KR20160035081A - 생체 내에서 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달하기 위한 폴리콘주게이트 - Google Patents

생체 내에서 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달하기 위한 폴리콘주게이트 Download PDF

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데이비드 비. 로제마
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Abstract

본 발명은 RNA 간섭 (RNAi) 유발제의 생체내 인테그린 양성 종양 세포로의 전달을 위한 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 효소 절단가능 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트 마스킹제로 가역적으로 개질된 RGD 리간드-표적화된 양친매성 막 활성 폴리아민을 포함한다. 상기 변형은 폴리머의 막 활성을 차단하지만, 가역성은 생리적 반응성을 제공한다. 가역적으로 개질된 폴리아민 (역학적 폴리콘주게이트 또는 콘주게이트)은 RNAi 유발제에 추가로 공유결합된다.

Description

생체 내에서 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달하기 위한 폴리콘주게이트{POLYCONJUGATES FOR DELIVERY OF RNAi TRIGGERS TO TUMOR CELLS IN VIVO}
RNAi 유발제(trigger) 및 다른 실질적으로 세포 막 불투과성 화합물의 살아 있는 세포내로의 전달은 상기 세포의 복합 막 시스템에 의해서 매우 제한된다. 안티센스, RNAi, 및 유전자 요법에 사용된 약물은 비교적 큰 친수성 폴리머이며 이것은 빈번하게 매우 음으로 하전된다. 이러한 둘 모두의 물리적 특성은 세포 막을 가로지르는 이들의 직접적인 확산을 극심하게 제한한다. 이러한 이유로, RNAi 유발제 전달에 대한 주요 장벽은 RNAi 유발제를 세포 막을 가로질러서 세포 세포질 또는 핵으로 전달하는 것이다.
시험관 내에서 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 상당히 효율적인 전달을 성취하는 수많은 형질감염 시약이 또한 개발되었다. 그러나, 이러한 동일한 형질감염 시약을 사용한 폴리뉴클레오타이드의 생체 내 전달은 복잡하며, 생체 내 독성, 부정적인 혈청 상호작용, 및 좋지 못한 표적화에 의해서 비효율적이게 된다. 시험관 내에서 잘 작용하는 형질감염 시약, 양이온성 폴리머 및 지질은 전형적으로 큰 양이온성 정전기 입자를 형성하며 세포 막을 불안정하게 한다. 시험관 내 형질감염 시약의 양 전하는 전하-전하 (정전기적) 상호작용을 통하여 핵산과의 회합을 촉진시켜 핵산/형질감염 시약 복합체를 형한킨다. 양 전하는 비히클의 세포로의 비특이적 결합에, 및 막 융합, 불안정화, 또는 파열에 유익하다. 막의 불안정화는 세포 막을 가로질러 실질적으로 세포 막 불투과성의 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진시킨다. 이러한 특성은 시험관 내 핵산 전달을 촉진시키는 반면, 독성 및 생체 내 비효과적인 표적화를 야기한다. 양이온 전하는 혈청 성분과의 상호작용을 초래하는데, 이에 의해 폴리뉴클레오타이드-형질감염 시약 상호작용의 불안정화, 좋지 못한 생체이용률, 및 좋지 못한 표적화가 얻어진다. 시험관 내에서 효과적일 수 있는 형질감염 시약의 막 활성은 종종 생체 내에서 독성을 초래한다.
생체 내 전달을 위해, 비히클 (핵산 및 관련된 전달제)은 작아야, 직경이 100 nm 미만 및 바람직하게는 50 nm 미만이어야 한다. 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 훨씬 더 작은 복합체가 아직까지 더욱 유용할 것이다. 100 nm보다 큰 전달 비히클은 생체 내에서 혈관 세포 이외의 세포로는 거의 접근하지 않는다. 정전기 상호작용에 의해 형성된 복합체는 생리적 염 농도 또는 혈청 성분에 노출되는 경우에 응집되거나 분해되는 경향이 있다. 게다가, 생체 내 전달 비히클 상에서의 양이온 전하는 부정적인 혈청 상호작용, 및 따라서 좋지 못한 생체이용률을 초래한다. 흥미롭게도, 높은 음전하는 또한 표적화에 필요한 상호작용, 즉 표적 리간드의 세포 수용체로의 결합을 방해함으로써 표적화된 생체 내 전달을 방해할 수 있다. 따라서, 생체 내 분배 및 표적화를 위해서는 거의 중성 비히클이 필요하다. 주의깊게 조절하지 않으면, 막 파열 또는 불안정화 작용은 생체 내에서 사용되는 경우 독이 된다. 핵산 전달을 사용하여 비히클 독성을 균형 맞추는 것은 생체 내에서보다 시험관 내에서 더욱 용이하게 성취된다.
로제마(Rozema) 등 (U.S. 특허 공보 20080152661, 20110207799, 20120165393, 및 20120172412)은, 폴리뉴클레오타이드의 생체 내 전달에 적합한 콘주게이트를 개발하였다. 이러한 콘주게이트는 가역적인 생리적 불안정 마스킹을 사용하여 막 활성 폴리아민의 막 파열 활성의 가역적인 조절을 특징으로 하였다. 비하전된 갈락토오스 또는 콜레스테롤을 표적화 리간드로 사용하여, 로제마 등은 이러한 콘주게이트를 사용하여 폴리뉴클레오타이드의 간세포로의 생체 내 전달을 입증하였다. RNAi 유발제를 암 세포로 표적화하는데 이러한 콘주게이트를 적응시키면 암에 대한 싸움에서 또 하나의 치료제가 제공될 것이다.
인테그린은 세포 부착을 매개하는 세포 표면 당단백질 그룹이다. 인테그린은 α 및 β 폴리펩타이드 서브유닛으로 구성된 이형이량체이다. 현재 11개의 상이한 α 서브유닛 및 6개의 상이한 β 서브유닛이 확인되었다. 다양한 α 서브유닛은 다양한 β 서브유닛과 조합되어 구별되는 인테그린을 형성시킨다. αvβ3 인테그린 (비트로넥틴 수용체)은 종양 전이, 고형 종양 성장 (신조직형성), 및 종양 신생혈관형성에서 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다. 인테그린 αvβ3은 신생혈관형성에서 중요한 역할을 담당한다. 이것은 종양성 내피 세포 상에서 뿐만 아니라, 일부 종양 세포 상에서 발현된다. 예를 들면, 세프토(Seftor) 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89 (1992) 1557-1561)은, 흑색종 세포 침습에서 αvβ3 인테그린에 대한 역할을 밝혔다. 브룩스(Brooks) 등 (Cell, Vol. 79 (1994) 1157-1164)은, αvβ3 길항제의 전신 투여에 의해 다양한 조직학적으로 뚜렷이 다른 인간 종양의 극적인 퇴행이 초래되었음을 실증하였다.
인테그린 αvβ3의 종양 세포 발현은 다양한 종양 유형에서 질환 진행과 상관되어 있다. αvβ3 인테그린은 인간 종양 생검 샘플의 혈관 상에서는 광범위하게 발현되지만, 정상 조직 내 혈관 상에서는 발현되지 않는다. 유방암에서, αvβ3 인테그린의 과발현은 골 전이와 관련되며, 증가된 종양 성장 및 오스테오폰틴(osteopontin)에 대한 침습을 유도한다. 교모세포종에서, αvβ3 인테그린은 종양의 침습성 경계(margin)에서 과발현되고 파이브로넥틴의 수준이 증가되는데, 이는 증대된 세포 운동성 및 세포자멸사 내성과 관련된다. 췌장 종양에서, αvβ3 인테그린의 증가된 발현은 MMP-2의 증가된 활성화 및 림프절 전이와 관련된다. 전립선 암종 세포에서,αvβ3 인테그린이 발현되어, 인테그린과, 라미닌, 파이브로넥틴 및 오스테오폰틴과 관련되는 부착 및 이동 과정 사이에서의 관련성 때문에 골로의 전이가 일어난다.
αvβ3 인테그린은 수많은 Arg-Gly-Asp (RGD) 함유 매트릭스 거대분자에 결합한다. RGD 펩타이드 서열이 다양한 다른 화합물에 연결되어 αvβ3 인테그린 결합을 제공한다. 따라서, RGD 펩타이드는 αvβ3 인테그린 양성 종양으로의 화합물의 표적화에 대해 조사되었다. 그러나, 비교적 낮은 친화도에 더하여, 많은 RGD 펩타이드는 또한 RGD-의존적 인테그린에 대해서 비교적 비-선택적이다. 예를 들면, αvβ3에 결합하는 대부분의 RGD 펩타이드는 또한 αvβ5, αvβ1, 및 α IIb β3 인테그린에 결합한다.
발명의 요약
RNAi 유발제에 공유 결합된 인테그린-표적화된 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리아민을 포함하는, 생체 내에서 RNAi 유발제를 포유동물 내 종양 세포로 전달하기 위한 조성물이 본원에 기술된다. 기술된 조성물은, RNAi 유발제가 세포의 내인성 RNA 간섭 경로와 상호작용하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 경우에 RNAi 유발제를 종양 세포로 전달한다.
본 발명은, 마스킹된 양친매성 막 활성 폴리아민 (전달 폴리머) 및 RNAi 유발제를 포함하며 상기 RNAi 유발제가 전달 폴리머에 공유 결합되는, 생체 내에서 RNA 간섭 (RNAi) 유발제를 종양 세포로 전달하는 조성물인 것을 특징으로 한다. 상기 전달 폴리머는, 폴리머 아민의 적어도 50% 또는 적어도 80%가 개질되도록 폴리머 아민을 하나 이상의 RGD 디펩타이드 마스킹제 및 임의로 하나 이상의 PEG 디펩타이드 마스킹제로 가역적으로 개질시켜서 마스킹된 양친매성 막 활성 폴리아민을 포함한다. 전달 폴리머를 RNAi 유발제로 공유 부착시키는데 바람직한 연결은 생리적으로 불안정한 연결이다. 일 구현예에서, 이 연결은 디펩타이드 마스킹제 연결에 직교한다. 상기 전달 콘주게이트는 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제 중에서 포유동물에게 투여된다.
바람직한 구현예에서, a) 디펩타이드-아미도벤질-카바메이트 가역적인 생리적으로 불안정한 연결을 통하여 복수의 RGD 리간드 및 입체 안정제에; 및 b) 하나 이상의 불안정한 공유 결합을 통하여 하나 이상의 RNAi 유발제에 공유 결합된 양친매성 막 활성 폴리아민을 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 일 구현예에서, 상기 디펩타이드-아미도벤질-카바메이트는 상기 불안정한 공유 결합에 직교한다. 상기 RNAi 유발제-폴리머 콘주게이트는 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제 중에서 포유동물에게 투여된다.
바람직한 구현예에서, 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리아민 (전달 폴리머)은 하기를 포함한다: 폴리아민의 아민과 RGD 마스킹제 및 입체 안정제 마스킹제와의 반응에 의해 가역적으로 개질된 양친매성 막 활성 폴리아민. 폴리머 아민과 마스킹제의 반응은 아민을 가역적으로 개질시켜서 가역적인 생리적으로 불안정한 공유 결합을 형성시킨다. 개질 그룹의 절단에 의해 아민이 복원되면 아민은 가역적으로 개질된다. 막 활성 폴리아민을 가역적으로 개질시키면 막 활성 폴리아민의 막 활성이 가역적으로 억제되고, 폴리아민과 혈청 성분의 상호작용이 억제되어서 증가된 순환 특성이 제공되며, 생체 내에서 폴리아민이 종양 세포로 표적화된다. 마스킹된 상태에서는, 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리아민이 막 파열 활성을 나타내지 않는다. 막 활성 억제 및/또는 막 활성 폴리아민의 생체 내 표적화는 폴리머 아민의 50% 초과의 개질을 필요로 한다. 마스킹제를 사용한 폴리아민 상에서 아민의 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 또는 90% 초과의 가역적인 개질이, 최적의 전달 폴리머를 형성시키는데 필요할 수 있다.
본 발명의 전달 폴리머의 개질된 폴리머 아민은 하기와 같이 표시된다:
Figure pct00001
여기서, R 4 는 RGD 리간드 또는 입체 안정제를 포함하고, R 1 및 R 2 는 아미노산 측쇄이다. R 1 은 바람직하게는 소수성 아미노산의 측면 그룹이다. 바람직한 소수성 아미노산은 알라닌이다. R 2 는 바람직하게는 중성 pH에서 친수성의 비하전된 아미노산의 측쇄이다. 바람직한 친수성의 비하전된 아미노산은 시트룰린이다. 디펩타이드 이후의 아미노산과 아미도벤질 그룹 사이에서 생체 내 효소에 의한 절단에서 폴리머로부터 R 4 가 제거되고, 아미도벤질-카바메이트가 자발적인 재배열을 겪어 폴리머 아민이 재생되게 되는 제거 반응이 개시된다.
전달 폴리머는 RNAi 유발제에 추가로 공유 결합된다. 일 구현예에서, 상기 RNAi 유발제는 생리적으로 불안정한 결합을 통하여 전달 폴리머에 연결된다. 바람직한 구현예에서, RNAi 유발제를 전달 폴리머에 연결시키는 불안정한 결합은 마스킹제를 폴리아민에 연결시키는 불안정한 결합에 직교한다. 따라서, 본 발명의 콘주게이트는 하기를 포함한다: 하기 표시된 일반적인 형태를 갖는 가역적으로 개질된 양친매성 막 활성 폴리아민에 공유 결합된 RNAi 유발제:
Figure pct00002
여기서, N은 RNAi 유발제를 포함하고, L 2 는 가역적인 생리적으로 불안정한 연결, 예컨대 A1A2-아미도벤질-카바메이트이고, P는 양친매성 막 활성 폴리아민을 포함하고, R은 각각 본원에서 정의된 RGD 리간드를 포함하고, PEG는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 입체 안정제를 포함하고, L 1 은 생리적으로 불안정한 연결기이고, y는 0 초과의 정수이고, z는 0 초과의 정수이며, 여기서 y + z의 값은, 비개질된 막 활성 폴리아민 내 아민의 수로 측정하여 폴리아민 P 상에 존재하는 아민 수의 50% 초과이다.
본 발명에 따른 화합물은 유기 또는 의약 화학의 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 일반적으로 수득될 수 있다. 본 발명의 추가 목적, 특징, 및 이점은 첨부 도면과 함께 취해진 경우 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
바람직한 구현예에서, 폴리머 개질부 -L2-R 및 -L2-PEG는 하기 일반적인 형태를 갖는다:
R-A1A2-아미도벤질-카바메이트- (화학식 2a)
PEG-A1A2-아미도벤질-카바메이트- (화학식 2b).
여기서, A1A2는 디펩타이드이고, A1은 아미노산이고, A2는 아미노산이다. RGD 리간드는 연결기, 예컨대 PEG 연결기를 통하여 디펩타이드에 연결될 수 있다. 바람직한 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. A1은 바람직하게는 소수성 아미노산이다. A2는 바람직하게는 친수성의 비하전된 아미노산이다. A1 및 A2는 바람직하게는 아미드 결합을 통하여 연결된다. 바람직한 아미도벤질 그룹은 p-아미도벤질 그룹이다. 카보네이트와 폴리머 아민의 반응에 의해 카바메이트가 형성된다. 바람직한 카보네이트는 활성화된 아민 반응성 카보네이트이다. A1A2-아미도벤질-카바메이트 연결은 디펩타이드가 생체 내에서 내인성 프로테아제에 의해 절단될 때까지 안정한데, 상기 절단에 의해 입체 안정제 또는 RGD 리간드가 폴리아민으로부터 절단된다. 디펩타이드 이후에 (A2와 아미도벤질 사이에서) 효소에 의한 절단 후에, 아미도벤질-카바메이트는 폴리머 아민의 재생을 초래하는 자발적 재배열을 겪는다.
일 구현예에서, RGD 리간드는, RGD 리간드의 디펩타이드로의 부착 및 마스킹제의 용해를 돕는 연결기를 사용하여 디펩타이드에 연결된다. 바람직한 마스킹제는 하기 일반적인 형태를 갖는다: RGD 리간드-PEG1-디아릴 하이드라존-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카보네이트. 각각의 성분은 당해 기술에서의 표준 방법, 예컨대 아미드 연결의 형성을 이용하여 연결될 수 있다. 디아릴 하이드라존은 HyNic (히드라지노-니코틴아미드) 그룹과 아릴 알데하이드의 반응에 의해서 형성될 수 있다. PEG1은 (CH2-CH2-O)n을 포함하고 PEG2는 (CH2-CH2-O)n을 포함한다. n 및 m은 독립적으로 4 이상의 정수이고, n + m의 합은 12-48이다. PEG 그룹은 RGD 리간드의 용해 및 출현을 돕고, 그렇게 함으로써 개질된 폴리아민의 종양 표적화가 개선된다. 놀랍게도, 디아릴 하이드라존은 또한 개질된 폴리아민의 생체 내 기능을 개선시킨다. 일 구현예에서, 아릴 알데하이드-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카보네이트는 먼저 폴리아민과 반응하여 아릴 알데하이드-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카바메이트-폴리아민을 형성시킨다. 그 후, 이 화합물은 RGD 리간드-PEG1-HyNic와 반응하여 RGD 리간드-PEG1-디아릴 하이드라존-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카바메이트-폴리아민을 형성시킨다.
도 1은 (A) 디펩타이드 마스킹제 또는 (B) 폴리아민에 연결된 디펩타이드 마스킹제의 구조를 보여주는 도면으로서, 여기서 R1 및 R2는 아미노산의 R 그룹이고, R4는 RGD 리간드 또는 입체 안정제를 포함하고, -X-는 -NH-, -O-, 또는 -CH2-이고, -Y-는 -NH- 또는 -O-이고, -R5는 위치 2, 4, 또는 6에 있고 -CH2-O-C(O)-O-Z인데, 여기서 Z는 카보네이트이고, -R6은 R5에 의해 점유된 위치를 제외하고 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6 각각에서 독립적으로 수소, 알킬, 또는 할라이드이다.
도 2는 다양한 PEG 디펩타이드 마스킹제, (A) PEG-GlyGly-PABC-PNP, (B) PEG-AsnGly-PABC-PNP, (C) PEG-PheLys-PABC-PNP, (D) PEG-ValCit-PABC-PNP, (E) PEG­AlaAsn-PABC-PNP, 및 (F) PEG-PheLys(CH3)2-PABC-PNP의 구조를 보여주는 도면이다.
도 3은 디펩타이드 마스킹제를 사용한 폴리아민의 가역적인 개질을 보여주는 도면으로서, 여기서 R은 RGD 리간드 또는 PEG를 포함하고, AA는 (보호 그룹을 갖거나 갖지 않는) 디펩타이드이고, R3은 아민-반응성 카보네이트이고, 폴리아민은 양친매성 막 활성 폴리아민이다.
도 4는 아미도벤질-카바메이트가 폴리머 아민의 재생을 초래하는 자발적 재배열을 겪는 제거 반응을 보여주는 도면으로서, 여기서 AA (A1A2)는 디펩타이드이고, R4는 RGD 리간드 또는 입체 안정제를 포함한다.
도 5는 PEG 디펩타이드 마스킹제의 합성을 보여주는 도면으로서, 여기서 R은 PEG를 포함하고, A1 및 A2는 (보호 또는 비보호된) 아미노산이다.
도 6은 (A) 디펩타이드의 NHS 에스테르, (B) Fmoc-보호된 유도체로부터의 아미노산 H-Asn(DMCP)-OH 및 H-Lys(MMT)-OH, 및 (C) Fmoc-A1A2-OH의 형성을 보여주는 도면으로서, 여기서 A, A1, 및 A2는 아미노산이다.
도 7은 (A) Fmoc-AA-PABA 및 Fmoc-A-PABA의 형성 및 (B) H-Lys(CH3)2-PABA와 Fmoc-Phe-NHS의 커플링을 보여주는 도면이다.
도 8은 H-A1A2-PABA 및 H-A1-PABA의 형성을 보여주는 도면이다.
도 9는 PEGn-A1A2-PABA의 형성을 보여주는 도면이다.
도 10은 (A) 및 (B) PEG-AA-PABC-PNP의 형성을 보여주는 도면이다.
도 11은 N-Boc-에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타크릴레이트의 RAFT 공중합을 보여주는 도면이다.
도 12는 아지도-PEG-아민을 사용한 말단 폴리머 개질을 보여주는 도면이다.
도 13은 RGD 마스킹제의 한 예에 의해 개질된 폴리아민, RGD 리간드-PEG1-디아민-디아릴 하이드라존-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카바메이트-폴리아민을 보여주는 도면이다. └───┘에 의해 유닛 부분 (즉 RGD 리간드, PEG1 등)으로서 명확하게 지시되지 않은 원자는 연결되는 원자로 간주되며, 어느 한쪽으로 라벨링된 유닛 부분인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명은, 생체 내에서 RNA 간섭 (RNAi) 유발제를 인테그린 발현 종양 세포 내로 전달하는 콘주게이트 및 방법을 제공한다. 기재된 콘주게이트는 전달될 RNAi 유발제로 공유 결합된 인테그린-표적화된 가역적 개질된 막 활성 폴리아민을 포함한다. 인테그린 표적화는 본원에 기재된 RGD 리간드에 의해서 제공된다. 막 활성 폴리아민의 가역적 개질은 본원에 기재된 RNA 리간드 및 입체 안정제 펩티다아제 절단가능한 마스킹제에 의해서 제공된다. 펩티다아제 절단가능한 연결은 프로테아제의 부재 하에서 가수분해에 대해 안정하며, 저장 및 생체 내에서의 순환에서 연장된 안정성을 제공한다. 순환에서 개선된 (더 긴) 반감기는 조직, 예컨대 종양 조직 내 RGD 리간드-매개된 축적에 대한 기회 창의 확장을 촉진시킨다. RNAi 유발제의 생체 내 전달은 유전자 발현의 치료적 억제 (녹다운)에 유용하다.
본 발명은 하기 일반적인 구조의 콘주게이트 전달 시스템을 포함한다:
Figure pct00003
여기서 N은 RNAi 유발제이고, L 1 은 생리적으로 불안정한 연결이며, P는 양친매성 막 활성 폴리아민이고, M 1 은 디펩타이드-아미도벤질-카바메이트 연결을 통하여 P에 연결된 RGD 리간드 (RGD 마스킹제)를 포함하고, M 2 는 디펩타이드-아미도벤질-카바메이트 연결을 통하여 P에 연결된 입체 안정제 (PEG 마스킹제)를 포함한다. y 및 z 각각은 0 초과의 정수이며, 단, y + z의 값은, 임의 마스킹제의 부재 하에서 P 상의 아민 양에 의해 측정된, 폴리아민 P 상의 일차 아민 수의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과의 값을 갖는다. 비개질된 상태에서, P는 막 활성 폴리아민이다. 전달 폴리머 M1 y-P-M2 z는 막 활성이 아니다. M1 및 M2의 부착에 의한 P 일차 아민의 가역적인 개질은 P의 막 활성을 가역적으로 억제하거나 불활성화시킨다. 일부 작은 양친매성 막 활성 폴리아민, 예컨대 멜리틴 펩타이드가 3-5개만큼 적은 일차 아민을 함유함이 주목된다. 아민 백분율의 변경은, 폴리머 집단에서 아민 퍼센트의 변경을 나타냄을 의미한다. M1 및 M2의 절단 시에, 폴리아민의 아민은 재생되고, 그렇게 함으로써 P는 그것의 비개질된, 막 활성 상태로 되돌아간다.
종양 전달을 위해, y는 폴리머 P 상의 일차 아민 수의 2-20%와 같은 값을 갖는다. 더 바람직하게는, y는 폴리머 P 상의 일차 아민 수의 2-10%와 같은 값을 갖는다. 따라서 z는 폴리머 P 상의 일차 아민 수의 80-98%와 같은 값을 갖는다. 비 y (RGD):z (입체 안정제)는 바람직하게는 약 1-12:50이고 더 바람직하게는 약 1:20이다.
마스킹된 상태에서, 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리아민은 막 파열 활성을 나타내지 않는다. 막 활성을 억제하고 세표 표적화 기능을 제공, 즉 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리머 (전달 폴리머)를 형성시키는데, 디펩타이드 마스킹제를 사용한 폴리아민 상의 아민의 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 또는 90% 초과의 가역적 개질이 필요할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 유발제는 생리적으로 불안정한 공유 결합을 통하여 본 발명의 전달 폴리머에 연결된다. 생리적으로 불안정한 연결을 사용함으로써, RNAi 유발제는 상기 폴리머로부터 절단되어, 이 RNAi 유발제는 세포 성분과의 기능적 상호작용에 참여하도록 분리될 수 있다.
마스킹은, 기재된 마스킹제가 막 활성 폴리아민에 가역적으로 부착되어 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리머, 즉 전달 폴리머를 형성시킴으로써 수행된다. 막 활성을 억제하는 것에 추가하여, 마스킹제는 폴리머를 비-특이적 상호작용으로부터 보호하고, 혈청 상호작용을 감소시키고, 순환 시간을 증가시키며/시키거나, 세포 특이적 상호작용, 즉 표적화를 제공한다.
응집 상태에서, 마스킹제가 폴리머의 막 활성을 억제하는 것이 마스킹제의 필수적인 특성이다. 마스킹제는 폴리머를 비-특이적 상호작용으로부터 보호 (혈청 상호작용 감소, 순환 시간 증가)할 수 있다. 막 활성 폴리아민은 비개질된 (비마스킹된) 상태에서 막 활성이며, 개질된 (마스킹된) 상태에서는 막 활성이 아니다 (불활성화된다). 충분한 수의 마스킹제가 상기 폴리머에 연결되어 원하는 수준의 불활성화가 얻어진다. 마스킹제(들)의 부착에 의한 원하는 수준의 폴리머 개질은 적절한 폴리머 활성 분석을 사용하여 용이하게 측정된다. 예를 들면, 폴리머가 소정 분석에서 막 활성을 보유하면, 충분한 수준의 마스킹제가 폴리머에 연결되어 그 분석에서 원하는 수준의 막 활성 억제가 얻어진다. 마스킹에는, 임의 마스킹제의 부재 하에서 폴리머 상의 일차 아민의 양에 의해 측정된 ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80% 또는 ≥90%의, 폴리머 집단 상의 일차 아민 그룹의 개질이 필요하다. 마스킹된 폴리머가 수성 용해도를 보유하는 것이 바람직하다.
응집 상태에서, RGD 마스킹제가 전달 폴리머를 αvβ3 인테그린 양성 종양 세포로 표적화하는 것이 RGD 마스킹제의 필수적인 특징이다. 충분한 수의 마스킹제가 상기 폴리머에 연결되어 종양 세포 표적화를 달성한다. 표적화에는, 임의 마스킹제의 부재 하에서 폴리머 상의 일차 아민의 수에 의해 측정된 약 2% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 또는 약 3% 내지 약 6%의, 폴리머 집단 상의 일차 아민 그룹의 개질이 필요하다.
일 구현예에서, 폴리아민을 개질시켜서 인테그린-표적화된 전달 폴리머를 형성시키는데 적합한 RGD 마스킹제는 하기를 포함한다: 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트에 공유 결합된 RGD 리간드 (RGD 디펩타이드 마스킹제). 유사하게, 폴리아민을 개질시켜서 인테그린-표적화된 전달 폴리머를 형성시키는데 적합한 입체 안정제 디펩타이드 마스킹제는 하기를 포함한다: 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트에 공유 결합된 입체 안정제. 상기 마스킹제는 하기 일반적인 형태를 갖는다:
(R 또는 PEG)-A1A2-아미도벤질-카보네이트.
여기서, R은 RGD 리간드를 포함하고, PEG는 다른 입체 안정제의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, A1A2는 제1 아미노산 A1 및 제2 아미노산 A2를 함유하는 디펩타이드이고, 카보네이트는 활성화된 아민-반응성 카보네이트이다. 마스킹제 카보네이트와 폴리머 아민의 반응에 의해 카바메이트 연결이 생성된다. RNA 리간드 또는 입체 안정제는 카보네이트와 폴리머 아민의 반응 전에 또는 카바메이트 연결의 형성 후에 디펩타이드에 부착될 수 있다. 상기 마스킹제는, 디펩타이드가 생체 내에서 내인성 프로테아제에 의해 절단되어서, 폴리아민으로부터 RGD 리간드 또는 입체 안정제가 절단될 때까지 상기 폴리머에 안정되게 연결된다. 디펩타이드 이후의 (A2와 아미도벤질 사이에서) 효소에 의한 절단 후에, 아미도벤질-카바메이트는 폴리머 아민의 재생을 초래하는 자발적 재배열을 겪는다. RGD 리간드는 연결기, 예컨대 PEG 연결기를 통하여 디펩타이드에 연결될 수 있다. 바람직한 입체 안정제 마스킹제는 비하전된다. 바람직한 비하전된 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 바람직한 디펩타이드는 아미드 결합을 통하여 친수성의 비하전된 아미노산(A2)에 연결된 소수성 아미노산(A1)으로 이루어진다. 바람직한 아미도벤질 그룹은 p-아미도벤질 그룹이다. 바람직한 카보네이트는 활성화된 아민 반응성 카보네이트이다.
본 발명의 인테그린-표적화된 전달 폴리머를 형성시키는데 적합한 마스킹제는 하기 일반적인 구조를 갖는다:
Figure pct00004
여기서, R 4 는 RGD 리간드 또는 입체 안정제를 포함하고, R 3 은 아민 반응성 카보네이트 모이어티를 포함하고, R 1 및 R 2 는 아미노산 측쇄이다. R 1 은 바람직하게는 소수성 아미노산의 측면 그룹이다. 바람직한 소수성 아미노산은 알라닌이다. R 2 는 바람직하게는 친수성의 비하전된 아미노산의 측쇄이다. 바람직한 친수성의 비하전된 아미노산은 시트룰린이다. 바람직한 카보네이트는 파라-니트로페놀이다. 그러나, 당해기술에 공지된 다른 아민 반응성 카보네이트가 상기 파라-니트로페놀에 대해 용이하게 대체된다. 활성화된 카보네이트와 아민의 반응에 의해 RGD 리간드 또는 입체 안정제가 하기 표시된 펩티다아제 절단가능한 디펩타이드-아미도벤질 카바메이트 연결을 통하여 막 활성 폴리아민에 연결된다:
Figure pct00005
여기서, R 4 , R 1 , 및 R 2 는 상기와 같다. 디펩타이드 이후, 아미노산과 아미도벤질 그룹 사이에서의 효소 절단에 의해 폴리머로부터 R 4 가 제거되고, 아미도벤질-카바메이트가 폴리머 아민의 재생을 초래하는 자발적인 재배열을 겪는 제거 반응이 유발된다.
또 다른 구현예에서, 가역적인 생리적으로 불안정한 연결을 통한 RGD 리간드의 폴리아민으로의 부착은, 먼저 하기 일반적인 구조를 갖는 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트를 사용하여 아민을 가역적으로 개질시켜서 달성된다:
Figure pct00006
여기서, R7은 RGD 리간드-함유 모이어티와의 반응에 적합하며 R3의 카보네이트보다 덜 아민 반응성인 반응성 그룹을 포함한다. R1, R2, 및 R3은 상기 정의된 바와 같다. 일 구현예에서, R7은 PEG 연결 모이어티 (본원에서 PEG2로도 지칭됨)를 추가로 포함한다. 본 출원인은, 디펩타이드와 상기 반응성 그룹 사이에 PEG 연결 모이어티를 삽입시키면 어셈블링된 RGD 마스킹제의 생체 내 기능 및 용해도가 개선됨을 발견하였다. 바람직한 PEG 연결 모이어티는 (CH2-CH2-O)4-44이다. 폴리머 아민을 반응성 그룹 (R7)-함유 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트를 사용하여 개질시킨 후에, 반응성 그룹 R7과의 반응을 통하여 RGD 리간드-함유 모이어티가 공유 결합된다. 디펩타이드와 RGD 리간드-함유 모이어티를 연결시키는데 적합한 예시적인 반응성 그룹 모이어티는 비제한적으로 하기를 포함한다: HyNic 및 알데하이드 (아릴 알데하이드를 포함함), "클릭" 화학 가교결합제 (특정 아자이드 및 알킨). 화학식 3의 예시적인 분자는 (4-포르밀벤즈알데하이드)-PEG-Ala-Cit-ara-아미노벤질 카보네이트이다.
본원에서 디펩타이드 A1A2 (또는 AA)로 표시된 디펩타이드 마스킹제의 디펩타이드는 아미드 결합을 통하여 연결된 아미노산의 이합체이다. α 및 β 아미노산을 포함하는 아미노산은 생물학 및 화학에서 잘 알려져 있고, 다양한 아미노산 사이에서 가변되는 아민 그룹, 카복실산 그룹 및 측쇄를 함유하는 분자이다. 바람직한 아미노산은 일반식 H2NCHRCOOH을 갖는 L α-아미노산인데, 여기서 R (화학식 3의 R1 및 R2)은 유기 치환체 또는 측면 그룹이다. 바람직한 L α 아미노산은 비하전된 천연 발생 아미노산이다. 바람직한 디펩타이드에서, A1은 소수성 아미노산이고 A2는 비하전된 친수성 아미노산이다. 바람직한 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 알라닌, 또는 트립토판이다. 바람직한 비하전된 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 또는 시트룰린이다. 더 바람직한 소수성 아미노산은 알라닌 또는 페닐알라닌이다. 더 바람직한 비하전된 친수성 아미노산은 시트룰린이다. 디펩타이드가 바람직하지만, A1과 R 사이에 추가 아미노산을 삽입시킬 수 있다. 아미노산 A1을 제거하여 디펩타이드 대신 단일 아미노산을 사용하는 것이 또한 가능하다. 본 발명에 사용된 임의의 천연 아미노산은 본원에서 그 공통 약어로 지칭된다.
바람직한 구현예에서, 양친매성 막 활성 폴리아민은 기재된 디펩타이드-아미도벤질-카보네이트 마스킹제와의 반응에 의해 가역적으로 개질되어 막 불활성 전달 폴리머를 생성시킨다. 상기 디펩타이드 마스킹제는 폴리머를 비-특이적 상호작용으로부터 보호하고, 순환 시간을 증가시키고, 특이적 상호작용을 증대시키고, 독성을 억제하거나, 폴리머 전하를 변경시킨다.
본 발명의 가역적으로 마스킹된 폴리머는 아래의 구조를 포함한다:
Figure pct00007
여기서:
X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2-이고
Y는 -NH- 또는 -O-이고
R1은 바람직하게는 -(CH2)k-페닐 (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; k = 1 페닐알라닌), -CH-(CH3)2 (발린), -CH2-CH-(CH3)2 (류신), -CH(CH3)-CH2-CH3 (이소류신), -CH3 (알라닌), 또는
Figure pct00008
(트립토판)이고;
R2은 바람직하게는 수소 (글리신), -(CH2)3-NH-C(O)-NH2 (시트룰린), -CH2-C(O)-NH2 (아스파라긴), -(CH2)2-C(O)-NH2 (글루타민), -(CH2)4-N-(CH3)2 (라이신(CH3)2), -(CH2)k -C(O)-NH2; (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6임), -CH2-C(O)-NR'R" (아스파르트산 아미드), -(CH2)2-C(O)-NR'R" (글루탐산 아미드), -CH2-C(O)-OR' (아스파르트산 에스테르), 또는 -(CH2)2-C(O)-OR' (글루탐산 에스테르)이고, 여기서 R' 및 R"는 알킬 그룹이고
R4는 RGD 리간드 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고; 그리고
상기 폴리아민은 양친매성 막 활성 폴리아민이다.
상기 구조는 폴리머에 연결된 단일 디펩타이드 마스킹제를 나타내지만, 본 발명의 실시에서, 폴리머 아민의 50% 내지 100%는 디펩타이드 마스킹제에 의해 개질된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 가역적으로 마스킹된 폴리머는 아래의 구조를 포함한다:
Figure pct00009
여기서 R1, R2, R4 및 폴리아민은 상기에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 가역적으로 마스킹된 폴리머는 본 발명의 디펩타이드 마스킹제와 폴리머 상의 아민과의 반응에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 디펩타이드 마스킹제는 아래의 구조를 갖는다:
Figure pct00010
여기서:
