KR20150001710A - Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(아크릴레이트) 고분자 - Google Patents

Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(아크릴레이트) 고분자 Download PDF

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대런 에이치. 웨이크필드
니콜라스 로시
데이비드 비. 로제마
로렌 알메이다
안토니 엘. 페릴로-니콜라스
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애로우헤드 리서치 코오포레이션
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Abstract

본 발명은 in vivo 세포에 RNA 간섭 (RNAi) 폴리뉴클레오티드의 표적 전달용 막 활성 폴리(아크릴레이트) 고분자 및 조성물에 관한 것이다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 폴리(아크릴레이트) 고분자에 결합되고, 고분자는 가역적으로 변형되어 in vivo 표적 전달을 가능하게 한다. 폴리(아크릴레이트)의 막 활성은 세포의 외부로부터 세포의 내부로 RNAi 폴리뉴클레오티드의 이동을 제공한다. 가역적인 변형은 생리적 반응성을 제공한다.

Description

Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(아크릴레이트) 고분자 {Poly(acrylate) Polymers for In Vivo Nucleic Acid Delivery}
본 발명은 in vivo 핵산 전달용 폴리(아크릴레이트) 고분자에 관한 것이다.
살아있는 세포로 폴리뉴클레오티드 및 기타 실질적으로 세포막 불투과성 화합물의 전달은 세포의 복잡한 막 시스템에 의해 크게 제한된다. 안티센스, RNAi, 및 유전자 치료에 사용된 약물은 상대적으로 큰 친수성 고분자이고, 종종 크게 음으로 하전된다. 이러한 물리적 특성 모두 세포막 쪽으로 이들의 직접 확산을 방해한다. 이러한 이유로, 폴리뉴클레오티드 전달의 주요 장벽은 세포막을 통해 세포의 세포질 또는 핵으로 폴리뉴클레오티드의 전달이다.
in vivo 작은 핵산을 전달하는데 사용되었던 하나의 수단은 작은 표적 분자 또는 지질 또는 스테롤에 핵산을 결합한 것이었다. 어떤 전달 및 활성은 이러한 컨쥬게이트와 함께 관찰되는 동안, 실용화를 위해 이러한 방법과 함께 필요한 핵산 용량은 엄청나게 컸다.
in vitro 세포로 폴리뉴클레오티드의 상당히 효율적인 전달을 이루는 많은 형질감염 시약이 개발되었다. 그러나, 이러한 동일한 형질감염 시약을 이용한 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 복잡하고, in vivo 독성, 혈청 상호작용, 및 좋지 못한 표적에 의해 비효율적이 된다. in vitro에서 잘 작용하는 형질감염 시약, 양이온성 고분자 및 지질은, 일반적으로 큰 정전기 입자를 형성하고 세포막을 불안정화시킨다. in vitro 형질감염 시약의 양전하는 전하-전하(정전기) 상호작용을 통해 핵산과의 결합을 용이하게 함으로써 핵산/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 또한, 양전하는 세포에 비히클의 비특이적 결합 및 막 융합, 불안정화, 또는 파괴에 유익하다. 막의 불안정화는 실질적으로 세포막을 통해 세포막 불투과성 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 한다. 이러한 특성은 in vitro 핵산 전달을 용이하게 하는 반면, in vivo 독성 및 비효율적 표적을 야기한다. 양이온성 전하는 혈청 성분과 상호작용을 하고, 폴리뉴클레오티드-형질감염 시약 상호작용의 불안정화, 및 좋지 못한 생체이용률 및 표적을 야기한다. 형질감염 시약의 막 활성은, in vitro에서 효율적일 수 있고, 종종 in vivo에서 독성을 일으킨다.
in vivo 전달의 경우, 비히클 (핵산 및 관련된 전달제)은 직경 100㎚ 미만, 바람직하게는 50㎚ 미만으로 작아야 한다. 20㎚ 미만 또는 10㎚ 미만의 더 작은 복합체도 여전히 더 유용할 것이다. 100㎚ 보다 더 큰 전달 비히클은 in vivo 혈관 세포 이외의 세포에 거의 접근하지 않는다. 정전기적 상호작용에 의해 형성된 복합체는 생리 식염수 농도 또는 혈청 성분에 노출되었을 때 응집하거나 또는 분해되는 경향이 있다. 또한, in vivo 전달 비히클에 대한 양이온성 전하는 반대 혈청 상호작용을 야기하여 좋지 못한 생체이용률을 일으킨다. 흥미롭게도, 높은 음전하도 표적에 필요한 상호작용을 간섭하여, in vivo 전달을 억제할 수 있다. 따라서, 중성에 가까운 비히클이 in vivo 분포 및 표적에 바람직하다. 주의 깊은 조절 없이, in vivo에서 사용될 때 막 파괴 또는 불안정한 활성은 독성이다. 비히클 독성과 핵산 전달의 균형은 in vivo 보다 in vitro에서 더 쉽게 도달한다.
로제마 등의 미국특허공개 20040162260은 일차 아민이 카복실기의 쌍 (2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물의 β 카복실 및 γ 카복실)으로의 가역적인 전환에 의해 막 활성 폴리아민의 막 파괴 활성을 가역적으로 조절하는 방법을 설명하였다. 로제마 등 (Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57)은 β 카복실이 완전 겉보기 음전하를 나타내지 않고 그 자체가 막 활성을 억제하지 않았을 수 있다는 것을 보고하였다. γ 카복실기의 첨가는 효과적인 막 활성 억제에 필수적인 것으로 보고되었다. 그러나, 비히클은 핵산 및 높은 음전하 밀도를 가진 변형된 고분자와 함께 크게 음으로 하전되기 때문에, 이 시스템은 in vivo 전달에 효율적이지 않았다.
로제마 등은 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물의 γ 카복실을 중성 친수성 표적 (갈락토오스) 및 입체적 안정화 (PEG) 기로 치환하여, 효과적인 in vivo 간세포 표적을 포함하는 동안 막 활성의 전체 수 용해도 및 가역적인 억제를 유지할 수 있었다 (미국특허공개 20080152661).
우리는 지금 in vivo 세포로 핵산의 전달에 사용하기 위한 새로운 막 활성 고분자 및 기재된 고분자로 제조된 조성물을 기재한다. 이러한 새로운 고분자는 이전에 기재된 것보다 개선된 치료 가능성을 제공한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 in vivo 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달에 특히 적합한 양극성(amphipathic) 양이온성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체를 특징으로 한다. 본 발명의 양극성 양이온성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 다수의 아민-함유 아크릴레이트 단량체 및 다수의 제 1 소수성 아크릴레이트 단량체를 포함한다. 아민-함유 단량체는 펜던트 일차 아민기를 함유한다. 소수성 단량체는 탄화수소 기, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알콕시 알킬기, 방향족 기, 및 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택된 2-20 탄소 원자를 가진 펜던트 소수성 기를 함유한다. 고분자는 다수의 제 2 아민-함유 아크릴레이트 단량체 또는 다수의 제 2 소수성 아크릴레이트 단량체를 더 포함할 수 있다. 제 2 아민-함유 아크릴레이트 단량체는 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, 사차 아민, 보호된 아민, 질소 헤테로고리, 알디민, 히드라지드, 히드라존, 및 이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택된 펜던트 아민기를 함유한다. 양극성인 것 외에도, 본 발명의 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 막 활성적이다. 바람직한 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 일차 아민-함유 알킬 아크릴레이트 단량체를 포함한다.
본 발명의 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 2, 3, 또는 4개의 다른 단량체로부터 합성될 수 있다. 단량체는 보호된 아민 아크릴레이트, 이미다졸 아크릴레이트, 알킬 아크릴레이트, 알케닐 아크릴레이트, 알키닐 아크릴레이트, 방향족 아크릴레이트, 및 아릴 아크릴레이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 보호된 아민 아크릴레이트 단량체는 tert-부톡시카보닐 (Boc) 보호된 아민 함유 아크릴레이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보호된 일차 아민 단량체는 알킬 아크릴레이트 단량체와 함께 공중합된다. 그 다음, 아민 보호기는 중합 후 제거되어 수성 가용성, 양극성 랜덤 공중합체를 형성한다. 지방족 소수성 기는 선형, 분기형, 또는 고리형일 수 있고, 하나 이상의 헤테로원자의 치환을 함유할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 RAFT(Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) 중합에 의해 합성된다. 하나의 실시예에서, RAFT 중합은 말로네이트 N,N-디페닐 디티오카바메이트 (MDP-DTC)를 이용하여 수행된다. RAFT 중합, 및 임의로 분획화를 이용하여, 1.5 미만, 또는 바람직하게는 1.4 미만 또는 1.3의 다분산도를 가진 고분자가 가능하다.
in vivo 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달의 경우, 기재된 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 가역적으로 변형된다. 가역적인 변형은 본 명세서에 정의된 바와 같이, 다수의 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 고분자 일차 아민에 다수의 차폐제의 결합을 포함한다. 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합은 pH 불안정한 결합 및 효소적으로 절단할 수 있는 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 가역적인 변형은 고분자 일차 아민이 고분자에 차폐제를 결합하는 생리적으로 불안정한 공유결합을 절단하여 회복된다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 고분자 일차 아민은 차폐제의 가역적인 결합에 의해 변형된다. 차폐제는 입체적 안정화제 및 표적 기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 차폐제는 in vivo에서 고분자 또는 고분자-폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 체내분포(biodistribution) 또는 표적을 개선시킨다. 차폐제는 고분자와 혈청 성분 또는 비-표적 세포의 비-특이적 상호작용을 억제할 수 있다. 차폐제는 고분자 또는 고분자-폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 응집을 감소시킬 수 있다. 표적 기를 함유하는 차폐제는 세포 표면 수용체에 컨쥬게이트 시스템을 표적하여 세포-특이적 표적 또는 세포 내재화를 향상시킨다. 차폐제는 폴리뉴클레오티드에 고분자의 결합 전 또는 이후에 고분자에 결합될 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 제 2 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 본 발명의 고분자에 결합된다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 제 2 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 본 발명의 고분자에 결합될 수 있다. 고분자에 차폐제를 결합하는 불안정한 결합인 제 1 불안정한 결합, 및 고분자에 폴리뉴클레오티드를 결합하는 불안정한 결합인 제 2 불안정한 결합은 동일하거나 유사한 조건 하에 절단될 수 있고, 또는 이들은 전혀 다른 조건 하에 절단될 수 있다, 즉 이들은 직교(orthogonal) 불안정한 결합일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 차단(blocking) 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드, siRNA, microRNA, mRNA 및 shRNA를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 제 2 생리적으로 불안정한 공유결합은 pH 불안정한 결합, 효소적으로 절단할 수 있는 결합, 이황화 결합, 및 핵산 에스터 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 우리는 a) 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 하나 이상의 표적 기 및/또는 입체적 안정화제; 및 b) 직교 제 2 불안정한 공유결합을 통해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 공유결합된 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체를 포함하는 조성물을 기재한다. 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서 포유동물에 투여된다.
바람직한 실시예에서, 우리는 세포에 막 불투과성 분자의 전달 및 세포에서 분자의 방출을 위한 고분자 컨쥬게이트 시스템을 기재한다. 고분자 컨쥬게이트 시스템은 본 발명의 가역적으로 변형된 폴리(아크릴레이트)에 가역적으로 결합된 막 불투과성 분자를 포함한다. 바람직한 막 불투과성 분자는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 siRNA 또는 miRNA를 포함한다. 고분자 또는 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서 포유동물에 투여된다.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 하나 이상의 표적 기 및/또는 입체적 안정화제에 공유결합된 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체, 및 폴리뉴클레오티드 표적 기에 결합된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 (폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트)를 포함하는 in vivo 간세포로 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 조성물을 특징으로 한다. 바람직한 폴리뉴클레오티드 표적 기는 적어도 20 탄소 원자를 함유하는 소수성 기이다. 다른 바람직한 폴리뉴클레오티드 표적 기는 3가(trivalent) 갈락토사민이다. 폴리(아크릴레이트) 및 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트는 개별적으로 합성되고, 별도의 용기 또는 단일 용기에서 공급될 수 있다. 이 조성물에서, 폴리뉴클레오티드는 고분자에 결합되지 않는다. 변형된 고분자 및 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서 포유동물에 투여된다. 하나의 실시예에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 포유동물에 투여 전 용액에서 혼합될 수 있다. 다른 실시예에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 별도의 용액으로 포유동물에 병용 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 순차적으로 포유동물에 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 전달 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 투여 전에 투여될 수 있다. 대안적으로, 순차적 투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 전달 고분자의 투여 전에 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, 기재된 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 in vitro 포유동물 세포에 폴리뉴클레오티드의 전달에 적합하다. in vitro 세포 전달의 경우, 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 상기 기재된 바와 같이 가역적으로 변형될 수 있거나 또는 가역적인 변형 없이 사용될 수 있다. 또한, 이들은 지질 또는 다른 고분자와 조합될 수 있다.
본 발명은 핵산, 펩티드, 및 단백질과 같은 생물학적 활성 물질의 전달에 유용한 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 및 이의 컨쥬게이트 시스템에 관한 것이다. 살아있는 세포로 핵산 및 기타 실질적으로 세포막 불투과성 화합물의 전달은 세포의 복잡한 막 시스템에 의해 크게 제한된다. in vivo 전달의 경우, 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 생리적으로 불안정한 결합을 통해 차폐제의 공유결합에 의해 가역적으로 변형된다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 화학식 (I)의 막 활성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체에 관한 것이다:
Figure pct00001
여기서,
N은 -NH2 형태를 가진 일차 아민이고,
N'는 -NR5H, -NR5R6, 또는 -NR5R6R7 형태를 가진 이차, 삼차, 또는 사차 아민이며, 여기서 R5, R6, 및 R7은 독립적으로 -CH3 및 -CH2-CH3로부터 선택되고, 또는 대안적으로 N'는 질소 헤테로고리, 알디민, 히드라지드, 히드라존, 또는 이미다졸일 수 있으며,
Y 및 Y'는 링커 기이고,
R 및 R'는 독립적으로 2-20 탄소 원자를 가진 본 명세서에 정의된 바와 같은 소수성 기 또는 알콕실 에틸기, -(CH2) l -O-CH2-CH3 이며, 여기서 l은 2, 3, 또는 4이고 (바람직한 알콕시 알킬기는 2-에톡시에틸 기, -(CH2)2-O-CH2-CH3이다),
R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소 (-H) 및 메틸 (-CH3)로부터 선택되며,
m 및 p는 영(0)보다 큰 정수이고,
n 및 q는 영(0)보다 크거나 같은 정수이며,
(m+n)/(p+q) 비는 0.67-5.7 (40-85% 아민) 및 더 바람직하게는 1.2-4 (55-80% 아민)이다.
바람직한 R 기는 2-6 탄소 원자를 가진 소수성 기이다.
링커 기 Y 및 Y'는 비전하이고 1-24 탄소 원자를 통해 아크릴레이트에 질소를 결합하며, 이들 중 하나 이상은 헤테로원자로 치환될 수 있다. 바람직한 실시예에서, Y 및 Y'는 독립적으로 1-12 탄소 원자를 함유하며, 이들 중 하나 이상은 헤테로원자로 치환될 수 있다. 하나의 실시예에서, Y 및 Y'는 독립적으로 -(CH2)x- 및 -(CH2-CH2-O)z-(CH2)x-로부터 선택되며, 여기서 x 및 z는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
다른 실시예에서, 형광 단량체와 같은 단량체는 실험 검출(experimental detection)의 보조를 위해 고분자에 포함될 수 있다. 예시적인 형광 단량체는 9-안트라세닐메틸 아크릴레이트이다. 이러한 단량체는 0.005 미만의 매우 낮은 %로 포함되고, 그래서 이들은 고분자의 생물학적 특성에 상당히 영향을 미치는 것으로 생각되지 않는다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 화학식 (Ia)의 아크릴레이트 랜덤 공중합체에 관한 것이다:
Figure pct00002
여기서,
N은 -NH2 형태를 가진 일차 아민이고,
Y는 상기 기재된 바와 같은 링커 기이며,
R은 2-6 탄소 원자를 가진 본 명세서에 정의된 바와 같은 소수성 기 또는 알콕실 알킬기, -(CH2) l -O-CH2-CH3이고, 여기서 l은 2, 3, 또는 4이며 (바람직하게는 2-에톡시에틸 기),
R1 및 R3는 독립적으로 수소 (-H) 및 메틸 (-CH3)로부터 선택되고,
m은 영(0)보다 큰 정수이며,
p는 영(0)보다 큰 정수이고,
m/p 비는 0.67-5.7 (40-85% 아민) 및 더 바람직하게는 1.2-4 (55-80% 아민)이다.
바람직한 실시예에서, R1은 수소이고, R3은 메틸이다. 다른 바람직한 실시예에서, R1은 수소이고, R3은 메틸이며, m/p는 1.86-3 (65-75% 아민 단량체)이다. 다른 바람직한 실시예에서, R1 및 R3은 각각 수소이다. 다른 바람직한 실시예에서, R1 및 R3은 각각 수소이고, m/p는 1-1.86 (50-65% 아민 단량체)이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, R1은 수소이고, Y는 에톡시에틸, 프로필, 부틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R은 2-4 탄소 원자를 가진 본 명세서에 정의된 바와 같은 소수성 기 또는 알콕실 알킬기, -(CH2) l -O-CH2-CH3 (여기서 l은 2, 3, 또는 4이다)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 2-4 탄소 원자를 가진 소수성 기는 프로필, 부틸, 에틸, 및 sec-부틸로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 고분자는 일반적으로 본 명세서에 기재된 대로 그리고 유기 또는 의약 화학의 기술분야에서 숙련된 자에게 알려진 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 고분자는 소수성 기-함유 아크릴레이트 단량체 및 보호된 아민-함유 아크릴레이트 단량체로부터 중합된다. 본 발명의 고분자를 형성하기 위한 중합은 바람직하게는 RAFT(Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) 중합을 이용하여 수행된다. 하나의 실시예에서, RAFT 중합은 RAFT 시약인 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산을 이용하여 수행된다. 그러나, 도 4에 나타낸 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 RAFT 시약도 가능하다. 고분자 합성은 보호된 아민 단량체를 이용하여 수행된다. 아민의 탈보호화는 N이 -NH2인 화학식 (I) 또는 (Ia)의 아민-함유 고분자를 생성한다.
