後將所得固體置入20ml 0.5mol/L HCl中並回流15min，用20ml蒸餾水洗滌，並再回流1小時。隨後將此溶液用NaOH中和，冷卻至RT，轉移至3,500分子量纖維素管道，利用蒸餾水透析24h(2×20L)並凍乾。
I. 聚合物Emi 1034-68C. 單體莫耳進料比係52.5 BAEAA：47.5丙烯酸丙酯(CAS：925-60-0)及6.66：1比率之CTA(CPCPA)對起始劑(AIBN)。向具有攪拌棒之40ml玻璃小瓶中添加BAEAA(2.6851g,10.35mmol)、丙烯酸丙酯(1.0742g,9.41mmol)、CPCPA(.0105g,0.0375mmol)、AIBN(0.000924g,0.00563mmol)及乙酸丁酯(15.9ml)。使用隔墊帽中之長的皮下針使溶液用氮鼓泡1h。移除針並使用油浴將溶液於80℃下加熱16h。使每一溶液冷卻至RT。使用己烷(約8×體積)沈澱出粗製聚合物並離心。傾析溶劑並將聚合物用己烷沖洗並溶解於DCM中。再次用己烷(約8×體積)沈澱溶解之聚合物。離心後，傾析溶劑並在減壓下乾燥聚合物。經由MALS獲得之分子量：59,640(PDI 1.328)；使用H1NMR獲得之聚合物組合物：55.4：44.6胺：烷基。
Figure 103127144-A0202-12-0085-135
分步沈澱.在50ml離心管中，使用超音波處理將試樣以25mg試樣/ml溶劑溶解於60%庚烷/40%二噁烷中。將試樣渦旋10秒並使其靜置4h。自頂部移液出溶劑且將沈澱出之聚合物用己烷沖洗兩次。使用高真空乾燥試樣。
MALS分析. 將少量聚合物以10mg/ml溶解於75% DCM、20% THF及5% ACN中。使用附接至使用Phenogel 5μ Linear(2)7.8×300管柱之Shimadzu Prominence HPLC之Wyatt Helos II多角光散射檢測器量測分子量及多分散性(PDI)。粗製聚合物：MW：59,640(PDI 1.328)，部分1：MW 80,540(PDI：1.120)。
Boc-去保護. 使純化BOC保護之聚合物與乙酸(7ml)中之2M HCl反應0.5h以移除BOC保護基團並產生胺。向反應物中添加15ml dH2O，將溶液轉移至3500 MW截止值纖維素管道中，利用高鹽透析24h，隨後利用dH2O透析18h。將內容物凍乾，隨後以20mg/ml之濃度溶解於DI H2O中。於2℃至8℃下儲存聚合物溶液。
J. 聚合物Emi1034-81F. 單體莫耳進料比係65 BAEAA：35丙烯酸丁酯(CAS：141-32-2)及6.66：1比率之CTA(CPCPA)對起始劑(AIBN)。向具有攪拌棒之20ml玻璃小瓶中添加BAEAA(0.9876g,3.809mmol)、丙烯酸丁酯(0.2607g,2.034mmol)、CPCPA(0.0035g,0.0125 mmol)、AIBN(0.000308g,0.00188mmol)及乙酸丁酯(5.3ml)。使用隔墊帽中之長的皮下針使溶液用氮鼓泡1h。移除針並使用油浴將溶液於80℃下加熱16h。使每一溶液冷卻至RT。使用己烷(約8×體積)沈澱出粗製聚合物並離心。傾析溶劑並將聚合物用己烷沖洗並溶解於DCM中。再次用己烷(約8×體積)沈澱溶解之聚合物。離心後，傾析溶劑並在減壓下乾燥聚合物。經由MALS獲得之分子量：63,260(PDI 1.318)；使用H1NMR獲得之聚合物組合物：68.7：31.3胺：烷基。
Figure 103127144-A0202-12-0086-185
分步沈澱.在50ml離心管中，使用超音波處理將試樣以25mg試樣/ml溶劑溶解於60%庚烷/40%二噁烷中。將試樣渦旋10秒並使其靜置4h。自頂部移液出溶劑且將沈澱出之聚合物用己烷沖洗兩次。使用高真空乾燥試樣
MALS分析. 將少量聚合物以10mg/ml溶解於75% DCM、20% THF及5% ACN中。使用附接至使用Phenogel 5μ Linear(2)7.8×300管柱之Shimadzu Prominence HPLC之Wyatt Helos II多角光散射檢測器量測分子量及多分散性(PDI)。粗製聚合物：MW：63,260(PDI 1.318)，部分1：MW 65,990(PDI：1.246)。
Boc-去保護. 使純化BOC保護之聚合物與乙酸(7ml)中之2M HCl反應0.5h以移除BOC保護基團並產生胺。向反應物中添加15ml dH2O，將溶液轉移至3500 MW截止值纖維素管道中，利用高鹽透析24h，隨後利用dH2O透析18h。將內容物凍乾，隨後以20mg/ml之濃度溶解於DI H2O中。於2℃至8℃下儲存聚合物溶液。