X, Y, R1, R2, 및 R4는 상기에서 기재된 바와 같고
R5는 위치 2, 4, 또는 6에 있고 -CH2-O-C(O)-O-Z이고, 여기서 Z는 -할라이드,
Figure pct00011
R6은 독립적으로, R5에 의해 점거된 위치를 제외한 각각의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6에서 수소, 알킬, -(CH2)n-CH3 (여기서 n = 0-4), -(CH2)-(CH3)2, 또는 할라이드이다.
바람직한 구현예에서, X는 -NH-이고, Y는 -NH-이고, R4는 RGD 리간드 또는 PEG 그룹을 포함하고, R5는 위치 4에 있고, 그리고 R6은 아래에서 보여진 바와 같이 수소이다:
Figure pct00012
.
또 다른 구현예에서, 화학식 4의 R4는 R8-(O-CH2-CH2)s-O-Y1-이고, 여기서: R8은 수소, 메틸, 또는 에틸이고; 그리고 s는 1 내지 150의 정수이고, 그리고 Y1는 PEG 그룹을 디펩타이드에 연결하기 위한 당해기술에서 적합한 링커이다. 적합한 링커 Y1는, 비제한적으로 하기를 포함한다: -(CH2)1-3-C(O)-, -Y2-NH-C(O)-(CH2)2-C(O)- (여기서 Y2는 -(CH2)3-임), 및 -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2- (p는 1 내지 20의 정수임).
본원에서 사용된 바와 같이, RGD 리간드는 알파 v/베타 3 (αvβ3 또는 αvβ3) 인테그린에 결합하고 (그것에 대해 친화성을 갖는) 크기가 <1500 kDa인 쯔비터이온 RGD 펩타이드 또는 RGD 모방체(mimic)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, RGD 펩타이드는 아르기닌-글리신-아스파르테이트 트리펩타이드를 포함한다. RGD 펩타이드는 RGD 서열에 대한 추가의 아미노산 아미노 또는 카복시 말단을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 아미노산이 존재하면, 인접 펩타이드 서열은 RGD 펩타이드를 구성한다. RGD 펩타이드는 형태적으로 구속될 수 있다. 형태적 구속은 펩타이드의 고리화에 의해, 예컨대 RGD 서열의 시스테인 아미노산 아미노 및 카복시 말단을 부가하고 시스테인 티올 사이의 디설파이드 결합을 형성하여 전형적으로 달성된다. 바람직한 구속된 RGD 펩타이드는 아미노산 서열: Xn1CmXn2CXn3RGDXn4CXn5CmXn6 (서열목록번호 1)를 포함하고, 여기서 X는 천연 발생 아미노산이고, m은 0 또는 1이고, 그리고 n1-n6은 독립적으로 0,1, 2, 또는 3이다. 존재하면 (n = 1, 2, 또는 3), 각 X에서의 하나 이상의 아미노산은 다른 위치에서 아미노산(들)의 선택에 대해 독립적이다. 일 구현예에서, m, n1, n2, 및 n5 각각은 1이고, 그리고 n3, n4, 및 n6 각각은 0이다. 또 다른 구현예에서, m은 1이고, Xn1은 알라닌이고, Xn2는 아스파르테이트이고, Xn5는 페닐알라닌이고, 그리고 n3, n4, 및 n6 각각은 0이다 (ACDCRGDCFC, 서열번호 2). RGD 펩타이드는 RGD 아미노산 서열에 연결된 비-펩타이드 성분을 가질 수 있다. 예를 들면, 펩타이드의 아미노 말단은 아실화될 수 있고 링커는 펩타이드의 카복시 말단에 부착될 수 있다. 또 다른 구현예에서, m은 1이고, Xn1은 아실화된 알라닌이고, Xn2는 아스파르테이트이고, Xn5는 페닐알라닌이고, n3, n4, 및 n6 각각은 0이다.
본원에서 사용된 바와 같이, RGD 모방체는 RGD 펩타이드의 활성 결정인자, 인테그린 결합 단백질의 인테그린-결합 RGD 부분, 또는 αvβ3 인테그린 결합 RGD 모티프를 생물학적으로 모방하는 RGD 펩타이드 이외의 비-펩타이드 합성 분자이다. RGD 모방체는 아미드 결합을 통해 연결된 1 또는 2개의 천연 발생 아미노산을 함유할 수 있다. RGD 모방체는 개질된 펩타이드일 수 있고, 비-표준 아미노산 또는 비-표준 아미노산 측쇄를 함유할 수 있다. RGD 모방체는 아래의 구조에 의해 나타낸 펩타이드 골격을 가질 수 있다:
Figure pct00013
여기서 n은 정수이다.
일 구현예에서, RGD 리간드는 아미드 결합을 통해 글리신-아스파르테이트 디펩타이드에 연결된 구아니디늄 그룹을 포함한다. 본 발명의 구아니디늄 그룹은 아래에 의해 나타낸 구조를 갖는다:
Figure pct00014
여기서 R9 및 R10는 독립적으로 수소 또는 알킬이고 연결되어 고리를 형성할 수 있고, 그리고 R11는 구아니디늄 그룹을 글리신-아스파르테이트 디펩타이드에 연결하는 링커이다. 구아니디늄 그룹는 상기에서 나타낸 구조 및 이의 공명 구조 둘 모두를 포함한다. 바람직한 링커는 하기이다:
-(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)- 또는 -(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)-(C4RR')-,
여기서: a) 각각의 R은 독립적으로 임의적이고, 존재하면 독립적으로 수소, 알킬, 또는 아릴이고, b) R'는 수소, 알킬, 아릴, 또는 NH2이고, 그리고 c) C1, C2, 및 C3은 단일 결합, 단일 결합 및 이중 결합, 또는 방향족 결합에 의해 연결될 수 있다.
본원에서 제공된 RGD 리간드 구조가 명백하게 보여지지 않지만, 구아니디늄 그룹이 중성 또는 거의 중성 pH (pH 6.5-7.5)에서 양으로 하전된 것으로 잘 알려져 있고 이해된다:
Figure pct00015
.
유사하게, 본원에서 제공된 RGD 리간드 구조가 명백하게 보여지지 않지만, 아미노산 아스파르트산이 중성 또는 거의 중성 pH (pH 6.5-7.5)에서 음으로 하전된 것으로 잘 알려져 있고 이해된다:
Figure pct00016
.
RGD 리간드의 아스파르테이트 아미노산에 부착된 페녹시 그룹은 폴리아민의 생체내 종양 세포로의 표적화를 개선하는 것으로 발견되었다. 바람직한 RGD 리간드는 구아니디늄-글리신-아스파르테이트-4-아미노페녹시 화합물을 포함한다. 바람직한 구아니디늄-글리신-아스파르테이트-4-아미노페녹시 화합물은 아래에 의해 나타낸 구조를 포함한다:
Figure pct00017
여기서 R13은
Figure pct00018
이다.
바람직한 구아니디늄은
Figure pct00019
및 이의 공명 구조이다.
또 다른 구현예에서, RGD 리간드-함유 모이어티는 아래에 의해 나타낸 구조를 포함한다:
Figure pct00020
여기서:
R14는
Figure pct00021
이고, 그리고
A는 연결기(linker)를 포함한다. 연결기는 RGD 모방체를 또 하나의 분자 예컨대 디펩타이드 아미도벤질-카보네이트에 연결하고, 증가된 용해도를 제공하하거나, 또는 또 하나의 분자에 공유 결합하기 위한 수단을 제공한다.
일 구현예에서, 연결기 A는 하기를 포함한다:
Figure pct00022
여기서
n은 0, 1, 2, 또는 3이고,
Y는 존재하지 않거나
Figure pct00023
이고,
Z는 존재하지 않거나
Figure pct00024
또는
Figure pct00025
이고,
m은 0, 1,2, 3, 또는 4이고, 그리고
PEG (도 13 내 PEG1)은 (CH2-CH2-O)4-44이고, 그리고
R12는 R7과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 그룹을 포함한다.
각각의 별개의 성분, PEG, 반응성 그룹, 등은 아미드 결합의 형성을 비제한적으로 포함하는, 당해기술에서 쉽게 이용가능한 방법을 사용하여 조합 (공유 결합)될 수 있다. 일 구현예에서, 반응성 그룹 R12는 디아민 예컨대 라이신을 통해 PEG에 연결될 수 있다. 라이신의 카복실 그룹은 고형 지지체에 부착되어 RGD 리간드의 합성을 도울 수 있다. 그 다음 말단 및 ε-아민은 사용되어 PEG 그룹 및 반응성 그룹을 연결할 수 있다. 반응성 그룹 R12는 식 3의 반응성 그룹 R7과 쉽게 반응하도록 선택되어 공유 연결을 형성한다. R12 및 R7과 함께 사용하는데 적합한 반응성 그룹이 쌍은 하기를 포함하는 쌍으로부터 선택될 수 있다: 아자이드 및 포스핀, 아자이드 및 알킨, 니트론 및 알킨, 테트라진 및 옥탄, 테트라진 및 사이클로프로펜, 테트라진 및 이소니트릴, 디-엔 및 알켄, 알데하이드 및 하이드라진, 알데하이드 및 아미노옥시, 알데하이드 및 하이드라자이드, 케톤 및 하이드라진, 케톤 및 아미노옥시, 및 케톤 및 하이드라자이드. 바람직한 반응성 그룹은 아래와 같다:
Figure pct00026
.
바람직한 구현예에서, RGD 리간드-함유 모이어티는 아래에 의해 나타낸 구조를 포함한다:
Figure pct00027
여기서: R14, n, Y, Z, m, PEG, 및 R12 각각은 상기에서 정의된 바와 같다.
반응성 그룹 R12는 사용되고 RGD 리간드를 가역적 생리적으로 불안정한 링커 예컨대 디펩타이드 링커에 부착시켜 RGD 마스킹제를 얻을 수 있다. 일 구현예에서, RGD 마스킹제는 아래에 의해 나타낸 구조를 포함한다:
Figure pct00028
여기서 R14는 상기에서 정의된 바와 같은 구아니디늄-함유 모이어티이고, A'는 PEG-함유 링커를 포함하고, R1은 바람직하게는 소수성 아미노산의 측면 그룹이고, R2은 바람직하게는 친수성 비하전된 아미노산의 측쇄이고 (중성 pH에서), 그리고 R3는 아민-반응성 카보네이트이다. 일 구현예에서, 링커 A'는 4 내지 48개의 에톡시 단위를 갖는 PEG 그룹을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커 A'는 4 내지 44개의 에틸렌 단위를 갖는 제1 PEG (PEG1) 그룹 및 디아실 하이드라진 또는 다른 연결 화학에 의해 분리된 4 내지 44개의 에틸렌 그룹을 갖는 제2 PEG (PEG2) 그룹을 포함한다. 일 구현예에서, 디아실 하이드라존은 디아민, 예컨대 라이신을 통해 제1 PEG 그룹에 연결된다. 디아릴 하이드라존은 HyNic (히드라지노-니코틴아미드) 그룹과 아릴 알데하이드와의 반응에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 연결기 A'는 아래의 반응인 연결 형태를 포함한다: 아자이드와 포스핀과의 반응, 아자이드와 알킨과의 반응, 니트론과 알킨과의 반응, 테트라진과 옥텐과의 반응, 테트라진과 사이클로프로펜과의 반응, 테트라진과 이소니트릴과의 반응, 디-엔과 알켄과의 반응, 알데하이드와 하이드라진과의 반응, 알데하이드와 아미노옥시과의 반응, 알데하이드와 하이드라자이드과의 반응, 케톤과 하이드라진과의 반응, 케톤과 아미노옥시과의 반응, 또는 케톤과 하이드라자이드의 반응.
RGD 마스킹제의 부착에 의한 막 활성 폴리아민의 변형으로 가역적으로 개질된 폴리아민을 얻는다. 일 구현예에서, RGD 마스킹제에 의해 개질된막 활성 폴리아민은 아래에 의해 나타낸 구조를 포함한다:
Figure pct00029
여기서 R14, R1, R2, 및 A'는 상기에서 정의된 바와 같다. 일 구현예에서, RGD는, 디펩타이드가 양친매성 막 활성 폴리아민에 연결된 후에 디펩타이드에 부착된다. 일 구현예에서, 아릴 알데하이드-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카보네이트는 폴리아민과 먼저 반응하여 아릴 알데하이드-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카바메이트-폴리아민을 형성한다. 그 다음 이러한 화합물은 RGD 리간드-PEG1-디아민-HyNic와 반응되어 하기를 형성한다: RGD 리간드-PEG1-디아민-디아릴 하이드라존-PEG2-디펩타이드-아미도벤질-카보메이트폴리아민 (도 13 참고).
본원에 사용된 용어 "펩타이드"는 하기 당해기술에서의 일반적인 의미를 갖는다: 펩타이드 (아미드) 결합, 즉 한 아미노산의 카복실 그룹이 또 하나의 아미노 그룹과 반응하는 경우에 형성된 공유 화학 결합에 의해 연결된, L α 아미노산 모노머의 단쇄.
본원에 사용된 어구 "천연 발생 아미노산"은 당해기술에서의 일반적인 의미를 갖는다. 본원에 사용된 "표준 아미노산"은 당해기술에서의 일반적인 의미를 갖는다: 유전자 암호에서 삼중항 코돈에 의해 직접적으로 인코딩된 천연 발생 L α 아미노산. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 막 활성 폴리머의 비제한적인 예는 US 특허 공보 US20080152661, US20090023890, US20080287630, US20110207799, US20130121954, 및 US20130317079 (이들 각각은 본원에 참고로 포함됨)에 이전에 기재되었다. 적합한 양친매성 막 활성 폴리아민은 또한 작은 펩타이드, 예컨대 멜리틴 펩타이드일 수 있다.
폴리머 아민은 본원에 기재된 펩티다아제 절단가능한 연결기를 사용하여 가역적으로 개질된다. 변경 그룹의 절단에 의해 아민의 재생이 얻어지면, 아민은 가역적으로 개질된다. 마스킹제의 활성화된 카보네이트와 폴리머 아민의 반응에 의해 도 3에 도시된 바와 같이 펩티다아제 절단가능한 디펩타이드-아미도벤질 카바메이트 연결을 통하여 RGD 리간드 또는 입체 안정제가 폴리머에 연결된다.
RGD 리간드 및 디펩타이드 마스킹제의 합성 및 콘주게이션 동안 보호 그룹이 사용될 수 있다. 존재한다면, 보호 그룹은 양친매성 막 활성 폴리아민의 개질 전 또는 후에 제거될 수 있다.
충분한 백분율의 폴리머 아민을 디펩타이드 마스킹제를 사용하여 가역적으로 개질시키면 막 활성 폴리아민의 막 활성이 억제된다. 디펩타이드-아미도벤질-카바메이트 연결은 프로테아제 (또는 펩티다아제) 절단에 대해 감수성이 있다. 프로테아제의 존재 하에, 아닐라이드 결합이 절단되어, 1,6 제거 반응이 즉시 일어나서 유리 폴리머가 분리되게 되는 중간체가 얻어진다 (도 4). 상기 제거 반응 후에, 유리 폴리머는 개질되지 않고 막 활성은 복원된다.
막 활성 폴리아민은 과량의 마스킹제의 존재 하에 마스킹제에 접합될 수 있다. 상기 과량의 마스킹제는 전달 폴리머의 투여 전에 접합된 전달 폴리머로부터 제거될 수 있다.
본원에 사용된 "입체 안정제"는, 입체 안정제를 함유하지 않는 폴리머와 비교하여, 이 입체 안정제가 부착되는 폴리머의 분자내 또는 분자간 상호작용을 방지 또는 억제하는 비-이온성의 친수성 폴리머 (천연, 합성, 또는 비-천연)이다. 입체 안정제는, 이것이 부착되는 폴리머가 정전기 상호작용에 참여하지 않게 한다. 정전기 상호작용은 양전하와 음전하 사이에서 인력으로 인한 둘 이상의 물질의 비-공유적 회합이다. 입체 안정제는 혈액 성분과의 상호작용, 및 따라서 옵소닌화, 식균작용, 및 세망내피 시스템에 의한 흡수를 억제할 수 있다. 따라서 입체 안정제는 이들이 부착되는 분자의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 입체 안정제는 또한 폴리머의 응집을 억제할 수 있다. 바람직한 입체 안정제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 PEG 유도체이다. 본원에 사용된 바람직한 PEG는 약 1-500, 또는 2-25 에틸렌 글리콜 모노머를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바람직한 PEG는 또한 약 85-20,000 달톤 (Da), 약 85-1000 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다. 본원에 사용된 입체 안정제는, 수용액 중에 입체 안정제를 함유하지 않는 폴리머와 비교하여, 이 입체 안정제가 부착되는 폴리머의 분자내 또는 분자간 상호작용을 방지 또는 억제한다.
"리간드"는, 이 리간드가 부착되는 콘주게이트의 약력학적 또는 생체분포 특성을 증대시켜서 콘주게이트의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포 특이적 흡수를 개선시킨다. 리간드는 분자와 표적 세포의 회합을 증대시킨다. 따라서, 리간드는, 이 리간드가 부착되는 콘주게이트의 약력학적 또는 생체분포 특성을 증대시켜서 콘주게이트의 세포성 분포 및 세포성 흡수를 개선시킬 수 있다. 리간드의 세포 또는 세포 수용체로의 결합은 세포내이입을 개시할 수 있다. 리간드는 1가, 2가, 3가, 4가이거나, 이보다 높은 원자가를 가질 수 있다.
본원에 사용된 막 활성 폴리아민은 원형질 막 또는 용해소체/세포내이입 막을 파열시킬 수 있다. 이러한 막 활성은 RNAi 유발제의 세포성 전달에 대해 필수적인 특징이다. 그러나, 막 활성은, 폴리머가 생체 내에서 투여되는 경우에 독성을 일으킨다. 폴리아민은 또한 생체 내에서 많은 음이온성 성분과 용이하게 상호작용하여 원하지 않는 생체-분포를 일으킨다. 따라서, 생체 내에서의 사용을 위해서는 폴리아민 막 활성의 가역적인 마스킹이 필요하다.
일 구현예에서, 막 활성 폴리아민은 하기를 포함한다: 아민-함유 모노머와 소수성 그룹-함유 모노머의 랜덤 중합에 의해 형성된 양친매성 폴리머. 상기 아민-함유 모노머는 펜던트 일차 아민 그룹을 함유한다. 상기 소수성 모노머는 펜던트 소수성 그룹을 함유한다. 상기 소수성 그룹은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 저급 소수성 그룹, 또는 6개 초과의 탄소 원자를 갖는 고급 소수성 그룹일 수 있다. 바람직한 소수성 그룹은 하기를 포함하는 리스트로부터 선택될 수 있다: 프로필, 부틸, 이소프로필, 및 이소부틸. 막 파열 활성을 갖는 수용성 폴리머가 형성되도록 소수성 그룹에 대한 아민 그룹의 비, 바람직하게는 소수성 모노머 당 ≥1의 아민 모노머가 선택된다. 일 구현예에서, 상기 폴리머는 50-80% 아민 모노머 및 더 바람직하게는 55-75% 아민 모노머를 가질 것이다. 소수성 그룹은 하기로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다: 각각 선형, 분지형, 또는 사이클릭일 수 있는, 알킬 그룹, 알케닐 그룹, 알키닐 그룹, 아릴 그룹, 아랄킬 그룹, 아르알케닐 그룹, 및 아르알키닐 그룹. 소수성 그룹은 바람직하게는, 단지 탄소 및 수소 원자를 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하고, 예를 들면 불소를 포함하는 치환 또는 헤테로원자가 허용될 수 있다.
"양친매성", 또는 "양친매성 폴리머"는 당해기술에 잘 공지되고 인지되어 있으며, 이들은 친수성 (극성, 수용성) 및 소수성 (무극성, 친유성, 수불용성) 그룹 또는 부분 둘 모두를 갖는다.
"친수성 그룹"은, 화학적 모이어티가 물을 선호하는 정성적 용어를 나타낸다. 전형적으로, 그와 같은 화학적 그룹은 수용성이고, 물과의 수소 결합 공여체 또는 수용체이다. 친수성 그룹은 하전되거나 하전되지 않을 수 있다. 하전된 그룹은 양으로 하전된 (음이온성) 또는 음으로 하전된 (양이온성) 또는 둘 모두 (쯔비터이온성)일 수 있다. 친수성 그룹의 예는 하기 화학적 모이어티를 포함한다: 탄수화물, 폴리옥시에틸렌, 어떤 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 아민, 아미드, 알콕시 아미드, 카복실산, 황, 및 하이드록실.
"소수성 그룹"은, 화학적 모이어티가 물을 회피하는 정성적 용어를 나타낸다. 전형적으로, 그와 같은 화학적 그룹은 수용성이 아니며, 수소 결합을 형성시키는 경향이 없다. 친유성 그룹은 지방, 오일, 지질, 및 무극성 용매 중에 용해되고, 수소 결합을 형성시키는 능력을 거의 내지는 전혀 갖지 않는다. 두 개 (2) 이상의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소, 어떤 치환된 탄화수소, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 유도체가 소수성 그룹 및 화합물의 예이다.
소수성 그룹은 바람직하게는, 탄소 및 수소 원자만을 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하고, 예를 들면 불소를 포함하는 무극성 치환 또는 무극성 헤테로원자가 허용될 수 있다. 상기 용어는, 각각이 선형, 분지형, 또는 사이클릭일 수 있는, 지방족 그룹, 방향족 그룹, 아실 그룹, 알킬 그룹, 알케닐 그룹, 알키닐 그룹, 아릴 그룹, 아랄킬 그룹, 아르알케닐 그룹, 및 아르알키닐 그룹을 포함한다. 용어 소수성 그룹은 또한 하기를 포함한다: 스테롤, 스테로이드, 콜레스테롤, 및 스테로이드 및 콜레스테롤 유도체.
양친매성 폴리머에 대해 본원에서 사용된 부분은, 하나의 공유 결합이 파괴되고 수소로 대체되는 경우에 유도된 분자로 정의된다. 예를 들면, 부틸 아민에서, 탄소와 질소 결합 사이에서 파괴되고 수소로 대체되면 암모니아 (친수성) 및 부탄 (소수성)이 얻어진다. 1,4-디아미노부탄이 질소-탄소 결합에서 절단되고 수소로 대체되면, 얻어지는 분자는 또한 암모니아 (2×) 및 부탄이다. 그러나, 1,4,-디아미노부탄은, 소수성 부분이 형성되는데 두 개 결합의 파괴가 필요하기 때문에 양친매성인 것으로 간주되지 않는다.
본원에 사용된 "표면 활성 폴리머"는, 물의 표면 장력 및/또는 다른 상과의 계면 장력을 저하시키며 따라서 액체/증기 계면에서 적극적으로 흡수된다. 표면 활성의 특성은 보통, 물질 분자가 양친매성 또는 양친매성이라는 사실에 기인한다.
본원에 사용된 "막 활성" 폴리머는, 생물학적 막에 대해 하기 효과 중 하나 이상을 유도할 수 있는 표면 활성, 양친매성 폴리머이다: 비-막 투과성 분자를 세포 내로 또는 막을 가로질러 유입시킬 수 있는 막의 변경 또는 파열, 막 내에서 공극 형성, 막의 분열, 또는 막의 파열 또는 용해. 본원에 사용된 "막" 또는 "세포 막"은 지질 이중층을 포함한다. 막의 변경 또는 파열은 적어도 하나의 하기 분석에서 폴리머 활성에 의해서 기능적으로 정의될 수 있다: 적혈구 용해 (용혈), 리포좀 누출, 리포좀 융합, 세포 융합, 세포 용해, 및 엔도솜(endosomal) 분리. 세포 막의 용해를 일으킬 수 있는 막 활성 폴리머는 또한 막 용해성 폴리머로 지칭된다. 원형질 막에 비하여 엔도솜 또는 리소좀을 우선적으로 파열시킬 수 있는 막 활성 폴리머가 엔도솜분해적인 것으로 간주된다. 세포 막에 대한 막 활성 폴리머의 효과는 일시적일 수 있다. 막 활성은 막에 대한 친화성을 보유하며, 이중층 구조의 변성 또는 변형을 일으킨다. 막 활성 폴리머는 합성 또는 비-천연 양친매성 폴리머일 수 있다.
본원에 사용된 막 활성 폴리머는, 화합물, 예컨대 HIV TAT 단백질로부터 유도된 아르기닌-풍부 펩타이드, 안네나페디아 펩타이드, VP22 펩타이드, 트랜스포르탄, 아르기닌-풍부 인공 펩타이드, 작은 구아니디늄-풍부 인공 폴리머 등으로 표시된 세포 침투성 펩타이드 또는 폴리머로 지칭된 폴리머 부류와는 뚜렷이 다르다. 세포 침투성 화합물이 명백하게 세포내이입을 요구하지 않으면서 및 막의 완전성을 방해하지 않으면서 막을 가로질러 지질 이중층의 한 측으로부터 지질 이중층의 다른 측으로 일부 분자를 이동시키는 것으로 보이지만, 이의 기전은 이해되지 않는다.
RNAi 유발제의 세포로의 전달은, 막 내에서의 공극 형성을 포함하는 원형질 막 또는 내부 소포 막 (예컨대 엔도솜 또는 리소좀)을 파괴 또는 불안정화시켜서 소포의 내용물을 세포 세포질 내로 방출시킬 수 있는 막 활성 폴리머에 의해서 매개된다.
본 발명의 양친매성 막 활성 폴리아민 공중합체는 2 이상 모노머 종의 공중합 생성물이다. 일 구현예에서, 본 발명의 양친매성 막 활성 헤테로폴리머는 하기 일반적인 구조를 갖는다:
-(A)a-(B)b-
여기서, A는 펜던트 일차 아민 작용 그룹을 함유하고 B는 펜던트 소수성 그룹을 함유한다. a 및 b는 >0인 정수이다. 상기 폴리머는 랜덤, 블록 또는 교대형일 수 있다. 추가 모노머의 혼입이 허용가능하다.
본원에 사용된 "엔도솜분해적 폴리머"는, 엔도솜-특이적 환경적 인자, 예컨대 용해 효소의 존재에 반응하여, 엔도솜의 파괴 또는 용해를 일으키거나 세포성 내부 막-봉입된 소포, 예컨대 엔도솜 또는 리소좀으로부터 정상적인 세포 막 불투과성 화합물, 예컨대 RNAi 유발제의 분리를 제공할 수 있는 폴리머이다. 엔도솜분해적 폴리머는 엔도솜에서 그 물리-화학적 특성에서의 변화를 겪는다. 이러한 변화는 전하, 소수성 또는 친수성에서의 변화로 인하여 다른 화합물 또는 막과 상호작용하는 폴리머의 능력 또는 용해도에서의 변화일 수 있다. 본 발명의 가역적으로 마스킹된 막 활성 폴리아민은 엔도솜분해적 폴리머인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "멜리틴(melittin)"은, 벌 독에서 천연 발생하는 작은 양친매성 막 활성 펩타이드이다 (US 특허 공보 20120165393). 멜리틴은 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 있거나 합성될 수 있다. 합성 폴리머는 "인간에 의한" 화학 공정으로 제조되거나 제형화되며, 천연 발생적인 생물학적 과정에 의해서는 생성되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 예를 들면, 하기 종의 독에서 확인될 수 있는 멜리틴 패밀리의 천연 발생 벌 독 펩타이드를 포함한다: 아피스 멜리페라, 아피스 세라나, 베스풀라 마쿨리프론스, 베스파 마그니피카, 베스파 벨루티나 니그리토락스, 폴리스테스 sp. HQL-2001, 아피스 플로래, 아피스 도르사타, 아피스 세라나 세라나, 폴리스테스 헤브래우스. 본원에 사용된 멜리틴은 또한 천연 발생 멜리틴 펩타이드와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드를 포함한다. 특이적으로, 멜리틴 아미노산 서열은 하기 표 1에 기재된 것들을 포함한다. 합성 멜리틴 펩타이드는 천연 발생 L형 아미노산 또는 거울상이성질체 D형 아미노산 (역전됨)을 함유할 수 있다. 그러나, 멜리틴 펩타이드는 본질적으로 모든 L형 또는 모든 D형 아미노산을 함유해야 하지만, 아미노 또는 카복시 말단에 첨부된 반대 입체중심의 아미노산을 가질 수 있다. 멜리틴 아미노산 서열은 또한 역전될 수 있다. 역전된 멜리틴은 L형 아미노산 또는 D형 아미노산을 가질 수 있다 (재역전됨). 2개의 멜리틴 펩타이드는 또한 공유 결합되어 멜리틴 이합체를 형성할 수 있다. 멜리틴은, 마스킹제 이외에, 아미노 말단 또는 카복시 말단에 부착된, 생체 내에서의 순환을 촉진시키거나 조직 표적화를 증대시키는 개질 그룹을 가질 수 있다.
연결(linkage) 또는 "연결기(linker)"는, 관심있는 하나의 화학 그룹 또는 분절을 하나 이상의 공유 결합을 통하여 관심있는 또 하나의 화학 그룹 또는 분절에 연결시키는 두 원자 사이에서의 연결이다. 예를 들면, 연결은 마스킹제, 폴리뉴클레오타이드, 또는 RNAi 유발제를 폴리머에 연결시킬 수 있다. 불안정한 연결은 불안정한 결합을 함유할 수 있다. 연결은 상기 두개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 상기 연결에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가시킬 수 있다. 스페이서는 비제한적으로 알킬 그룹, 알케닐 그룹, 알키닐 그룹, 아릴 그룹, 아랄킬 그룹, 아르알케닐 그룹, 아르알키닐 그룹을 포함한다; 상기 그룹 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오타이드, 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 그룹은 당해기술에 잘 공지되어 있고 상기 리스트는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
"불안정한 결합"은, 수소에 대한 공유 결합 이외에, 동일한 분자 내 다른 공유 결합을 파괴시키거나 절단시키지 않을 조건 아래에서 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 공유 결합이다. 더 구체적으로, 불안정한 결합은 동일한 분자 내 다른 비-불안정한 공유 결합보다 (열역학적으로) 덜 안정하거나 (동력학적으로) 더 빠르게 파괴되는 공유 결합이다. 분자 내 불안정한 결합이 절단되면 두 개 분자가 형성될 수 있다. 당업자를 위해, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기 (t½) (결합의 반이 절단되는데 필요한 시간)의 측면에서 논의된다. 따라서, 불안정한 결합은 분자 내 다른 결합보다 더 신속하게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
본원에 사용된 "생리적으로 불안정한 결합"은, 포유동물 신체 내에서 마주치는 것들과 유사하거나 일반적으로 마주치는 조건 아래에서 절단가능한 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 연결 그룹은, 이러한 그룹이 어떤 생리적 조건에 놓이는 경우에 화학적 변환 (예를 들면, 절단)을 겪도록 선택된다.
본원에 사용된 "세포성의 생리적으로 불안정한 결합"은, 포유동물 세포내 조건 하에서 절단가능한 불안정한 결합이다. 포유동물 세포내 조건은 화학적 조건, 예컨대 포유동물 세포에서 확인되거나 마주친 것들과 유사한 염 농도, pH, 온도, 및 산화 또는 환원 조건 또는 제제를 포함한다. 포유동물 세포내 조건은 포유동물 세포 중에 일반적으로 존재하는, 예컨대 단백분해 또는 가수분해 효소로부터의 효소 활성의 존재를 또한 포함한다. 세포성의 생리적으로 불안정한 결합은 약제학적으로 허용가능한 외인성 제제의 투여에 반응하여 또한 절단될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", 또는 핵산 또는 다핵산은 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는 폴리머를 지칭하는 당해기술의 용어이다. 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 폴리머의 모노머 유닛이다. 120개 미만의 모노머 유닛을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 종종 소위 올리고뉴클레오타이드라 불린다. 천연 핵산은 데옥시리보스- 또는 리보오스-포스페이트 골격을 갖는다. 비-천연 또는 합성 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내에서 또는 무세포 시스템에서 중합되는 폴리뉴클레오타이드이며, 동일하거나 유사한 염기를 함유하지만 천연 리보오스 또는 데옥시리보스-포스페이트 골격 이외 유형의 골격을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 당해기술에 공지된 임의 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 당해기술에 공지된 폴리뉴클레오타이드 골격은 하기를 포함한다: PNAs (펩타이드 핵산), 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트, 모폴리노스, 및 원상태(native) 핵산의 포스페이트 골격의 다른 변이체. 염기는, 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 추가로 포함하는 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체는 비제한적으로, 뉴클레오타이드 상에 새로운 반응성 그룹, 예컨대, 비제한적으로 아민, 알코올, 티올, 카복실레이트, 및 알킬할라이드를 위치시키는 개질을 포함한다. 상기 용어 "염기"는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 임의 것을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 합성 뉴클레오타이드, 또는 임의의 적합한 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내에서 중합될 수 있고, 재조합될 수 있고, 키메라성 서열, 또는 이러한 그룹의 유도체를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 5'-말단, 3'-말단, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 모두에서 말단 캡 모이어티를 포함할 수있다. 상기 캡 모이어티는 비제한적으로 역전된 데옥시 무염기성(abasic) 모이어티, 역전된 데옥시 티미딘 모이어티, 티미딘 모이어티, 또는 3'-글리세릴 개질부일 수 있다.
RNAi 유발제는 RNA 간섭 (RNAi)의 생물학적 과정을 통하여 유전자 발현을 억제한다. RNAi 유발제는 전형적으로 15-50개의 염기쌍 및 바람직하게는 18-25개의 염기쌍을 함유하며, 세포 내에서 발현된 표적 유전자에서의 코딩 서열과 동일하거나 (완벽하게 상보적인) 또는 거의 동일한 (실질적으로 상보적인) 핵염기 서열을 갖는 이중가닥 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함한다. RNAi 유발제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 짧은 간섭 RNAs (siRNAs), 이중-가닥 RNAs (dsRNA), 마이크로 RNAs (miRNAs), 짧은 헤어핀 RNAs (shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex), 및 다이서(dicer) 기질 (US 특허 번호 8,084,599 8,349,809 및 8,513,207).
RNAi 유발제는 서로 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적인 적어도 2개의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 두개의 RNAi 유발제 서열은 제1 서열을 포함하는 센스 가닥 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 상기 두개의 RNAi 유발제 서열은 제1 서열을 함께 포함하는 두개의 센스 가닥 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는데, 여기서 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 함께 메로듀플렉스를 형성시킨다 (표 2 및 4). 센스 가닥은 연결기 분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 연결기 또는 비-뉴클레오타이드 연결기를 통하여 안티센스 가닥에 연결될 수 있다.
안티센스 가닥은 표적 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA 부분과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 상보성 영역의 길이는 가장 바람직하게는 30개 미만의 뉴클레오타이드이다. RNAi 유발제 센스 가닥은 AAT mRNA의 적어도 일부와 적어도 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 표적 유전자를 발현하는 세포로의 전달 시에 RNAi 유발제는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상기 표적 유전자의 발현을 억제한다.