RAFT(Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) 중합은 조절된 라디칼 중합의 형태이다. 더 상세하게는, RAFT는 가역적인 사슬 전달 시약의 존재 하에 종래의 라디칼 중합과 관련된 현재 사용되는 중합의 유형이다. RAFT 중합은 많은 단량체에 대해 조절된 분자량 및 1.5 및 1.6 사이의 낮은 다분산도(PDI)를 가진 넓은 범위의 고분자의 합성을 가능하게 한다. 본 발명의 폴리(아크릴레이트)는 1.5 미만, 더 바람직하게는 1.4 미만 또는 1.3의 다분산도를 가진다. 분획화는 다분산도를 더 감소시키기 위해 사용될 수 있다. RAFT 중합은 WO9504026, WO9801478, WO9905099, WO9931144, WO10083569, 미국특허 6,291,620, 미국특허 6,376,626, 미국특허 6,642,318, 및 미국특허 6,747,111에 기재된다. 또한, 20,000 이상의 분자량 및 낮은 다분산도를 가진 고분자는 RAFT 중합과 함께 가능하고, in vivo 전달에 대해 바람직하다. 거대 분자의 경우, 효과적으로 혈류를 통해 순환하고 신장에 의해 제거되지 않도록 하기 위해, 30,000 - 50,000 이상의 분자량이 종종 바람직하다.
본 발명의 변형되지 않은 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체의 본질적인 특징은 이들이 막 활성적이라는 것이다; 즉, 이들은 원형질막 또는 리소좀/세포내 이입 막(lysosomal/endocytic membranes)을 파괴할 수 있다. 그러나, 고분자가 in vivo 투여될 때 막 활성은 독성을 일으킬 수 있다. 또한, 폴리아민은 in vivo에서 많은 음이온성 성분과 즉시 반응하여, 원하지 않는 체내 분포를 이끈다. 따라서, 폴리아민의 막 활성의 가역적인 억제는 in vivo 용도에 사용된다. 이 억제는 고분자 아민에 차폐제의 가역적인 생리적으로 불안정한 결합을 통해 이루어져 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리(아크릴레이트), 즉 본 명세서에서 전달 고분자라고도 불리는 것을 형성한다. 막 활성의 억제 외에, 차폐제는 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하고, 혈청 상호작용을 감소시키며, 순환시간을 증가시키고, 또는 세포-특이적 상호작용, 즉 표적을 제공한다. 또한, 가역적인 결합의 공정은 양전하를 감소시켜 중성에 가까운 전하 고분자를 형성한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, '불안정한'은 고분자에 차폐제의 결합이 생리적 조건 하에 일반적으로 존재하는 조건 하에 즉시 절단된다는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, '가역적인'은 고분자에 차폐제를 결합하는 결합의 절단이 미리-변형된 상태, 즉 일차 아민으로 고분자 아민의 회복을 야기하는 것을 의미한다.
바람직한 가역적인 생리적으로 불안정한 결합은 생리적으로 불안정한 공유결합 또는 포유동물 세포 내 조건 하에 절단할 수 있는 공유결합을 포함한다. 바람직한 불안정한 공유결합은 pH 불안정한 결합을 포함한다. 바람직한 pH 불안정한 생리적으로 불안정한 결합은 말레아메이트를 포함한다. 다른 바람직한 생리적으로 불안정한 결합은 효소적으로 절단할 수 있는 결합을 포함한다. 바람직한 효소적으로 절단할 수 있는 결합은 펩티드 (아미드) 결합이다. 바람직한 펩티드 결합은 미국특허출원 13/326,433에 기재된 바와 같은 디펩티드-아미도벤질-카보네이트를 포함하고, 참조로 본 명세서에 포함된다.
전체적으로, 이들은 고분자의 막 활성을 억제하고, 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하며 (혈청 상호작용 감소, 순환시간 증가), in vivo 세포 표적을 제공하는 것이 차폐제의 본질적인 특징이다. 본 발명의 막 활성 폴리(아크릴레이트)는 변형되지 않은(차폐되지 않은) 상태에서 막 활성적이고, 변형된(차폐된) 상태에서 막 활성적이지 않다(불활성적이다). 차폐제의 충분한 수가 고분자에 결합되어 원하는 수준의 불활성화를 이룬다. 차폐제의 결합에 의한 폴리(아크릴레이트)의 원하는 수준의 변형은 적당한 막 활성 어세이를 이용하여 즉시 측정된다. 예를 들어, 만일 폴리(아크릴레이트)가 정해진 어세이에서 막 활성을 가진다면, 충분한 수준의 차폐제가 고분자에 결합되어 그 어세이에서 원하는 수준의 막 활성의 억제를 이룬다. 어떠한 차폐제 없이 고분자 위에 있는 아민의 양에 의해 측정된 대로, 차폐는 고분자 위에 있는 아민기의 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%의 변형을 필요로 한다. 또한, 차폐제의 바람직한 특성은 고분자에 이들의 결합이 고분자의 순 (net) 전하를 감소시킴으로써 더 중성의 전달 고분자를 형성하는 것이다. 차폐된 고분자는 수성 용해도를 유지하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 만일 변형된 고분자가 막 활성을 나타내지 않고 in vivo 세포-특이적 (예를 들어, 간세포) 표적을 나타내면, 본 발명의 막 활성 폴리(아크릴레이트)는 차폐된다. 만일 고분자에 차폐제를 결합하는 결합의 절단이 폴리(아크릴레이트) 위에 있는 아민을 회복시켜 막 활성이 회복되면, 본 발명의 막 활성 폴리(아크릴레이트)는 가역적으로 차폐된다.
차폐제가 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 막 활성 폴리(아크릴레이트)에 결합되는 것이 다른 본질적인 특징이다. 가역적인 생리적으로 불안정한 결합(linkages) 또는 결합(bonds)을 이용함으로써, 차폐제는 in vivo 고분자로부터 절단될 수 있고, 이로써 고분자를 차폐하지 않고 차폐되지 않은 고분자의 활성을 회복시킬 수 있다. 적당한 가역적인 결합을 선택함으로써, 원하는 세포 유형 또는 세포 위치에 전달 또는 표적된 후 막 활성 고분자의 활성을 회복시키는 컨쥬게이트를 형성하는 것이 가능하다. 결합의 가역성은 막 활성 고분자의 선택적 활성을 제공한다. 적당한 가역적인 공유결합은 생리적으로 불안정한 결합, 세포의 생리적으로 불안정한 결합, 프로테아제 민감성 결합, pH 불안정한 결합, 매우 pH 불안정한 결합, 및 극도로 pH 불안정한 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 가역적인 불안정한 결합을 함유한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 차폐제는 세포 표적 기 또는 입체적 안정화제를 가진 화합물 및 아민-반응성 기를 포함하고, 폴리(아크릴레이트) 위에 있는 아민과 아민-반응성 기의 반응은 가역적인 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 고분자에 표적 기 또는 입체적 안정화제의 결합을 야기한다. 바람직하게는, 차폐제는 중성 전하이다. 바람직한 표적 기는 아시알로당단백질 수용체 (Asialoglycoprotein Receptor, ASGPr) 표적 기이다. ASGPr 표적 기는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 가지는 기, 일반적으로 당류(saccharides)이다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 본 발명의 바람직한 차폐제는 수용액에서 본 발명의 폴리(아크릴레이트)를 변형시킬 수 있다 (고분자와 함께 가역적인 결합을 형성한다).
바람직한 아민-반응성 기는 이치환된 말레익 무수물을 포함한다. 바람직한 차폐제는 하기 구조로 표시된다:
Figure pct00003

여기서, R1은 메틸기 (-CH3), 에틸기 (-CH2CH3), 또는 프로필기 (-CH2CH2CH3)와 같은 알킬기이고, R2는 중성 표적 기 또는 중성 입체적 안정화제를 포함한다. 더 바람직하게는, 표적 기 및 입체적 안정화제는 비전하(uncharged)이다. R1 또는 R2가 수소인 일치환된(Monosubstituted) 말레익 무수물은 기재된 발명에 적합하지 않은 결합을 생성한다. 말레익 무수물과 아민의 반응은 β 카복실 기를 생성하는 반면, β 카복실은 완전히 겉보기 음전하를 나타내지 않는다 (Rozema et al. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57). 따라서, R1 및 R2가 중성 전하인 말레익 무수물-계 차폐제를 사용하여 높은 음전하를 부여하지 않고 폴리아민을 중성화시킬 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 폴리(아크릴레이트) 폴리아민은 다수의 이치환된 말레익 무수물과 함께 반응하여 가역적으로 변형된다. 따라서, 본 발명은 화학식 (II) 및 (IIa)의 랜덤 공중합체를 제공한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
여기서, N, N', Y, Y', R, R', R1, R2, R3, R4, m, n, p, q는 상기 화학식 (I) 및 (Ia)에 제공된 의미를 가지며,
m1은 0 보다 크거나 같은 정수이고, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 m 보다 작거나 같으며,
m3 은 0 보다 크거나 같은 정수이고, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 m 보다 작거나 같으며,
m1 + m2 + m3은 화학식 (I) 또는 (Ia)의 m이고,
m1 + m3은 m2 보다 크거나 같으며 [즉, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 0.5×m 보다 크거나 같으며, 화학식 (I) 또는 (Ia)의 m 보다 작거나 같다],
R7은 알킬기이고 R8은 중성 표적 기를 포함하거나, 또는 R8은 알킬기이고 R7은 중성 표적 기를 포함하며,
R9은 알킬기이고 R10은 중성 입체적 안정화제를 포함하거나, 또는 R10은 알킬기이고 R9은 중성 입체적 안정화제를 포함한다.
다른 바람직한 차폐제는 하기 구조로 표시되는 프로테아제 민감성 디펩티드-아미도벤질-카보네이트를 포함한다:
Figure pct00006
여기서, R4는 중성, 바람직하게는 비전하, 표적 기 또는 입체적 안정화제를 포함하고, R3은 아민 반응성 카보네이트 기를 포함하며, R1 및 R2는 아미노산 곁사슬(side chain)이다. 바람직한 디펩티드에서, R1은 소수성 아미노산 곁사슬이고, R2는 비전하 친수성 아미노산 곁사슬이다. 바람직한 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 알라닌, 또는 트립토판이다. 바람직한 비전하 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 또는 시트룰린이다. 더 바람직한 소수성 아미노산은 페닐알라닌 또는 발린이다. 더 바람직한 비전하 친수성 아미노산은 시트룰린이다. 바람직한 활성화된 카보네이트는 파라-니트로페놀이다. 그러나, 기술분야에서 알려진 다른 아민 반응성 카보네이트는 파라-니트로페놀을 즉시 치환한다. 활성화된 카보네이트와 아민의 반응은 펩티다제 절단할 수 있는 디펩티드-아미도벤질 카바메이트 결합을 통해 막 활성 폴리아민에 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 연결한다. 아미노산과 아미도벤질 기 사이에서 디펩티드의 효소 절단은 고분자로부터 R4를 제거하고 제거 반응을 일으켜 고분자 아민을 재생한다.
디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제와 폴리(아크릴레이트)의 아민의 반응은 폴리(아크릴레이트)의 가역적인 변형을 야기한다. 따라서, 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제와 함께 변형에 의해 차폐된 본 명세서에 기재된 양극성 막 활성 폴리(아크릴레이트)를 포함하는 컨쥬게이트가 본 명세서에 제공된다. 그래서 차폐된 고분자는 하기 화학식 (III)을 가진다:
Figure pct00007
여기서,
X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2- 이고,
Y는 -NH- 또는 -O- 이며,
R1은 바람직하게는 -(CH2)k-페닐 (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6이고; k=1 페닐알라닌), -CH-(CH3)2 (발린), -CH2-CH-(CH3)2 (류신), -CH(CH3)-CH2-CH3 (이소류신), -CH3 (알라닌), -(CH2)2-COOH (글루탐산), 또는
Figure pct00008
(트립토판) 이고;
R2는 바람직하게는 수소 (글리신), -(CH2)3-NH-C(O)-NH2 (시트룰린), -(CH2)4-N-(CH3)2 (리신(CH3)2), -(CH2)k -C(O)-NH2, (k는 1, 2, 3, 4, 5, 6 이다), -CH2-C(O)-NH2 (아스파라긴), -(CH2)2-C(O)-NH2 (글루타민), -CH2-C(O)-NR1R2 (아스파르트산 아미드), -(CH2)2-C(O)-NR1R2 (글루탐산 아미드), -CH2-C(O)-OR1 (아스파르트산 에스터), 또는 -(CH2)2-C(O)-OR1 (글루탐산 에스터) 이고, R1 및 R2는 알킬기이며,
R4는 중성 폴리에틸렌 글리콜 또는 표적 리간드를 포함하고;
폴리아민은 양극성 막 활성 폴리(아크릴레이트) 이다.
상기 구조는 고분자에 결합된 단일 디펩티드 차폐제를 나타내는 반면, 본 발명의 실행에서, 50% 내지 90% 또는 그 이상의 고분자 아민은 디펩티드 차폐제에 의해 변형된다.
본 발명의 막 활성 폴리(아크릴레이트)는 과량의 차폐제의 존재 하에 차폐제에 결합될 수 있다. 과량의 차폐제는 전달 고분자의 투여 전에 결합된 전달 고분자로부터 제거될 수 있다.
하나의 실시예에서, 막 활성 폴리(아크릴레이트) 폴리아민은 폴리아민 위에 있는 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%의 아민에 표적 기 차폐제 또는 입체적 안정화제 차폐제의 결합에 의해 가역적으로 차폐된다. 다른 실시예에서, 막 활성 폴리아민은 폴리아민 위에 있는 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%의 아민에 표적 기 차폐제와 입체적 안정화제 차폐제의 조합의 결합에 의해 가역적으로 차폐된다. 다른 실시예에서, 표적 기 차폐제는 PEG 링커를 통해 아민-반응성 기에 결합된 표적 기를 포함한다. 표적 기 차폐제와 입체적 안정화제 차폐제 모두와 차폐하는 막 활성 폴리아민의 경우, 입체적 안정화제 대 표적 기의 비가 약 0-4:1, 더 바람직하게는 약 0.5-2:1 이다. 다른 실시예에서는, 약 1.3-2 입체적 안정화제 차폐제 대 약 1 표적 기 차폐제가 있다.
본 발명의 추가 실시예에서, 생물학적으로 활성 화합물, 바람직하게는 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드에 공유결합된 화학식 (I) 또는 (Ia)의 고분자의 컨쥬게이트를 제공한다. 바람직하게는, 고분자는 생리적으로 불안정한 결합에 의해 폴리뉴클레오티드에 공유결합된다. 바람직한 생리적으로 불안정한 결합은 생리적으로 불안정한 결합을 통해 차폐제에 직교이다. 적당한 생리적으로 불안정한 결합은 생리적으로 불안정한 결합, 세포의 생리적으로 불안정한 결합, pH 불안정한 결합, 매우 pH 불안정한 결합, 극도로 pH 불안정한 결합, 효소적으로 절단할 수 있는 결합 (적당한 에스터, 아미드, 및 포스포디에스터 결합 포함), 및 이황화 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
우리는 폴리뉴클레오티드가 세포에 전달된 후 끊어진 가역적인 링커를 통해 고분자에 폴리뉴클레오티드를 결합함으로써, in vivo 세포에 기능적으로 활성 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다. 불안정한 링커는 이들이 특정 생리적 조건 (예를 들어, 세포의 세포질 환경이 감소하는)에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다. 본 발명의 폴리(아크릴레이트)에 폴리뉴클레오티드의 결합은 in vivo 세포에 폴리뉴클레오티드의 전달을 향상시킨다. 불안정한 결합의 절단에 의해 고분자로부터 폴리뉴클레오티드의 방출은 활성에 대해 적당한 세포의 성분과 폴리뉴클레오티드의 상호작용을 용이하게 한다.
RNAi 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 고분자에 RNAi 폴리뉴클레오티드를 결합함으로써 형성된다. 폴리뉴클레오티드는 반응성 기 A를 함유하도록 합성되거나 또는 변형된다. 또한, 고분자는 반응성 기 B를 함유하도록 합성되거나 또는 변형된다. 반응성 기 A 및 B는 이들이 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 생리적으로 불안정한 공유결합을 통해 결합될 수 있도록 선택된다. 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. 비록 센스 가닥이 바람직하지만, siRNA 폴리뉴클레오티드의 경우, 표적 기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 결합될 수 있다.
화학식 (I) 및 (Ia)의 고분자의 곁사슬 일차 아민에 RNAi 폴리뉴클레오티드의 결합은 화학식 (IV) 및 (IVa)의 고분자가 된다.
Figure pct00009
여기서, N, N', Y, Y', R, R', R1, R2, R3, R4, m, n, p, q는 상기 화학식 (I) 및 (Ia)에 제공된 의미를 가지며,
m1은 1, 2, 3, 또는 4이고,
m1 + m2는 화학식 (I) 또는 (Ia)의 m이며,
링커는 생리적으로 불안정한 링커를 포함한다.
다른 실시예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 화학식 (V) 및 (Va)에 예시된 바와 같이 고분자 백본(backbone) 말단에 결합된다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 다른 말단에 결합될 수 있다.