K. 聚合物LH1073-20C-1：單體進料比係55 BAPVE(Boc-胺基丙基乙烯基酯)：45丁酸乙烯基酯(CAS：123-20-6)及10：1比率之鏈轉移劑(MDPD)對起始劑(AIBN)。向具有攪拌棒之20ml玻璃小瓶中添加BAPVE(0.8g,3.72mmol)、MDPD(9.26mg,0.0229mmol)、AIBN(0.21mg,0.00229mmol)及乙酸丁酯(0.5ml)。使用隔墊帽中之長的皮下針使溶液用氮鼓泡1h。類似地使過量丁酸乙烯基酯之單獨小瓶脫氣。移除針/氮並利用Hamilton注射器向反應溶液中添加丁酸乙烯基酯(0.35g,3.04mmol)。將溶液於80℃下攪拌4h且隨後冷卻至RT。將所得黏稠溶液溶解於5ml DCM中並藉由添加40ml己烷沈澱出聚合物。離心後，傾析上部溶劑並將聚合物用5ml己烷沖洗。將經沖洗之聚合物重新溶解於5ml DCM中，並用40ml己烷再次沈澱，離心，並傾析上部溶劑。隨後在高真空下乾燥聚合物。經由MALS獲得之分子量：42,230(PDI 1.205)；使用H1NMR獲得之聚合物組合物：57.5：42.5胺：烷基。
分步沈澱：在50ml離心管中，將聚合物溶解於10ml DCM中並添加足夠己烷以使溶液越過濁點(約30ml)。將渾濁混合物離心，從而形成兩個液體層。移除更黏稠之底層，用5ml DCM稀釋並用40ml己烷完全沈澱，以產生部分1。在對部分進行離心後，傾析溶劑並在減壓下乾燥聚合物。經由MALS獲得之分子量：61,350(PDI 1.205)。
MALS分析：將少量聚合物以10mg/ml溶解於75% DCM、20% THF及5% ACN中。使用附接至具有Phenogel 5u Linear(2)7.8×300管柱之Shimadzu Prominence HPLC之Wyatt Helos II多角光散射檢測器量測分子量及多分散性(PDI)。參見上述分子量。
Boc-去保護：使分級分離之BOC保護之聚合物與乙酸(5ml)中之2N HCl反應並攪拌1h以移除BOC基團並產生胺。將溶液用水(30ml)稀釋並利用NaCl水溶液及隨後去離子水經2天透析(3500 MWCO纖維素管道)。將內容物凍乾，且隨後以20mg/ml之濃度溶解於DI水中。在2℃至8℃下儲存聚合物。
Figure 103127144-A0202-12-0088-138
L. 蜂毒肽. 所有蜂毒肽皆係使用業內之標準肽合成技術製得。適宜蜂毒肽可為全L-形式胺基酸、全D-形式胺基酸(逆轉型)。獨立於L或D形式，蜂毒肽序列可逆轉(逆轉型)。
實例25. 具有疊氮基-PEG-胺之末端聚合物修飾. 在配備有隔墊帽及攪拌棒之40ml振盪小瓶中，將聚合物(Emi 1034-68C種類，1g，0.0143mmol)溶解於20ml無水二氯甲烷(Sigma)中。在攪拌下向燒瓶中添加五氟苯酚(Sigma,26.3mg,0.143mmol)及N,N’-二環己基碳化二亞胺(Sigma,29.5mg,0.143mmol)。使用N2氣體管線及用於排氣之針，將系統用N2吹掃約10min。將反應物於RT下攪拌過夜。向燒瓶中添加額外五氟苯酚(Sigma,26.3mg,0.143mmol)及N,N’-二環己基碳化二亞胺(Sigma,29.5mg,0.143mmol)，將系統用N2氣體吹掃，並將反應物於RT下攪拌3h。使聚合物與己烷(約10×體積，Sigma)一起沈澱，離心，並傾析溶劑。將聚合物溶解於最少二氯甲烷中，與己烷(約10×體積)一起沈澱，離心，並傾析溶劑。將聚合物溶解於最少乙酸乙酯(Sigma)中，與己烷(約10×體積)一起沈澱，離心，並傾析溶劑。在高真空下乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆定重量為止。
在配備有隔墊帽及攪拌棒之40ml振盪小瓶中，將前一步驟之聚合物(Emi 1034-68C種類，1g，0.0143mmol)溶解於20ml無水二氯甲烷中。在攪拌下向燒瓶中添加疊氮基PEG4胺(PurePeg,37.5mg,0.143mmol)及N,N-二異丙基乙基胺(Sigma,20.3mg,0.157mmol)。將系統用N2氣體吹掃約10min，且將反應物於RT下攪拌過夜。向燒瓶中添加額外疊氮基PEG4胺(PurePeg,37.5mg,0.143mmol)及N,N-二異丙基乙基胺(Sigma,20.3mg,0.157mmol)，將系統用N2氣體吹掃，並將反應物於RT下攪拌3h。使聚合物與己烷(約10×體積)一起沈澱，離心，並傾析溶劑。將聚合物溶解於最少二氯甲烷中，與己烷(約10×體積)一起沈澱，離心，並傾析溶劑。在高真空下乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆定重量為止(圖12)。
<110> 美商愛羅海德麥迪森公司承為軍 黃素珍 艾倫 M 艾爾梅達 大衛 B 羅薩馬 安卓 V 布洛克希 傑佛瑞 C 卡爾森
<120> 用於在活體中遞送RNAi觸發子至腫瘤細胞之聚結合物
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<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RGD整聯蛋白結合肽
<220>
<221> misc_feature