RNAi 유발제 분자는 천연 발생 뉴클레오타이드로 구성될 수 있거나, 적어도 하나의 개질된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 모방체로 구성될 수 있다. 본 발명의 RNAi 유발제 센스 및 안티센스 가닥은 당해기술에서 잘 확립된 방법에 의해서 합성 및/또는 개질될 수 있다. RNAi 유발제 분자 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오타이드 염기는 포스페이트-함유 (천연) 또는 비-포스페이트-함유 (비-천연) 공유 뉴클레오사이드간의 연결에 의해 연결될 수 있는데, 즉 RNAi 유발제 분자는 천연 또는 비-천연 올리고뉴클레오타이드 골격을 가질 수 있다. 또 하나의 구현예에서, RNAi 유발제는 뉴클레오타이드 염기 사이에 비-표준 (비-포스페이트) 연결을 함유한다.
개질된 뉴클레오타이드는 비제한적으로 하기를 포함한다: 2' 개질, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-아미노 뉴클레오타이드, 2'­알킬 뉴클레오타이드, 말단 3' 대(to) 3' 연결, 역전된 데옥시티미딘, 5'­포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 티오포스페이트 연결, 포스포로디티오에이트 그룹, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 록킹된(locked) 뉴클레오타이드, 브릿징된 뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 록킹되지 않은 뉴클레오타이드 (본원에서 NUNA로 표시됨), 모폴리노 뉴클레오타이드, 및 무염기성 뉴클레오타이드. 소정 화합물 내 모든 위치가 반드시 균일하게 개질되는 것은 아니다. 반대로, 1 초과의 개질부가 단일 RNAi 유발제 화합물 중에 또는 심지어는 그 단일 뉴클레오타이드 중에 혼입될 수 있다. 리보오스 2' 개질부가, 개질된 뉴클레오사이드 연결과 조합될 수 있다.
RNAi 유발제 분자는 또한 튀어나온 부분(overhang), 즉 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 본원에서 정의된 쌍의 코어 서열에 의해 일반적으로 형성된 이중 나선 구조에 직접적으로 관련되지 않은, 전형적으로 짝지어지지 않으면서 튀어나온 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
RNAi 유발제는 각각 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 독립적으로 1 내지 5개의 염기로 된 3' 및/또는 5' 튀어나온 부분을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두는 3' 및 5' 튀어나온 부분을 함유한다. 일 구현예에서, 한 가닥 염기의 하나 이상의 3' 튀어나온 부분의 뉴클레오타이드는 다른 가닥의 하나 이상의 5' 튀어나온 부분의 뉴클레오타이드와 짝을 이룬다. 또 하나의 구현예에서, 한 가닥 염기의 하나 이상의 3' 튀어나온 부분의 뉴클레오타이드는 다른 가닥의 하나 이상의 5' 튀어나온 부분의 뉴클레오타이드와 짝을 이루지 않는다. RNAi 유발제의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오타이드 염기를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 안티센스 및 센스 가닥은 듀플렉스를 형성할 수 있는데, 여기서 상기 5' 말단만이 둔감한(blunt) 말단을 가지며, 3' 말단만이 둔감한 말단을 가지며, 5' 및 3' 말단 둘 모두가 둔감한 말단으로 되어 있거나 이 5' 및 3' 말단 모두가 둔감한 말단으로 되어있지 않다. 또 하나의 구현예에서, 튀어나온 부분 내 하나 이상의 뉴클레오타이드는 티오포스페이트, 포스포로티오에이트, 데옥시뉴클레오타이드 역전된 (3' 대 3' 연결된) 뉴클레오타이드를 함유하거나, 개질된 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드이다.
공지된 miRNA 서열의 리스트는 연구 기관, 예컨대 특히 웰컴 트러스트 생어 연구소 (Wellcome Trust Sanger Institute), 펜 생체정보 센터 (Penn Center for Bioinformatics), 메모리얼 슬론 케터링 암 센터 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center), 및 유럽 분자 생물학 실험실에 보유된 데이타베이스에서 확인할 수 있다. 공지된 효과적인 siRNA 서열 및 동족 결합 부위 또한 관련된 문헌에 잘 나타나 있다. RNAi 분자는 당해기술에 공지된 기술에 의해 쉽게 설계되고 제조된다. 또한, 효과적이며 특이적인 서열 모티프를 발견할 기회를 증가시키는 계산(computational) 도구가 있다 (페이(Pei) 등 2006, 레이놀즈(Reynolds) 등 2004, 크보로바(Khvorova) 등 2003, 스크와츠(Schwarz) 등 2003, 위-테이(Ui-Tei) 등 2004, 헬레(Heale) 등 2005, 칼크(Chalk) 등 2004, 아마츠구이우이(Amarzguioui) 등 2004).
RNAi 유발제는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 다중 유전자가 서로 약간의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, RNAi 유발제는 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 따라서, RNAi 유발제는 상이한 유전자 표적 중에서 공유되거나 특이적인 유전자 표적에 대해 독특한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 따라서, RNAi 유발제는 여러 유전자 사이에서 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존 부위를 표적화하여 유전자 패밀리 (예를 들면, 상이한 유전자 동형체, 스플라이스 변이체, 변종 유전자 등)에서 여러 유전자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, RNAi 유발제는 단일 유전자의 특이적 RNA 서열에 독특한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
용어 "상보성"은, 전통적 왓슨-크릭 또는 다른 비-전통적 유형에 의해 또 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 참고하여, 그 표적 (효과기 결합 부위) 또는 상보적 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자에 대한 결합 유리(free) 에너지는, 폴리뉴클레오타이드의 관련된 기능에 의해 예를 들면, 효소에 의한 mRNA 절단 또는 번역 억제가 진행될 수 있게 하는데 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 유리 에너지의 측정은 당해기술에 잘 공지되어 있다 (프라이어(Frier) 등 1986, 터너(Turner) 등 1987). 상보성 퍼센트는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열과 수소 결합 (예를 들면, 왓슨-크릭 염기 짝짓기)을 형성할 수 있는 제1 폴리뉴클레오타이드 분자 내 인접 가닥으로 되어 있는 염기 퍼센트를 나타낸다 (예를 들면, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적이다). 완벽한 상보성은, 폴리뉴클레오타이드 서열의 인접 가닥 내 모든 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드 서열 내 동일한 수의 인접 염기와 수소 결합할 것임을 의미한다.
억제, 하향-조절, 또는 녹다운 유전자 발현은, 유전자로부터 전사된 RNA 수준, 또는 RNA로부터 번역된 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 서브유닛 수준에 의해 측정된 유전자 발현이 본 발명의 RNAi 유발제-콘주게이트의 부재 하에 관찰된 것 미만으로 감소됨을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의해 전달된 RNAi 유발제를 사용한 유전자 발현의 억제, 하향-조절, 또는 녹다운은 바람직하게는 대조 불활성 핵산, 스크램블된 서열을 갖거나 불활성화되는 미스매치를 갖는 핵산의 존재 하에서, 또는 마스킹된 폴리머에 대한 RNAi 유발제의 콘주게이트의 부재 하에서 관찰된 그러한 수준 미만이다.
RNAi 유발제의 전달 폴리머로의 연결
일 구현예에서, RNAi 유발제는 생리적으로 불안정한 결합 또는 연결기를 통하여 전달 폴리머에 연결된다. 상기 생리적으로 불안정한 연결기는, 이 연결기가 어떤 생리적 조건 (예를 들면, 세포 세포질의 감소되는 환경 중에서 절단된 디설파이드 결합)에 놓이는 경우에 화학적 변형 (예를 들면, 절단)을 겪도록 선택된다. 생리적으로 불안정한 연결의 절단에 의해 폴리머로부터 상기 유발제를 분리시키면, 활성에 대한 적절한 세포성 성분과 상기 유발제의 상호작용이 촉진된다.
RNAi 유발제-폴리머 콘주게이트는 상기 유발제를 폴리머에 공유 결합시킴으로써 형성된다. 폴리머는, 이 폴리머가 반응성 그룹 A를 함유하도록 중합되거나 개질된다. RNAi 유발제 또한, 이 유발제가 반응성 그룹 B를 함유하도록 중합되거나 개질된다. 반응성 그룹 A 및 B는, 이들이 당해분야에서 공지된 방법을 사용하여 가역적 공유 결합을 통하여 연결될 수 있도록 선택된다.
RNAi 유발제의 폴리머로의 접합은 과량의 폴리머의 존재 하에서 수행될 수 있다. RNAi 유발제 및 폴리머가 접합 동안 반대 전하일 수 있기 때문에, 과량의 폴리머의 존재는 콘주게이트의 응집을 감소시키거나 제거할 수 있다. 대안적으로, 과량의 캐리어 폴리머, 예컨대 다중양이온이 사용될 수 있다. 상기 과량의 폴리머는 동물 또는 세포 배양물로 상기 콘주게이트를 투여하기 전에 접합된 폴리머로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 과량의 폴리머는 콘주게이트와 함께 동물 또는 세포 배양물로 공동 투여될 수 있다.
생체내 투여
약리학 및 독성학에서, 투여 경로는 약물, 유체, 독, 또는 다른 물질이 신체와 접촉하게 되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물을 치료하기 위한 약물 및 핵산의 투여 방법이 당해기술에서 잘 공지되어 있으며 본 발명의 조성물의 투여에 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 임의의 적합한 경로를 통하여, 가장 바람직하게는 비경구로, 그 경로에 적절하게 맞추어진 조제물로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 예를 들면, 정맥 내로, 근육 내로, 피부 내로, 피하로, 또는 복강 내로, 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
비경구 투여 경로는, 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용하는 혈관 내 (정맥 내, 동맥 내), 근육 내, 실질 내, 진피 내, 진피 하, 피하, 종양 내, 복강 내, 척추강 내, 경막 하, 경막 외, 및 림프 내 주사를 포함한다. 본원에서 "혈관 내"는 신체 내 조직 또는 기관에 연결되는 혈관이라 불리는 관형 구조 내를 의미한다. 상기 관형 구조의 공동 내에는, 체액이 신체 부분으로 또는 이로부터 흐른다. 체액의 예는 혈액, 뇌척수액 (CSF), 림프액, 또는 담즙을 포함한다. 혈관의 예는 동맥, 세동맥, 모세관, 세정맥, 굴맥관, 정맥, 림프, 담관, 및 타액 또는 다른 외분비샘의 관을 포함한다. 혈관내 경로는 혈관, 예컨대 동맥 또는 정맥을 통한 전달을 포함한다. 혈액 순환계는 약제의 전신 확산을 제공한다.
기재된 조성물은 약제학적으로 허용가능한 캐리어 용액 중에서 주사된다. "약제학적으로 허용가능한"은, 약리적/독물학적 관점으로부터 포유동물에게 허용가능한 그러한 특성 및/또는 물질을 지칭한다. 어구 "약제학적으로 허용가능한"은, 생리적으로 허용성이 있고 포유동물에게 투여되는 경우에 알러지 또는 다른 다루기 힘들거나 독성인 반응을 전형적으로 나타내지 않는 분자 실재물, 조성물 및 특성을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 포유동물에서 및 더 구체적으로는 인간에서의 사용에 대해 U.S. 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에 열거되어 있거나, 주 또는 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인됨을 의미한다.
이러한 캐리어는 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은, 상기 멸균화 과정에 의해 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 등을 포함시킴에 의한 둘 모두의 방법으로 보장될 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제 형태의 연장된 흡수는, 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 얻어질 수 있다.
치료 효과
RNAi 유발제는 연구 목적으로 또는 치료적인 세포에서의 변화를 나타내도록 전달될 수 있다. 생체 내 전달되는 RNAi 유발제는 연구 시약으로 및 다양한 치료, 진단, 표적 검증, 게놈 발견, 유전공학, 및 약리유전학(pharmacogenomic) 응용예에 대해서 유용하다. 본 출원인은, 간세포에서 내인성 유전자 발현을 억제시키는 RNAi 유발제 전달을 개시하였다. RNAi 유발제 전달 후에 측정된 리포터 (마커) 유전자 발현 수준은, 다른 RNAi 유발제 전달 후에 유사한 수준의 유전자 발현의 합리적인 예상을 나타낸다. 당업자에 의해 유익한 것으로 간주된 치료 수준은 질병마다 상이하다. 예를 들면, 혈우병 A 및 B는 각각 X-연결된 응고 인자 VIII 및 IX의 결핍에 의해서 일어난다. 이의 임상 과정은 인자 VIII 또는 IX의 정상 혈청 수준 퍼센트에 의해 크게 영향받는다: < 2%, 중증; 2-5%, 중간 정도; 및 5-30% 경증. 따라서, 중증 환자에서 정상 수준 순환 인자의 1%에서 2%까지의 증가는 유익한 것으로 간주될 수 있다. 6% 초과 수준은 자연 출혈은 예방하지만, 수술 또는 부상에 대한 2차적인 출혈은 예방하지 않는다. 유사하게, 유전자 억제는 치료적 이점을 제공하기 위해 100%일 필요는 없다. 유전자 치료 분야의 당업자는, 충분한 수준의 마커 유전자 결과를 기초로, 질병에 대해 특이적인 유전자 발현의 유익한 수준을 합리적으로 예상할 것이다. 혈우병 예에서, 마커 유전자가 인자 VIII의 정상 수준의 2%에 비교가능한 용적 수준에서 단백질을 생성하도록 발현된 경우에, 인자 VIII에 대한 유전자 코딩은 또한 유사한 수준에서 발현될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서, 리포터 또는 마커 유전자는 일반적으로 세포내 단백질의 발현을 위한 유용한 패러다임을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물 내 활성 성분의 실제 용량 수준은, 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 가변될 수 있다. 선택된 용량 수준은, 약력학적 인자, 예컨대 사용된 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속시간, 사용된 특정한 조성물과 함께 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 컨디션, 일반적인 건강 및 전 병력, 및 의학 분야에 잘 공지된 유사 인자에 따를 것이다.
본원에 사용된 "생체 내"는 유기체 내부에서 일어남을, 및 더 구체적으로 어떠한 과정이, 부분적 또는 죽은 것과는 반대로, 전체의 살아있는 다세포 유기체 (동물), 예컨대 포유동물의 살아있는 조직 중에서 또는 그 위에서 수행됨을 의미한다.
본원에 사용된 "약제학적 조성물"은 본 발명의 콘주게이트, 약제학적 캐리어 또는 희석제, 및 제형화에 필요한 임의의 다른 매체 또는 제제를 포함한다.
본원에 사용된 "약제학적 캐리어"는, 생리적으로 친화성(compatible)인 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 캐리어는 (예를 들면 주사 또는 주입에 의한) 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다.
실시예
실시예 1. PEG 프로테아제 (펩티다아제) 절단가능 마스킹제의 합성. 수성 NaHCO3 중 아미노산의 커플링 및 실릴-그룹 탈보호를 제외한 모든 반응을, 신선한 무수 용매를 사용하는 무수 조건에서 수행했다. 칼럼 정제를 명시된 용출물을 사용하는 실리카겔 상에서 수행했다. 질량-스펙트럼 (MS) 전기분무 이온화를 사용하여 수행했다.
PEG PEG-AA-PABC-PNP)의 활성 p-니트로페닐-p-아실아미도벤질 카보네이트 유도체의 제조에서 PEG의 NHS 에스테르를 이용하여 디펩티도-p-아실아미노벤질 알코올 전구체의 아미노 말단을 아실화했다. 하기 단계에서 벤질 하이드록실 그룹을 p-니트로페닐 카보네이트로 전환하고, 그 다음 보호성 그룹을 아미노산으로부터 제거했다. 일부 적용에서, 파라니트로페놀 (PNP)-카보네이트를 어떤 폴리머의 변형을 위해 사용할 때, 보호성 그룹을 폴리머 변형 전에 제거했다 (도 5 참고).
합성은 H-A1A2-PABA (표 2) 유도체의 제조로부터 시작한다. 이들 부가물을, 일부 변형과 함께 Dubowchik at al. (2002)에 의해 기재된 합성 도식을 이용하여 수득했다. Fmoc-보호된 아미노산, Fmoc-A1-OH를, 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)과의 반응에서, N-하이드록시석신이미드 에스테르, Fmoc-A1-NHS로의 전환에 의해 활성화했다. 이들 반응성 NHS-에스테르를, 아미노 그룹이 반응성을 유지하도록 부가된 수성 NaHCO3의 존재에서 보호된 아미노산 A2와 커플링했다. 1e 및 1f (표 2)의 제조에 대해, NHS 에스테르 대신에, 상업적으로 이용가능한 펜타플루오로페닐 에스테르 (OPfp)을 커플링용으로 사용했다.
Fmoc 디펩타이드 1a-h의 합성.
a) AA의 NHS 에스테르를, NHS 및 DCC와 함께 각 아미노산으로부터 제조했고 추가의 정제 없이 사용했다 (도 5A).
Fmoc-Ala-NHS에 대해, DCC (286　mg, 1.38　mmol)을 DCM (13　ml) 중 Fmoc-Ala-OH (412　mg, 1.32　mmol) 및 NHS (160　mg, 1.38　mmol)의 빙랭된 용액에 부가하고, 30 분 동안 교반하고, 그 다음 20 ℃에서 16 시간 동안 교반했다. 고형 디사이클로헥실우레아 (DCU)을 여과 제거하고 용매를 진공에서 제거했다.
Fmoc-Asn(DMCP)-NHS에 대해, DCC (148　mg, 0.72　mmol)을 DCM (13　ml) 중 Fmoc-Asn(DMCP)-OH (298　mg, 0.68　mmol) 및 NHS (83　mg, 0.72　mmol)의 빙랭된 용액에 부가하고, 30 분 동안 교반하고, 그 다음 20 ℃에서 16 시간 동안 교반했다. 고형 DCU를 여과 제거하고 용매를 진공에서 제거했다.
Fmoc-Gly-NHS에 대해, Fmoc-Gly-OH (891　mg, 3　mmol) 및 NHS (380　mg, 3.3　mmol)을 THF (10　ml)에서 0 ℃에서 5 분 동안 교반하고 THF (5　ml) 중 DCC 용액 (650　mg, 3.15　mmol)으로 처리했다. 냉각욕을 30 분 내로 제거하고 반응 혼합물을 20 ℃에서 10 시간 동안 교반했다. 고형 DCU를 여과 제거하고, THF로 세정하고 용매를 회전증발기 상에서 제거했다. 생성물을 칭량하고 DME에서 용해시켜 0.2 mM 용액을 만들었다.
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS에 대해, DCC (217　mg, 1.05　mmol)을 THF (5　ml) 중 Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-OH (487　mg, 1　mmol) 및 NHS (127　mg, 1.1　mmol)의 빙랭된 용액에 부가하고, 15 분 동안 교반하고 그 다음 20 ℃에서 10 시간 동안 교반했다. 워크업을 Fmoc-Gly-NHS에 대해 기재된 바와 같이 수행했다.
Fmoc-Phe-NHS에 대해, DCC (1.181　g, 5.72　mmol)을 DCM (50　ml) 중 Fmoc-Phe-OH (2.11　g, 5.45　mmol) 및 NHS (664　mg, 5.77　mmol)의 빙랭된 용액에 부가하고, 30 분 동안 교반하고, 그 다음 20 ℃에서 10 시간 동안 교반했다. 고형 DCU를 여과 제거하고 용매를 진공에서 제거했다.
Fmoc-Val-NHS에 대해, DCC (227　mg, 1.1　mmol)을 DCM (13　ml) 중 Fmoc-Val-OH (339　mg, 1　mmol) 및 NHS (127　mg, 1.1　mmol)의 빙랭된 용액에 부가하고, 30 분 동안 교반하고, 그 다음 20 ℃에서 16 시간 동안 교반했다. 고형 DCU를 여과 제거하고 용매를 진공에서 제거했다.
b) 아미노산 H-Asn(DMCP)-OH 및 H-Lys(MMT)-OH을 이용가능한 Fmoc-보호된 유도체 로부터 제조했다 (도 5B 참고).
H-Asn(DMCP)-OH. Fmoc-Asn(DMCP)-OH (576　mg, 1.32　mmol)을 DMF (9　ml)에서 Et3N (3.7　ml, 26.4　mmol)와 함께 15 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 에테르 (30　ml)로 3회 분쇄하고 진공에서 건조시켰다. 수율 271　mg (96%). MS: 643.6 [3M+1]+; 451.3 [2M+Na]+; 429.5 [2M+1] +; 236.7 [M+Na] +; 215.3 [M+1] +; 132.8 [M-DMCP+1] +.
H-Lys(MMT)-OH. Fmoc-Lys(MMT)-OH (4.902　g, 7.65　mmol)을 10 시간 동안 DMF (100　ml)에서 Et3N (32　ml, 30 당량, 229.4　mmol)와 함께 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 에테르로 2회 분쇄하고 진공에서 건조시켰다. 수율 3.1g (97%). MS (neg. mode): 455, 453.3 [M+Cl]-; 417.8 [M-1]-.
c) Fmoc-A1A2-OH의 합성. (도 5C.) Fmoc-GlyGly-OH 1a에 대해, 글리신 (75　mg, 1　mmol) 및 NaHCO3 (100　mg, 1.2　mmol)을 H2O (10　ml) 및 디메톡시에탄 (DME) (5　ml)에서 용해시켰다. DME (5　ml, 1　mmol) 중 Fmoc-Gly-NHS 용액을 부가했다. THF (2.5　ml)을 부가하고, 혼합물을 초음파처리하여 균질하게 만들고 20 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 H2O 중 EtOAc 및 5% KHCO3 용액으로 처리했다. 생성물을 EtOAc로 4회 추출하고, pH=3에서 염수로 세정하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수율 321　mg (90%). MS: 775.0 [2M +2Na]+; 377.4 [M+Na]+; 355.1 [M+1]+.
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-OH 1b에 대해, 글리신 (75　mg, 1　mmol) 및 NaHCO3 (84　mg, 1　mmol)을 H2O (2　ml), THF (4　ml) 및 DME(5　ml)의 혼합물에서 용해시켰다. DME (5　ml, 1　mmol) 중 Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS 용액을 부가하고 10 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 20 ml의 0.1M MES 버퍼 (pH=5)을 부가하고 그 다음 EtOAc (25　ml)을 부가했다. 반응 혼합물을 얼음 상에서 교반하고 KHSO4의 5% 용액으로 pH=5로 산성화했다. 생성물을 EtOAc로 4회 추출하고, 염수로 pH=5에서 린스하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수율 528　mg (96%). MS: 567 [M+Na]+; 562 [M+NH4]+; 545.0 [M+1]+; 427.1 [M-2PhiPr]+.
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-OH에 대해, 1c를, 1b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 Fmoc-Asn(DMCP)-NHS 및 H-Gly-OH 로부터 제조했다. 수율 96%. MS: 987.4 [2M+1] +; 516.3 [M+Na] +; 494.4 [M+1]+; 412.2 [M-DMCP+1] +.
Fmoc-PheLys(MMT)-OH에 대해, 1d를, 1b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 Fmoc-Phe-NHS 및 H-Lys(MMT)-OH 로부터 제조했다. 수율 94%. MS: 788.5 [M+1]+, 273.1 [M-MMT+1]+.
Fmoc-PheCit-OH 1e에 대해:
i) DME (40　ml) 중 Fmoc-Phe-NHS (4.96　g, 10.26　mmol)에 H2O (40　ml) 및 THF (20　ml)의 혼합물 중 L-시트룰린 (1.80　g, 10.26　mmol) 및 NaHCO3 (0.86　g, 10.26　mmol)를 함유하는 용액에 부가했다. 반응을 15 시간 동안 교반했다. 활성화로부터의 잔류 DCC를 여과하고 유기 용매를 회전증발기 상에서 제거했다. 잔류물에 H2O (100　ml) 및 iPrOH (10　ml)을 부가했다. 서스펜션을 5% KHSO4로 pH=3으로 산화화하고, 생성물을 EtOAc:iPrOH=9:1 용액 (3×, 500　ml)로 추출하고, 염수:iPrOH=9:1 (2×, 50　ml)의 혼합물로 세정하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고 농축하고, 오일 펌프로 건조시켰다. 에테르로 분쇄하여 순수한 생성물 1e를 얻었다. 수율 3.84　g (68%). MS: 545.6 [M+Na] +; 528.5 [M-H2O] +; 306.3 [M-Fmoc+H2O] +.
ii) THF (5　ml) 중 Fmoc-Phe-OPfp (553　mg, 1　mmol)의 용액을 H2O (2.6　ml) 중 H-Cit-OH (184　mg, 1.05　mmol) 및 NaHCO3 (88.2　mg, 1.05　mmol)의 용액에 부가했다. THF (2　ml)을 부가하여 용액을 균질하게 만들고 10 시간 동안 교반했다. THF를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 H2O (10　ml) 및 iPrOH (1　ml)로 희석하고 3% HCl로 pH=1로 산성화했다. 생성물을 EtOAc:iPrOH=9:1 용액으로 5회 추출하고, 염수:iPrOH=9:1 의 혼합물로 린스하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공에서 농축했다. 에테르로 분쇄하여 313　mg의 순수한 생성물 1e (57%)를 얻었다.
Fmoc-AlaCit-OH 1f를1e -(a)에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 Fmoc-Ala-NHS 및 H-Cit-OH로부터 제조했다. 수율 77%. MS: 959.8 [2M+Na]+; 938.1 [2M+1]+; 491.4 [M+Na]+; 469.9 [M+1]+.
조 Fmoc-ValCit-OH 1g를, 1b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 Fmoc-Val-NHS 및 H-Cit-OH로부터 제조했다. 최종 정제를 에테르에 의한 분쇄로 수행했다. 총 수율 76%. MS: 1060.3 [2M+3Na]+; 1015.7 [2M+Na]+; 519.7 [M+Na]+; 497.9 [M+1]+.
Fmoc-Ala-Asn(DMCP)-OH 1h를, 1b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 Fmoc-Ala-NHS 및 H-Asn(DMCP)-OH 로부터 제조했다. 수율 95%. MS: 530.2 [M+Na]+; 508.2 [M+1]+; 426.0 [M-DMCP+1]+.
p- 아미노벤질 알코올과의 커플링, Fmoc -AA-PABA 및 Fmoc -A-PABA 2a-m 의 제조.
생성물 1a-h를 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ)의 존재에서 p-아미노벤질 알코올 (PABA)과 커플링시켜 2a-h를 형성했다. 4개의 대표적인 3 j-l을, PABA 모이어티에 부착된 단 하나의 아미노산과 함께 또한 제조했다 (도 7A).
Fmoc-GlyGly-PABA 2a에 대해, DCM (17　ml) 및 MeOH (6　ml) 중 1a (318　mg, 0.9　mmol) 및 PABA (220　mg, 1.8　mmol)의 용액을 EEDQ (444　mg, 1.8　mmol)와 함께 10 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 Et2O로 분쇄하고 생성물을 여과 제거하고 진공에서 건조시켰다. 수율 348　mg (84%).
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-PABA 2b에 대해, DCM (10　ml) 중 1b (524　mg, 0.96　mmol) 및 PABA (142　mg, 1.55　mmol)의 용액을 EEDQ (357　mg, 1.44　mmol)과 함께 10 시간 동안 교반했다. 워크업을 2a에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 수행했다. 수율 462　mg (74%).
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-PABA 2c를 2a에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 제조했다. 수율 64%. MS: 621.5 [M+22]+; 599.3 [M+1]+.
Fmoc-PheLys(MMT)-PABA 2d를 2b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 제조했다. 수율 70 %.
Fmoc-PheCit-PABA 2e에 대해, DCM (150　ml) 및 MeOH (50　ml) 중 1e (5.98　g, 10.97　mmol) 및 PABA (2.70　g, 21.95　mmol)의 용액을 EEDQ (5.43　g, 21.95　mmol)으로 처리하고 15 시간 동안 교반했다. 워크업을 2a에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 수행했다. 수율 6.14　g (86%). MS: 650.7 [M+1]+; 527.3 [M-PABA+1]+.
Fmoc-AlaCit-PABA 2f에 대해, DCM (45　ml) 및 MeOH (15　ml) 중 1f (2.89　g, 6.17　mmol) 및 PABA (1.52　g, 12.34　mmol)의 용액을 EEDQ (3.05　g, 12.34　mmol)으로 처리하고 15 시간 동안 교반했다. 워크업을 2a에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 수행했다. 수율 4.56　g (74%). MS (ES, neg. mode): 307.4 [M-263.6-1]-; 349.9 [M-Fmoc-1]-; 610, 608.4 [M+HCl-1]-.
Fmoc-ValCit-PABA 2g를 2b에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 제조했다. (98%).
Fmoc-AlaAsn(DMCP)-PABA 2h를 2a에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 제조했다. 수율 59%. MS: 613.2 [M+1]+; 531.4 [M-DMCP+1]+; 408.2 [M-205+1]+.
Fmoc-Lys(CH3)2-PABA 2i에 대해, Fmoc-Lys(CH3)2-OH.HCl 염 (433　mg, 1mmol) 및 PABA (246　mg, 2　mmol)을 DCM (10　ml) 및 MeOH (1.5　ml)에서 용해시키고, 5 ℃로 냉각시키고 EEDQ (495　mg, 2　mmol)을 부가했다. 냉각욕을 제거하고 혼합물을 10 시간 동안 RT (실온)에서 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 Et2O로 분쇄하고, 조 생성물을 여과 제거했다. DCM (2　ml) 및 MeOH (1　ml)의 혼합물에서 재용해시키고 Et2O (40　ml)에 적가하여 다시 침전시켰다. 생성물을 여과하고 진공에서 건조시켰다. 수율 448　mg (83%).
Fmoc-Leu-PABA 2j에 대해, DCM (10　ml) 중 Fmoc-Leu-OH (353　mg, 1　mmol), EEDQ (495　mg, 2　mmol) 및 PABA (222　mg, 1.8　mmol)의 용액을 10 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 Et2O (40　ml)에서 용해시키고, 드라이아이스 상에서 2 시간 동안 냉각하고 고형물을 원심분리로 분리했다. 수득된 조 물질을 칼럼, CHCl3 중 MeOH (1-2%)의 용출물 구배 상에서 정제했다. 수율 444　mg (97%). MS: 459.4 [M+1]+.
Fmoc-Asn(DMCP)-PABA 2k를 2j에 대해 기재된 바와 같이 제조했다. DCM의 제거 후 칼럼 정제 대신의 워크업에서 잔류물을 Et2O로 분쇄하고, 0 ℃로 냉각하고 조 생성물을 여과 제거했다. 이러한 처리를 한 번 반복하고 그 다음 진공에서 건조시켰다. 수율 77%. MS: 542.5 [M+1]+.
Fmoc-Cit-PABA 2l에 대해, DCM (10　ml) 및 MeOH (4　ml) 중 Fmoc-Cit-OH (345.7　mg, 0.87　mmol) 및 PABA (214　mg, 1.74　mmol)의 용액을 EEDQ (430　mg, 1.74　mmol)으로 처리하고 15 시간 동안 교반했다. 고형 생성물을 에테르로 3회 분쇄하고, 생성물을 여과하고 건조시켰다. 수율 288　mg (67%). MS: 502.3 [M+1]+; 485.5 [M-H2O+1]+; 263 [M-Fmoc-H2O+1]+; 179.0 [M-306+1]+; 120.2 [M-365.3+1]+.
생성물 2m을 상이한 도식을 사용하여 제조했다: H-Lys(CH3)2-PABA 유도체 3 과 Fmoc-Phe-NHS와의 커플링 (도 7B).