Figure pct00010
여기서, N, N', Y, Y', R, R', R1, R2, R3, R4, m, n, p, q는 상기 화학식 (I) 및 (Ia)에 제공된 의미를 가지며, 링커는 생리적으로 불안정한 링커를 포함한다.
본 발명의 추가 실시예에서, 변형되지 않은 고분자에 대해 상기 나타낸 바와 같이, 생물학적으로 활성 화합물, 바람직하게는 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드에 공유결합된 화학식 (II), (IIa) 및 (III)의 고분자의 컨쥬게이트를 제공한다. 바람직하게는, 고분자는 생리적으로 불안정한 결합에 의해 폴리뉴클레오티드에 공유결합된다.
폴리뉴클레오티드는 과량의 고분자의 존재 하에 고분자에 결합될 수 있다. 과량의 고분자는 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트의 형성을 촉진시킬 수 있다. 과량의 고분자는 컨쥬게이트의 형성 동안 컨쥬게이트의 응집을 감소시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 세포 또는 유기체에 컨쥬게이트의 투여 전에 과량의 고분자로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드-고분자 컨쥬게이트는 세포 또는 유기체에 과량의 고분자와 함께 병용-투여될 수 있다. 과량의 고분자는 고분자와 동일할 수 있고, 또는 헬퍼(helper) 또는 부스트 고분자 (boost polymer)와 다를 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 표적 기에 결합된 화학식 (II), (IIa) 또는 (III)의 고분자, 및 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드를 포함하는, in vivo 간세포에 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 전달을 위한 조성물을 특징으로 한다. 폴리뉴클레오티드 표적 기는 적어도 20 탄소 원자를 함유하는 소수성 기 또는 미국특허공개 20110207799에 기재된 바와 같은 3가 ASPGr 표적 기일 수 있다. 가역적으로 변형된 폴리(아크릴레이트) 및 siRNA-컨쥬게이트는 개별적으로 합성되고, 별도의 용기 또는 단일 용기에서 공급될 수 있다. RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 고분자에 결합되지 않는다.
우리는 폴리뉴클레오티드 표적 기인, 소수성 기에 또는 갈락토오스 클러스터에 RNAi 폴리뉴클레오티드의 결합, 및 상기 기재된 변형된 폴리(아크릴레이트)와 함께 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 병용-투여가 간세포, 특히 in vivo 간세포에 RNAi 폴리뉴클레오티드의 효율적이고 기능적인 전달을 제공하는 것을 확인하였다. 기능적 전달의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드가 세포에 전달되고, 예상되는 생물학적 활성, 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 가지는 것을 의미한다. 포유동물의 혈관 (vasculature)에 투여된 폴리뉴클레오티드를 포함하여 많은 분자들은 간에 의해 신체로부터 통상적으로 제거된다. 폴리뉴클레오티드가 분해되거나 또는 그 반대로 신체로부터 제거를 위해 처리되는, 그리고 폴리뉴클레오티드가 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 야기하지 않는 간에 의한 폴리뉴클레오티드의 제거는 기능적 전달로 간주되지 않는다.
RNAi 폴리뉴클레오티드-폴리뉴클레오티드 표적 기 컨쥬게이트는 본 발명의 가역적으로 변형된 폴리(아크릴레이트)와 함께 병용-투여된다. 병용-투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드 및 전달 고분자가 둘 다 동시에 포유동물에 존재하도록 포유동물에 투여되는 것을 의미한다. RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 및 전달 고분자는 동시에 투여될 수 있고, 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 동시 투여의 경우, 이들은 투여 전에 혼합될 수 있다. 순차적 투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 기 컨쥬게이트 또는 전달 고분자가 먼저 투여될 수 있다.
RNAi 폴리뉴클레오티드-소수성 표적 기 컨쥬게이트의 경우, RNAi 컨쥬게이트는 전달 고분자의 투여 전 30분까지 투여될 수 있다. 또한, RNAi 폴리뉴클레오티드-소수성 표적 기 컨쥬게이트의 경우, 전달 고분자는 RNAi 컨쥬게이트의 투여 전 2시간까지 투여될 수 있다.
RNAi 폴리뉴클레오티드-갈락토오스 클러스터 표적 기 컨쥬게이트의 경우, RNAi 컨쥬게이트는 전달 고분자의 투여 전 15분까지 투여될 수 있다. 또한, RNAi 폴리뉴클레오티드-갈락토오스 클러스터 표적 기 컨쥬게이트의 경우, 전달 고분자는 RNAi 컨쥬게이트의 투여 전 15분까지 투여될 수 있다.
양극성
본 발명의 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체는 양극성이다. 양극성 (amphipathic), 또는 양친매성(amphiphilic) 고분자는 친수성(극성, 수용성) 및 소수성(비-극성, 지용성, 불수용성) 기 모두 또는 일부를 가진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 양극성 고분자에 관하여, 일부는 하나의 공유결합이 깨지고 수소로 대체될 때 유도된 분자로서 정의된다. 예를 들어, 부틸아민에서, 탄소와 질소 결합 사이의 파괴, 및 수소로 대체는 암모니아(친수성) 및 부탄(소수성)으로 된다. 만일 1,4-디아미노부탄이 질소-탄소 결합에서 절단되고 수소로 대체되면, 결과로 생긴 분자는 다시 암모니아(2×) 및 부탄이다. 그러나, 소수성 부분의 형성이 2개 결합의 파괴를 필요로 하기 때문에, 1,4-디아미노부탄은 양극성으로 간주되지 않는다.
막 활성
본 명세서에 사용된 바와 같이, 막 활성 고분자는 생물학적 막에 하나 이상의 하기의 효과를 유발할 수 있는 표면 활성, 양극성 고분자이다: 세포로 들어가거나 또는 막을 통해 막을 투과할 수 없는 분자를 허용하는 막의 변경 또는 파괴, 막의 기공 형성, 막의 분열, 또는 막의 파괴 또는 용해. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 막 또는 세포막은 지질 이중층을 포함한다. 막의 변경 또는 파괴는 적어도 하나의 하기 어세이에서 고분자의 활성에 의해 기능적으로 정의될 수 있다: 적혈구 용해(red blood cell lysis, 용혈(hemolysis)), 리포좀 누출(liposome leakage), 리포좀 융합, 세포융합, 세포 용해, 및 엔도좀 방출. 세포막의 용해를 야기할 수 있는 막 활성 고분자는 막 용해 고분자(membrane lytic polymers)라고도 한다. 원형질막(plasma membrane)을 통해 엔도좀 또는 리소좀의 파괴를 우선적으로 일으키는 고분자는 엔도좀 분해능(endosomolytic)으로 간주된다. 막 활성 고분자가 세포막에 미치는 영향은 일시적일 수 있다. 막 활성 고분자는 막에 대해 친화도를 가지고, 이중층 구조의 변성(denaturation) 또는 변형(deformation)을 일으킨다. 막 활성 고분자는 합성 또는 비-천연 양극성 고분자일 수 있다.
세포에 폴리뉴클레오티드의 전달은 막의 기공 형성, 또는 엔도좀 또는 리소좀 소포체의 파괴를 포함하여 원형질막 또는 내부 소포체 막 (엔도좀 또는 리소좀과 같은)을 파괴 또는 불안정화하는 막 활성 고분자에 의해 조정되고, 이로써 세포의 세포질로 소포체의 내용물의 방출을 허여한다.
엔도좀 분해능
엔도좀 분해능 고분자는 pH의 변화에 대한 반응에서 엔도좀의 파괴 또는 용해를 일으킬 수 있거나, 또는 엔도좀 또는 리소좀과 같은 세포의 내부 막으로 쌓인 소포체(membrane-enclosed vesicle)로부터 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 같은 일반적으로 세포막 불투과성 화합물의 방출을 제공할 수 있는 고분자이다. 엔도좀 분해능 고분자는 생리적으로 관련된 pH 범위 (보통 pH 5.5-8)를 통해 이들의 물리화학적 특성의 변화를 겪는다. 이러한 변화는 고분자의 용해도 또는 전하, 소수성, 또는 친수성의 변화의 결과로서 다른 화합물 또는 막과 상호작용하는 능력의 변화일 수 있다. 예시적인 엔도좀 분해능 고분자는 pH-불안정한 기 또는 결합을 가진다. 따라서, pH 불안정한 결합을 통해 차폐제가 고분자에 결합되는 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리(아크릴레이트)는 엔도좀 분해능 고분자인 것으로 간주될 수 있다.
친수성 기
친수성 기는 화학적 기가 물-선호하는 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수용성이고, 물과 함께 수소결합 주개(donors) 또는 받개 (acceptors)이다. 친수성 기는 하전되거나 또는 비하전될 수 있다. 하전된 기는 양으로 하전된(음이온성) 또는 음으로 하전된(양이온성) 또는 모두 하전(쯔비터이온성)될 수 있다. 친수성 기의 예는 하기 화학적 부분(moieties)을 포함한다: 탄수화물, 폴리옥시에틸렌, 특정 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 아민, 아미드, 알콕시 아미드, 카복실산, 황, 및 히드록실.
소수성 기
소수성 기는 화학적 기가 물-피하는 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수 불용성이고, 수소결합을 형성하지 않는 경향이 있다. 소수성 기는 지방, 오일, 지질, 및 비-극성 용매에 용해되고, 수소 결합을 형성하는 능력을 거의 가지고 있지 않다. 둘(2) 이상의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소, 특정 치환된 탄화수소, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 유도체는 소수성 기 및 화합물의 예이다.
소수성 기는 탄소 및 수소 원자만 함유하는 탄화수소가 바람직하다. 그러나, 소수성을 유지하는 비-극성 치환 또는 비-극성 헤테로원자, 예를 들어 불소를 포함하는 것이 허용될 수 있다. 용어 소수성 기는 지방족 기, 방향족 기, 아실기, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기를 포함하며, 이들 각각은 선형, 분기형, 또는 고리형일 수 있다. 또한, 용어 소수성 기는 스테롤, 스테로이드, 콜레스테롤, 및 스테로이드 및 콜레스테롤 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 낮은 소수성 단량체 또는 기는 둘(2) 내지 여섯(6) 탄소 원자를 가지는 소수성 기를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 중간 소수성 단량체 또는 기는 일곱(7) 내지 열하나(11) 탄소 원자를 가지는 소수성 기를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 높은 소수성 단량체 또는 기는 열둘(12) 내지 삼십육(36) 또는 그 이상의 탄소 원자를 가지는 소수성 기를 포함한다.
표적 기
표적 기 또는 부분은 이들이 컨쥬게이트의 세포-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시키기 위해 결합된 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시킨다. 표적 기는 표적 세포와 분자의 결합을 향상시킨다. 따라서, 표적 기는 이들이 컨쥬게이트의 세포 분포 및 세포 흡수를 개선시키기 위해 결합된 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시킬 수 있다. 세포 또는 세포 수용체에 리간드와 같은 표적 기의 결합은 세포내 이입을 개시할 수 있다. 표적 기는 1가, 2가, 3가, 4가, 또는 그 이상의 원자가를 가질 수 있다. 표적 기는 세포 표면 분자에 친화도를 가지는 화합물, 세포 수용체 리간드, 및 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 친화도를 가지는 항체 모방체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 표적 기는 세포 수용체 리간드를 포함한다. 다양한 리간드는 세포 및 특이적 세포 수용체에 약물 및 유전자를 표적하기 위해 사용되었다. 세포 수용체 리간드는 탄수화물, 글리칸, 당류 (갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 만노오스, 및 만노오스 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는), 비타민, 폴레이트, 비오틴, 압타머, 및 펩티드 (RGD-함유 펩티드, 인슐린, EGF, 및 트랜스페린을 포함하나 이에 한정되지 않는)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
ASGPr 표적 기
갈락토오스 및 갈락토오스 유도체는 간세포의 표면 위에서 발현된 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 이들의 결합을 통해 in vivo 간세포에 분자를 표적하기 위해 사용되었다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, ASGPr 표적 기는 갈락토오스의 친화도보다 크거나 같은 ASGPr의 친화도를 가진 갈락토오스 및 갈락토오스 유도체(구조적 유사체)를 포함한다. ASGPr(s)에 갈락토오스 표적 부분의 결합은 간세포에 전달 고분자의 세포-특이적 표적 및 간세포로의 전달 고분자의 세포내 이입을 용이하게 한다.
ASGPr 표적 부분은 락토오스, 갈락토오스 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소부타노일-갈락토사민, 올리고당류, 당류 클러스터 (예를 들어, Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3, 리신-계 갈락토오스 클러스터, 및 콜란-계(cholane-based) 갈락토오스 클러스터)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다 (Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). ASGPr 표적 부분은 단량체 (예를 들어, 단일의 갈락토사민을 가진) 또는 다량체 (예를 들어, 다수의 갈락토사민을 가진) 일 수 있다. 더 적당한 컨쥬게이트는 아시알로당단백질-수용체(ASGP-R)에서 확인된 탄수화물 인지 도메인(carbohydrate recognition domain, CRD)에 결합할 수 있는 올리고당류를 포함할 수 있다. 올리고당류 및/또는 탄수화물 복합체를 함유하는 컨쥬게이트 부분의 예는 미국특허 공개번호 6,525,031에 제공된다.
어떤 실시예에서, ASGPr 표적 기는 하기 구조로 예시된 바와 같은 PEG 링커를 통해 말레익 무수물과 같은 아민-반응성 기에 결합된다:
Figure pct00011
여기서, n은 1 내지 19의 정수이다.
하나의 실시예에서, ASGPr 표적 기는 갈락토오스 클러스터(갈락토오스 클러스터 표적 기)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 갈락토오스 클러스터는 2 내지 4 말단 갈락토오스 유도체를 가진 분자를 포함한다. 말단 갈락토오스 유도체는 이의 C-1 탄소를 통해 분자에 결합된다. 바람직한 갈락토오스 클러스터는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 가지는 각각의 3 말단 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체를 가진다. 더 바람직한 갈락토오스 클러스터는 3 말단 N-아세틸-갈락토사민을 가진다. 기술분야에서 다른 공통적 용어는 3-촉각(tri-antennary) 갈락토오스, 3가(tri-valent) 갈락토오스 및 갈락토오스 삼량체(trimer)를 포함한다. 3-촉각 갈락토오스 유도체 클러스터는 이(bi)-촉각 또는 일(mono)-촉각 갈락토오스 유도체 구조보다 더 큰 친화도를 가진 ASGPr에 결합된다고 알려져 있다(Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945).
Figure pct00012
갈락토오스 클러스터는 중심 분기점에 결합된 각 3개의 갈락토오스 유도체를 함유한다. 갈락토오스 유도체는 당류의 C-1 탄소를 통해 중심 분기점에 결합된다. 갈락토오스 유도체는 링커 또는 스페이서를 통해 분기점에 결합된 것이 바람직하다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다(미국특허 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분기점은 3개의 갈락토오스 유도체의 결합을 허용하고 RNAi 폴리뉴클레오티드에 분기점의 결합을 더 허용하는 임의의 소분자일 수 있다. 예시적인 분기점 기는 디-리신 (di-lysine)이다. 디-리신 분자는 3개의 갈락토오스 유도체가 결합될 수 있는 것을 통해 3개의 아민기, 및 디-리신이 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있는 것을 통해 카복실 반응성 기를 함유한다.
Figure pct00013
분기점과 핵산 사이의 PEG 스페이서를 가진 갈락토오스 클러스터
입체적 안정화제
본 명세서에 사용된 바와 같이, 입체적 안정화제는 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비해 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 또는 억제하는 비-이온성 친수성 고분자(천연, 합성, 또는 비-천연)이다. 입체적 안정화제는 정전기적 상호작용으로 맞물린 것으로부터 결합된 고분자를 방해한다. 정전기적 상호작용은 양전하 및 음전하 사이의 인력(attractive forces)으로 인해 2 이상의 물질의 비-공유 결합이다. 입체적 안정화제는 혈액 성분과의 상호작용을 억제할 수 있고, 따라서 식균작용증가(opsonization), 식세포작용(phagocytosis), 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의해 흡수할 수 있다. 따라서, 입체적 안정화제는 이들이 결합된 분자의 순환시간을 증가시킬 수 있다. 또한, 입체적 안정화제는 고분자의 응집을 억제할 수 있다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG 유도체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 1-500 에틸렌 글리콜 단량체, 2-20 에틸렌 글리콜 단량체, 5-15 에틸렌 글리콜 단량체, 또는 약 10 에틸렌 글리콜 단량체를 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 85-20,000 달톤(Da), 약 200-1000 Da, 약 200-750 Da, 또는 약 550 Da의 평균 분자량을 가질 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 입체적 안정화제는 수용액에서 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비해 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 또는 억제한다.
구조적 유사체는 다른 화합물의 구조와 유사한 구조를 가지나, 특정 성분에 대하여 다른 화합물이다. 이것은 하나 이상의 원자, 작용기, 또는 서브구조가 다를 수 있고, 다른 원자, 기, 또는 서브구조로 대체된다. 일반적으로, 구조적 유사체는 단일 원소의 대체, 즉 하나의 원자 또는 작용기를 다른 원소의 다른 원자 또는 작용기로의 대체가 다르다. 구조적 유사체는 적어도 이론적으로 다른 화합물로부터 형성되는 것으로 가정될 수 있다. 따라서, 구조적 유사체는 다른 화합물과 높은 화학적 유사성을 가진다. 일반적으로 기술분야에서 사용된 바와 같이, 구조적 유사성에도 불구하고, 구조적 유사체는 매우 다른 물리적, 화학적, 또는 생화학적 특성을 가질 수 있다. 그러나, 이의 언급된 특성에 관하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 구조적 유사체는 유사한 물리적, 화학적, 또는 생화학적 특성을 가진다.