<222> 1,3,5,9,11,13
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 1
Figure 103127144-A0202-12-0090-139
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RGD整聯蛋白結合肽
<400> 2
Figure 103127144-A0202-12-0090-140
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Aha1 siRNA有義鏈序列
<220>
<221> modified_base
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_鹼基=「2’-去氧-2’-氟相應核苷」
<220>
<221> modified_base
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_鹼基=「2’-O-甲基相應核苷」
<220>
<221> modified_base
<222> 20
<223> /mod_鹼基=「3’-3’-連接之去氧胸苷」
<400> 3
Figure 103127144-A0202-12-0091-186
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Aha1 siRNA反義鏈序列
<220>
<221> modified_base
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_鹼基=「2’-去氧-2’-氟相應核苷」
<220>
<221> modified_base
<222> 2,21
<223> /mod_鹼基=「5’-硫代磷酸酯核苷」
<220>
<221> modified_base
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_鹼基=「2’-O-甲基相應核苷」
<400> 4
Figure 103127144-A0202-12-0091-187
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RGD整聯蛋白結合肽
<400> 5
Figure 103127144-A0202-12-0092-141

Claims (7)

  1. 一種含有RGD模擬物之化合物，其包含由以下表示之結構：R-A1A2-醯胺基苄基-碳酸酯 其中，R包含含有選自
    Figure 103127144-A0305-02-0095-5
    及
    Figure 103127144-A0305-02-0095-6
    之結構之RGD模 擬物，A1係疏水性胺基酸，A2係經由醯胺鍵連接至A1之親水性不帶電胺基酸，且碳酸酯包含能夠與胺反應以形成胺基甲酸酯之胺反應性碳酸酯部分。
  2. 如請求項1之化合物，其中A1係選自由以下組成之群：丙胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸及色胺酸。
  3. 如請求項1之化合物，其中A2係選自由以下組成之群：瓜胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。
  4. 如請求項3之化合物，其中該R-A1A2-醯胺基苄基-碳酸酯具有由以下表示之結構：
    Figure 103127144-A0305-02-0095-8
     其中R1係疏水性胺基酸A1之側基，R2係親水性不帶電胺基酸A2之側基，且R3係-CH2-O-C(O)-Z，其中-Z係
    Figure 103127144-A0305-02-0095-10
  5. 如請求項1之化合物，其中該RGD模擬物包含由以下表示之結構：
    Figure 103127144-A0305-02-0096-1
     其中該胍鎓係選自
    Figure 103127144-A0305-02-0096-3
    及其共振結構，及
    Figure 103127144-A0305-02-0096-4
    及其共振結構。
  6. 如請求項1之化合物，其中該RGD模擬物包含PEG連接部分。
  7. 如請求項4之化合物，其中a)R1係選自由以下組成之群：-CH3、-(CH2)-苯基、-CH-(CH3)2、-CH2-CH-(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3及色胺酸，且b)R2係選自由以下組成之群：-(CH2)3-NH-C(O)-NH2、-CH2-C(O)-NH2及-(CH2)2-C(O)-NH2。
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