Fmoc-PheLys(CH3)-PABA 2m에 대해, Fmoc-Lys(CH3)2 --PABA (2i) (448　mg, 0.83　mmol)은 DMF (11　ml) 중 Et3N (3.5　ml)과 함께 10 시간 동안 교반하여 탈보호된 Fmoc였다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하여 조 생성물 3i를 얻었다. 이러한 생성물을 DMF (7　ml)에서 용해시키고, Fmoc-Phe-NHS (482　mg, 0.996　mmol) 그 다음 DIEA (0.42　ml, 2.2　mmol)을 부가하고 혼합물을 10 시간 동안 교반했다. 용매를 DIEA와 함께 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하여 조 2m을 얻었고, 이것을 추가의 정제 없이 사용했다. MS: 549.4 [M+1]+.
H-AA-PABA 3a-h, m 및 H-A-PABA 3j-l 의 제조(도 7).
Fmoc-유도체 2a-h, j-l을 3i에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 DMF 중 Et3N으로 처리하고, 그 다음 농축하고 진공 건조시켰다. 조 생성물을 DMF에서 용해시켜 0.1 M 용액을 만들고 추가의 정제 없이 사용했다.
표 2. H-A1A2-PABA의 중간체 (1-3)
Figure pct00030
Figure pct00031
프로테아제 절단가능 PEG- 마스킹 시약의 제조.
H-AA-PABA 3b,e,g,h,j,k -m 중 어떤 것의 아미노 그룹을 PEG의 NHS 에스테르-산 (DIEA, DMF, 5-10h)로 아실화하여 22a-k를 얻었다. 그 다음 생성물 22a-k 중 하이드록실 그룹을 p-니트로페닐 카보네이트 ((PNP)2CO, 디옥산 또는 THF, 40-60 ℃, 10h)로 전환하여 23a-k를 얻었다. 23a,d,g에 대해, Asn 및 Glu로부터의 보호성 그룹을 수성 TFA (TFA/H2O=3:1, 5 ℃, 2-3h)에 의한 처리로 제거하여 원하는 생성물 24a-c를 얻었다.
PEGn-AA-PABA 22a-k의 제조 (도 9).
생성물 22a (n=11, AA=GluGly). DMF (3.5　ml, 0.35　mmol) 중3b의0.1M 용액을 10 시간 동안 PEG11-NHS 에스테르 (240　mg, 0.35　mmol) 및 DIEA (0.061　ml, 0.35　mmol)와 함께 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물: CHCl3:MeOH:AcOH=38:2:1 상에서 정제했다. 수율 274　mg (78%) MS: 1015.6 [M+NH4]+, 998.7 [M+1]+.
생성물 22b (n=11, AA=PheCit). DMF (3　ml) 중 3e (0.88　mmol) 및 DIEA (167　μl, 0.96　mmol)의 용액에 DMF (3　ml) 중 PEG11-NHS 에스테르 (0.80　mmol)의 용액을 부가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 조 물질을 CHCl3:MeOH (5　ml)로부터 Et2O (45　ml)로 침전시키고 칼럼, CHCl3중 MeOH (10-16%)의 용출물 구배 상에서 정제했다. 수율 420　mg (53%). MS: 1015.9 [M+H2O]+; 998.8 [M+1]+; 981.1 [M-H2O]+.
생성물 22c (n=11, AA=ValCit). 생성물 22f를, 22a에 대해 기재된 바와 같이 조 3g (로부터 수득됨 300　mg, 0.5　mmol의 2g), PEG11-NHS 에스테르 (298　mg, 0.435　mmol) 및 DIEA (0.09　ml, 0.522　mmol)로부터 제조했다. 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 농축 후 생성물을 MeOH:DCM=1:1 혼합물 (6　ml)에서 현탁시키고, 초음파처리하고, 여과하고 Et2O (50　ml)로 침전시켰다. 고형물을 분리하고 절차를 다시 반복했다. 잔류 용매를 진공에서 제거했다. 수율 283　mg (60%). MS: 951.5 [M+1]+.
생성물 22d (n=11, AA=AlaAsn(DMCP)). DMF (3　ml) 중 3h (0.56　mmol) 및 DIEA (116　μl, 0.67　mmol)의 용액에 DMF (3　ml) 중 PEG11-NHS 에스테르 (0.56　mmol)의 용액을 부가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5　ml)에서 용해시키고 냉각된 (0 ℃에서) Et2O (45　ml)로 침전시켰다. 고형물을 칼럼, DCM 중 MeOH (3-14%)의 용출물 구배 상에서 정제했다. 수율 261　mg (49%). MS: 983.7 [M+Na]+; 979.1 [M+NH4]+; 961.8 [M+1]+; 943.9 [M-H2O+1]+.
생성물 22e (n=11, AA=PheLys(Me2)). 생성물 22e를 22a에 대해 기재된 바와 같이 제조했다. 정제를 하기를 사용하여 수행했다: HPLC 칼럼 Nucleodur C-18, 250 × 4.6, 용출물 ACN-H2O (0.1% TFA), 램프 15-30%. MS: 998.1 [M+1]+. 단리된 생성물을 하기 상에서 탈염했다: Dowex 1×8 수지, 용출물 H2O. 수율 40%.
생성물 22f (n=11, AA=Leu). 생성물 22f를 22a에 대해 기재된 바와 같이 제조하고 칼럼, 용출물: CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH=9:7:2:0.04 상에서 정제했다. 수율 48%. MS: 824.9 [M+NH4]+.
생성물 22g (n=11, AA=Asn(DMCP). 조 3k (419　mg, 0.77　mmol의 2k 로부터 수득됨), Peg11NHS 에스테르 (200　mg, 0.292　mmol) 및 DIEA (0.06　ml, 0.35　mmol)을 DCM (5　ml)에서 10 시간 동안 교반했다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH AcOH=4.5:3.5:1:0.02 상에서 정제했다. 수율 254　mg (37%). MS: 891.1 [M+1]+.
생성물 22h (n=11 AA=Cit). DMF (2.5　ml) 중 3l (0.50　mmol) 및 DIEA (104　μl, 0.60　mmol)의 용액에 DMF (2.5　ml) 중 PEG11-NHS 에스테르 (0.50　mmol)의 용액을 부가했다. 혼합물 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5　ml)에서 용해시키고 Et2O (45　ml)로 침전시켰다. 침전을 2회 더 반복하고 생성물을 추가의 정제 없이 사용했다. 수율 340　mg (80%). MS: 869.4 [M+NH4]+; 851.9 [M+1]+.
생성물 22i (n=23, AA=PheCit). DMF (3　ml) 중 3e (0.72　mmol) 및 DIEA (130　μl, 0.74　mmol)의 용액에 DMF (3　ml) 중 PEG23-NHS 에스테르 (0.60　mmol)의 용액을 부가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5　ml)에서 용해시키고 Et2O (45　ml)로 침전시켰다. 고형 생성물을 칼럼, CHCl3 중 MeOH (7-12%)의 용출물 구배 상에서 정제했다. 수율 487　mg (53%). MS: 1555.2 [M+Na]+; 1544.7 [M+NH4]+;1527.7 [M+1]+.
생성물 22j (평균 MW 1000를 갖는 PEG. AA=PheCit). mPEG-1000-알코올 (Fluka) (0.173g, 0.173　mmol), N,N-디석신이미딜 카보네이트 (62　mg, 0.242　mmol), 및 TEA (0.101　ml, 0.726　mmol)의 혼합물을 MeCN (1　ml)에서 16 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고 조 잔류물을 CHCl3 (10　ml)에서 용해시켰다. 유기 층을 H2O (1　ml, pH=5), 그 다음 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하여 PEG-1000-NHS 카보네이트를 얻었다. 이러한 생성물을 16 시간 동안 DMF (1　ml) 중 3e (0.121　mmol) 및 DIEA (30　μl, 0.173　mmol)와 함께 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5　ml)에서 용해시키고 Et2O (45　ml)로 침전시켰다. 침전을 2회 더 반복하고 생성물을 추가의 정제 없이 사용했다. 수율 134　mg (79%).
생성물 22k (n=23, AA=ValCit). DMF (4　ml) 중 3g (1.0　mmol) 및 DIEA (183　μl, 1.04　mmol)의 용액에 DMF (4　ml) 중 PEG23-NHS 에스테르 (0.87　mmol)의 용액을 부가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거했다. 잔류물을 CHCl3:MeOH=1:1 혼합물 (5　ml)에서 용해시키고 Et2O (45　ml)로 침전시켰다. 침전을 2회 더 반복하고 생성물을 추가의 정제 없이 사용했다. 수율 1.0　g (77%). MS: 1496.1 [M+NH4]+;1479.3 [M+1]+.
PEG-AA-PABC-PNP 23a-k (도 10A)
생성물 23a (n=11, AA=Glu(2PhiPr)Gly)에 대해, DCM (15　ml) 중 생성물 22a (274　mg, 0.274　mmol)을 어둠 속에서 (PNP)2CO (418　mg, 1.372　mmol) 및 DIEA (0.143　ml, 0.823　mmol)와 함께 15 시간 동안 교반했다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물 4% MeOH, CHCl3 중 0.2%AcOH 상에서 정제했다. 수율 260　mg (81%). MS: 1180.7 [M+NH4]+ .
생성물 23b (n=11, AA=PheCit)에 대해, 디옥산 (4　ml) 중 22b (419　mg, 0.42　mmol), (PNP)2CO (766　mg, 2.52　mmol) 및 DIEA (263　μl, 1.52　mmol)의 용액을 어둠 속에서 50 ℃에서 15 시간 동안 교반하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거했다. 잔류 DIEA를 DMF의 2 번의 연속적인 증발로 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 그 다음 CHCl3:MeOH (9:1) 상에서 정제했다. 수율 390　mg (80%). MS: 1181.2 [M+NH4]+,1164.2 [M+1]+.
생성물 23c (n=11, AA=ValCit)에 대해, 1,4-디옥산 (22　ml) 중 22c (273　mg, 0.287　mmol), (PNP)2CO (874　mg, 2.88　mmol) 및 DIEA (0.3　ml, 1.72　mmol)의 용액을 어둠 속에서 24 시간 동안 50 ℃에서 교반했다. 용매를 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물: CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1 그 다음 CHCl3 중 12-15% MeOH 상에서 정제했다. 수율 163　mg (51%). MS: 1116.0 [M+1]+.
생성물 23d (n=11, AA=AlaAsn(DMCP))를 23b의 제조에서 기재된 바와 같이 제조했다. 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH (9:2:1) 상에서 정제했다. 수율 77%. MS: 1144.0 [M+NH4]+; 1127.3 [M+1]+.
생성물 23e (n=11, AA=PheLys(Me)2)를 23a에 대해 기재된 바와 같이 제조하고 칼럼, 용출물: 10% MeOH, CHCl3 중 0.2%AcOH 상에서 정제했다. 수율 63%. MS: 1163.1 [M+1]+ .
생성물 23f (n=11, AA=Leu)를, 24 시간 동안 가열하면서 5　당량의 (PNP)2CO 및 3 당량의 DIEA만을 사용하여 23c에 대해 기재된 바와 같이 제조했다. 생성물을 칼럼, CHCl3 중 MeOH (7-12%)의 용출물 구배 상에서 정제했다. 수율 75%. MS: 972 [M+1]+.
생성물 23g (n=11, AA=Asn(DMCP))를 23f에 대해 기재된 바와 같이 제조하고 조 생성물을 추가 정제 없이 하기의 단계에서 사용했다. MS: 1073.4 [M+18]+.
생성물 23h (n=11, AA=Cit)에 대해, DCM (4　ml) 중 22h (340　mg, 0.40　mmol), (PNP)2CO (608　mg, 2.00　mmol) 및 DIEA (208　μl, 1.20　mmol)의 용액을 어둠 속에서 30 ℃에서 15 시간 동안 교반하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거했다. 잔류 DIEA를 DMF의 2 번의 연속적인 증발로 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH (7:2.5:0.5) 그 다음 CHCl3 중 MeOH (8-14%)의 구배 상에서 정제했다. 수율 390　mg (80%). MS: 1034.3 [M+NH4]+; 1016.9 [M+1]+.
생성물 23i (n=23, AA=PheCit)를 23b의 제조에서 기재된 바와 같이 제조하고 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 그 다음 CHCl3 중 MeOH (6-12%)의 구배 상에서 정제했다. 수율 86%. MS: 1711.4 [M+NH4]+; 1694.4 [M+1]+.
생성물 23j (PEG 1000K AA=PheCit)를 23b의 제조에서 기재된 바와 같이 제조하고 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH (4.5:5:0.5) 그 다음 CHCl3중 MeOH (6-12%)의 구배 상에서 정제했다. 수율 72%.
생성물 23k (n=23, AA=ValCit)를 23b의 제조에서 기재된 바와 같이 제조하고, 생성물을 HPLC으로 정제했다. 칼럼: Luna (Phenomenex) 5u, C-8, 100 A. 이동상: ACN-H2O (F3CO2H 0.01%), ACN 구배 30-37%, 31 분. 수율: 530　mg (48%). MS: 1666.4 [M+Na]+;1644.2 [M+1]+.
PEG-AA-PABC-PNP 24a-c, AA 탈보호 (도 10B).
생성물 24a (n=11, AA=GluGly). 생성물 23a (250　mg, 0.215　mmol)을 CHCl3 (16　ml)의3% TFA 용액에서 35 분 동안 교반하고, 회전증발기 상에서 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수율 224　mg (100%) (MS: 1062.6 [M+NH4]+ .; 1045.9 [M+1]+.
생성물 24b (n=11, AA=AlaAsn-PABC-PNP). 화합물 23d를 1.5 시간 동안 TFA:DCM (3:1)의 혼합물에서 교반하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 20 ℃에서 제거했다. 생성물을 CHCl3중 MeOH (6-12%)의 용출물 구배를 이용하는 칼럼 상에서 정제했다. 수율 30%. MS: 1066.7 [M+Na]+, 1062.0 [M+NH4]+; 1045.2 [M+1]+.
생성물 24c (n=11, AA=Asn). 23g (160　mg, 0.143　mmol)를 가지고 있는 반응 플라스크를 0 ℃로 냉각하고 TFA:H2O (9:1) (12.5　ml)의 차가운 혼합물을 부가했다. 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하고 차가운 H2O (50　ml)로 희석했다. 교반을 20 분 동안 20 ℃에서 계속했다. 침전물을 여과 제거하고 H2O로 린스했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃에서 제거하고 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH= 4.5:3.5:1.2:0.02상에서 정제했다. 수율 43　mg (30%). MS: 974.0 [M+1]+.
표 3. 콘주게이트 제조를 위해 사용된 최종 PEG-L-A1A2-PABC.
Figure pct00032
실시예 2. 합성 또는 RGD 리간드.
A. RGD -PEG- 티오에이트 :
1.RGD 모방체 #1-PEG8-티오에이트, MW 982.1.
Figure pct00033
2. RGD 모방체 #2-PEG8-티오에이트, MW 1022.2.
Figure pct00034
3. RGD 모방체 #3-PEG8-티오에이트, MW 1080.2.
Figure pct00035
4. RGD 모방체 #3-PEG12-티오에이트, MW 1212.4.
Figure pct00036
B. RGD - HyNic :
1. RGD 모방체 #1-PEG12-HyNic, MW 1272.
Figure pct00037
2. RGD 모방체 #1a-HyNic, MW 802.8.
Figure pct00038
3. RGD 모방체 #1b-HyNic, MW 830.9 (RGD ).
Figure pct00039
C. RGE - PEG 12 - HyNic (대조). MW 1282.
Figure pct00040
D. RGD 펩타이드 - HyNic : RGD4C, [NH2­ACDCRGDCFCG-Lys(e-6-HyNic); SEQ ID 5], MW 1407.83.
Figure pct00041
실시예 3. 양친매성 막 활성 폴리아민의 가역적 개질. 프로테아제 절단가능한 마스킹제의 아민-함유 폴리머로의 연결 - p-아실아미도벤질 카바메이트 연결 형성.
A. RGD -PEG- 티오에이트 .
Cy3-표지된 폴리머를 실온에서 1시간 동안 100 mM HEPES pH 9.0 완충제 중에서 원하는 비로 SPDP-PEG24-FCit-파라-니트로페놀과 합하였다. 그 후, SPDP-PEG24-FCit-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:8 (폴리머:PEG12-FCit)의 중량 비로 PEG12-FCit와 반응시켰다. 그 후, 개질된 폴리머를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
Figure pct00042
RGD-PEG-티오에이트 모방체를 2 시간 동안 실온에서 PBS pH 7.4 중에서 1:5 (RGD-PEG-티오에이트 모방체:하이드록실아민) 몰 비로 하이드록실아민을 사용하여 탈아세틸화하였다.
개질된 폴리머를 최소 4 시간 동안 실온에서 PBS pH 7.4 중에서 1:1 (폴리머:RGD)의 중량 비로 탈아세틸화된 RGD-PEG-티오에이트 모방체와 조합시켜서 폴리머 RGD 콘주게이트를 형성시켰다. 상기 폴리머-RGD 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
콘주게이션 효율을, 피리딘 2-티온에 대한 8.08×103 M- 1 cm-1의 소멸 계수를 사용하여 343 nm에서 폴리머-RGD 콘주게이트의 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다.
Figure pct00043
폴리머-RGD 콘주게이트를 등장성 글루코오스 용액을 사용하여 원하는 농도로 희석시켰다.
Figure pct00044
B. RGD -PEG- HyNic .
Cy3-표지된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES pH 9.0 완충제 중에서 원하는 비로 알데하이드-PEG12 /24-TFP (Quanta Biodesign #10082)와 합하였다. 그 후, 알데하이드-PEG12 /24-TFP-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:8 (폴리머:PEG12-FCit)의 중량 비에서 PEG12-FCit와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
Figure pct00045
개질된 폴리머를 최소 4 시간 동안 실온에서 50 mM MES, pH 5.0 완충제 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD)의 중량 비로 RGD-HyNic 모방체와 합하여 폴리머 RGD 콘주게이트를 형성시켰다. 상기 폴리머-RGD 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
콘주게이션 효율을, 비스-아릴 하이드라존 결합에 대한 2.9×101 M- 1 cm-1의 소멸 계수를 사용하여 354 nm에서 폴리머-RGD 콘주게이트의 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다.
Figure pct00046
폴리머-RGD 콘주게이트를 등장성 글루코오스 용액을 사용하여 원하는 농도로 희석시켰다.
Figure pct00047
실시예 4. PEG 프로테아제 절단가능한 마스킹제를 사용한 폴리아민의 개질.
p-아실아미도벤질 알코올 유도체의 활성화된 (아민 반응성) 카보네이트를 pH > 8에서 H2O 중의 양친매성 막 활성 폴리아민의 아미노 그룹과 반응시켜서 p-아실아미도벤질 카바메이트를 생성시켰다.
Figure pct00048
R1는 PEG를 포함하고,
R2는 양친매성 막 활성 폴리아민이고,
AA는 (보호 또는 비보호된) 디펩타이드이고,
Z는 아민-반응성 카보네이트이다.
× mg 폴리머에 등장성 글루코오스 중의 12× mg의 HEPES 유리 염기를 첨가한다. 완충된 폴리머 용액에 DMF 중의 2× 내지 16× mg 200 mg/ml 디펩타이드 마스킹제를 첨가한다. 일부 응용예에서는, 폴리머를 2× mg 디펩타이드 마스킹제를 사용하여 개질시킨 후에 siRNA를 부착시킨다. 그 후, 상기 폴리머-siRNA 콘주게이트를 6× 내지 8× mg 디펩타이드 마스킹제를 사용하여 추가로 개질시킨다.
실시예 5. 콘주게이트 제형.
A. RGD-PEG-티오에이트 및 PEG-디펩타이드 마스킹제를 사용한 siRNA 전달 콘주게이트의 형성.
명시된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 5 mM HEPES, pH 8.0 완충제 중에서 1:0.015 (폴리머:SMPT)의 중량 비로 SMPT와 반응시켰다.
그 후, SMPT-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 원하는 비로 SPDP-PEG24-FCit와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:2 (폴리머:PEG12-FCit)의 중량 비로 PEG12-FCit와 반응시켰다. 그 후, 개질된 폴리머를 실온에서 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:SATA-siRNA)의 중량 비로 SATA-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG12-FCit)의 중량 비로 PEG12-FCit와 반응시켰다. 생성된 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
탈아세틸화된 RGD-PEG-티오에이트를, 최소 4 시간 동안 실온에서 PBS pH 7.4 중에서 1:1 (폴리머:RGD-PEG-티올)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 개질된 폴리머에 접합시켜서 RGD-콘주게이트를 형성시켰다. 상기 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다. RGD 표적화 리간드 콘주게이션 효율을 상기와 같이 측정하고, 42K 비개질된 폴리머 당 3.5 및 21 RGD 리간드인 것으로 확인하였다.
B. RGD-PEG-HyNic 및 PEG-디펩타이드 마스킹제를 사용한 siRNA 전달 콘주게이트의 형성.
1) 프로토콜 1. 명시된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 5 mM HEPES, pH 8.0 완충제 중에서 1:0.015 (폴리머:SMPT)의 중량 비로 SMPT와 반응시켰다.
그 후, SMPT-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 원하는 비로 알데하이드-PEG-디펩타이드 마스킹제 (알데하이드-PEG12-FCit 또는 알데하이드-PEG24-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:2 (폴리머:PEG)의 중량 비로 PEG12-디펩타이드 마스킹제 (PEG12-FCit, PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 개질된 폴리머를 실온에서 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:SATA-siRNA)의 중량 비로 SATA-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG)의 중량 비로 프로테아제 절단가능한 PEG (PEG12-FCit 또는 PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다. 생성된 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다.
RGD-HyNic (실시예 2B)을, 실온에서 최소 4 시간 동안 50 mM MES, pH 5.0 완충제 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD-HyNic 모방체)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 상기 개질된 폴리머에 부착시켜서 완전한 전달 콘주게이트를 형성시켰다. 상기 콘주게이트를 세파덱스 G-50 스핀 칼럼을 사용하여 정제하였다. RGD 리간드 부착 효율을 상기와 같이 측정하였다.
2) 프로토콜 2. 명시된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 5 mM HEPES, pH 8.0 완충제 중에서 1:0.015 (폴리머:SMPT)의 중량 비로 SMPT와 반응시켰다.
그 후, SMPT-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.5 (폴리머:PEG)의 중량 비로 알데하이드-PEG-디펩타이드 마스킹제 (알데하이드-PEG24-ACit)와, 및 1:2 (폴리머:PEG)의 중량 비로 PEG-디펩타이드 마스킹제 (PEG12-FCit, PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:SATA-siRNA)의 중량 비로 SATA-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 100 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG)의 중량 비로 프로테아제 절단가능한-PEG (PEG12-FCit 또는 PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다.
RGD-HyNic (실시예 2B)을, 실온에서 밤새 69 mM 염화수소 용액 (HCl) 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD-HyNic)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 개질된 폴리머에 부착시켜서 완전한 콘주게이트를 형성시켰다. RGD 리간드 부착 효율을 상기와 같이 측정하였다.
3) 프로토콜 3. 명시된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 5 mM HEPES, pH 8.0 완충제 중에서 1:0.015 (폴리머:SMPT)의 중량 비로 SMPT와 반응시켰다.
그 후, SMPT-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.5 (폴리머:PEG)의 중량 비로 알데하이드-PEG-디펩타이드 마스킹제 (알데하이드-PEG24-ACit)와, 및 1:2 (폴리머:PEG)의 중량 비로 PEG-디펩타이드 마스킹제 (PEG12-FCit, PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:SATA-siRNA)의 중량 비로 SATA-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG)의 중량 비로 프로테아제 절단가능한-PEG (PEG12-FCit 또는 PEG12-ACit 또는 PEG24-ACit)와 반응시켰다.
RGD-HyNic (실시예 2B)을, 실온에서 밤새 100 mM MES 유리 산 용액 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD-HyNic 모방체)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 개질된 폴리머에 부착시켜서 완전한 전달 콘주게이트를 형성시켰다. RGD 표적화 리간드 콘주게이션 효율을 상기와 같이 측정하였다.
4) 프로토콜 4. 명시된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 5 mM HEPES, pH 8.0 완충제 중에서 1:0.015 (폴리머:아지도)의 중량 비로 아지도-PEG4-NHS와 반응시켰다.
그 후, 아지도-개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.5 (폴리머:PEG)의 중량 비로 알데하이드-PEG-디펩타이드 마스킹제 (알데하이드-PEG24-ACit)와, 및 1:2 (폴리머:PEG)의 중량 비로 PEG-디펩타이드 마스킹제 (PEG12-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:알킨-siRNA)의 중량 비로 알킨-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG)의 중량 비로 프로테아제 절단가능한-PEG (PEG12-ACit)와 반응시켰다.
RGD-HyNic (실시예 2B)을, 실온에서 밤새 100 mM 나트륨 아세테이트-아세트산 완충 용액, pH 5.0 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD-HyNic 모방체)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 개질된 폴리머에 부착시켜서 완전한 전달 콘주게이트를 형성시켰다. RGD 표적화 리간드 콘주게이션 효율을 상기와 같이 측정하였다.
5) 프로토콜 5. 모노 아자이드-폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.5 (폴리머:PEG)의 중량 비로 알데하이드-PEG-디펩타이드 마스킹제 (알데하이드-PEG24-ACit)와, 및 1:2 (폴리머:PEG)의 중량 비로 PEG-디펩타이드 마스킹제 (PEG12-ACit)와 반응시켰다. 그 후, 상기 개질된 폴리머를 실온에서 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:0.2 (폴리머:알킨-siRNA)의 중량 비로 알킨-siRNA와 밤새 반응시켜서 siRNA를 부착시켰다. 다음으로, 개질된 폴리머를 실온에서 1 시간 동안 50 mM HEPES, pH 9.0 완충제 중에서 1:6 (폴리머:PEG)의 중량 비로 프로테아제 절단가능한-PEG (PEG12-ACit)와 반응시켰다.
RGD-HyNic (실시예 2B)을 실온에서 밤새 100 mM 나트륨 아세테이트-아세트산 완충 용액, pH 5.0 중에서 1:0.7 (폴리머:RGD-HyNic 모방체)의 중량 비로 개질된 폴리머와 반응시킴으로써 개질된 폴리머에 부착시켜서 완전한 전달 콘주게이트를 형성시켰다. RGD 표적화 리간드 콘주게이션 효율을 상기와 같이 측정하였다.
실시예 6. 시험관내 세포 결합. 2 ml의 50,000/ml에서의 종양 세포를 24 시간 동안 6-웰 플레이트 내 유리 커버슬립 상에 파종하였다. 5 μg/ml Cy3-표지된 RGD-PEG-티오에이트 또는 Cy3-표지된 RGD-PEG-HyNic (프로토콜 1-5) 개질된 폴리머 (50 μl의 0.2 mg/ml, RGD-PEG, RGD #1)를 세포에 적가하고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2× 세정하고, 10% 포르말린 용액 중에서 또는 30 분 동안 고정시켰다. 고정 후에, 세포를 PBS로 2× 세정하였다.
세포를 20분 동안 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 팔로이딘 (2 유닛/ml) 및 토프로(ToPro)-3 아이오다이드 (0.2 μM)를 사용하여 염색시켜서 각각 액틴 및 핵을 염색시켰다; 그 다음 PBS로 2× 세정하였다. 커버슬립을 벡타쉴드(Vectashield) 봉입제(mounting medium)와 함께 슬라이드에 놓은 다음, 자이스(Zeiss) LSM 710 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 형광 신호를 포착하였다. RDG-개질된 폴리아민의 세포 흡수를 세포내 Cy3 형광의 존재에 의해 측정하였다. 다양한 유형의 종양 세포 내 Cy3 신호 세기가 하기 표 4에 요약되어 있다 (5: 최고; 1: 최저).
표 4. RDG-개질된 폴리아민의 종양 세포 흡수
Figure pct00049
Figure pct00050
실시예 7. 생체내 종양 추적. 등장성 글루코오스 100-200 μg (0.5 또는 1 mg/ml 200 μl) 중의 Cy3-표지된 RGD(티올-RGD #1)/PEG-개질된 Lau 1005-116C-1 (54% 에틸에톡시아민 아크릴레이트/46% 부틸 아크릴레이트 RAFT 코-폴리머, 분획 1, 104 k 보호된 MW, 76 k 탈보호된 MW, 1.2 PDI)를, 꼬리 정맥 투여를 통하여 인간 종양 이종이식편 함유 면역결핍 마우스 내로 주사하였다. 주사 후 4 시간에 동물을 희생시키고, 종양을 수확하였다. 최소 4시간 동안 10% 포르말린 용액 중에서 인큐베이션시켜서 종양 전체를 고정시켰다. 그 후, 종양을 밤새 또는 평형화될 때까지 30% 수크로오스 용액 내로 액침시켰다. 포화된 종양을 액체 질소 중에서 순간 냉동시키고, 유리 슬라이드 (VWR 수퍼프로스트(superfrost) 플러스 마이크로 슬라이드) 상에서 7 μm 슬라이스로 동결절단시켰다. 그 후, 절편을 실온에서 20 분 동안 알렉사 플루오르 488 팔로이딘 (2 유닛/ml) 및 토프로-3 아이오다이드 (0.2 μM)를 사용하여 염색시켰다. 염색 후에, 절편을 PBS로 2× 세정하고, 벡타쉴드 봉입제를 사용하여 맨 위에 커버슬립과 함께 놓고, 자이스 LSM 710 레이저 스캐닝 레이저 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였다. Cy3 형광의 조직 및 세포성 분포를 확인하기 위해 대표적인 이미지를 취하였다. A498 종양 모델에서, 종양 이식 (피하, 간, 또는 신장) 위치와는 상관없이, RGD-개질된 폴리머를 종양 조직 내 깊이 침투시키고, 종양 세포를 유입시켰다. 대조 폴리머 (RGD가 없거나 (PEG 단독) RGE-개질된)는 종양 세포로 유입되지 않고 주로 맥관구조 중에 남아있었다. 간 이식된 HepG2 종양 모델에서는, 종양 조직 내로의 강한 RGD-콘주게이트 침투가 관찰되었다.