표면 전하
제타 전위(zeta potential)는 현탁액에서 입자에 의해 나타나고 표면 전하에 밀접하게 관련된 물리적 특성이다. 수용성 매질에서, 시료의 pH는 제타 전위에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중 하나이다. 전하가 염기/산의 수소화/탈수소화를 기반으로 한 경우, 전하는 pH에 의존한다. 따라서, 제타 전위 값은 중요한 용액 조건, 특히 pH를 포함해야 한다. 일반적인 입자의 경우, 제타 전위의 크기는 콜로이드계의 전위 안정성의 조짐을 보인다. 만일 현탁액 내 모든 입자가 큰 음성 또는 양성 제타 전위를 가진다면, 이들은 서로 밀어내는 경향이 있을 것이고, 입자의 합칠 가능성은 없을 것이다. 그러나, 입자가 낮은 제타 전위 값을 가진다면, 입자가 합치고 응집되는 것을 막을 힘이 없을 것이다. 일반적인 입자에 대해 안정하고 불안정한 현탁액 사이의 일반적인 경계선은 일반적으로 +30 또는 -30 mV에서 이해된다. +30 mV 이상의 양성 제타 전위 또는 -30 mV 이상의 음성 제타 전위를 가진 입자는 일반적으로 안정하다고 간주된다. 기재된 발명의 전달 고분자는 생리 식염수 및 pH 8에서 +20 mV 내지 -20 mV의 제타 전위를 나타내나, 수용액에서 콜로이드적으로 안정하고 응집되지 않는다.
막 활성 폴리아민의 양전하, 또는 제타 전위는 차폐제로 변형시켜 감소된다. 고분자 전하, 특히 양전하는 혈청 성분 또는 비-표적 세포와 원하지 않는 상호작용을 야기할 수 있다. 또한, 양 표면 전하는 고분자와 음으로 하전된 세포막의 상호작용을 향상시킴으로써 막 활성에서 역할을 한다. 따라서, 중성에 가까운 순 전하 또는 제타 전위를 가진 in vivo siRNA 전달 비히클이 바람직하다. ASGPr 표적 기 차폐제와 입체적 안정화제 차폐제의 가역적인 결합에 의해 변형된 막 활성 폴리아민인 본 발명의 전달 고분자는, 중성에 가까운 겉보기 표면 전하를 가지고 혈청 안정적이다. 더 상세하게는, 본 발명의 전달 고분자는 +30 및 -30 mV 사이, +20 및 -20 mV 사이, +10 및 -10 mV 사이, 또는 +5 및 -5 mV 사이에서 pH 8에서 측정된 제타 전위를 가진다. pH 7에서, 컨쥬게이트의 순 전하는 pH 8에서 보다 더 양성일 것으로 예상된다. 순 전하, 또는 표면 전하는 in vivo 적용에 대해 중요한 인자이다.
불안정한 결합( Labile Linkage )
결합 또는 링커는 하나 이상의 공유 결합을 통해 관심있는 하나의 화학적 기 또는 조각(segment)을 관심있는 다른 화학적 기 또는 조각에 결합하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 결합은 고분자에 변형제 또는 차폐제를 연결할 수 있다. 결합의 형성은 2개의 별도의 분자를 단일 분자로 연결할 수 있거나 또는 동일한 분자에서 2개의 원자를 연결할 수 있다. 결합은 중성 전하일 수 있거나 또는 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 가역적인 또는 불안정한 결합(linkage)은 가역적인 또는 불안정한 결합(bond)을 함유한다. 결합은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 결합에 유연성 및/또는 길이를 더 가할 수 있다. 스페이서는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 아르알키닐기를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며; 이들 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로고리, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류(saccharides)를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 선행 목록이 발명의 범위를 한정하는 것으로 의미하지 않는다.
가역적인 또는 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 공유결합을 파괴 또는 절단하지 않을 조건 하에 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 수소 원자에 대한 공유결합 이외의 공유결합이다. 더 상세하게는, 가역적인 또는 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 불안정하지 않은 공유결합보다 적당한 조건 하에 덜 안정하고(열역학적으로) 또는 더 빠르게 파괴된(동력학적으로) 공유결합이다. 분자 내 불안정한 결합의 절단은 2개의 분자를 형성할 수 있다. 기술분야에서 숙련된 자의 경우, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기(t1 /2)(결합의 반이 절단하는데 필요한 시간) 면에서 논의된다. 따라서, 가역적인 또는 불안정한 결합은 분자에서 다른 결합보다 더 빠르게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
적당한 조건은 불안정한 결합의 유형에 의해 결정되고 유기화학에서 잘 알려져 있다. 불안정한 결합은 pH, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 온도, 염 농도, 효소의 존재(뉴클레아제 및 프로테아제를 포함하는 에스터라제와 같은), 또는 가해진 물질의 존재에 민감할 수 있다. 예를 들어, 증가된 또는 감소된 pH는 pH-불안정한 결합에 대해 적당한 조건이다.
불안정한 기가 변형을 수행할 비율은 불안정한 기를 함유하는 분자의 화학적 성분을 변경함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 불안정한 기 근처의 특정 화학적 부분(예를 들어, 전자 받개 또는 주개)의 첨가는 화학적 변형이 일어날 조건 하에 특정 조건(예를 들어, pH)에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 생리적으로 불안정한 결합은 일반적으로 접하는 조건 또는 포유동물 신체 내에서 접하는 조건과 유사한 조건 하에 절단할 수 있는 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 결합 기는 이들이 특정 생리적 조건에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 포유동물 세포내 조건 하에서 절단할 수 있는 불안정한 결합이다. 포유동물 세포내 조건은 포유동물 세포에서 확인된 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 및 염 농도와 같은 화학적 조건 또는 포유동물 세포에서 접하는 조건과 유사한 조건을 포함한다. 또한, 포유동물 세포내 조건은 단백질 가수분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에서 일반적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 45분 미만의 반감기를 가진 적당한 조건 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 매우 불안정하다고 간주된다. 15분 미만의 반감기를 가지는 적당한 조건 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 극도로 불안정하다고 간주된다.
화학적 변형(불안정한 결합의 절단)은 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적당한 세포내 및/또는 세포외 환경에 도달할 때 발생한다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화된 엔도좀으로 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도좀 절단할 수 있는 결합으로 간주될 수 있다. 효소 절단할 수 있는 결합은 엔도좀 또는 리소좀에서 또는 세포질에서 존재하는 것과 같은 효소에 노출되었을 때 절단될 수 있다. 이황화 결합은 분자가 세포의 세포질의 더 환원성 환경으로 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, 이황화 결합은 세포질의 절단할 수 있는 결합으로 간주될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건(pH<7) 하에 선택적으로 파괴되는 불안정한 결합이다. 세포 엔도좀 및 리소좀은 7 미만의 pH를 가지기 때문에, 이러한 결합은 엔도좀의 불안정한 결합으로 불리울 수도 있다. 용어 pH-불안정한(pH-labile)은 pH-불안정한, 매우 pH-불안정한, 및 극도로 pH-불안정한 결합을 포함한다.
아민과 고리형 무수물의 반응은 아미드 산을 형성한다.
Figure pct00014
아민과 무수물을 형성하기 위한 아미드 산의 절단은 pH-의존적이고, 산성 pH에서 크게 촉진된다. 이러한 pH-의존적 반응성을 이용하여 가역적인 pH-불안정한 결합과 링커를 형성할 수 있다.
매우 pH-불안정한 결합: 매우 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 45분 미만의 반감기를 가진다. 매우 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에서 잘 알려져 있다.
극도로 pH-불안정한 결합: 극도로 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 15분 미만의 반감기를 가진다. 극도로 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에서 잘 알려져 있다.
이치환된(disubstituted) 고리형 무수물은 본 발명의 막 활성 폴리(아크릴레이트) 고분자에 차폐제의 변형 또는 결합에 특히 유용하다. 이들은 생리적으로 pH-불안정한 결합을 제공하고, 즉시 아민을 변형시키며, 세포의 엔도좀 및 리소좀에서 확인된 감소된 pH에서 절단하여 아민을 회복시킨다. 두 번째, 아민과 반응하여 생성되는 α 또는 β 카복실산 기는 고분자에 예상되는 음전하의 약 1/20th만 기여하는 것으로 나타난다 (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 폴리아민과 이치환된 말레익 무수물의 변형은 높은 음전하를 가진 고분자를 생성하기 보다는 다소 폴리아민의 양전하를 효과적으로 중성화한다. 중성에 가까운 고분자는 in vivo 전달에 바람직하다.
RNAi 폴리뉴클레오티드-폴리뉴클레오티드 표적 기 컨쥬게이트
RNAi 폴리뉴클레오티드-폴리뉴클레오티드 표적 기 컨쥬게이트는 폴리뉴클레오티드 표적 기에 RNAi 폴리뉴클레오티드를 공유결합하여 형성된다. 폴리뉴클레오티드는 반응성 기 A를 함유하도록 합성되거나 또는 변형된다. 또한, 폴리뉴클레오티드 표적 기는 반응성 기 B를 함유하도록 합성되거나 또는 변형된다. 반응성 기 A 및 B는 이들이 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 공유결합을 통해 결합될 수 있도록 선택된다.
폴리뉴클레오티드 표적 기는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. 비록 센스 가닥이 바람직하지만, siRNA 폴리뉴클레오티드의 경우, 표적 기는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 결합될 수 있다.
하나의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 표적 기는 소수성 기로 이루어진다. 더 상세하게는, 폴리뉴클레오티드 표적 기는 적어도 20 탄소 원자를 가지는 소수성 기로 이루어진다. 폴리뉴클레오티드 표적 부분으로 사용된 소수성 기는 본 명세서에서 소수성 표적 부분으로 나타낸다. 예시적인 적당한 소수성 기는 콜레스테롤, 디콜레스테롤, 토코페롤, 디토코페롤, 디데실, 디도데실, 디옥타데실, 이소프레노이드, 및 콜레아미드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
소수성 표적 기는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA와 같은 2개의 가닥을 가진 RNAi 폴리뉴클레오티드의 경우, 소수성 기는 어느 하나의 가닥에 결합될 수 있다.
갈락토오스 클러스터는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA와 같은 2개의 가닥을 가진 RNAi 폴리뉴클레오티드의 경우, 갈락토오스 클러스터는 어느 하나의 가닥에 결합될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
용어 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산 또는 폴리핵산은 적어도 2개의 뉴클레오티드를 함유하는 고분자를 나타내는 기술분야의 용어이다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 고분자의 단량체 단위이다. 120 단량체 단위 미만의 폴리뉴클레오티드는 종종 올리고뉴클레오티드라고 부른다. 천연 핵산은 데옥시리보오스- 또는 리보오스-포스페이트 백본을 가진다. 비-천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드는 in vitro 또는 무세포 시스템(cell free system)에서 중합되는 폴리뉴클레오티드이고, 동일 또는 유사한 염기를 함유하나 천연 리보오스 또는 데옥시리보오스-포스페이트 백본 이외의 유형의 백본을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 기술분야에서 임의의 알려진 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 기술분야에서 알려진 폴리뉴클레오티드 백본은 PNAs(펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트, 모폴리노 및 본래의 핵산의 포스페이트 백본의 다른 이형을 포함한다. 염기는 퓨린 및 피리미딘을 포함하고, 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 더 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체는 아민, 알콜, 티올, 카복실레이트, 및 알킬할라이드와 같으나 이에 한정되지 않는 뉴클레오티드 위에 새로운 반응성 기를 배치한 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 염기는 DNA 및 RNA의 알려진 염기 유사체 중 어느 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 또는 어느 적당한 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 in vitro에서 중합될 수 있고, 이들은 재조합일 수 있으며, 키메릭 서열, 또는 이들 기의 유도체를 함유한다. 폴리뉴클레오티드는 5'-말단, 3'-말단, 또는 5' 및 3' 말단 모두에서 말단 캡 기를 포함할 수 있다. 캡 기는 역 데옥시 염기가 결여된 기(inverted deoxy abasic group), 역 데옥시 티미딘 기, 티미딘 기, 또는 3' 글리세릴 변형일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
RNA 간섭(RNAi) 폴리뉴클레오티드는 서열 특이적 방법으로 트랜스유전자 (transgene)의 메신저 RNA(mRNA) 전사의 번역을 분해 또는 억제하기 위해 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 방법과 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도할 수 있는 분자이다. 2개의 일차 RNAi 폴리뉴클레오티드는 작은 (또는 짧은) 간섭 RNAs(siRNAs) 및 microRNAs(miRNAs) 이다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 siRNA, miRNA, 이중-가닥 RNA (dsRNA), 짧은 머리핀 RNA(shRNA), 및 RNA 간섭을 유도할 수 있는 RNA를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. siRNA는 일반적으로 15-50 염기쌍, 바람직하게는 21-25 염기쌍을 함유하고 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA의 서열을 코딩하는데 뉴클레오티드 서열 동일성(완전히 상보성) 또는 거의 동일성(부분적 상보성)을 가지는 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA는 디뉴클레오티드 3' 돌출물(overhangs)을 가질 수 있다. siRNA는 2개의 어닐링된(annealed) 폴리뉴클레오티드 또는 머리핀 구조를 형성하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 하나의 실시예에서, 컨쥬게이트의 siRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드 단편으로부터 조립되며, 하나의 단편은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 두 번째 단편은 siRNA 분자의 센스 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 센스 가닥은 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커와 같은 링커 분자를 통해 안티센스 가닥에 연결된다. microRNAs(miRNAs)는 이의 mRNA 표적의 파괴 또는 번역 억제(translational repression)를 지도하는 약 22 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩(noncoding) RNA 유전자 산물이다. 만일 miRNA와 표적 mRNA 사이의 상보성이 부분적이면, 표적 mRNA의 번역은 억제된다. 만일 상보성이 광범위하면, 표적 mRNA는 절단된다. miRNAs의 경우, 복합체는 일반적으로 miRNA와 부분적 상동성만 공유하는 mRNAs의 3' UTR에 주로 위치된 표적 부위에 결합한다. "씨드 영역(seed region)"은 - 이의 표적과 함께 완전한 염기쌍을 형성하는 miRNA의 5' 말단 위의 약 일곱(7) 연속적인 뉴클레오티드의 신장(stretch) - miRNA 특이성에서 중요한 역할을 한다. mRNA에 RISC/miRNA 복합체의 결합은 단백질 번역의 억제 또는 mRNA의 절단 및 분해를 이끌 수 있다. 최근 자료는 만일 씨딩 영역에서 단지 완전한 염기쌍을 보이는 것 대신 miRNA 및 이의 표적의 전체 길이를 따라 완전한 상동성이 있다면 mRNA 절단이 우선적으로 일어난다는 것을 나타낸다 (Pillai et al. 2007).
RNAi 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 세포에서 전사하여 siRNA, 별도의 센스 및 안티-센스 가닥 선형 siRNAs, 또는 miRNA로서 기능할 수 있는 작은 머리핀 RNAs를 생성할 수 있다. RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사된 DNAs는 U6 프로모터, H1 프로모터, 및 tRNA 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된 프로모터를 함유한다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 U1, U2, U4 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, microRNA 프로모터, 및 mRNA 프로모터를 포함한다.
알려진 miRNA 서열의 목록은 특히 Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지된 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 또한, 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족 (cognate) 결합 위치는 관련 문헌에서 잘 나타난다. RNAi 분자는 기술분야에서 알려진 기술에 의해 즉시 설계되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾아내는 기회를 증가시키는 실험 도구(computational tools)가 있다 (Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 화학적 변형의 비-제한적인 예는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합 (phosphorothioate internucleotide linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, "유니버설 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 및 역 데옥시 염기가 결여된 잔기 결합을 포함한다. 이러한 화학적 변형은 다양한 폴리뉴클레오티드 구조체에서 사용될 때, 세포에서 폴리뉴클레오티드 활성을 보존하는 동시에 이러한 화합물의 혈청 안정성을 증가시키는 것으로 나타낸다. 또한, 화학적으로 변형된 siRNA는 인간에서 인터페론 활성을 활성화하는 가능성을 최소화시킬 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 화학적으로-변형된 RNAi 폴리뉴클레오티드는 2개의 가닥을 가지는 듀플렉스(duplex)를 포함하고, 이들 중 하나 또는 모두는 화학적으로-변형될 수 있고, 각 가닥은 약 19 내지 약 29 뉴클레오티드이다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 재구성된 in vitro 시스템 내부에서 RNAi를 조정하는 능력을 유지하는 동안 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있고, 화학적 변형은 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 이상)의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수의 퍼센트로서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 약 5 내지 약 100%의 뉴클레오티드 위치의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 뉴클레오티드 위치). 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 의존한다. 만일 RNAi 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥이면, 퍼센트 변형은 단일 가닥 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 마찬가지로, 만일 RNAi 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥이면, 퍼센트 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 또한, 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트도 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 총 수에 의존할 수 있다. 예를 들어, RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 모든 피리미딘 뉴클레오티드 및/또는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 변형된다.
RNAi 폴리뉴클레오티드는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 많은 유전자들은 서로 서열 상동성의 어느 정도를 공유할 수 있기 때문에, RNAi 폴리뉴클레오티드는 충분한 서열 상동성을 가지는 유전자의 종류를 표적하도록 설계될 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 다른 유전자 표적 사이에서 공유되거나 또는 특정 유전자 표적에 대해 독특한 서열의 상보성을 가지는 서열을 함유할 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 여러 유전자들 사이에서 상동성을 가지는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적하도록 설계될 수 있고, 이로써 유전자 과 (family)(예를 들어, 다른 유전자 아형(isoform), 스플라이스 변이체(splice variants), 돌연변이체 유전자 등)에서 여러 유전자를 표적한다. 다른 실시예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 단일 유전자의 특이적 RNA 서열에 독특한 서열을 표적하도록 설계될 수 있다.
용어 상보성(complementarity)은 전통적 Watson-Crick 또는 기타 비-전통적 유형에 의해 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 수소결합을 형성하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 나타낸다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 관하여, 이의 표적(효과기(effector) 결합 부위) 또는 상보적 서열과 함께 폴리뉴클레오티드 분자의 결합 자유 에너지는 효소적 mRNA 절단 또는 번역 억제를 진행하는 폴리뉴클레오티드의 관련 기능을 허여하기에 충분하다. 핵산 분자의 결합 자유 에너지의 측정은 기술분야에서 잘 알려져 있다(Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). 퍼센트 상보성은 두 번째 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 10 중 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적)과 함께 수소결합을 형성할 수 있는 첫 번째 폴리뉴클레오티드 분자 (예를 들어, Watson-Crick 염기쌍)의 인접한 가닥에서 염기의 퍼센트를 나타낸다. 완전하게 상보적은 폴리뉴클레오티드 서열의 인접한 가닥에서 모든 염기가 두 번째 폴리뉴클레오티드 서열에서 인접한 염기의 동일한 수를 가진 수소결합일 것이라는 것을 의미한다.
유전자 발현을 억제, 하향-조절(down-regulate), 또는 녹다운시키는 경우, 이것은 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 RNA로부터 번역된 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정된 바와 같이, 유전자의 발현이 본 발명의 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트를 차단하지 않고 관찰된 것 이하로 감소된다는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의해 전달된 폴리뉴클레오티드와 함께 유전자 발현의 억제, 하향-조절, 또는 녹다운은, 대조 불활성화 핵산, 스크램블된 서열 또는 불활성화 부조화 (mismatch)를 가지는 핵산의 존재 하에, 또는 차폐된 고분자에 폴리뉴클레오티드의 결합 없이 관찰된 수준 이하가 바람직하다.
In Vivo 투여
약리학 및 독성학에서, 투여 경로는 약물, 체액, 독, 또는 기타 물질이 신체와 접촉하게 되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위한 약물 및 핵산의 투여 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있고, 본 발명의 조성물의 투여로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 임의의 적당한 경로, 가장 바람직하게는 비경구를 통해 경로에 적당하게 조건에 맞도록 만든 제제로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 정맥내, 근육내, 피내(intracutaneously), 피하(subcutaneously), 또는 복강내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
비경구 투여 경로는 혈관내(정맥내, 동맥내), 근육내, 뇌실질내 (intraparenchymal), 피부내(intradermal), 피하(subdermal), 피하(subcutaneous), 종양내, 복강내, 척수강내(intrathecal), 경막하(subdural), 경막외(epidural), 및 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용하는 림프관내(intralymphatic) 주사를 포함한다. 본 명세서에서 혈관내는 신체 내 조직 또는 기관에 연결된 도관이라 불리우는 관 구조 내를 의미한다. 관 구조의 공동(cavity) 내에 체액은 신체 일부로 또는 신체 일부로부터 흐른다. 체액의 예는 혈액, 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF), 림프액, 또는 담즙을 포함한다. 도관의 예는 동맥(arteries), 소동맥(arterioles), 모세관(capillaries), 세정맥(venules), 동양혈관(sinusoids), 정맥(veins), 림프 (lymphatics), 담관(bile ducts), 및 침 또는 다른 외분비샘(exocrine glands)의 관을 포함한다. 혈관내 경로는 동맥 또는 정맥과 같은 혈관을 통한 전달을 포함한다. 혈액 순환계는 의약품의 전신 확산을 제공한다.
기재된 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 용액에 주입된다. 약학적으로 허용가능한은 약리학적/독성학적 관점으로부터 포유동물에 허용가능한 특성 및/또는 물질을 나타낸다. 문구 약학적으로 허용가능한은 생리적으로 허용할 수 있고 포유동물에 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 다른 바람직하지 않은 또는 독성 반응을 생성하지 않는 분자 실재물, 조성물 및 특성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 약학적으로 허용가능한은 동물, 특히 인간에서 사용을 위해 연방의 규제 기관 또는 주 정부에 의한 승인이나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정된 약전에 기재된 것을 의미한다.
치료 효과
RNAi 폴리뉴클레오티드는 연구 목적 또는 치료하는 세포의 변화를 생성하기 위해 전달될 수 있다. RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 연구 시약으로 유용하고, 다양한 치료, 진단, 표적 검증, 유전체 발견, 유전공학 및 약물유전체학 (pharmacogenomics) 적용에 유용하다. 우리는 간세포에서 내인성 유전자 발현의 억제를 야기하는 RNAi 폴리뉴클레오티드를 밝혀내었다. 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 측정된 리포터 (마커) 유전자 발현의 수준은 다른 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 유전자 발현의 유사한 수준의 적당한 예상을 나타낸다. 기술분야에서 숙련된 자에 의해 유익하다고 간주된 치료 수준은 질병으로부터 질병까지 다르다. 예를 들어, 혈우병 A 및 B는 각각 X-결합된 응고 인자 Ⅷ 및 Ⅸ의 결핍에 의해 야기된다. 이들의 임상과정은 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ의 정상 혈청 수준의 퍼센트에 의해 크게 영향을 받는다: < 2%, 중증(severe); 2-5%, 중간(moderate); 및 5-30% 가벼운(mild). 따라서, 중증 환자의 순환 인자의 정상 수준의 1% 내지 2%의 증가는 유익한 것으로 간주될 수 있다. 6%보다 큰 수준은 자발적인 출혈을 막을 수 있으나 수술 또는 부상에 대한 이차 출혈은 막을 수 없다. 유사하게, 유전자의 억제는 치료 혜택을 제공하기 위해 100%일 필요는 없다. 유전자 치료의 기술분야에서 숙련된 자는 마커 유전자 결과의 충분한 수준을 기준으로 질병에 대해 특이적인 유전자 발현의 유익한 수준을 적당하게 예상할 것이다. 혈우병 예에서, 만일 마커 유전자가 인자 Ⅷ의 정상 수준의 2%의 부피의 비교 수준에서 단백질을 생성하기 위해 발현되었다면, 인자 Ⅷ을 코딩하는 유전자 또한 유사한 수준에서 발현될 것이라고 적당하게 예상될 수 있다. 따라서, 리포터 또는 마커 유전자는 일반적으로 세포내 단백질의 발현에 대해 유용한 범례(paradigm) 역할을 한다.
간은 대사작용(예를 들어, 다양한 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemias)의 지질단백질 대사작용)에서 이의 중심 역할이 주어진 RNAi 치료 및 순환 단백질(예를 들어, 혈우병의 혈액 응고 인자)의 분비를 위해 중요한 표적 조직이다. 또한, 만성 간염 및 간경변과 같은 후천적 장애(acquired disorders)는 일반적이고 또한 RNAi 치료에 의해 잠재적으로 치료된다. 간을 침범하는 또는 간에 의해 침범된 많은 질환 또는 질병은 간에서 유전자 발현의 녹다운(억제)를 통해 잠재적으로 치료된다. 이러한 간 질환 및 질병은 간암(간세포암, HCC 포함), 바이러스성 감염(간염 포함), 신진 대사 장애(고지혈증 및 당뇨병 포함), 섬유증, 및 급성 간 손상을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
투여된 전달 고분자 및 RNAi-폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트의 양(용량)은 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있다. 우리는 0.05-20 ㎎/㎏ 동물 무게의 siRNA-컨쥬게이트 및 1-60 ㎎/㎏ 동물 무게의 전달 고분자를 이용하여 유전자 발현의 효과적인 녹다운을 나타내었다. 마우스에서 바람직한 양은 0.25-2.5 ㎎/㎏ siRNA-컨쥬게이트 및 1-40 ㎎/㎏ 전달 고분자이다. 더욱 바람직하게는, 약 2-10 ㎎/㎏ 전달 고분자가 투여된다. 랫트에서 바람직한 양은 0.25-16 ㎎/㎏ 전달 고분자이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, in vivo는 유기체 내부에서 발생하는, 더 상세하게는 포유동물과 같은, 부분적 또는 죽은 것과 반대되는, 전체 살아있는 다세포 유기체(동물)의 살아있는 조직 안 또는 위에서 수행된 과정을 의미한다.
형질감염 시약
본 명세서에 기재된 폴리(아크릴레이트)는 in vitro 형질감염 시약으로 사용될 수 있다. in vitro 세포에 폴리뉴클레오티드의 전달 과정은 통상적으로 형질감염 또는 형질감염의 과정이라고 불리웠다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 형질감염은 폴리뉴클레오티드가 생물학적 활성을 가지도록 세포의 외부로부터 세포의 내부로 폴리뉴클레오티드의 도입을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 연구 목적 또는 치료될 수 있는 세포의 변화를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 전달은 표적 세포에 존재하는 유전 물질(genetic material)의 변형을 야기할 수 있다.
in vitro 형질감염 시약은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 또는 함께 혼합하고 및 세포, 일반적으로 in vitro 포유동물 세포로 이들의 진입을 조정하는 화합물 또는 화합물들의 조성물이다. in vitro 형질감염 시약의 예는 단백질 및 고분자 복합체 (폴리플렉스 (polyplexes)), 지질 및 리포좀 (리포플렉스(lipoplexes)), 고분자와 지질의 조합 (리포폴리플렉스), 칼슘 포스페이트, 침전물, 및 덴드리머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, in vitro 형질감염 시약은 정전기적 상호작용을 통해, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 음전하와 결합하거나 또는 혼합하는 순 양전하를 가진 성분을 가진다. 또한, 양이온성 in vitro 형질감염 시약은 큰 핵산을 응축할 수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리(아크릴레이트)는, in vivo 전달에 대한 이들의 유용성 이외에, in vitro 형질감염 시약으로도 사용될 수 있다. in vitro 형질감염 시약으로 사용하기 위해, 폴리(아크릴레이트)는 차폐되거나 또는 차폐되지 않을 수 있다.
도 1은 막 활성 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체의 구조를 나타낸 도로서, 여기서
N은 -NH2 형태를 가진 일차 아민이고,
N'는 -NR5H, -NR5R6, 또는 -NR5R6R7 형태를 가진 이차, 삼차, 또는 사차 아민이며, 여기서 R5, R6, 및 R7은 독립적으로 -CH3 및 -CH2-CH3로부터 선택되고, 또는 대안적으로 N'는 질소 헤테로고리, 알디민, 히드라지드, 히드라존, 또는 이미다졸일 수 있으며,
Y 및 Y'는 링커 기이고,
R 및 R'는 독립적으로 2-20 탄소 원자를 가진 소수성 기 또는 알콕실 알킬기이며,
R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소 (-H) 및 메틸 (-CH3)로부터 선택되고,
m 및 p는 영(0)보다 큰 정수이며,
n 및 q는 영(0)보다 크거나 같은 정수이고,
(m+n)/(p+q) 비는 0.67-9 (40-90% 아민)이다.
도 2는 Y, R1, R2, R, m, 및 n이 도 1에 정의된 바와 같은 본 발명의 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 3은 Y, R1, R2, R, m, 및 n이 도 1에 정의된 바와 같은 고분자의 아민 탈보호화에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 4는 다양한 예시적인 적당한 RAFT 시약의 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 아민 보호된 고분자 LAU 41648-140-B-fr1의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 6은 아민 보호된 고분자 LAU 42101-23-D-fr1의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 7은 아민 보호된 고분자 NAR 42020-117A-fr1의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 8은 아민 보호된 고분자 NAR 41439-141B-fr1의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 9는 아민 보호된 고분자 NAR 41439-71B-fr1의 RAFT 중합에 대한 일반적인 반응식을 나타낸 도이다.
도 10은 다양한 예시적인 디펩티드 차폐제의 구조를 나타낸 도이다.
도 11은 3.0 또는 1.5 ㎍/ml 에틸아미노아크릴레이트 + 부틸 메타크릴레이트 (EAA-BuMA) 공중합체와 함께 500　ng/mL Aha1 siRNA의 전달 후에 in vitro 다양한 세포 유형의 % Aha1 유전자 녹다운을 나타낸 표이다.
도 12는 3.0 또는 1.5 ㎍/ml 에톡시에틸아미노아크릴레이트 + sec-부틸 아크릴레이트 (EEAA-SecBuA) 공중합체와 함께 500　ng/mL Aha1 siRNA의 전달 후에 in vitro 다양한 세포 유형의 % Aha1 유전자 녹다운을 나타낸 표이다.
도 13은 3.0 또는 1.5 ㎍/ml 에톡시에틸아미노아크릴레이트 + 부틸 아크릴레이트 (EEAA-BuA) 공중합체와 함께 500　ng/mL Aha1 siRNA의 전달 후에 in vitro 다양한 세포 유형의 % Aha1 유전자 녹다운을 나타낸 표이다.
도 14는 본 발명의 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 및 이들의 조성을 열거한 표이다.
도 15는 siRNA에 결합된 본 발명의 차폐된 폴리(아크릴레이트) 고분자의 투여 후에 in vivo 표적 유전자 발현의 % 녹다운을 나타낸 표이다.
도 16은 콜레스테롤-siRNA와 함께 본 발명의 차폐된 폴리(아크릴레이트) 고분자의 병용 투여 후에 in vivo 표적 유전자 발현의 % 녹다운을 나타낸 표이다.
실시예
실시예 1. 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 합성 - 일반적인 RAFT 과정
A. RAFT ( Reversible Addition - Fragmentation chain Transfer ) 중합을 수행하여 일련의 랜덤 (메트)아크릴레이트 공중합체를 합성하였다. RAFT 중합은 Shipp DA and Malepu V "RAFT Polymerization of Vinyl Acetate, Styrene and Acrylates Using N,N Dithiocarbamates," In Controlled / Living Radical Polymerization : Progress in RAFT , DT , NMP , and OMRP; Matyjaszewski, K.; ACS Symposium Series 1024; American Chemical Society: Washington, DC, 2009; pp 37-47에 기재되어 있다.
B. 고분자 계산: 고분자 이론적 분자량 ( M n , th ), moles 단량체, moles 사슬 전달제, moles 개시제 .
단량체 A 및 B로부터 고분자 P의 일반적인 합성 반응
Figure pct00015
A = 친수성 단량체
B = 소수성 단량체
P = 고분자
C = 사슬 전달제 (CTA)
I = 개시제
고분자 P에 대한 단량체 평균 분자량의 계산
Figure pct00016
%A = 고분자 P에서 % 친수성 단량체 A
%B = 고분자 P에서 % 친수성 단량체 B
MWA = 친수성 단량체 A의 분자량
MWB = 친수성 단량체 B의 분자량
Figure pct00017
= 고분자 단량체의 평균 분자량
원하는(이론적) 분자량 Mn , th (이하 방정식에서 Mn)을 가진 고분자 P에서 단량체의 수의 계산:
Figure pct00018
Figure pct00019
= 이론적 분자량 Mn , th을 가진 고분자 P에서 단량체의 수
이론적 분자량 Mn , th을 가진 x 그램 고분자 P에서 단량체 A 및 B의 moles의 계산:
Figure pct00020
molesA = 친수성 단량체 A의 moles
molesB = 친수성 단량체 B의 moles
이론적 분자량 Mn을 가진 x 그램 고분자 P의 합성을 위한 사슬 전달제(CTA)의 moles의 계산:
Figure pct00021
molesC = 사슬 전달제의 moles
이론적 분자량 Mn , th을 가진 x 그램 고분자 P의 합성을 위한 개시제의 moles의 계산:
Figure pct00022
molesI = 개시제의 moles
C. 보호된 아민 아크릴레이트 랜덤 공중합체의 RAFT 중합에 대한 일반적 과정
CTA 및 개시제의 용액은 부틸 아세테이트에서 제조되었다. 친수성 단량체, 소수성 단량체, CTA 용액, 개시제 용액, 및 부틸 아세테이트를 바이알에 가하고, 혼합물을 N2 버블링에 의해 1시간 동안 탈기하였다. 바이알을 밀봉하고, 80℃에서 밤새도록 교반하였다. ~16시간 후에, 반응 용기를 열로부터 제거하고, 용액을 RT로 냉각시켰다. 결과의 고분자는 헥산 (~8× 부피)을 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후, 용액을 따르고, 고분자를 헥산으로 헹구었다. 헹궈진 고분자를 DCM에 용해시키고, 헥산 (~8× 부피)으로 다시 침전시켰다. 원심분리 후, 용액을 따르고, 고진공 하에 고분자를 건조시켰다 (도 2. RAFT 중합).
D. 아민-보호된 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점(cloud point)이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액(milky solution)을 원심분리하였다. 하부층 (고분자의 원하는 %를 나타내는 진한 액체(thick liquid), 30-60%)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 두 번째 분획을 원심분리하여 고분자를 분리한 후 진공 하에 건조하였다.
E. 아민-보호된 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (0.400g 고분자 당 ~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염(high salt), 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관 (dialysis tubing)으로 투석하였다. 그 다음, 분획을 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다 (도 3. 아민 탈보호화).
실시예 2. 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 합성
A. 고분자 Lau 41648-140-B- fr1 .
1. 아민-보호된 Lau 41648-140-B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, CAS 78-67-1) 용액을 부틸 아세테이트에서 1 mg/ml로 제조하였다. 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA, CAS 201611-92-9)의 분리 용액을 부틸 아세테이트에서 10 mg/ml로 제조하였다. 2-(2-Boc-아미노에톡시) 에틸 아크릴레이트 (BAEEA) (1.053g, 4.059　mmol), 프로필 메타크릴레이트 (CAS 2210-28-8, 0.197 g, 1.54 mmol), CPCPA 용액 (0.700 mL, 0.0250 mmol), AIBN 용액 (0.616 mL, 0.00375 mmol), 및 부틸 아세테이트 (4.70 mL)를 교반바가 있는 20 mL 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비 (molar feed ratio)는 72.5:27.5 이었다. 이론적 Mw는 50,000 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사기를 제거하고, 바이알을 유조 (oil bath)를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. 수율 0.762 g. 관찰된 Mw 40,000; 관찰된 조성 66:34, N-BOC-에틸에톡시 아크릴레이트:프로필 메타크릴레이트. (도 5)
2. 아민-보호된 Lau 41648-140-B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화.