실시예 8. 생체내 종양 mRNA 녹다운. 등장성 글루코오스 (500 μg; 300 μl의 1.67 mg/ml) 중의 RGD-표적화 콘주게이트를, 꼬리 정맥 투여를 통하여 인간 종양 이종이식편 보유 면역결핍 마우스 내로 주사하였다. 주사 후 72 시간에 동물을 희생시키고 종양을 수확하였다. 종양 조직을 Tri 시약 (Molecular Research Center) 중에서 균질화시켜서 전체 RNA를 단리하였다. 정량적 RT-PCR을 사용하여 상대 mRNA 녹다운을 측정하였다.
실시예 9. 동소이식 신장 세포 암종 ( RCC ) 종양 마우스 모델. A498 세포 (ATCC)를 10% FBS (Invitrogen)가 보충된 MEM (Invitrogen) 중에서 성장시켰다. 786-O RCC 세포 (ATCC)를 10% FBS가 보강된 RPMI (Invitrogen) 및 1× MEM 비-필수 아미노산 용액 (Invitrogen) 중에서 성장시켰다. 세포를 수집하고, 계수하고, 얼음 상에서 매트리겔 매트릭스 HC (BD Biosciences, 30 용적 %)와 혼합시켰다.
암컷 무흉선 누드 마우스를 ~3% 이소플루란으로 마취시키고 우측 측면으로 누운(decubitus) 위치로 놓았다. 좌측 옆구리에 작은 0.5-1cm의 세로 복부 절개를 행하였다. 축축한 면봉을 사용하여, 좌측 신장을 복막 밖으로 꺼내고 천천히 안정화시켰다. 주사 직전에, 1.0 ml 주사기에 세포/매트리겔 혼합물을 채우고, 27 게이지 바늘 카테터를 주사기 끝에 부착시켰다. 그 후, 상기 채워진 주사기를 주사기 펌프 (Harvard Apparatus, 모델 PHD2000)에 부착시키고, 자극하여(primed) 공기를 제거하였다. 그 후, 주사기에 부착된 27-게이지 바늘 카테터 끝을 미부(caudal pole) 근처의 신장 피막 바로 아래로 삽입시킨 다음, 바늘 끝을 상기 피막 3-4 mm를 따라 머리쪽으로(cranially) 천천히 진행시켰다. 약 200,000개 세포를 함유하는 10 μl 분취량의 2.5:1 (용적:용적) 세포/매트리겔 혼합물을, 주사기 펌프를 사용하여 신장 실질 내로 천천히 주사하였다. 바늘을 신장에 15-20 초 동안 남겨두어서 주사가 완료되게 하였다. 그 후, 바늘을 신장으로부터 제거하고, 면봉을 30초 동안 주사 위치 위에 두어서 세포 유출 또는 출혈이 방지되게 하였다. 그 후, 신장을 복부 내로 다시 천천히 위치시키고, 복벽을 닫았다. 이식하고 3주 후에, 안락사 후 시각적 조사 및 측정에 의해서 종양 진행을 평가하였다. 대부분의 연구에 대해서, 종양 측정치가 전형적으로 약 4-8 mm이 되는 이식 후 5-6주 동안, 종양 마우스가 사용되었다.
실시예 10. 피하 ( SQ ) 종양. SQ 종양 이식을 위해, 3% 이소플루란을 함유하는 유도 챔버에 마우스를 위치시켜서 마취를 유도하였다. 일단 마취되면, 마우스를 드레이프 위에 위치시키고 노즈 콘(nose cone)을 통하여 3% 이소플루란 마취제를 보충하였다. 마우스를 그 측면 (우측 또는 좌측)으로 위치시키고, 반대편 옆구리 내로 주사를 수행하였다. 주사 직전에, 1.0 ml 주사기를 세포/매트리겔 혼합물로 채우고, 27 게이지 바늘 카테터를 주사기 끝에 부착시켰다. 그 후, 상기 채워진 주사기를 주사기 펌프 (Harvard Apparatus, 모델 PHD2000)에 부착시키고, 자극하여 공기를 제거하였다. 바늘을 피부 층 바로 아래의 옆구리에 삽입시키고, 세포 (10 μl 또는 20 μl)를 분 당 250 μl의 속도에서 주사하였다. 주사 후에, 바늘을 제거하고, 회복용 케이지 아래 위치한 워터 재킷화 가열 패드(water jacketed heating pad)에 의해 열이 제공되는 회복용 케이지에 마우스를 위치시켰다. 일단 동물이 정상 수준의 활성을 회복하게 되면 동물을 그 수용 선반(housing rack)으로 복귀시켰다.
실시예 11. 간 종양 모델. HepG2 세포를 2개 발현 벡터, 즉 pMIR85 인간 태반 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 벡터 및 pMIR3 네오마이신/카나마이신-내성 유전자 벡터로 공동 감염시켜서, 안정한 SEAP 발현을 갖는 세포 주를 발육시켰다. 세포를 10% FBS 및 300 μg/ml G418이 보충된 DMEM 중에서 성장시켰다. HT-29 결장 암종 세포를 10% FBS가 보충된 맥코이 5A 배지 중에서 성장시켰다. 종양 이식을 위해, 세포를 수집하고, 계수하고, 매트리겔 (BD Biosciences, 40 용적 %)과 혼합시켰다. 무흉선 누드 마우스를 ~3% 이소플루란으로 마취시키고, 흉골 가로누운 위치로 놓았다. 칼돌기 바로 아래에서 작은 1-2 cm의 정중선 복부 절개를 행하였다. 축축한 면봉을 사용하여, 간 좌엽을 천천히 몸 밖으로 꺼냈다. 간 좌엽이 천천히 수축되었고, 주사기 바늘을 상기 좌엽 중간 내로 삽입시켰다. 주사 직전에, 1.0 ml 주사기를 세포/매트리겔 혼합물로 채우고, 27 게이지 바늘 카테터를 주사기 끝에 부착하였다. 그 후, 상기 채워진 주사기를 주사기 펌프 (Harvard Apparatus, 모델 PHD2000)에 부착시키고, 자극하여 공기를 제거하였다. 주사기 바늘을, 간 피막 바로 아래 약 0.5 cm에 경사(bevel)지게 삽입시켰다. 10 μl의, 100,000개 세포를 함유하는 세포/매트리겔 혼합물을 주사기 펌프를 사용하여 간 내로 주사하였다. 바늘을 15-20 초 동안 간에 머무르게 하여 주사가 완료되게 하였다. 그 후, 바늘을 간으로부터 제거하고, 면봉을 주사 위치 위에 두어서 세포 유출 또는 출혈이 방지되게 하였다. 상기 매트리겔/세포 혼합물은 확인가능한 덩어리를 형성시켰는데, 이것은 바늘 제거 후에 사라지지 않았다. 그 후, 간 엽을 복부 내로 다시 천천히 위치시키고, 복벽을 닫았다. HepG2 종양 마우스에 대해, 종양 이식 후에 매주 1회 혈청을 수집하고, 여기에 SEAP 분석을 실시하여 종양 성장을 모니터하였다. 대부분의 연구에 대해서는, 종양 측정치가 SEAP 값을 기반으로 대략 4-8 mm인 것으로 예상되는 이식 후 4-5 주 동안, 종양 마우스가 사용되었다. HT-29 종양 마우스에 대해서는, 이력 관찰을 기초로, 종양이 전형적으로 길이 및 폭에서 4-8 mm에 도달하는 이식 후 5-6 주 동안, 종양 마우스가 사용되었다.
실시예 12. 정량적 실시간 PCR 분석. 정량적 PCR을 준비하는 중에, 제조자의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 트리리전트(TriReagent) (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) 중에서 균질화된 조직 샘플로부터 단리하였다. 대략 500 ng RNA를 고용량 cDNA 역 전사 키트 (Life Technologies)를 사용하여 역-전사시켰다. 인간 (종양) Aha1 발현을 위해서는, 인간 Aha1 (분석 ID: Hs00201602_m1) 및 CycA (Part#: 4326316E)에 대한 사전 제작된 TaqMan 유전자 발현 분석을, TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 (Life Technologies) 또는 VeriQuest 프로브 마스터 믹스 (Affymetrix)를 사용하여 바이플렉스(biplex) 반응에서 3회 사용하였다. 인간 (종양) EG5 발현을 위해서는, 인간 EG5 (분석 ID: Hs00189698_m1) 및 CycA (Part#: 4326316E)에 대한 사전 제작된 TaqMan 유전자 발현 분석을, TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 (Life Technologies) 또는 VeriQuest 프로브 마스터 믹스 (Affymetrix)를 사용하여 바이플렉스 반응에서 3회 사용하였다. 7500 패스트(Fast) 또는 스텝원플러스(StepOnePlus) 실시간 PCR 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. ΔΔCT 방법을 사용하여 상대적인 유전자 발현을 계산하였다.
실시예 13. 생체 내에서 신장 세포 암종 종양 유전자의 녹다운. RGD 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트를 RGD 모방체 #1-PEG-티오에이트 또는 RGD 모방체 #1-PEG-HyNic를 사용하여 형성시켰다. 500 μg Lau 41648-106 폴리머를, 8× PEG12-FCit/0.5× 알데하이드-PEG24-FCit (프로토콜 #1을 사용하는 RGD 모방체 #1-PEG-HyNic를 갖는) 또는 SPDP-PEG24-FCit (RGD-PEG-티오에이트를 갖는) 및 100 μg Aha1 siRNA를 사용하여 개질시켰다. 신장 RCC 종양 함유 마우스를 기재된 바와 같이 생성시키고, Aha1 콘주게이트의 단일 꼬리 정맥 주사로 처리하였다. 주사 후 72 시간에 마우스를 안락사시키고, 전체 RNA를 제조자의 권고에 따라 트리졸 시약을 사용하여 신장 종양으로부터 준비하였다. 전달 완충제만으로 처리한 마우스와 비교한 상대적 Aha1 mRNA 수준을, 기재된 대로 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 표적화 리간드 또는 RGE 대조 리간드없이 제형화된 콘주게이트는 유전자 발현에서 25-35% 감소를 나타냈다. RGD 표적화된 콘주게이트는 종양 Aha1 발현 (n = 3 또는 4)에서 50-70% 유전자 감소를 나타냈다.
표 5. 1회 용량의 Aha1 siRNA 콘주게이트로 처리한 후의 마우스에서 동소이식 신장 RCC 종양에서의 상대적 종양 Aha1 mRNA 수준
Figure pct00051
표적화되지 않은 콘주게이트 (리간드 또는 RGE 모방체 없음 (음성 대조 리간드))로 처리한 동물에서 유전자를 녹다운시키면 아마도 증대된 투과성 및 보유 (EPR) 효과를 통하여 종양 내 콘주게이트가 비활동적으로 축적되는 결과 (Torchilin, 2011)가 얻어졌다. 콘주게이트의 긴 혈청 안정성 및 순환에 의해 EPR을 통하여 종양 내에 유의미하게 축적될 수 있다. 여전히, RGD-표적화된 콘주게이트는 비활성적으로 표적화된 콘주게이트와 비교하여 유전자 발현에서 추가 20-40% 감소를 나타냈다.
실시예 14. 생체 내에서 신장 세포 암종 종양 유전자의 녹다운. RGD 모방체 #1 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트를, RGD 모방체 #1-PEG 및 프로토콜 #1을 사용하여 형성시켰다. 500 μg Lau 41648-106 폴리머를 8× PEG12-FCit/0.5× 알데하이드-PEG24-FCit, 및 100 μg Aha1 siRNA를 사용하여 개질시켰다. RGD 모방체 #1-PEG-HyNic를 이러한 샘플에 대한 표적화 리간드로 사용하였다. 전이성 (피하) 및 동소이식 신장 RCC 종양 둘 모두를 함유하는 마우스를 상기와 같이 생성시키고, Aha1 콘주게이트의 단일 꼬리 정맥 주사로 처리하였다. 마우스를 주사 후 72 시간에 안락사시키고, 전체 RNA를 제조자의 권고에 따라서 트리졸 시약을 사용하여 신장 종양으로부터 준비하였다. 종양 이식 부위에서의 상대적 인간 (종양) Aha1 mRNA 수준을 상기와 같이 RT-qPCR에 의해 측정하고, 전달 완충제 만이 주사된 마우스에 대해서 표준화하였다. RGD-표적화된 콘주게이트는 종양 Aha1 발현 (n = 3 또는 4)에서 40-50% 유전자 감소를 나타냈다.
표 6. 1회 용량의 Aha1 siRNA 콘주게이트로 처리한 후의 마우스에서 동소이식 신장 또는 전이성 피하 RCC 종양에서의 상대적 종양 Aha1 mRNA 수준.
Figure pct00052
실시예 15. 다중 종양 유형으로 RDG - 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트 전달 siRNA. 간에 영향을 미치는 암은 간 세포로부터 시작되는 암 (예를 들면 간세포 암종, HCC) 및 다른 조직, 예컨대 결장, 폐, 신장 또는 유방에서 시작되는 전이 암을 포함한다. 시험관 내에서 αvβ3 인테그린을 발현하고 RGD-콘주게이트에 결합하는 것으로 알려진 다양한 암 세포 유형을 간 내로 이식하였다. RGD 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트를, RGD 모방체 #1-HyNic 또는 RDG 모방체 #1-PEG-티오에이트를 사용하여 형성시켰다. 500 μg Lau 41648-106 폴리머를 8× PEG12-FCit/0.5× 알데하이드-PEG24-FCit (프로토콜 #1 또는 #5) 또는 8× PEG12-FCit-/0.5× SPDP-PEG24-FCit (RGD-PEG-티오에이트 프로토콜을 사용함) 및 100 μg Aha1 siRNA를 사용하여 개질시켰다. 그 후, 상기 종양 함유 마우스를, 꼬리 정맥 주사에 의해 투여된 1회 용량의 Aha1 siRNA 전달 콘주게이트로 처리하였다. 주사 후 72 시간에 마우스를 안락사시키고, 전체 RNA를 제조자의 권고에 따라서 트리졸 시약을 사용하여 간 종양으로부터 준비하였다. 각각의 종양 유형에 대하여, 종양 Aha1 mRNA 수준을, 전달 완충제 만이 투여되는 마우스 종양에 대하여 표준화하였다. RGD-표적화된 콘주게이트는 종양 Aha1 유전자 발현 (n = 3 또는 4)에서 50-60% 감소를 나타냈다.
표 7. 1회 용량의 Aha1 siRNA 콘주게이트로 처리한 후의 마우스에서 다양한 간 종양에서의 상대적 종양 Aha1 mRNA 수준.
Figure pct00053
실시예 16. 상이한 폴리머 부류를 갖는 RGD - 콘주게이트 제형.
폴리머 Emi 1034-68C-1
폴리머 Emi 1034-81F-1
폴리머 LH 1073-20C-1
RGD 모방체 #1 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트를, RGD 모방체 #1b 및 프로토콜 #2를 사용하여 형성시켰다 400 μg Emi 1034-68C-1, Emi 1034-81F-1 또는 LH 1073-20C-1 폴리머를 8× PEG12 ACit/0.5× 알데하이드-PEG24-ACit 및 80 μg Aha1 siRNA를 사용하여 개질시켰다. RGD 모방체 #1b를 이러한 제형에 대한 표적화 리간드로 사용하였다. 그 후, 동소이식 RCC 종양 함유 마우스를, 꼬리 정맥 주사에 의해 투여된 1회 용량의 Aha1 콘주게이트로 처리하였다. 주사 후 72 시간에 마우스를 안락사시키고, 전체 RNA를 제조자의 권고에 따라서 트리졸 시약으로 사용하여 간 종양으로부터 준비하였다. 종양 Aha1 mRNA 수준을, 전달 완충제 만이 투여되는 마우스에서의 종양에 대하여 표준화하였다.
표 8. 1회 용량의 Aha1 siRNA 콘주게이트로 처리한 후의 마우스에서 동소이식 신장 RCC 종양에서의 상대적 종양 Aha1 mRNA 수준.
Figure pct00054
실시예 17. ACit 또는 FCit 디펩타이드 마스킹 시약을 사용한 RGD - 콘주게이트 제형. RGD 모방체 #1 표적화된 siRNA 전달 콘주게이트를, RGD 모방체 #1b 및 프로토콜 #2를 사용하여 형성시켰다. 400 μg Emi 1034-68C-1 폴리머를 8× PEG12-FCit/0.5× 알데하이드-PEG12-FCit (FCit디펩타이드 마스킹된 전달 콘주게이트에 대한) 또는 8× PEG12-ACit/0.5× 알데하이드-PEG24-ACit (ACit 디펩타이드 마스킹된 전달 콘주게이트에 대한) 및 80 μg Aha1 siRNA를 사용하여 개질시켰다. RGD 모방체 #1b-HyNic를 이러한 제형에 대한 표적화 리간드로 사용하였다. 그 후, 동소이식 RCC 종양 함유 마우스를, 꼬리 정맥 주사에 의해 투여된 1회 용량의 Aha1 siRNA 전달 콘주게이트로 처리하였다. 주사 후 72 시간에 마우스를 안락사시키고, 전체 RNA를 제조자의 권고에 따라서 트리졸 시약을 사용하여 간 종양으로부터 준비하였다. 종양 Aha1 mRNA 수준을, 전달 완충제 만이 투여되는 마우스에서의 종양에 대하여 표준화하였다. ACit 또는 FCit siRNA 전달 콘주게이트 간의 유전자 녹다운 효능에서는 유의미한 차이가 없었다. RGD-표적화된 콘주게이트는 각각 ACit 또는 FCit 콘주게이트에 대한 종양 Aha1 유전자 발현 (n=3)에서 51% 또는 53% 감소를 나타냈다.
표 9. 1회 용량의 Aha1 siRNA 콘주게이트로 처리한 후의 마우스에서 동소이식 신장 RCC 종양에서의 상대적 종양 Aha1 mRNA 수준.
Figure pct00055
실시예 18. siRNAs. siRNAs는 하기 서열을 가진다:
AhaI siRNA:
센스: (NH2C6)GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT) (서열번호 3)
안티센스: pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT (서열번호 4)
p = 포스페이트
뉴클레오타이드 앞의 d = 2'-데옥시
s = 포스포로티오에이트 연결
뉴클레오타이드 뒤의 f = 2'-F 치환
소문자 = 2'-O-CH3 치환
RNA 합성은, 고형 지지체로
Figure pct00056
올리고파일럿(Oligopilot) 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 또는 머메이드(Mermade) 12 (Bioautomation, Plano Texas) 및 조절된 기공 유리 (CPG) 위에서 종래의 포스포르아미다이트 화학에 의해 고체 상(phase)에서 수행되었다.
실시예 19. 알킨 디설파이드 센스-가닥 RNA 콘주게이트의 합성. 5' C-6 아미노 변형에 의한 조 센스-가닥 RNA (3.4mg, 506 nmol)을, -80 ℃에서 EtOH 중 아세트산나트륨 (0.3M)을 사용하여 침전시키고, 동결건조시키고, 300 μL 0.2M NaHCO3, pH 8-9에서 용해시켰다. 디벤조사이클로옥틴-N-하이드록시석신이미딜 (디벤조사이클로옥틴-S-S-N-하이드록시석신이미딜 에스테르 (DBCO-NHS), 물품 #761532 Aldrich) (2.86　mg, 5060 nmol)을 286 μL DMF에서 용해시키고 RNA 용액에 부가했다. 반응 혼합물을 잘 혼합하고 2 시간 동안 실온에서 진행되도록 했다. 반응을 RP-HPLC를 사용하여 모니터링했다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 건조시키고 RP-HPLC를 사용하여 정제했다. RNA 콘주게이트를 45% 수율 (229　nmol)로 제조했다. RNA 콘주게이트의 순도를 RP-HPLC (순도: 96.6%)로 결정하고 동일성을 MALDI-TOF/TOF로 확인했다 (계산된 질량: 7164.0; 관측된 질량: 7164.8).
실시예 20. 4-( Fmoc -4- 아미노펜옥시 ) 부티르산의 합성.
Figure pct00057
A. 3의 합성: p-니트로-페놀 (2) (7.5　g, 53.9　mmol)을 DMF (75　ml) 중 에틸 4-브로모부티레이트 (8.45　ml, 5.9　mmol) 및 K2CO3　(7.5　g, 5.4　mmol)와 조합하고 2 시간 동안 100 ℃에서 교반했다. DMF를 제거하고 조 물질을 2 N NaOH 및 메탄올의 3:1 혼합물에서 희석하고 4 시간 동안 실온에서 교반했다. 반응 혼합물을 6M HCl로 산성화했다. 백색 침전물을 수집했다 (10.9　g 90 % 수율)을 얻었다. [1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ:　12.165 (bs, 1　H) δ: 8.175 (AA', J= Hz, 2　H) δ: 7.120 (AA', J= Hz, 2　H), δ: 4.122 (t, J=6.8 Hz, 2 H), δ:　2.379 (t, J=6.8 Hz, 2H), δ: 1.975 (p, J= 6.8 Hz, 2H)]
B. 4의 합성: 3 (37.1　g,　mmol)을 암모늄 포르메이트 (35　g,　mmol)과 함께 MeOH (1 L)에서 용해시키고 10% Pd/C (데구싸 유형) (3.5　g)을 부가했다. 혼합물을 65 ℃에서 밤새 환류시켰다. 반응을 셀라이트로 여과하여 불그스름산 갈색 고형물 (30.5　g, 95 % 수율)을 얻었다. [1H-NMR (400 MHz, DMSO), δ: 6.609 (AA', J= Hz, 2 H) δ: 6.470 (AA', J= Hz, 2 H), δ: 3.790 (t, J= 6.8 Hz, 2 H), δ: 2.288 (t, J= 7.2 Hz, 2 H), δ: 1.832 (p, J= 7.2 Hz, 2 H)]
C. 4-( Fmoc -4- 아미노펜옥시 ) 부티르산 ( 1)의 합성: 4 (5.1　g, 26　mmol)을 수성 포화된 중탄산나트륨 용액 및 THF (300　ml)의6:4 혼합물에서 용해시켜 백색 슬러리를 만들었다. Fmoc-OSu (8.82　g, 26.1　mmol)을 부가하고 반응을 4 시간 동안 교반했다. 아세톤을 제거하고, 반응을 산성화하고 황백색 침전물을 수집하고 1N HCl에서 분쇄하여 9.6　g 생성물 (88% 수율, 분자량 389.40066)을 얻었다. [1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ: 9.508 (bs, 1　Hz), δ: 7.885 (d, J= 7.6, 2 Hz, 2H), δ: 7.727 (d, J= 6.8 Hz, 2H), δ: 7.389-7.32 (bm, 7H), δ: 7.328 (dd, J= 6.8, 6.4 Hz, 2H), δ: 6.828 (d, J= 7.6 Hz, 2H), δ: 4.435 (d, J= 6.0 Hz, 2H), δ: 4.275 (t, J= 6.4 Hz, 1H), δ: 3.897 (t, J= 6.0 Hz, 2H), δ: 2.335 (t, J= 7.2 Hz, 2H), δ: 1.885 (p, J= 7.2 Hz)]
사용된 시약: 디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄 (DCM), 메탄올 (MeOH), H2O (HPLC 등급), 아세톤, p-니트로페놀, 에틸 4-브로모부티레이트, 칼륨 카보네이트, Pd/C (데구싸 유형)을 Sigma Aldrich로부터 구매하고 있는 그대로 사용했다. Fmoc-OSu를 Novabiochem로부터 구매했다.
실시예 21. 구아나디노 - Gly -Asp(OH)- APOA - PEG 12 - HyNic - Boc의 합성.
Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH
2
A. Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH (2). Fmoc-Gly-OH (CAS 29022-11-5) (1.57　g, 5.28　mmol)을 THF (30 ml)에서 용해시키고 빙욕에서 교반하도록 설정했다. NHS (0.668　g, 5.81　mmol) 및 DCC (1.2　g, 5.81　mmol)을 용액에 부가하고, 5 분 동안 교반하고, 빙욕을 제거했다. 반응 혼합물을 16 시간 동안 20 ℃에서 교반하고, 1 시간 동안 0 ℃로 냉각하고, 그 다음 여과하고, 농축하고 진공에서 건조시켰다. 조 생성물을 THF (20 ml)에서 용해시키고 H2O (30　ml) 중 H-Asp(2-PhiPr)-OH (CAS 200336-86-3) (1.328　g, 5.28　mmol) 및 NaHCO3 (600　mg, 7.14　mmol)의 용액에 부가했다. 1,2-디메톡시에탄 (DME, 30　ml)을 부가하여 용액을 균질하게 만들고 16 시간 동안 교반했다. THF 및 DME를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 H2O (150　ml)로 희석하고 3% HCl로 pH=3으로 산성화하여 Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH (2)를 얻었다. 생성물을 EtOAc로 5회 추출하고, 염수로 린스하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수율 2.54　g. 조 생성물을 다음 단계에서 사용하고, 그 수율은 100%인 것으로 추정된다.
Figure pct00058
B. Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc (3). 디펩타이드 2 (1.168g, 2.2　mmol)을 DCM (20 ml)에서 용해시키고 빙욕에서 교반하도록 설정했다. NHS (291　mg, 2.53　mmol) 및 DCC (522　mg, 2.53　mmol)을 용액에 부가하고, 5 분 동안 0 ℃에서 및 그 다음 16 시간 동안 20 ℃에서 교반했다. 반응 혼합물을 빙욕 상에서 1 시간 동안 냉각하고, 여과하고 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수득된 NHS 유도체를 DCM (15　ml)에서 용해시키고 4-[3-(Boc-아미노)프로판-1-일옥시]-아닐린 (APOA-Boc, 644　mg, 2.42　mmol) (Quelever, Frederic. 및 Kraus Organic & Biomolecular Chemistry, 1(10), 1676-1683; 2003) 및 TEA (175　μl, 1.25　mmol)의 용액에 부가했다. 반응을 20 ℃에서 3 시간 동안 교반하고 1,4-디옥산 (10　ml)을 부가했다. 모든 휘발성물질을 진공에서 제거했다. 잔류물을 EtOAc (200 ml)에서 용해시키고, 5%　KHSO4 (2 × 40　ml), 물 (1 × 40　ml), 농축된 중탄산나트륨 용액 (1　×　40　ml), 및 염수 (1 × 40 ml)로 세정했다. 유기 층을 건조시키고 (Na2SO4), 그 다음 농축하고 진공에서 건조시켰다. 수율 1.714　g. 조 생성물, Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc (3)을, 다음 단계에서 사용하고, 그 수율은 100%인 것으로 추정된다.
Figure pct00059
C. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA HCl 염 (4). 화합물 3 (800　mg, 1.02　mmol)을 디옥산 (4M, 22　ml) 중 HCl의 빙랭된 용액으로 처리하고 0 ℃에서 45 분 동안 교반했다. 냉각욕을 제거하고 서스펜션을 농축했다. 잔류물을 CHCl3 (2.5　ml)에서 현탁시키고, 디에틸 에테르 (45　ml)을 부가하고, 고형물을 분리했다. 4-[3-(아미노)프로판-1-일옥시]-아닐린 (APOA) 유도체의 HCl 염의 재침전 절차를 2회 반복하고, 생성물을 진공에서 건조시켰다. 수율: 557　mg (92%).
Figure pct00060
D. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH-Boc (5). DCM (8　ml) 중 Boc-Peg12-CO2H (Quanta Biodesign Limited 10761, 803　mg, 1.12　mmol)을 함유하는 용액에 0 ℃에서 NHS (193　mg, 1.68　mmol) 그 다음 DCC (346　mg, 1.68　mmol)을 부가했다. 냉각을 제거하고 교반을 24 시간 동안 계속했다. 반응 혼합물을 20 ℃로 냉각하고, 여과하고 농축했다. NHS 유도체를 DMF (14　ml) 중 화합물 4 (667　mg, 1.12　mmol) 및 DIEA (154　μl, 0.89　mmol)의 용액으로 처리하고, 16 시간 동안 교반하고, 여과하고, 농축했다. 수득된 조 잔류물을 DCM:MeOH:아세트산 (92.5:7:0.5)을 용출하는 플래시 SiO2 크로마토그래피로 정제했다. 수율: 575　mg (41%).
Figure pct00061
E. Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH2 (6). 화합물 5 (140　mg, 0.11　mmol)을 TFA (3　ml) 및 H2O (1　ml)ㅍ. 혼합물을 20 분 동안 교반하고, 차가운 H2O로 희석하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거했다. 잔류물을 Et2O로 3회 분쇄하고, 진공에서 건조시키고 추가 정제없이 사용했다. 수율: 115　mg (90%).
Figure pct00062
F. H2N-Gly-Asp(OH)-APOA -PEG12-HyNic-Boc (7). DCM (3　ml) 중 6 (105　mg, 0.091　mmol) 및 DIEA (31　μl, 0.18　mmol)를 함유하는 용액에 Boc-HyNic-NHS을 부가했다 (Abrams, M. J., Juweid, M., Tenkate, C. I., Schwartz, D. A., Hauser, M. M.. Gaul, F. E., Fuccello, A. J., Rubin, R. H., Strauss, H. W., Fischmann, A. J. J. Nucl. Med. 31, 2022-2028, 1990.) (35　mg, 0.10　mmol).
Figure pct00063
혼합물을 16 시간 동안 교반하고, MeOH 중 에틸 아민 (30　μl, 2.0M)으로 처리하고, 추가 3 시간 동안 교반했다 (과잉의 미반응된 Boc-HyNic-NHS의 켄칭 목적). 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거했다. 조 잔류물을 DMF (3 ml)에서 용해시키고, 그 다음 TEA (400 μl)으로 처리하고 16 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 오일 펌프 진공을 갖는 회전증발기 상에서 제거했다. 조 생성물을 30 분에 걸쳐 H2O (0.1% 포름산) 중 ACN (0.1% 포름산)의 구배 (18-43%)를 용출하는 Thermo Aquasil C18 칼럼 (5u, 100Å)를 사용하는 분취 HPLC로 정제했다. 수율: 36　mg (34%).
Figure pct00064
G. 3-구아나디노벤조산-NHS 에스테르 (1). NHS (589　mg, 5.12　mmol)을 DMF (25　ml) 중 3-구아니디노벤조산 (1g, 4.65　mmol; Chandrakumar, N., 등 US 특허 5,773,646)의 교반 용액에 부가하고, 5 분 동안 교반하고, 그 다음 DCC (1.056　g, 5.12　mmol)을 반응 혼합물에 부가했다. 교반을 2 시간 동안 계속하고 그 다음 반응 혼합물을 20 ℃로 30 분 동안 냉각하고, 생성물을 여과 제거하고, 차가운 DMF로 세정하고, 오일 펌프를 사용하여 진공에서 건조시켰다. 수율: 1.283　g (100%).
Figure pct00065
H. 구아나디노-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc (8). 7 (36　mg, 0.031　mmol) 및 NaHCO3 (13　mg, 0.155　mmol)을 함유하는 H2O (1　ml) 및 THF (0.9　ml)의 혼합물을 3-구아나디노벤조산 (1) (19.5　mg, 0.071　mmol)의 NHS 에스테르로 처리하고 22 시간 동안 교반했다. 그 다음 혼합물을 H2O로 희석하고 THF를 회전증발기 상에서 제거했다. 잔류물을 pH=3 (1%　HCl)에서 물 (3　ml)에서 현탁시키고 고형 분순물을 여과 제거했다. 생성물을 진공에서 농축하고, 조 잔류물을 H2O (0.8　ml), 아세톤 (0.8　ml), 및 TFA (1.8　ml)의 혼합물로 처리하고 40 분 동안 교반했다. 완료 시 용액을 아세톤 (2 ml)으로 희석하고 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거했다. 수득한 조 생성물을 H2O (0.1% 포름산) ACN (0.1% 포름산)의 구배 (18-43%)를 용출하는 Thermo Aquasil C18 칼럼 (5u, 100Å)를 사용하는 분취 HPLC로30 분에 걸쳐 정제했다. 수율: 34　mg (89%).
실시예 22. RGD 리간드의 고상 합성.
Figure pct00066
디메틸포름아미드 (DMF), 피페리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디에틸 에테르 (Et2O), H2O (HPLC 등급), 아세토니트릴 (ACN) (HPLC 등급), 트리에틸아민 (TEA), F3CCO2H (TFA), 및 트리이소프로필 실란 (TIPS). PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노- 포스포늄 헥사플루오로포스페이트)을 Oakwood Products Inc로부터 구매했다. 핑크색 아미드 MBHA 수지, Fmoc-Gly-OH, 및 Fmoc-Asp(tBu)-OH를 Novabiochem로부터 구매했다. 4-(N-Fmoc 파라- 아미노펜옥시)-부티르산 및 디-boc m-구아니디노 벤조산산을 당해기술의 표준 기술을 사용하여 합성했다. 소결된 폴리프로필렌 주사기를 Torviq로부터 구매했다. 용매 A는 H2O:F3CCO2H 100:0.1 v/v이다. 용매 B는 CH3CN: F3CCO2H 100:0.1 v/v이다. Fmoc-Lys(HyNic)-OH를 이전에 기재된 바와 같이 합성했다.
Figure pct00067
Figure pct00068
A. 펩타이드 합성. 핑크색 아미드 MBHA 수지를 소결된 폴리프로필렌 주사기 내에 두었고 DCM 2에서 시간 동안 진탕한 후 사용했다. 하기 표준 고상 펩타이드 합성 조건을 사용했다. Fmoc 탈보호를, 피페리딘:DMF 용액 (20:80 v/v)의 10　ml (1　mmol의 수지 당)를 20 분 동안 침지시켜 수행했다. 아미드 커플링을 DMF 중0.1 M 농도로 수지를 DMF 중 4 당량 Fmoc-아미노산, 4 당량 PyBOP 및 10 당량 트리에틸아민와 함께 40 분 동안 침지시켜 수행했다.
Fmoc-Lys(HyNic)-OH, 4-(N-Fmoc 파라-아미노펜옥시)-부티르산, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, 및 Fmoc-3-아미노벤조산을 순차적으로 수지에 커플링시켰다. 아미드 커플링의 진행을 MALDI-TOF 분석을 사용하여 확인했다. 4-(N-Fmoc 파라-아미노펜옥시)-부티르산의 Fmoc 탈보호를 40 분 동안 수행하여 완료된 Fmoc-탈보호를 보장했다. Fmoc-Asp(tBu)-OH 잔류물을 이중 커플링하여 Fmoc-아스파르테이트 산과 4-(아미노펜옥시)-부티르산 잔기의 아미노 모이어티 사이의 아미드 형성을 보장했다. 수지로부터의 절단을 TFA:H2O:TIPS:아세톤 (92.5:2.5:2.5:2.5 v/v/v/v) 용액에서 2 시간 동안 수행했다. 취입 공기를 사용하여 TFA 용액을 ~10% 용적으로 감소시키고, 펩타이드를 Et2O에서 침전시켰다. 침전물을 A:B (1:1 v/v) 용매 혼합물에서 재용해시키고 역상 HPLC를 사용하여 정제했다.
B. 펩타이드 정제. (>90% 균질성에 대한) 정제를 10-30% B 용매 구배를 20 분에 걸쳐 사용하여 Phenomenex Gemini C18 (250×21.2mm, 5μm 입자)가 구비된 분취 규모 Shimadzu HPLC 상에서 수행했다. 순도를, Waters xBridge C18 (4.6×250 mm, 5μm 입자) 칼럼이 구비된 분석적 Shimadzu HPLC 상에서 10-60% B 구배를 50 분에 걸쳐 사용하여 평가했다. HPLC 분획의 동결건조로 정제된 펩타이드를 TFA 염으로서 얻었다.
실시예 23.
A. PEG 12 /24 - FCit - PABOC - PNP의 합성.
Figure pct00069
1) 디펩타이드 전구체의 제조:
a) Fmoc-FCit-OH
Figure pct00070