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~30%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 두 번째 분획을 원심분리하여 고분자를 분리한 후 진공 하에 건조하였다. 분획 1 수율은 0.206 g, Mw 50,000 이었고; 분획 2 수율은 0.412 g, Mw 41,000 이었다.
3. 아민-보호된 Lau 41648-140-B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 20 ml의 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염, 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관으로 투석하였다. 분획을 50 ml 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다.
높은 소수성 (10-24 탄소 원자) 아크릴레이트, 낮은 소수성 (1-6 탄소 원자) 아크릴레이트, 또는 낮은 및 높은 소수성 아크릴레이트의 조합을 포함하여, 다양한 소수성 아크릴레이트와 공중합된 보호된 에틸, 프로필, 또는 부틸 아미노 아크릴레이트를 이용하여, 유사한 고분자를 제조할 수 있다.
B. 고분자 Lau 42101-23-D- fr1 .
1. 아민-보호된 Lau 42101-23-D- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, CAS 78-67-1) 용액을 부틸 아세테이트에서 1 mg/ml로 제조하였다. 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA, CAS 201611-92-9)의 분리 용액을 부틸 아세테이트에서 10 mg/ml로 제조하였다. Boc-아미노프로필 아크릴레이트 (BAPA) (0.947g, 4.133　mmol), 2-에톡시에틸 메타크릴레이트 (CAS 2370-63-0, 0.303 g, 1.918 mmol), CPCPA 용액 (0.350 mL, 0.0125 mmol), AIBN 용액 (0.308 mL, 0.00188 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.30 mL)를 교반바가 있는 20 mL 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비는 68:32 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사기를 제거하고, 바이알을 유조를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. 수율 0.851 g. (도 6)
2. 아민-보호된 Lau 42101-23-D- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화 .
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~30%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 두 번째 분획을 원심분리하여 고분자를 분리한 후 진공 하에 건조하였다. 분획 1 수율은 0.267 g이었고; 분획 2 수율은 0.308 g이었다.
3. 아민-보호된 Lau 42101-23-D- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 20 ml의 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염, 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관으로 투석하였다. 분획을 50 ml 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다.
C. 고분자 NAR 42020-117A- fr1
1. 아민-보호된 NAR 42020-117A- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, CAS 78-67-1) 용액을 부틸 아세테이트에서 1 mg/ml로 제조하였다. 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA, CAS 201611-92-9)의 분리 용액을 부틸 아세테이트에서 10 mg/ml로 제조하였다. Boc-아미노프로필 아크릴레이트 (BAPA) (0.947g, 4.13　mmol), 부틸 메타크릴레이트 (BuMA, 0.251 g, 1.77 mmol), 옥타데실 아크릴레이트 (C18A, 0.0956 g, 0.295 mmol), CPCPA 용액 (0.180 mL, 0.00647 mmol), AIBN 용액 (0.159 mL, 0.000971 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.66 mL)를 교반바가 있는 20 mL 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비는 66.5:22.5:5 (66.5 아민:27.5 소수성) 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사기를 제거하고, 바이알을 유조를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. Mw 130,000 (PDI 1.34); 65% BAPA, 30% BuMA, 5% C18A; 수율 65%. (도 7)
2. 아민-보호된 NAR 42020-117A- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화 .
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~30%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 분획 1: Mw = 149,000; 65% BAPA, 30% BuMA, 5% C18A. 수율 30%.
3. 아민-보호된 NAR 42020-117A- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 20 ml의 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염, 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관으로 투석하였다. 분획을 50 ml 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다.
D. 고분자 NAR 41439-141B- fr1
1. 아민-보호된 NAR 41439-141B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, CAS 78-67-1) 용액을 부틸 아세테이트에서 1 mg/ml로 제조하였다. 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA, CAS 201611-92-9)의 분리 용액을 부틸 아세테이트에서 10 mg/ml로 제조하였다. Boc-아미노프로필 아크릴레이트 (BAPA) (1.05g, 4.34　mmol), 에틸 메타크릴레이트 (EtMA, 0.148 g, 1.30 mmol), CPCPA 용액 (0.335 mL, 0.0120 mmol), AIBN 용액 (0.295 mL, 0.00180 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.37 mL)를 교반바가 있는 20 mL 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비는 77:23 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사기를 제거하고, 바이알을 유조를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. Mw 38,000 (PDI 1.18); 67% BAPA, 33% EtMA; 수율 43%. (도 8)
2. 아민-보호된 NAR 41439-141B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화 .
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~30%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 분획 1: Mw = 49,000 (PDI 1.10); 수율 45%.
3. 아민-보호된 NAR 41439-141B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 20 ml의 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염, 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관으로 투석하였다. 분획을 50 ml 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다.
E. 고분자 NAR 41439-71B- fr1 ( AKA 41439-117 AB - fr1 ).
1. 아민-보호된 NAR 41439-71B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체 합성.
2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, CAS 78-67-1) 용액을 부틸 아세테이트에서 1 mg/ml로 제조하였다. 4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA, CAS 201611-92-9)의 분리 용액을 부틸 아세테이트에서 10 mg/ml로 제조하였다. 2-(2-Boc-아미노에톡시) 에틸 아크릴레이트 (BAEEA) (1.09g, 4.21　mmol), 프로필 메타크릴레이트 (PrMA, CAS 2210-28-8, 0.180 g, 1.41 mmol), CPCPA 용액 (0.170 mL, 0.00610 mmol), AIBN 용액 (0.150 mL, 0.000915 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.68 mL)를 교반바가 있는 20 mL 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비는 76:24 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사기를 제거하고, 바이알을 유조를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. Mw 68,000 (PDI 1.70); 69% BAEEA, 31% PrMA; 수율 70%. (도 9)
2. 아민-보호된 NAR 41439-71B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 분획화 .
건조된, 침전된 고분자를 DCM (~60 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~30%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 분리하고 진공 하에 건조하였다. 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 두 번째 분획을 원심분리하여 고분자를 분리한 후 진공 하에 건조하였다. 분획 1: Mw = 92,000 (PDI 1.42); 수율 45%. 분획 2: Mw = 52,000 (PDI 1.55); 수율 50%.
3. 아민-보호된 NAR 41439-71B- fr1 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 탈보호화
건조된 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (~7 ml)로 1시간 동안 탈보호화하였다. 그 다음, 반응을 20 ml의 물로 희석하고, 10-15분 동안 교반하였다. 그 다음, 분획을 각각 고염, 고염, 및 물에서 15시간, 8시간, 및 15시간 동안 3500 MW 투석관으로 투석하였다. 분획을 50 ml 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 3일 동안 또는 건조할 때까지 동결건조시켰다. 추가 연구를 위해 건조 시료를 물에서 20 mg/ml로 이르게 하였다.
F. 고분자 Ant 41658-111
1. 단량체 합성.
교반바가 장착된 2L 둥근-바닥 플라스크에서, 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (21.1g, 202.9　mmol, Sigma Aldrich)을 350 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 별도의 1L 플라스크에서, BOC 무수물 (36.6g, 169.1 mmol)을 660 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 2L 둥근-바닥 플라스크를 추가 깔때기로 맞추고, BOC 무수물 용액을 6시간 동안 플라스크에 가하였다. 반응을 밤새도록 교반하였다. 2L 분별 깔때기에서, 생성물을 각 300 ml의 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물인 BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올을 Na2SO4로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 DCM을 증발시켰다.
교반 바가 장착되고 아르곤이 분출되는 500 ml 둥근 바닥 플라스크에서, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (27.836g, 135.8 mmol)을 가한 다음, 240 mL 무수 디클로로메탄을 가하였다. 디이소프로필에틸 아민(35.5 ml, 203.7 mmol)을 가하고, 시스템을 드라이 아이스/아세톤 욕조에 놓았다. 아크릴로일 클로라이드(12.1 ml, 149.4 mmol)를 10 ml의 디클로로메탄을 이용하여 희석시키고, 아르곤이 분출된 시스템에 방울방울 가하였다. 시스템을 아르곤 하에 유지시키고, 실온으로 방치하고 밤새도록 교반하였다. 생성물을 각 100 mL의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물인 BOC-아미노 에틸 에톡시 아크릴레이트(BAEEA)를 Na2SO4로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발을 이용하여 DCM을 증발시켰다. 생성물을 7.5㎝ 직경 컬럼을 이용하여 29㎝ 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 사용된 용매계는 헥산 내 30% 에틸 아세테이트이었다. Rf: 0.30. 분획을 모으고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 용매를 제거하였다. BAEEA를 74% 수율로 얻었다. BAEEA를 냉장고에 저장하였다.
Figure pct00023

2. 고분자 합성.
부틸 아세테이트 내 AIBN (1.00 mg/mL) 및 RAFT 시약 (4-시아노-4-(페닐카보노티오일티오)펜탄산 (CPCPA), 10.0 mg/mL)의 용액을 제조하였다. 단량체 몰 공급비는 0.108 CPCPA RAFT 시약 및 0.016 AIBN 촉매 (0.00562 총 mol)와 함께 75 BAEEA : 25 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8) 이었다.
BAEEA (1.09 g, 4.21 mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (0.180 g, 1.41 mmol) (B), CPCPA 용액 (0.170 ml, 0.00609 mmol) (C), AIBN 용액 (0.150 ml, 0.000915 mmol), 및 부틸 아세테이트 (5.68 ml)를 교반바가 있는 20 ml 유리 바이알에 가하였다. 단량체 몰 공급비는 75:25 이었다. 바이알을 고무 캡으로 밀봉하고, 용액을 1시간 동안 배출구로서 두 번째 주사기가 있는 긴 주사기를 이용하여 질소와 함께 버블링하였다. 주사 바늘을 제거하고, 시스템을 유조를 이용하여 15시간 동안 80℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 헥산 (35 mL)을 용액에 가하였다. 용액을 4,400 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상층액 층을 조심스럽게 따르고, 하부층 (고체 또는 겔-유사)을 헥산으로 헹구었다. 하부층을 DCM (7 mL)에 재-용해시킨 다음, 헥산 (35 mL)에서 침전시키고, 한번 더 원심분리하였다. 상층액을 따르고, 하부층을 헥산으로 헹군 다음, 고분자를 몇 시간 동안 감압 하에 건조시켰다. MALS를 통해 얻어진 분자량: 73,000 (PDI 1.7); H1 NMR을 이용하여 얻어진 고분자 조성: 69:31 아민:알킬.
3. 분획 침전.
건조된, 침전된 생성물을 DCM (100 mg/mL)에 용해시켰다. 운점이 도달하자마자 (~20 ml), 헥산을 가하였다. 결과의 밀키 용액을 원심분리하였다. 하부층 (~60%의 고분자를 나타내는 진한 액체)을 추출하고 핵산으로 완전히 침전시켰다. 또한, 남아있는 상부 용액은 헥산을 더 가하여 완전히 침전시켰다. 양 분획을 원심분리하여 고분자를 분리한 후 진공 하에 건조하였다. 분획 1: Mw = 87,000 (PDI 1.5); 분획 2: Mw = 52,000 (PDI 1.5-1.6).
4. MALS 분석.
대략 10 mg의 고분자를 0.5 mL 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라히드로퓨란, 0.2% 트리에틸아민에 용해시켰다. 분자량 및 다분산도 (PDI)는 Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVB column을 이용한 Shimadzu Prominence HPLC에 결합된 Wyatt Helos II 다각 광산란 검출기(multiangle light scattering detector)를 이용하여 측정되었다. 조 고분자: MW: 73,000 (PDI 1.7), 분획 1: MW 87,000 (PDI:1.5), 분획 2: MW 52,000 (PDI 1.5-1.6).
정제된 BOC-보호된 고분자를 아세트산 내 2M HCl (7 ml)로 0.5시간 동안 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고 아민을 생성하였다. 15 mL dH2O를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 관으로 옮기고, 24시간 동안 고염에 대해 투석한 다음, 18시간 동안 dH2O에 대해 투석하였다. 내용물을 동결건조시킨 다음, 20 mg/ml의 농도로 DI H2O에 용해시켰다. 고분자 용액을 2-8℃에서 저장하였다.
5. 고분자 LAU 24B는 단량체 공급비가 72.5 BAEEA : 27.5 프로필 메타크릴레이트인 것을 제외하고는 상기와 같이 제조되었다.
6. 고분자 Ant -129-1은 하기 단량체를 사용한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 제조되었다:
Figure pct00024
[표 1] 고분자 Ant-129-1 합성 반응물
Figure pct00025

실시예 3. 양극성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 합성 - 비-RAFT 중합
A. 고분자 LAU 41305-38-17-19 랜덤 폴리아크릴레이트 .
1. N- Boc -아미노-프로필- 아크릴레이트 ( BAPA )의 합성.
교반 바가 장착되고 아르곤이 분출되는 500 ml 둥근 바닥 플라스크에, 3-(BOC-아미노)-1-프로판올 (TCI) (135.8　mmol)을 가한 다음, 240 mL 무수 디클로로메탄을 가하였다. 디이소프로필에틸 아민(203.7 mmol)을 가하고, 시스템을 드라이 아이스/아세톤 욕조에 놓았다. 아크릴로일 클로라이드(149.4 mmol)를 10 ml의 디클로로메탄을 이용하여 희석시키고, 아르곤이 분출된 시스템에 방울방울 가하였다. 시스템을 아르곤 하에 유지시키고, 실온으로 방치하고 밤새도록 교반하였다. 생성물을 각 100 mL의 dH2O, 10% 시트르산, 10% K2CO3, 포화 NaHCO3, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물인 BOC-아미노 프로필 아크릴레이트(BAPA)를 Na2SO4로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발을 이용하여 DCM을 증발시켰다. 생성물을 7.5㎝ 직경 컬럼을 이용하여 29㎝ 실리카 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 사용된 용매계는 헥산 내 30% 에틸 아세테이트이었다. Rf: 0.30. 분획을 모으고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 용매를 제거하였다. BAPA를 74% 수율로 얻었다. BAPA를 냉장고에 저장하였다.
2. 고분자 합성. 80% BAPA, 20% 에틸 메타크릴레이트 (CAS 97-63-2), (3%　AIBN 촉매) 몰 공급비 (0.0105 총 mol).
BAPA (8.40 mmol) 및 에틸 메타크릴레이트 (2.10 mmol)를 교반바가 장착된 15 ml 반응 튜브에 가하였다. 아세토니트릴 (11.5 ml)을 가한 다음 AIBN (0.315 mmol)을 가하였다. 2개의 반응을 동시에 수행하기 위해 상기 단계를 반복하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 N2로 정화하였다. 반응 튜브를 뚜껑 씌운 다음, 유조로 옮기고 3시간 동안 60℃에서 가열하였다. 튜브를 제거하고, 내용물을 모았다. 아세토니트릴을 회전 증발과 고진공을 통해 증발시키고, 조 고분자를 50 mg/ml로 74.8% 디클로로메탄/25% 테트라히드로퓨란/0.2% 트리에틸아민 용액에 용해시켰다. 3 주입의 조 고분자 용액(500 mg, 10 ml)을 5.0 ml/min의 유속에서 사용된 Jordi gel 플루오르화 디비닐 벤젠 104Å 컬럼(내부 직경: 22 mm, 길이: 500 mm)에서 정제하였다. 고분자 용출을 Shimadzu RID-10A 굴절률 집전기를 이용하여 탐색하였다. 17.16분에서 19.18분까지의 분획을 모으고 합하였다. 용매를 회전 증발을 통해 증발시켰다. 정제된 BOC-보호된 고분자를 1.5시간 동안 빙초산 내 2 M HCl(7 ml)과 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고 아민을 생성하였다. 40 mL dH2O를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 관으로 옮기고, 24시간 동안 고염에 대해 투석한 다음, 18h 동안 dH2O에 대해 투석하였다. 내용물을 증발건조시킨 다음, 30 mL dH2O에 용해시키고 2번 동결건조하였다. 보호된 고분자의 Mw는 100 kDa이었다. 탈보호된 고분자의 계산된 Mw는 61 kDa이었다. PDI = 1.381.
Figure pct00026
80 및 20은 고분자 내 단량체 조성 %를 나타낸다.
B. N- Boc - 에틸에톡시 아크릴레이트 및 프로필 메타크릴레이트의 랜덤 공중합.
아민 아크릴레이트/Cn 메타크릴레이트로 이루어진 공중합체는 하기와 같이 합성되었다. 단량체는 표시된 비로 디옥산에 이르게하여 무게를 재었다. AIBN (아조비스-이소부티로니트릴)을 가하고, 질소를 RT에서 1시간 동안 반응을 통해 버블링하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 3시간 동안 60℃에서 유조에 놓았다. 그 다음, 고분자를 감압 하에 건조시켰다. 고분자를 GPC로 정제하였다. 고분자 분획을 아세트산 내 2M HCl (7 ml)로 RT에서 30분 동안 탈보호화하였다. 30분 후, 15 ml의 물을 반응 혼합물에 가하고, 혼합물을 3.5 kDa MWCO 투석관으로 옮겼다. 고분자를 NaCl에 대해 밤새도록 투석한 다음, 다른 날에 dH2O에 대해 투석하였다. 그 다음, 동결건조를 통해 물을 제거하고, 고분자를 dH2O에 용해시켰다.
고분자 Lau41648 -106.
단량체 공급비는 80 BAEEA : 20 프로필 메타크릴레이트 (CAS:2210-28-8) 이었고, 3% AIBN 촉매는 총 단량체 moles를 기준으로 하였다. BAEEA (6.53 g, 25.2 mmol) (A), 프로필 메타크릴레이트 (0.808 g, 6.3 mmol) (B), AIBN 용액 (0.155 ml, 0.945 mmol), 및 디옥산 (34.5 ml)을 교반바가 있는 50 ml 유리 튜브에 가하였다. 화합물 A 및 B는 상기 기재된 바와 같이 제조되었다. 반응은 3회로 설정하였다. 각 용액은 1시간 동안 긴 피펫을 이용하여 질소로 버블링하였다. 피펫을 제거하고, 각 튜브는 조심스럽게 뚜껑을 덮었다. 그 다음, 각 용액은 유조를 이용하여 3시간 동안 60℃로 가열하였다. 각 용액을 실온으로 냉각시키고, 둥근 바닥 플라스크에 모았다. 조 고분자를 감압 하에 건조시켰다. MALS를 통해 얻어진 분자량: 55,000 (PDI 2.1); H1 NMR을 이용하여 얻어진 고분자 조성: 74:26 아민:알킬.
Figure pct00027
GPC 분획화 .
건조된 조 고분자를 75% 디클로로메탄, 25% 테트라히드로퓨란, 및 0.2% 트리에틸아민에서 50 mg/ml로 이르게 하였다. 그 다음, 고분자를 5　ml/min의 유속 및 10 ml 주입을 이용한 Jordi Gel DVB 104Å-500mm/22mm 컬럼으로 분획화하였다. 초기 분획은 15-17분에서 모으고, 나중 분획은 17-19분에서 모았다. 분획 15-17: Mw 138,000 (PDI 1.1); 분획 17-19: Mw 64,000 (PDI 1.2).
MALS 분석.
대략 10 mg의 고분자를 0.5 mL 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라히드로퓨란, 0.2% 트리에틸아민에 용해시켰다. 분자량 및 다분산도(PDI)는 Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVB column을 이용한 Shimadzu Prominence HPLC에 결합된 Wyatt Helos II 다각 광산란 검출기를 이용하여 측정되었다. 조 고분자: MW: 55,000 (PDI 2.1), 분획 15-17: MW 138,000 (PDI:1.1), 분획 17-19: MW 64,000 (PDI 1.2).
정제된 BOC-보호된 고분자를 아세트산 내 2M HCl (7 ml)로 0.5시간 동안 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고 아민을 생성하였다. 15 mL dH2O를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 관으로 옮기고, 24시간 동안 고염에 대해 투석한 다음, 18시간 동안 dH2O에 대해 투석하였다. 내용물을 동결건조시킨 다음, 20 mg/ml의 농도로 DI H2O에 용해시켰다. 고분자 용액을 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 4. 차폐제
A. 갈락토오스 이치환된 말레익 무수물 차폐제
1) 화합물 10
Figure pct00028
여기서,
Y는 -(CH2)a-(O-CH2-CH2)b-NH-CO-(CH2)c- (여기서, a, b 및 c는 독립적으로 1-6의 정수이다)와 같으나 이에 한정되지 않는 중성 링커이고, 및
R은 OH (갈락토오스), NH2 (D-갈락토사민), NH-CO-H (N-포르밀-D-갈락토사민), NH-CO-CH3 (N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc)), NH-CO-CH2CH3 (N-프로피오닐-D-갈락토사민), NH-CO-CH2CH2CH3 (N-n-부타노일-D-갈락토사민), 및 NH-CO-CH(CH3)2 (N-이소-부타노일-D-갈락토사민)를 포함하는 군으로부터 선택된 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 가지는 갈락토오스 유도체이다.
말레익 무수물과 고분자 위에 있는 아민 기의 반응은 갈락토오스 및 고분자 아민 사이의 pH 불안정한 결합을 형성한다.
2) 화합물 11
Figure pct00029
여기서,
Y는 -NH-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c- (여기서, b 및 c는 독립적으로 1-6의 정수이다)와 같으나 이에 한정되지 않는 중성 링커이고, 및
R은 화합물 10의 상기 정의된 바와 같다.
3) 화합물 12
Figure pct00030
여기서, n은 1-6의 정수이고, R은 화합물 10의 상기 정의된 바와 같다.
4) 화합물 13: N-아세틸-갈락토사민-PEG-메틸 말레익 무수물
Figure pct00031
여기서, n은 1-6의 정수이다.
5) 화합물 14에 예시된 바와 같이, 알킬 스페이서 기가 사용될 수도 있다.
Figure pct00032
여기서, n은 0 내지 10의 정수이고, R은 화합물 10의 상기 정의된 바와 같다.
B. 폴리에틸렌 글리콜 이치환된 말레익 무수물 차폐제
1) 화합물 15
Figure pct00033
여기서, R은 중성이고, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
말레익 무수물과 고분자 위에 있는 아민 기의 반응은 PEG 및 고분자 아민 사이의 pH 불안정한 결합을 형성한다.
2) 화합물 16
Figure pct00034
여기서,
n은 1 내지 500의 정수이고, 및
R은 -H, -CH3, 및 -CH2-CH3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, n은 2 내지 100의 정수이다. 더 바람직하게는, PEG는 5 내지 20의 에틸렌 단위 (n은 5 내지 20의 정수이다)를 함유한다. 더 바람직하게는, PEG는 10 내지 14의 에틸렌 단위 (n은 10 내지 14의 정수이다)를 함유한다. PEG는 가변 길이일 수 있고, 5-20 또는 10-14의 에틸렌 단위의 평균 길이를 가질 수 있다. 대안적으로, PEG는 정확하게 11 또는 13의 에틸렌 단위를 가지는 단분산, 균일 또는 불연속일 수 있다.
C. 디펩티드 차폐제, 화합물 16
Figure pct00035
여기서,
R1 및 R2는 아미노산의 R 기이고,
R4는 입체적 안정화제의 표적 리간드이며,
X는 -NH-, -O-, 또는 -CH2- 이고,
Y는 -NH- 또는 -O- 이며,
R5는 2, 4, 또는 6번 위치에 있고, -CH2-O-C(O)-O-Z 이며 (여기서, Z는 카보네이트이다), 및
R6은 독립적으로 R5에 의해 점령된 위치를 제외하고는 각각의 2, 3, 4, 5, 또는 6번 위치에서 수소, 알킬, 또는 할라이드이다.
실시예 5. 이황화 결합을 통해 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체에 siRNA의 결합
A. SATA / SMPT 결합.
N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA)-변형된 폴리뉴클레오티드는 5' 아민-변형된 siRNA와 물 내 1 무게당량(weight equivalents (wt. eq.))의 SATA 시약 (Pierce) 및 0.36 wt. eq.의 NaHCO3를 4℃에서 16시간 동안 반응시켜 합성되었다. 보호된 티올 변형된 siRNAs는 9 부피의 에탄올을 가하여 침전시키고, -78℃에서 2시간 동안 배양하였다. 침전물을 분리하고, 1×siRNA 완충액 (Dharmacon)에 용해시킨 다음, 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
5 mM TAPS pH 9 내 고분자는 1.5 wt% 4-석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-[2-피리딜디티오]-톨루엔 (SMPT, Pierce)의 첨가에 의해 변형되었다. SMPT의 첨가 후 1시간에, SMPT-고분자를 5 mM TAPS pH　9를 함유하는 등장성 글루코오스 용액에 가하였다. 이 용액에 SATA-변형된 siRNA를 가하였다. 이렇게 하여, 가역적인 이황화 결합을 통해 폴리뉴클레오티드를 고분자에 결합하였다. 고분자와 siRNA 사이의 결합을 위한 이황화 결합은 세포질의 환원성 환경에서 가역성을 제공한다.
Figure pct00036
siRNA-고분자 컨쥬게이트는 용액에 HEPES 유리 염기를 가한 다음 CDM-NAG 및 CDM-PEG의 혼합물을 가하여 차폐되었다. 그 다음, 용액을 주입 전에 실온 (RT)에서 1시간 동안 배양시켰다.
B. SATA / SPDP 결합.
센스 가닥 위에 있는 5'-아미노 기를 가진 siRNA는 HEPES 염기 pH 7.5 존재 하에 SATA와 반응한다. 별도로, 폴리(아크릴레이트)는 HEPES pH 7.5 존재 하에 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-히드록시석신이미드 에스터 (SPDP)와 반응한다. 그 다음, 변형된 siRNA 및 변형된 고분자를 결합하여 고분자에 siRNA를 공유결합시킨다.
C. 5- 메틸 -2- 이미노티올란 결합.
가닥 말단 아미노 기를 가진 siRNA는 S-아세틸 기와 반응하여 siRNA-SAc을 생성한다. 고분자는 DTNB의 존재 하에 5-메틸-2-이미노티올란 (M2IT)과 반응하여 활성화된 이황화를 가진 고분자를 생성한다.
Figure pct00037
그 다음, 상기 변형된 고분자를 siRNA-SAc와 반응시켜 siRNA-고분자 컨쥬게이트를 형성한다.
Figure pct00038
이황화 결합이 일반적인 포유동물 세포의 환원성 환경에서 절단의 동역학을 변화시켜 제조될 수 있음을 주목하라.
D. 말레익 무수물 결합.
가닥 말단 아미노 기를 가진 siRNA는 알칼리성 완충액 (예를 들어, HEPES pH 7.9) 존재 하에 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물 또는 CDM-티오에스터와 같은 이치환된 말레익 무수물과 반응한다. siRNA-말레익 무수물에 폴리(아크릴레이트)를 가한다. 그 다음, 말레익 무수물을 고분자 위에 있는 아민과 반응시킨다.
실시예 6. 막 활성 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체의 가역적인 변형 (차폐).
A. 말레익 무수물-계 차폐제로 변형.
변형 전, 5-7× mg의 이치환된 말레익 무수물 차폐제 (예를 들어, CDM-NAG)를 0.1% 빙초산 수용액에서 동결건조시켰다. 건조된 이치환된 말레익 무수물 차폐제에, 0.2× mL의 등장성 글루코오스 내 ×㎎ 고분자 용액과 10×㎎의 HEPES 유리 염기를 가하였다. 무수물이 완전히 용해된 후, 용액을 동물 투여 전에 RT에서 적어도 30분 동안 배양하였다.
이치환된 말레익 무수물 차폐제와 고분자를 반응시켜 하기 물질을 생성하였다:
Figure pct00039
여기서, R은 폴리(아크릴레이트) 고분자이고, R1은 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 포함한다. 무수물과 고분자 아민 사이의 반응에서 생성된 무수물 카복실은 ~1/20th의 예상된 전하를 나타낸다(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 막 활성 고분자는 크게 음으로 하전된 다가음이온으로 전환하기 보다는 효과적으로 중성화된다.
어떤 적용에서, 고분자는 2-단계 공정으로 변형된다. 먼저, 차폐(shielding) (PEG) 및 표적 기를 가진 CDM-계 차폐제는 차폐제 대 표적제를 2:1 (wt:wt)의 비로 혼합하였다. 고분자를 2× mg의 CDM 차폐제 혼합물로 30분 동안 변형시킨 다음, siRNA를 결합하였다. 그 다음, 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 5× mg의 CDM 차폐제 혼합물로 더 변형시켰다. 그 다음, 용액을 동물에 주사하기 전에 실온 (RT)에서 적어도 1시간 배양하였다.
B. 프로테아제 절단할 수 있는 차폐제로 변형
p-아실아미도벤질 알콜 유도체의 활성화된 (아민 반응성) 카보네이트를 pH>8에서 H20 내 양극성 막 활성 폴리아민의 아미노 기와 반응시켜 p-아실아미도벤질 카바메이트를 생성하였다.
Figure pct00040
여기서,
R1은 표적 기 리간드 (보호된 또는 탈보호된) 또는 PEG를 포함하고,
R2는 양극성 말 활성 폴리(아크릴레이트)이며,
AA는 디펩티드 (보호된 또는 탈보호된)이고, 및
Z는 아민-반응성 카보네이트이다.
× mg의 고분자에 등장성 글루코오스 내 10-12× ㎎의 HEPES 유리 염기를 가하였다. 완충된 고분자 용액에, 2× 내지 16× ㎎의 200 ㎎/ml DMF 내 디펩티드 차폐제를 가하였다. 어떤 적용에서, 고분자를 2× mg의 디펩티드 차폐제로 변형시킨 다음 siRNA를 결합하였다. 그 다음, 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 6× 내지 8× mg의 디펩티드 차폐제로 더 변형시켰다. 그 다음, 용액을 동물에 주사하기 전에 실온 (RT)에서 적어도 1시간 배양하였다. 어떤 적용에서, 고분자를 2× mg의 PEG 디펩티드 차폐제로 변형시킨 다음 siRNA를 결합하였다. 그 다음, 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 6× 내지 8× mg의 표적 리간드 디펩티드 차폐제로 더 변형시켰다. 그 다음, 용액을 동물에 주사하기 전에 실온 (RT)에서 적어도 1시간 배양하였다.
어떤 적용에서, 고분자를 2× mg의 디펩티드 차폐제로 변형시킨 다음 siRNA를 결합하였다. 그 다음, 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 6× 내지 8× mg의 CDM-계 차폐제로 더 변형시켰다. 그 다음, 용액을 동물에 주사하기 전에 RT에서 적어도 1시간 배양하였다. 어떤 적용에서, 고분자를 2× mg의 PEG 디펩티드 차폐제로 변형시킨 다음 siRNA를 결합하였다. 그 다음, 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 6× 내지 8× mg의 표적 리간드 CDM-계 차폐제로 더 변형시켰다. 그 다음, 용액을 동물에 주사하기 전에 실온 (RT)에서 적어도 1시간 배양하였다.
실시예 7. 컨쥬게이트 형성 - 차폐 및 폴리뉴클레오티드 결합
A) 고분자를 SMPT로 변형시켰다. 1시간 후, 2 wt 당량의 CDM-NAG (N-아세틸갈락토오스아민) 및/또는 CDM-PEG (평균 11 단위)를 HEPES 염기 존재 하에 고분자에 가하였다. 이 용액에 SATA-siRNA를 가하였다. 밤새도록 배양한 후, CDM-NAG 및/또는 CDM-PEG를 컨쥬게이트에 가하였다.
B) 고분자를 SMPT로 변형시켰다. 1시간 후, 2 wt 당량의 FCit-NAG (N-아세틸갈락토오스아민) 및/또는 FCit-PEG (평균 11 단위)를 HEPES 염기 존재 하에 고분자에 가하였다. 이 용액에 SATA-siRNA를 가하였다. 밤새도록 배양한 후, FCit-NAG 및/또는 FCit-PEG를 컨쥬게이트에 가하였다.
실시예 8. siRNAs .
siRNAs는 하기 서열을 가졌다:
인자 VII - 설치류
센스: (Chol)-5' GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT) 3' (서열번호 1)
안티센스: 5' pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT 3' (서열번호 2)
또는
센스 5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT 3' (서열번호 3)
안티센스 5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3' (서열번호 4)
인자 VII - 영장류
센스 (chol)-5' uuAGGfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT) 3' (서열번호 5)
안티센스 5' pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT 3' (서열번호 6)
ApoB siRNA:
센스 (cholC6SSC6)-5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (서열번호 7)
안티센스 5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3' (서열번호 8)
siLUC
센스 (chol) 5'-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3' (서열번호 9)
안티센스 5'-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3' (서열번호 10)
소문자 = 2'-O-CH3 치환
s = 포스포로티오에이트 결합
뉴클레오티드 뒤의 f = 2'-F 치환
뉴클레오티드 앞의 d = 2'-데옥시
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 고체 지지체로서 조절된 기공 유리(controlled pore glass, CPG)에 관한 종래의 포스포르아미디트 화학에 의해 고체 상에서 RNA 합성을 수행하였다.
실시예 9. 아미노-변형된 RNA 의 합성
센스 가닥의 5'-말단에 C-6-아미노링커가 갖춰진 RNA는 AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 고체 지지체로서 조절된 기공 유리(Prime Synthesis, Aston, PA, USA)를 이용하여 1215μmol의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미디트 화학으로 생성되었다. 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 RNA는 상응하는 포스포르아미디트, 2'-O-메틸 포스포르아미디트 및 TFA-헥실아미노링커 아미디트(Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany)를 사용하여 생성되었다. 절단, 탈보호 및 정제는 기술분야에서 알려진 방법에 의해 이루어졌다(Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84).
실시예 10. 폴리 ( 아크릴레이트 ) 전달 고분자를 이용한 RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달
RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 및 차폐된 폴리(아크릴레이트) 고분자를 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 6 내지 8주령 마우스(C57BL/6 또는 ICR 계통, 각 ~18-20g)는 Harlan Sprague Dawley(Indianapolis IN)로부터 얻었다. 마우스는 주사 전 적어도 2일 수용하였다. Harlan Teklad Rodent Diet (Harlan, Madison WI)를 무제한 급여하였다. 별도의 언급이 없으면, 0.4 mL의 전달 펩티드-siRNA 컨쥬게이트의 용액을 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하여 주사하였다. 조성물은 생리적 조건에서 가용성 및 비응집(nonaggregating)이었다. 다른 용기로 주입, 예를 들어, 우측 후안와(retro-orbital) 주입은 동일하게 효과적일 것으로 예측된다.
175-200g의 Wistar Han rats는 Charles River (Wilmington, MA)로부터 얻었다. 랫트는 주사 전 적어도 1주일 수용하였다. 랫트의 주입 용량은 일반적으로 1 ml 이었다.