THF (5　ml) 중 Fmoc-Phe-OPfp (EMD NovaBiochem 852226) (553　mg, 1　mmol)의 용액을 H2O (2.6　ml) 중 H-Cit-OH (Sigma-Aldrich C7629) (184　mg, 1.05　mmol) 및 NaHCO3 (88.2　mg, 1.05　mmol)의 용액에 부가했다. THF (2　ml)을 부가하여 용액을 균질하게 만들고 10 시간 동안 교반했다. THF를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 H2O (10　ml) 및 iPrOH (1　ml)로 희석하고 3% HCl로 pH=1로 산성화했다. 생성물을 9:1 EtOAc:iPrOH 용액으로 5회 추출하고, 염수:iPrOH의 9:1혼합물로 린스하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축하고 진공에서 건조시켰다. 에테르로 분쇄하여 313　mg의 순수한 생성물 (57%)을 얻었다. 유사한 조건은 Fmoc-ACit-OH의 제조를 위해 사용될 수 있다.
b) Fmoc-FCit-PAB-OH
Figure pct00071
DCM (150　ml) 및 MeOH (50　ml) 중 Fmoc-FCit-OH (5.98　g, 10.97　mmol) 및 PABA (2.70　g, 21.95　mmol)의 용액을 EEDQ (5.43　g, 21.95　mmol)으로 처리하고 20 ℃에서 15 시간 동안 교반되도록 했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 Et2O로 분쇄하고, 생성물을 여과 제거하고 진공에서 건조시켰다. 수율 6.14　g (86%). 유사한 조건은 Fmoc-ACit-PAB-OH의 제조를 위해 사용될 수 있다.
c) H2N-FCit-PAB-OH (H2N-A-Cit-PAB-OH의 제조와 동일한 조건)
Figure pct00072
Fmoc-FCit-PAB-OH (0.83　mmol)은 DMF (11　ml) 중 Et3N (3.5　ml)과 함께 10 시간 동안 교반하여 탈보호된 Fmoc였다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 40 ℃/오일 펌프 진공에서 제거하고 조 생성물을 얻었고, 이것을 추가 정제 없이 사용했다.
B. PEG 12 - FCit - PABC - PNP . ( FCit = 페닐알라닌-시트룰린)의 제조
Quanta Biodesign 제품 번호: 10262
Figure pct00073
Quanta Biodesign 제품 번호: 10304
Figure pct00074
1. PEG12-FCit-PAB-OH
Figure pct00075
DMF (3　ml) 중 H2N-FCit-PAB-OH (0.88　mmol) 및 DIEA (167　μl, 0.96　mmol)의 용액에 DMF (3　ml) 중 PEG12-NHS (Quanta Biodesign 10262) 또는 PEG24-NHS (Quanta Biodesign 10304) (0.8　mmol)의 용액에 부가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반하고, 여과하고 농축했다. 조 물질을 CHCl3:MeOH (1:1, 5　ml)로부터 Et2O (45　ml)에 침지시키고 추가의 정제 없이 사용했다. 수율: 420　mg (53%).
ii) PEG12-FCit-PABC-PNP
Figure pct00076
디옥산 (4　ml) 중 PEG12 /24-FCit-PAB-OH (419　mg, 0.42　mmol), (PNP)2CO (Sigma-Aldrich 161691) (766　mg, 2.52　mmol) 및 DIEA (263　μl, 1.52　mmol)을 함유하는 용액을 어둠 속에서 50 ℃에서 15 시간 동안 교반했다. 모든 휘발성물질을 회전증발기 상에서 제거하고 잔류 DIEA를 DMF로부터 증발로 제거했다. 생성물을 칼럼, 용출물 CHCl3:EtOAc:MeOH=4.5:5:0.5 그 다음 CHCl3 중 MeOH (12-15%)의 구배 상에서 정제했다. 수율: 390　mg (80%).
실시예 24. 양친매성 막 활성 폴리아민 합성.
A. N-Boc-에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타크릴레이트의 RAFT 공중합 (도 11). 다른 막 활성 폴리머에 대해, A는 또한 보호된 에틸, 프로필, 또는 부틸 아미노 아크릴레이트일 수 있다. B는 더 높은 소수성 (10-24개의 탄소 원자, C18 보여짐) 아크릴레이트, 더 낮은 소수성 (1-6개의 탄소 원자, C4 보여짐) 아크릴레이트, 또는 낮은 더 높은 소수성 아크릴레이트의 조합일 수 있다.
아민 아크릴레이트/C3 메타크릴레이트로 이루어진 공중합체를 하기와 같이 합성했다. 모노머 및 RAFT 제제를 칭량하고 명시된 비로 부틸 아세테이트와 합쳤다. AIBN (아조비스-이소부티로니트릴)을 부가하고 질소로 반응 실온에서 1 시간 동안 반응에 거품을 일으겼다. 반응 그 다음 혼합물을 80 ℃에서 15 시간 동안 오일 배쓰에 넣었다. 그 다음 폴리머를 헥산으로 침전시키고, DCM/헥산 용매계를 사용하여 추가로 아주 조금 침전시켰다 (아래 참고). 그 다음 폴리머를 감압 하에서 건조시켰다. 폴리머를 아세트산에서 30 분 동안 실온에서7　ml 2M　HCl로 탈보호했다. 30 분 후, 15 ml의 물을 반응 혼합물에 부가하고, 혼합물을 3.5 kDa MWCO 투석 튜우빙으로 이동시켰다. 폴리머를 NaCl에 대항하여 밤새 투석하고 그 다음 다른 날 dH2O에 대항하여 투석했다. 그 다음 물을 동결건조를 통해 제거하고, 폴리머를 dH2O에서 용해시켰다.
B. N - Boc - 에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타크릴레이트의 랜덤 공중합. 아민 아크릴레이트/Cn 메타크릴레이트로 이루어진 공중합체를 하기와 같이 합성했다. 모노머를 명시된 비로 칭량하여 디옥산과 합했다. AIBN (아조비스-이소부티로니트릴)을 부가하고 질소로 실온에서 1 시간 동안 반응에 거품을 일으켰다. 반응 그 다음 혼합물을 60 ℃에서 3 시간 동안 오일 배쓰에 넣었다. 그 다음 폴리머를 감압 하에서 건조시켰다. 폴리머를 GPC로 정제했다. 그 후 폴리머 분획을 아세트산에서 30 분 동안 실온에서 7　ml 2M　HCl로 탈보호했다. 30 분 후, 15 ml의 물을 반응 혼합물에 부가하고, 혼합물을 3.5 kDa MWCO 투석 튜우빙으로 이동시켰다. 폴리머를 NaCl에 대항하여 밤새 투석하고 그 다음 다른 날 dH2O에 대항하여 투석했다. 그 다음 물을 동결건조를 통해 제거하고, 폴리머를 dH2O에서 용해시켰다.
C. 수용성, 양친매성 , 막 활성 폴리 (비닐 에테르) 폴리아민 삼원중합체의 합성. X mol% 아민-보호된 비닐에테르 (예를 들면, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드)를 무수 디클로로메탄 중 질소의 블랭키트 하에서 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 부가했다. 이 용액에 Y mol% 더 낮은 소수성 그룹 (예를 들면, 프로필, 부틸) 비닐에테르 및 임의로 Z mol% 더 높은 소수성 그룹 (예를 들면, 도데실, 옥타데실) 비닐에테르를 부가했다 (도 1). 용액을 -50 내지 -78℃ 배쓰에 넣고, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 침전되도록 했다. 이 용액에 10　mol % BF3ㆍ(OCH2CH3)2을 부가하고 상기 반응을 2 내지 3 시간 동안 -50 내지 -78℃에서 진행되도록 했다. 중합을 메탄올 용액 중 수산화암모늄의 부가호 종료했다. 폴리머를 감압 하에서 건조시키고 그 다음 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에서 취했다. 프탈이미드당 20 mol 당량의 하이드라진을 부가하여 보호 그룹을 아민으로부터 제거했다. 용액을 3 시간 동안 환류시키고 그 다음 감압 하에서 건조시켰다. 수득한 고형물을 0.5 mol/L HCl에서 용해시키고 15 분 동안 완료시켜 폴리머의 하이드로클로라이드 염을 형성하고, 증류수로 희석하고, 추가의 시간 동안에 환류했다. 그 다음 용액을 NaOH로 중화하고, RT로 냉각하고, 분자 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 증류수에 대항하여 투석하고, 동결건조시켰다. 폴리머를 크기 배제 또는 다른 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 폴리머의 분자량을, 분석적 크기-배제 크로마토그래피 및 다중-각 광 산란에 의한 크기-배제 크로마토그래피 (SEC-MALS)를 포함하는 표준 절차에 따라 칼럼을 사용하여 추정했다.
D. 폴리머 Ant-41658-111:
1) 모노머 합성. 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, 라디칼 개시제), 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오) 펜탄산 (CPCPA, RAFT Agent) 및 부틸 아세테이트를 Sigma Aldrich로부터 구매했다. 프로필 메타크릴레이트 모노머 (Alfa Aesar)을 여과하여 억제제를 제거했다.
교반 바가 구비된 2L 둥근바닥 플라스크에서, 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (21.1　g, 202.9　mmol, Sigma Aldrich)을 350　ml 디클로로메탄에서 용해시켰다. 별개의 1　L 플라스크에서, BOC 무수물 (36.6　g, 169.1　mmol)을 660　ml 디클로로메탄에서 용해시켰다. 2L 둥근바닥 플라스크에 부가 깔때기를 맞추고 BOC 무수물 용액을 플라스크에 6 시간에 걸쳐 부가했다. 반응을 밤새 교반되도록 했다. 2L 분별 깔때기에서, 생성물을 300　ml 각각의 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세정했다. 생성물, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올을, Na2SO4 상에서 건조시키고, 중력 여과하고, DCM을 회전식 증발 및 고진공으로 증발시켰다.
교반 바가 구비되고 아르곤으로 씻어낸 500 ml 둥근바닥 플라스크에서, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (27.836　g, 135.8　mmol)을 부가하고, 그 다음 240　ml 무수 디클로로메탄. 디이소프로필에틸 아민 (35.5　ml, 203.7　mmol)을 부가하고, 시스템을 드라이아이스/아세톤 배쓰에 두었다. 아크릴로일 클로라이드 (12.1　ml, 149.4　mmol)을 10 ml의 디클로로메탄을 사용하여 희석하고, 아르곤 씻어 낸 시스템에 적가했다. 시스템을 아르곤 하에 두었고 RT로 되도록 하고 밤새 교반했다. 생성물을 100　ml 각각의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화된 NaCl로 세정했다. 생성물, BOC-아미노 에틸 에톡시 아크릴레이트 (BAEEA)을, Na2SO4 상에서 건조시키고, 중력 여과하고, DCM을 회전식 증발로 증발시켰다. 생성물을 7.5 cm 직경 칼럼을 사용하여 29 cm 실리카상 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제했다. 사용된 용매계는 헥산 중 30% 에틸 아세테이트였다. Rf: 0.30. 분획을 수집하고 용매를 회전식 증발 및 고진공을 사용하여 제거했다. BAEEA,를 74% 수율로 얻었다. BAEEA를 냉동고에서 보관했다.
Figure pct00077
2) 중합: 부틸 아세테이트 중 AIBN (1.00　mg/ml) 및 RAFT 제제 (4-시아노-4(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA), 10.0　mg/ml)의 용액을 제조했다. 모노머 몰 공급 비는0.108 CPCPA RAFT 제제 및 0.016 AIBN 촉매 (0.00562 총 몰)와 함께 75 BAEEA : 25 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8)였다.
BAEEA (1.09　g, 4.21　mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (.180　g, 1.41　mmol) (B), CPCPA 용액 (.170　ml,.00609　mmol) (C), AIBN 용액 (.150　ml,.000915　mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.68　ml)을 교반기 바가 있는 20 ml 유리 바이알에 부가했다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고 용액에, 제2 짧은 주사기 바늘을 유출구로서 갖는 긴 주사기 바늘을 사용하여 1 시간 동안 질소 거품을 일으켰다. 주사기 바늘을 제거하고 시스템을, 오일 배쓰를 사용하여 80 ℃로 15 시간 동안 가열했다. 용액을 RT로 냉각되도록 하고 50 ml 원심관으로 이동시킨 후 헥산 (35　ml)을 용액에 부가했다. 용액을 4,400 rpm에서 2 분 동안 원심분리했다. 상청액 층을 주의 깊게 경사분리하고 하부 (고체 또는 겔-유사) 층을 헥산으로 린스했다. 최저 층을 그 다음 DCM (7　ml)에서 재용해시키고, 헥산 (35　ml)에서 침전시키고 한 번 더 원심분리했다. 상청액을 경사분리하고 최저 층 헥산으로 린스한 후 폴리머를 감압 하에서 몇 시간 동안 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 73,000 (PDI 1.7); 폴리머 조성물을 H1NMR을 사용하여 수득했다: 69:31 아민:알킬.
분별 침전. 건조된, 침전된 생성물을 DCM (100　mg/ml)에서 용해시켰다. 헥산을 구름점이 도달된 직후까지 부가했다 (~20　ml). 수득한 우유빛 용액을 원심분리했다. 최저 층 (폴리머의 ~ 60%를 나타내는 농액)을 추출하고 헥산에 완전히 침전시켰다. 잔여 상부 용액을 헥산의 추가 부가에 의해 또한 완전히 침전시켰다. 분획 둘 모두를 원심분리하고, 그 후 폴리머를 단리하고 진공하에서 건조시켰다. 분획 1: Mw 87,000 (PDI 1.5); 분획 2: Mw 52,000 (PDI 1.5-1.6).
MALS 분석. 대략 10　mg의 폴리머를 0.5　ml 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라하이드로푸란, 0.2% 트리에틸아민에서 용해시켰다. 분자량 및 다분산도 (PDI)을 Jordi 5μ 7.8×300 혼상식 LS DVB 칼럼을 사용하는 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다중각 광 산란 검출기를 사용하여 측정했다. 조 폴리머: MW: 73,000 (PDI 1.7), 분획 1: MW 87,000 (PDI:1.5), 분획 2: MW 52,000 (PDI 1.5-1.6)
정제된 BOC-보호된 폴리머를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl와 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 그룹을 제거하고 아민을 생산했다. 15　ml dH2O을 반응에 부가하고, 용액을 3500 MW 컷오프 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 높은 염에 대항하여 24 시간 동안 투석하고, 그 다음 dH2O에 대항하여 18 시간 동안 투석했다. 내용물을 동결건조시키고, 그 다음 DI　H2O에서 20 mg/ml의 농도에서 용해시켰다. 폴리머 용액을 2 내지 8 ℃에서 보관했다.
E. 폴리머 Lau24B를 상기에서와 같이 제조하지만, 모노머 공급 비는 72.5　BAEEA : 27.5 프로필 메타크릴레이트였다.
F. Ant-129-1을 본질적으로 상기에서 기재된 바와 같이 제조하지만, 하기 모노머를 사용했다:
Figure pct00078
표 10. Ant-129-1 폴리머 합성 반응물.
Figure pct00079
N-Boc-아미노-프로필-아크릴레이트 (BAPA)에 대해, 교반 바가 구비되고 아르곤으로 씻어낸 500　ml 둥근바닥 플라스크에서, 3-(BOC-아미노)1-프로판올 (TCI) (135.8　mmol)을 부가하고, 그 다음 240　ml 무수 디클로로메탄. 디이소프로필에틸 아민 (203.7　mmol)을 부가하고, 시스템을 드라이아이스/아세톤 배쓰에 두었다. 아크릴로일 클로라이드 (149.4　mmol)을 10 ml의 디클로로메탄을 사용하여 희석하고, 아르곤 씻어 낸 시스템에 적가했다. 시스템을 아르곤 하에 두었고 RT로 되도록 하고 밤새 교반했다. 생성물을 100　ml 각각의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화된 NaCl로 세정했다. 생성물, BOC-아미노 프로필 아크릴레이트 (BAPA)을, Na2SO4 상에서 건조시키고, 중력 여과하고, DCM을 회전식 증발로 증발시켰다. 생성물을 7.5 cm 직경 칼럼을 사용하여 29 cm 실리카상 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제했다. 사용된 용매계는 헥산 중 30% 에틸 아세테이트였다. Rf: 0.30. 분획을 수집하고 용매를 회전식 증발 및 고진공을 사용하여 제거했다. BAPA를 74% 수율로 얻었다. BAPA를 냉동고에서 보관했다.
G. 폴리머 Lau41648 -106. 모노머 몰 공급 비는 총 모노머 몰을 기준으로 80 BAEEA : 20 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8) 및 3% AIBN 촉매였다. BAEEA (6.53　g, 25.2　mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (0.808　g, 6.3　mmol) (B), AIBN (0.155　g, 0.945　mmol), 및 디옥산 (34.5　ml)을 교반 바가 있는 50 ml 유리관에 부가했다. 화합물 A 및 B를 실시예 16Ai에서 상기에서 기재된 바와 같이 제조했다. 반응을 트리플리케이트에서 설정했다. 각각의 용액에 긴 피펫을 사용하여 1 시간 동안 질소 거품을 일으겼다. 피펫을 제거하고 각각의 튜브를 주의 깊게 캡핑했다. 그 다음 각각의 용액을, 오일 배쓰를 사용하여 60 ℃에서 3 시간 동안 가열했다. 각각의 용액을 RT로 냉각되도록 하고 둥근바닥에서 조합했다. 조 폴리머를 감압 하에서 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 55,000 (PDI 2.1); 폴리머 조성물을 H1NMR을 사용하여 수득했다: 74:26 아민:알킬.
Figure pct00080
GPC 분획화 . 건조된 조 폴리머를 75% 디클로로메탄, 25% 테트라하이드로푸란, 및 0.2% 트리에틸아민에서 50 mg/ml로 취했다. 그 다음 폴리머를, 5 ml/분의 유속 및 10　ml 주사를 사용하여 Jordi Gel DVB 104 Å - 500mm/22mm 칼럼 상에서 분획화했다. 조기 분획을 15 내지 17 분 동안 수집하고, 나중의 분획을 17 내지 19 분 동안 수집했다. 분획 15-17: Mw 138,000 (PDI 1.1); 분획 17-19: Mw 64,000 (PDI 1.2).
MALS 분석. 대략 10　mg의 폴리머를 0.5　ml 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라하이드로푸란, 0.2% 트리에틸아민에서 용해시켰다. 분자량 및 다분산도 (PDI)을 Jordi 5μ 7.8×300 혼상식 LS DVB 칼럼을 사용하는 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다중각 광 산란 검출기를 사용하여 측정했다. 조 폴리머: MW: 55,000 (PDI 2.1), 분획 15-17: MW 138,000 (PDI:1.1), 분획 17-19: MW 64,000 (PDI 1.2)
정제된 BOC-보호된 폴리머를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl와 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 그룹을 제거하고 아민을 생산했다. 15　ml dH2O을 반응에 부가하고, 용액을 3500 MW 컷오프 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 높은 염에 대항하여 24 시간 동안 투석하고, 그 다음 dH2O에 대항하여 18 시간 동안 투석했다. 내용물을 동결건조시키고, 그 다음 DI　H2O에서 20 mg/ml의 농도에서 용해시켰다. 폴리머 용액을 2 내지 8 ℃에서 보관했다.
H. 폴리머 DW1360. 아민/부틸/옥타데실 폴리(비닐 에테르) 삼원중합체를, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드 (5　g, 23.02　mmol), 부틸 비닐에테르 (0.665　g, 6.58　mmol), 및 옥타데실 비닐에테르 (0.488　g, 1.64　mmol) 모노머로부터 합성했다. 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 아르곤의 블랭키트 하에서 36　ml 무수 디클로로메탄에서 자석 교반 막대를 내포한 200 ml 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 부가했다. 이 용액에 부틸 비닐 에테르 및 n-옥타데실 비닐 에테르를 부가했다. 모노머를 실온 (RT)에서 완전히 용해하여 맑은, 균질한 용액을 얻었다. 그 다음 맑은 용액을 수용한 반응 용기를, 드라이아이스의 ACS 등급 변성된 알코올 및 에틸렌 글리콜의1:1　용액에의 부가에 의해 산출된 -50 ℃ 배쓰에서 두었고 프탈이미드 모노머의 가시적인 침전이 형성되도록 했다. 약 1.5 분 동안 냉각한 후, BF3ㆍ(OCH2CH3)2 (0.058　g, 0.411　mmol)을 부가하여 중합 반응을 개시했다. 프탈이미드 모노머를 중합의 개시시에 용해시켰다. 반응을 3 시간 동안 -50 ℃에서 진행되도록 했다. 중합을 메탄올 중5 ml의 1% 수산화암모늄의 부가로 멈추었다. 그 다음 용매를 회전식 증발로 제거했다.
그 다음 폴리머를 30 ml의 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에서 용해시켰다. 이 용액에 하이드라진 (0.147　g, 46　mmol)을 부가하고 혼합물을 3 시간 동안 가열 환류시켰다. 그 다음 용매를 회전식 증발로 제거하고 그 다음 수득한 고형물을 20 ml의 0.5 mol/L HCl에서 취하고 15 분 동안 환류하고, 20 ml 증류수로 희석하고, 추가 시간 동안 환류시켰다. 그 다음 이러한 용액을 NaOH로 중화하고, RT로 냉각하고, 3,500 분자량 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 증류수에 대항하여 24 시간 동안 (2×20L) 투석하고, 동결건조시켰다.
I. 폴리머 Emi 1034-68C. 모노머 몰 공급 비는 52.5 BAEAA: 47.5 프로필 아크릴레이트 (CAS: 925-60-0) 및 6.66:1 비의 CTA (CPCPA) 대 개시제 (AIBN)였다. BAEAA (2.6851　g, 10.35　mmol), 프로필 아크릴레이트 (1.0742　g, 9.41　mmol), CPCPA (.0105　g, 0.0375　mmol), AIBN (0.000924g, 0.00563　mmol), 및 부틸 아세테이트 (15.9　ml)을 교반 바가 있는 40 ml 유리 바이알에 부가했다. 용액에 격막 캡에서 긴 피하 주사침을 사용하여 질소로 1 시간 동안 거품을 일으켰다. 바늘을 제거하고 용액을 오일 배쓰를 사용하여 80 ℃에서 16 시간 동안 가열했다. 각각의 용액을 RT로 냉각되도록 했다. 조 폴리머를 헥산 (~8× vol.)을 사용하여 침전시키고 원심분리했다. 용매를 경사분리하고 폴리머를 헥산으로 린스하고 DCM에서 용해시켰다. 용해된 폴리머를 헥산 (~8× vol.)으로 다시 침전시켰다. 원심분리 후, 용매를 경사분리하고 폴리머를 감압 하에서 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 59,640 (PDI 1.328); 폴리머 조성물을 H1NMR을 사용하여 수득했다: 55.4:44.6 아민:알킬.
Figure pct00081
분별 침전. 50 ml 원심관에서, 샘플을 초음파처리를 사용하여 25 mg 샘플/ml 용매에서 60% 헵탄/40% 디옥산에서 용해시켰다. 샘플에 10 초 동안 소용돌이를 일으키고 4 시간 동안 교반되도록 했다. 용매를 최상부에서 피펫팅하고 침전된 폴리머를 헥산으로 2회 린스했다. 샘플을 고진공으로 건조시켰다.
MALS 분석. 소량의 폴리머를 75% DCM, 20% THF, 및 5% ACN에서 10 mg/ml에서 용해시켰다. 분자량 및 다분산도 (PDI)을 Phenogel 5μ 선형(2) 7.8×300 칼럼을 사용하는 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다중각 광 산란 검출기를 사용하여 측정했다. 조 폴리머: MW: 59,640 (PDI 1.328), 분획 1: MW 80,540 (PDI:1.120).
Boc - 탈보호 . 정제된 BOC-보호된 폴리머를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl와 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 그룹을 제거하고 아민을 생산했다. 15　ml dH2O을 반응에 부가하고, 용액을 3500 MW 컷오프 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 높은 염에 대항하여 24 시간 동안 투석하고, 그 다음 dH2O에 대항하여 18 시간 동안 투석했다. 내용물을 동결건조시키고, 그 다음 DI　H2O에서 20 mg/ml의 농도에서 용해시켰다. 폴리머 용액을 2 내지 8 ℃에서 보관했다.
J. 폴리머 Emi1034 -81F. 모노머 몰 공급 비는 65 BAEAA: 35 부틸 아크릴레이트 (CAS: 141-32-2) 및 6.66:1 비의 CTA (CPCPA) 대 개시제 (AIBN)였다. BAEAA (0.9876　g, 3.809　mmol), 부틸 아크릴레이트 (0.2607　g, 2.034　mmol), CPCPA (0.0035　g, 0.0125　mmol), AIBN (0.000308g, 0.00188　mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.3　ml)을 교반 바가 있는 20 ml 유리 바이알에 부가했다. 용액에 격막 캡에서 긴 피하 주사침을 사용하여 질소로 1 시간 동안 거품을 일으켰다. 바늘을 제거하고 용액을 오일 배쓰를 사용하여 80 ℃에서 16 시간 동안 가열했다. 각각의 용액을 RT로 냉각되도록 했다. 조 폴리머를 헥산 (~8× vol.)을 사용하여 침전시키고 원심분리했다. 용매를 경사분리하고 폴리머를 헥산으로 린스하고 DCM에서 용해시켰다. 용해된 폴리머를 헥산 (~8× vol.)으로 다시 침전시켰다. 원심분리 후, 용매를 경사분리하고 폴리머를 감압 하에서 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 63,260 (PDI 1.318); 폴리머 조성물을 H1NMR을 사용하여 수득했다: 68.7:31.3 아민:알킬.
Figure pct00082
분별 침전. 50 ml 원심관에서, 샘플을 초음파처리를 사용하여 25 mg 샘플/ml 용매에서 60% 헵탄/40% 디옥산에서 용해시켰다. 샘플에 10 초 동안 소용돌이를 일으키고 4 시간 동안 교반되도록 했다. 용매를 최상부에서 피펫팅하고 침전된 폴리머를 헥산으로 2회 린스했다. 샘플을 고진공으로 건조시켰다.
MALS 분석. 소량의 폴리머를 75% DCM, 20% THF, 및 5% ACN에서 10 mg/ml에서 용해시켰다. 분자량 및 다분산도 (PDI)을 Phenogel 5μ 선형(2) 7.8×300 칼럼을 사용하는 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다중각 광 산란 검출기를 사용하여 측정했다. 조 폴리머: MW: 63,260 (PDI 1.318), 분획 1: MW 65,990 (PDI:1.246).
Boc - 탈보호 . 정제된 BOC-보호된 폴리머를 아세트산 (7 ml) 중 2M HCl와 0.5 시간 동안 반응시켜 BOC 보호 그룹을 제거하고 아민을 생산했다. 15　ml dH2O을 반응에 부가하고, 용액을 3500 MW 컷오프 셀룰로오스 튜우빙으로 이동시키고, 높은 염에 대항하여 24 시간 동안 투석하고, 그 다음 dH2O에 대항하여 18 시간 동안 투석했다. 내용물을 동결건조시키고, 그 다음 DI　H2O에서 20 mg/ml의 농도에서 용해시켰다. 폴리머 용액을 2 내지 8 ℃에서 보관했다.
K. 폴리머 LH1073-20C-1: 모노머 공급 비는 55 BAPVE (Boc-아미노 프로필 비닐 에스테르): 45 비닐 부티레이트 (CAS: 123-20-6), 및 10:1 비의 사슬 이동제 (MDPD) 대 개시제 (AIBN)였다. BAPVE (0.8　g, 3.72　mmol), MDPD (9.26　mg, 0.0229　mmol), AIBN (0.21　mg, 0.00229　mmol), 및 부틸 아세테이트 (0.5　ml)을 교반 바가 있는 20 ml 유리 바이알에 부가했다. 이러한 용액에 격막 캡에서 긴 피하 주사침을 사용하여 질소로 1 시간 동안 거품을 일으겼다. 과잉의 비닐 부티레이트의 별개의 바이알을 유사하게 탈기했다. 니들/ 질소를 제거하고 비닐 부티레이트 (0.35　g, 3.04　mmol)을 해밀턴 주사기로 반응 용액에 부가했다. 용액을 4 시간 동안 80 ℃에서 교반하고 그 다음 RT로 냉각되도록 했다. 수득한 점성 용액을 5 ml DCM에서 용해시키고 폴리머를 40 ml 헥산의 부가로 침전시켰다. 원심분리 후, 상부 용매를 경사분리하고 폴리머를 5 ml의 헥산으로 린스했다. 린스된 폴리머를 5 ml DCM에서 재용해시키고, 40　ml 헥산으로 한 번 도 침전시키고, 원심분리하고, 상부 용매를 경사분리했다. 그 다음 폴리머를 고진공 하에서 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 42,230 (PDI 1.205); 폴리머 조성물을 H1NMR을 사용하여 수득했다: 57.5: 42.5 아민: 알킬.
분별 침전: 50　ml 원심관에서, 폴리머를 10　ml DCM에서 용해시키고 충분한 헥산을 부가하여 구름점 초과의 용액을 얻었다 (대략 30　ml). 흐린 혼합물을 원심분리하고, 2개의 액체 층을 형성했다. 더 많은 점성의 최저 층을 제거하고, 5 ml DCM로 희석하고 40 ml의 헥산으로 완전히 침전시켜 분획을 얻었다. 용매의 원심분리 후 용매를 경사분리하고 폴리머 감압 하에서 건조시켰다. 분자량을 MALS을 통해 수득했다: 61,350 (PDI 1.205).
MALS 분석: 소량의 폴리머를 75%DCM, 20% THF, 및 5% ACN 중 10　mg/ml을 얻었다. 분자량 및 다분산도 (PDI)을, Phenogel 5u 선형 (2) 7.8x300 칼럼을 갖는 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다중각 광 산란 검출기를 사용하여 측정했다. 상기의 분자량 참고.
Boc - 탈보호: 분획화된 BOC-보호된 폴리머를 아세트산 (5　ml)에서2N　HCl와 반응시키고 1 시간 동안 교반하여 BOC 그룹을 제거하고 아민을 생산했다. 용액을 물 (30　ml)로 희석하고 수성 NaCl 용액 및 그 다음 탈이온수에 대항하여 2일에 걸쳐(3500 MWCO 셀룰로오스 튜우빙) 투석했다. 내용물을 동결건조시키고, 그 다음 20　mg/ml의 농도에서 탈이온수에서 용해시켰다. 폴리머를 2-8 ℃에서 보관했다.
Figure pct00083
L. 멜리틴 . 모든 멜리틴 펩타이드를 당해기술에서 펩타이드 합성 기술 표준을 사용하여 제조했다. 적합한 멜리틴 펩타이드는 모든 L-형 아미노산, 모든 D-형 아미노산 (인버소)일 수 있다. L 또는 D 형태와는 독립적으로, 멜리틴 펩타이드 서열은 역전될 숴 있다 (레트로).
실시예 25. 아지도 -PEG- 아민에 의한 말단 폴리머 변형. 셉타 캡 및 교반 바가 구비된 40 ml 신틸레이션 바이알에서, 폴리머 (Emi 1034-68C 클래스, 1　g, 0.0143　mmol)을 20 ml 무수 디클로로메탄 (Sigma)에서 용해시켰다. 펜타플루오로페놀 (Sigma, 26.3　mg, 0.143　mmol) 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (Sigma, 29.5　mg, 0.143　mmol)을 교반하면서 플라스크에 부가했다. 탈기용 N2 가스 라인 및 바늘을 사용하여, 시스템을 N2로 ~10 분 동안 퍼징했다. 반응을 실온에서 밤새 교반되도록 했다. 추가의 펜타플루오로페놀 (Sigma, 26.3　mg, 0.143　mmol) 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (Sigma, 29.5　mg, 0.143　mmol)을 플라스크에 부가하고, 시스템을 N2 가스로 퍼징하고, 반응을 3 시간 동안 실온에서 교반했다. 폴리머를 헥산 (~10× 용적, Sigma)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 경사분리했다. 폴리머를 최소 디클로로메탄에서 용해시키고, 헥산 (~10× 용적)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 경사분리했다. 폴리머를 최소 에틸 아세테이트(Sigma)에서 용해시키고, 헥산 (~10× 용적)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 경사분리했다. 폴리머 침전물을 고형물이 일정한 중량에 도달할 때까지 고진공 하에서 건조시켰다.
셉타 캡 및 교반 바가 구비된 40 ml 신틸레이션 바이알에서, 이전의 단계로부터 폴리머 (Emi 1034-68C 클래스, 1　g, 0.0143　mmol)을 20　ml 무수 디클로로메탄에서 용해시켰다. 아지도 PEG4 아민 (PurePeg, 37.5　mg, 0.143　mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (Sigma, 20.3mg, 0.157　mmol)을 교반하면서 플라스크에 부가했다. 시스템을 ~10분 동안 N2 가스로 퍼징하고, 반응을 실온에서 밤새 교반되도록 했다. 추가의 아지도 PEG4 아민 (PurePeg, 37.5　mg, 0.143　mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (Sigma, 20.3mg, 0.157　mmol)을 플라스크에 부가하고, 시스템을 N2 가스로 퍼징하고, 반응을 3 시간 동안 실온에서 교반했다. 폴리머를 헥산 (~10× 용적)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 경사분리했다. 폴리머를 최소 디클로로메탄에서 용해시키고, 헥산 (~10× 용적)으로 침전시키고, 원심분리하고, 용매를 경사분리했다. 폴리머 침전물을 고형물이 일정한 중량에 도달할 때까지 고진공 하에서 건조시켰다 (도 12).
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Claims (20)

  1. RNAi 유발제를 생체내 인테그린 양성 종양 세포로 전달하기 위한 화합물로서,
    하기로 나타낸 구조를 포함하는, 화합물.
    R-A 1 A 2 -아미도벤질-카바메이트-P
    여기서,
    R은 RGD 리간드를 포함하고, A 1 는 소수성 아미노산이고, A 2 는 아미드 결합을 통해 A 1 에 연결된 친수성 비하전된 아미노산이고, 상기 친수성 비하전된 아미노산은 중성 pH에서 비하전되고, 그리고 P는 막 활성 폴리아민을 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, A1은 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, A2는 시트룰린, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린은 αvβ3 인테그린인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R-A 1 A 2 -아미도벤질-카바메이트-P는 하기로 나타낸 구조를 갖는, 화합물.
    Figure pct00084

    여기서,
    R 4 는 RGD 리간드를 포함하고, R 1 은 소수성 아미노산의 측면 그룹이고, R 2 는 친수성 비하전된 아미노산의 측면 그룹이고, 그리고 폴리아민은 막 활성 폴리아민 P이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RGD 리간드는 RGD 모방체를 포함하는, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RGD 모방체는 아미드 결합을 통해 글리신-아스파르테이트 디펩타이드에 연결된 구아니디늄 그룹을 포함하는, 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 RGD 모방체는 하기로 나타낸 구조를 포함하는, 화합물:
    Figure pct00085
    .
  9. 제8항에 있어서, 상기 구아니디늄은 하기로부터 선택되는, 화합물:
    Figure pct00086
    및 이의 공명 구조, 및
    Figure pct00087
    및 이의 공명 구조.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R은
    RGD 모방체-PEG1-디아릴 하이드라존-PEG
    를 포함하는 화합물이고:
    여기서
    PEG1은 (CH2-CH2-O)n를 포함하고,
    PEG2는 (CH2-CH2-O)m를 포함하고,
    n 및 m은 독립적으로 4 이상의 정수이고,
    n+m의 합은 12-48이며
    RGD 모방체는 아래에 의해 나타낸 구조로 구성된다:
    Figure pct00088

    여기서,
    R14는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
    Figure pct00089
    및 이의 공명 구조, 및
    Figure pct00090
    및 이의 공명 구조.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 가역적인 생리적으로 불안정한 공유 결합을 통해 상기 막 활성 폴리아민에 연결된 폴리에틸렌 글리콜을 더 포함하는, 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 유발제는 상기 막 활성 폴리아민에 공유 결합하는, 화합물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화합물은 하기로 나타낸 구조를 갖는, 화합물:
    Figure pct00091

    여기서,
    N은 RNAi 유발제이고, L1은 생리적으로 불안정한 연결이고, PEG는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, L2는 A1A2-아미도벤질-카바메이트이고, y는 0 초과의 정수이고, z는 0 초과의 정수이고, 그리고 y 및 z의 합의 값은 개질되지 않은 막 활성 폴리아민 상의 아민의 수에 의해 측정 시, 막 활성 폴리아민 P 상에 존재하는 아민의 수의 50% 초과이다.
  14. 제13항에 있어서, P-L2-R은
    R-PEG'-디아릴 하이드라존-PEG"-AA-아미도벤질 카바메이트-폴리아민
    을 포함하는 화합물이고:
    여기서
    R는 하기로 나타낸 구조를 갖고:
    Figure pct00092
    ,
    PEG'는 하기로 나타낸 구조를 갖고:
    Figure pct00093

    (여기서 n=4-44),
    디아릴 하이드라존는 하기로 나타낸 구조를 갖고:
    Figure pct00094
    ,
    PEG"는 하기로 나타낸 구조를 가지며:
    Figure pct00095

    (여기서 m=4-44),
    AA-아미도벤질 카바메이트-폴리아민는 하기로 나타낸 구조를 갖는다:

    (여기서 폴리아민은 막 활성 폴리아민 P임).
  15. 막 활성 폴리아민을 가역적으로 개질시켜 RNAi 유발제를 생체내 인테그린 양성 종양 세포에 전달하기 위한 화합물의 형성 방법으로서,
    a) 하나 이상의 아민을, 각각 하기로 나타낸 구조를 갖는 하나 이상의 제1 화합물과 반응시켜 상기 폴리아민 상의 하나 이상의 아민을 가역적으로 개질시키는 단계:
    Figure pct00097

    여기서, R3은 아민과 반응하여 카바메이트를 형성할 수 있는 아민 반응성 카보네이트 모이어티를 포함하고, R7은 아민 반응성 카보네이트보다 아민 반응성이 적은 제1 반응성 그룹을 포함하고, R1은 소수성 아미노산의 측면 그룹이고, R2는 친수성 비하전된 아미노산의 측쇄이다: 및
    b) R7을 하기로 나타낸 구조를 갖는 제2 화합물과 반응시키는 단계:
    Figure pct00098

    여기서, R14는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00099
    ,
    A는 상기 R7의 제1 반응성 그룹과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 제2 반응성 그룹에 연결된 4 내지 44개의 에톡시 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다:
    를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, R7은 4 내지 44개의 에톡시 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 그룹을 더 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    하나 이상의 아민을, 각각 하기로 나타낸 구조를 갖는 하나 이상의 화합물과 반응시켜 상기 폴리아민 상의 하나 이상의 아민을 가역적으로 개질시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
    PEG-A1A2-아미도벤질-카보네이트
    여기서,
    PEG는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, A1은 소수성 아미노산이고, A2는 아미드 결합을 통해 A1에 연결된 친수성 비하전된 아미노산이고, 상기 친수성 비하전된 아미노산은 중성 pH에서 비하전된다.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아민 상의 아민의 수의 80% 또는 그 초과는 가역적으로 개질되고, 개질된 폴리아민은 막 활성이 없는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 유발제 분자는 생리적으로 불안정한 결합을 통해 상기 폴리아민에 공유 결합하는, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린은 αvβ3 인테그린인, 방법.

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