표시된 양의 고분자-siRNA 컨쥬게이트를 22 내지 25 게이지 정맥 카테터를 이용하여 복재정맥류(saphenous vein)로 주사를 통해 필리핀 원숭이(Cynomolgus macaque) (짧은꼬리원숭이(Macaca fascicularis)) 영장류 (웅성, 3.0 내지 8.0 kg)에 투여하였다. 대조로서, 다른 세트의 영장류는 등장성 글루코오스를 주사하였다. 혈액요소질소(blood urea nitrogen, BUN), 알라닌 트랜스아미나제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 및 크레아티닌에 대한 혈액 시험은 제조자의 권고에 따라 Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics)에서 수행되었다.
마우스, 랫트, 및 영장류는 주사 전, 4시간, 16시간, 또는 밤새도록 금식시켰다. 영장류는 채혈(blood collection) 또는 조직 수확 전에 밤새도록 금식시켰다. 혈액 시료는 마우스의 경우 악하 출혈(submandibular bleeding)에 의해, 랫트의 경우 경정맥(jugular vein)으로부터, 영장류의 경우 대퇴정맥(femoral vein)으로부터 모았다. 마우스와 랫트의 경우, 별도의 표시가 없으면, 고분자 주사 후 2일에 시료를 얻었다. 영장류의 경우, 2일(주사 후 24시간) 및 4일(주사 후 72시간)에 혈액 시료를 모았다. 또한, 영장류의 경우, 혈액 시료 수집은 81일까지 수행하였다. 웨스턴 어세이에 사용하기 위한 혈청을 모으고, 동일한 용량의 EDTA 함유 Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, IndianapolisIN)에 가하고, -20℃에서 저장하였다. 제조자의 프로토콜(MolecularResearchCenter, CincinnatiOH)에 따라 TRI-REAGENT®를 이용하여 수확 후 즉시 간으로부터 총 RNA를 분리하였다.
혈청 ApoB 수준 측정.
혈청 ApoB 단백질 수준은 표준 샌드위치 ELISA 방법으로 측정되었다. 간단하게, 다클론 염소 항-마우스 ApoB 항체 및 토끼 항-마우스 ApoB 항체(Biodesign International)를 각각 포획물 및 검출 항체로 사용하였다. HRP-결합된 염소 항-토끼 IgG 항체(Sigma)는 ApoB/항체 복합체를 결합하기 위해 나중에 적용되었다. 그 다음, 테트라메틸-벤지딘(TMB, Sigma) 비색 개발의 흡광도를 450 nm에서 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 리더로 측정하였다.
혈장 인자 Ⅶ(F7) 활성 측정.
동물로부터의 혈장 시료는 표준 과정에 따라 0.109 mol/L 소듐 시트레이트 항응고제(1 부피)를 함유하는 미세원심분리 튜브로 (마우스의 경우 악하 출혈에 의해 또는 랫트의 경우 경정맥으로부터) 혈액(9 부피)을 모아 제조되었다. 혈장에서 F7 활성은 제조자의 권고에 따라 BIOPHEN VII kit (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH)를 이용하여 발색분석(chromogenic method)으로 측정되었다. 비색 개발의 흡광도는 450 nm에서 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정되었다.
실시예 11. 양극성 양이온성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체는 in vitro 형질감염 시약에서 효과적이다.
A. 하기의 고분자는 상기 기재된 바와 같이 RAFT 중합을 통해 합성되었다.
1) 에틸(boc)아미노아크릴레이트 + 부틸 메타크릴레이트 (EAA-BuMA)
Figure pct00041
2) 에톡시에틸(boc)아미노아크릴레이트 + sec-부틸 아크릴레이트 공중합체 (EEAA-SecBuA)
Figure pct00042
3) 에톡시에틸(boc)아미노아크릴레이트 + 부틸 아크릴레이트 공중합체 (EEAA-BuA)
Figure pct00043

B. 표시된 공중합체 (500 mg)를 아세트산 내 2 N HCl 용액 (5 mL)에 용해시키고 1시간 동안 교반하여 아민 보호기를 제거하였다. 용액을 물(30 mL)로 희석하고, 2일 동안 NaCl 수용액에 대해 투석한 다음 탈이온수로 투석하였다. 용액을 동결건조한 다음, H2O에 재-용해시켜 20 mg/mL의 용액을 만들었다. 표시된 바와 같이, Hep3B-SEAP (간세포암), MCF7 (유방암), HT29 (대장암), HepG2-SEAP (간세포암), 또는 A375 (흑색종) 세포를 10,000 cells/well의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 1.5 ㎍/mL 또는 3 ㎍/mL의 공중합체 및 OPTI-MEM 환원된-혈청 배지(Gibco)에서 제조된 500 ng/mL의 Aha1 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, 세포를 용해시키고, TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit (Life Technologies)를 이용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)로 처리하였다. StepOne Real-Time PCR System (Life Technologies)에서 인간 Aha1 및 인간 CycA에 대해 TaqMan 어세이를 이용하여 Biplex qRT-PCR을 수행하였다. 상대적 유전자 발현 정량화의 △△CT 방법을 이용하여 분석을 수행하였다.
고분자는 (형질감염) 광범위한 in vitro 세포에 siRNA의 전달에 효과적이다. 이러한 양극성 폴리(아크릴레이트) RAFT 공중합체의 경우, 40% 내지 80%의 아민 함량은 효과적이었다. 일반적으로, 정해진 아민 함량의 경우, 분자량의 증가는 형질감염 활성이 증가한 고분자를 생성하였다. 도 11, 12, 및 13 참조.
실시예 12. 프로테아제 절단할 수 있는 DPCs로 표적하는 종양
A) 표적 유전자 녹다운 측정.
하기에 제시된 모든 연구의 경우, 표적 유전자인 Aha1 유전자 전사에 대해 특이적인 siRNA를 사용하였다. 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)에 대한 siRNA를 비-표적 대조로서 사용하였다. Aha1 siRNA는 인간 및 마우스 유전자 둘 다에서 100% 상동인 Aha1의 서열 모티프에 상보적이었다. 따라서, 숙주세포 또는 인간 이종 이식(xenograft)의 종양세포로 Aha1 siRNA의 전달은 mRNA 절단 및 분해를 야기한다. 마우스 및 인간 Aha1 유전자의 다른 서열 모티프를 이용하여, 세포 유형의 혼합된 집단이 함유된 조직 시료에서 인간 Aha1 및 마우스 Aha1 mRNA 수준 둘 다의 정량적 측정을 가능하게 하는 PCR 프라이머를 설계하였다. siRNA 전달 후 24, 48 또는 72시간에, 결합된 몇몇 건강한 마우스 간 조직과 함께 종양을 수확하고, 총 RNA 분리를 위해 Tri-Reagent (Invitrogen)로 처리하였다. 그 다음, 인간 및 마우스 Aha1 mRNA 수준을, 내부 기준 유전자로서 인간 Cyc-A 및 마우스 β-액틴을 이용하여 qPCR 어세이로 측정하였다. 가짜-주입된 동물, 또는 비-표적 대조 GFP siRNA를 수여받은 마우스로부터의 동물에서 Aha1 mRNA 수준은 100%로 간주되었다. 결과는 대조에 대해 Aha1 mRNA 수준의 %로 나타내고, 하기 표에 나타내었다.
B) 이소성( Orthotopic ) 간세포암( HCC ) 종양 모델 마우스.
HegG2, Hep3B, 또는 HuH7 세포 간세포암은 2개의 발현 벡터, pMIR85 인간 태반 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 벡터 및 pMIR3 네오마이신/카나마이신-내성 유전자 벡터로 공-형질감염시켜 안정한 SEAP 발현을 가진 세포주를 개발하였다. 세포를 10% FBS 및 300 ug/ml G418로 보충된 DMEM에서 성장시키고, 모으고, 계수한 다음, 마트리젤 (BD Biosciences) (50% 부피로)과 혼합하였다. 무흉선 누드 (Athymic nude) 또는 Scid 베이지 마우스를 ~3% 이소플루란(isoflourane)으로 마취시키고 흉골 횡와위(sternal recumbent position)에 놓았다. 칼돌기(xyphoid) 바로 아래에 작은, 1-2 cm, 정중선 복부 절개를 하였다. 촉촉한 면봉을 이용하여, 간의 좌엽(left lobe)을 부드럽게 몸 밖으로 내었다. 간의 좌엽을 부드럽게 집어넣고, 주사 바늘을 좌엽의 가운데에 삽입하였다. 주사 바늘을 간의 낭(capsule) 바로 아래 약 0.5 cm 아래에 비스듬한 면으로 삽입하였다. 100,000 세포를 함유하는 10㎕의 세포/마트리젤 혼합물을 주사기 펌프를 이용하여 간에 주사하였다. 바늘을 몇 분 동안 (15-20초) 간에 그대로 두어 주입이 완료되었음을 확인하였다. SEAP-Hep2G 세포를 무흉선 누드 마우스에 주사하였다. SEAP-Hep3B 및 SEAP-HuH7 세포를 Scid 베이지 마우스에 주사하였다. 그 다음, 간으로부터 주사 바늘을 제거하고, 면봉을 주사 부위에 놓아 세포의 누출 및 출혈을 막았다. 마트리젤/세포 혼합물은 눈에 보이는 덩어리를 형성하였으며, 바늘의 제거 후 사라지지 않았다. 간엽을 복부 등에 부드럽게 놓은 다음, 복벽(abdominal wall)을 닫았다. 종양 이식 후 일주일에 한 번씩 혈청을 모으고, SEAP 어세이를 수행하여 종양 크기를 관찰하였다. 대부분의 연구를 위해, 종양 치수가 SEAP 값을 기준으로 약 4-8 mm로 될 것으로 예측될 때인, 이식 후 4-5주의 종양 마우스를 이용하였다.
C) 대장 전이성 종양 모델.
HT29 세포를 10% FBS로 보충된 McCoy's 5a 배지에서 성장시키고, 모으고, 계수한 다음, 마트리젤 (BD Biosciences) (50% 부피로)과 혼합하였다. 무흉선 누드 마우스를 ~3% 이소플루란으로 마취시키고 흉골 횡와위에 놓았다. 칼돌기 바로 아래에 작은, 1-2 cm, 정중선 복부 절개를 하였다. 촉촉한 면봉을 이용하여, 간의 좌엽을 부드럽게 몸 밖으로 내었다. 간의 좌엽을 부드럽게 집어넣고, 주사 바늘을 좌엽의 가운데에 삽입하였다. 주사 바늘을 간의 낭 바로 아래 약 0.5 cm 아래에 비스듬한 면으로 삽입하였다. ~40,000 세포를 함유하는 5㎕의 세포/마트리젤 혼합물을 주사기 펌프를 이용하여 간에 주사하였다. 바늘을 몇 분 동안 (15-20 초) 간에 그대로 두어 주입이 완료되었음을 확인하였다. 그 다음, 간으로부터 주사 바늘을 제거하고, 면봉을 주사 부위에 놓아 세포의 누출 및 출혈을 막았다. 마트리젤/세포 혼합물은 눈에 보이는 덩어리를 형성하였으며, 바늘의 제거 후 사라지지 않았다. 간엽을 복부 등에 부드럽게 놓은 다음, 복벽을 닫았다. 이식 후 4-5주의 종양 마우스를 이용하였다.
실시예 13. PEG 24 - Val - Cit DPC 투여 후 HepG2 - SEAP 이소성 간세포암 ( HCC ) 모델에서 표적 유전자 발현의 in vivo 녹다운.
상기 기재된 바와 같이, Ant-129-1 고분자 DPCs를 18× 중량 초과 PEG24-Phe-Cit 차폐제 (또는 PEG24-Val-Cit 차폐제) 또는 7× PEG550-CDM으로 변형 (차폐)시켰다. 상기 기재된 바와 같이, Aha1-siRNA 또는 GFP-siRNA (비-표적 대조)를 고분자에 결합시켰다 (4:1 중량비). DPCs는 전달 전에 겔 여과로 정제하지 않았고, 표적 리간드를 가하지 않았다. 동물 당 200 ㎕ 등장성 글루코오스 내 320 ㎍ (고분자 중량) DPC 컨쥬게이트를 꼬리 정맥에 주사하여 투여하였다 (군 당 n=3). 24시간 후, 동물은 200 ㎕ 등장성 글루코오스 내 320 ㎍ (고분자 중량) DPC 컨쥬게이트의 두 번째 주사를 수여받았다. 두 번째 주사 후 48시간에, 혈청 시료를 모아 간 효소 (ALT 및 AST) 및 혈액 요소 질소 (BUN) 수준을 측정한 다음, 조직 수확, 및 qPCR 분석에 의해 독성을 평가하였다.
Aha1 siRNA를 전달하기 위해 PEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPCs를 이용하여, 인간 종양 세포에서 Aha1 유전자의 46% 녹다운이 발생하였다 (표 2). 인간 Aha1 녹다운 수준과는 반대로, 마우스 Aha1은 PEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPCs 투여 반응에서 70% 녹다운되었다 (표 2). 이치환된 말레익 무수물 차폐제 (PEG550-CDM)로 제조된 유사한 DPCs와 비교하여, 내인성 간세포 Aha1 녹다운을 감소시켰다. ALT, AST 및 BUN 수준으로 나타낸 바와 같이, PEG24-Val-Cit DPCs는 잘 견디고 독성을 나타내지 않았다 (표 3).
[표 2] 말레익 무수물 변형된 대 펩티드 절단할 수 있는 변형된 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HepG2 간 종양 모델에서 Aha1 녹다운.
Figure pct00044
[표 3] 말레익 무수물 변형된 또는 펩티드 절단할 수 있는 변형된 Aha1 siRNA DPCs의 투여 후에 혈액 화학 독성 마커.
Figure pct00045

실시예 14. 이중특이적 항체 ( bsAb )- 표적된 DPCs (2011090701)와 함께 표적 유전자 발현의 녹다운.
상기 기재된 바와 같이, Ant-129-1 고분자를 5× Dig-PheCit (Dig-FCit) 차폐제로 변형시켰다. 그 다음, siRNA를 컨쥬게이트에 결합시켰다. 마지막으로, Dig-FCit-Ant-129-1-siRNA 컨쥬게이트를 8× (wt)PEG12-FCit로 더 변형시켰다. Aha1-siRNA (RD-09070) 또는 GFP siRNA (RD-05814)를 4:1의 고분자:siRNA 중량비로 결합시켰다. PEG12-FCit DPCs를 Sephadex G50 스핀 컬럼에서 정제하여 결합되지 않은 시약을 제거하였다.
헤파란 설페이트 프로테오글리칸 글리피칸-3 (GPC3), HepG2-SEAP 세포에서 크게 발현되는 것으로 알려진 세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및 디곡시제닌 (Dig)에 특이적인 세포 표적 이중특이적 항체 (bsAb)를 제조하였다. 대조로서, 단백질 CD33(골수-유래 조혈줄기세포의 마커) 및 Dig에 대해 특이적인 이중특이적 항체를 제조하였다. CD33은 HepG2-SEAP 세포에 의해 발현되지 않는다. BsAbs를 변형된 DPCs와 1.25:1 중량비로 혼합하여 예측된 1:1 몰비를 제공하였다. 복합체는 전달 전 적어도 30분에 PBS에서 형성되었다.
bsAb 표적제와 함께 또는 없이 HepG2-SEAP 종양을 가진 마우스에 DPCs를 투여하였다. 각 동물 (군 당 n=3)은 250 ㎍ (고분자 wt.) DPCs의 단회 용량을 수여받았다. 200 ㎕ 멸균 PBS 내 DPCs를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 혈청 및 조직 시료를 48시간 후에 수확하고, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, bsAb 표적 DPCs (250 ㎍ 고분자, 62.5 ㎍ siRNA)의 단회 용량은 21-32%의 표적 유전자 녹다운을 야기하였다.
[표 4] 이중특이적 항체를 이용하여 표적된 펩티드 절단할 수 있는 차폐제 변형된 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HepG2 간 종양 모델에서 Aha1 녹다운.
Figure pct00046

실시예 15. 이중특이적 항체 ( bsAb )- 표적된 DPCs 와 함께 표적 유전자 발현의 녹다운.
a) PEG24-FCit를 PEG12-FCit 대신 사용하고, b) Dig-PEG12-NHS를 사용하여 고분자에 Dig를 결합한 것을 제외하고는, 상기와 같이 DPCs를 제조하였다. PEG24-FCit DPCs는 PEG12-FCit DPCs보다 적게 응집하였고, 더 작고 더 균일하였다. 비-불안정한 결합 외에도, Dig-PEG12-NHS는 긴 PEG를 함유하였다. DPCs는 bsAb와 함께 혼합하고, 상기 기재된 바와 같이 동물에 주사하였다. 혈청 및 조직 수확은 주사 후 24 또는 48시간에 수확하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, DPCs (250 ㎍ 고분자 wt.)의 단회 용량은 주사 후 24시간에 46-56%의 인간 Aha1 녹다운을 야기하였다.
[표 5] 증가된 PEG 길이를 가진 펩티드 절단할 수 있는 차폐제를 이용하여 변형된 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HepG2 간 종양 모델에서 Aha1 녹다운.
Figure pct00047

실시예 16. bsAb 표적된 DPCs 에 의한 인간 대장선암( colorectal adenocarcinoma) 전이성 간 종양 조직에 DPCs 의 표적.
Ant-129-1 고분자를 5× 몰 초과 Dig-PEG12-NHS 및 8× 중량 초과 PEG24-FCit로 변형시켰다. Aha1 siRNA 또는 GFP siRNA를 4:1의 고분자:siRNA 중량비로 변형된 고분자에 결합시켰다. DPCs를 Sephadex G50 스핀 컬럼에서 정제하여 결합되지 않은 시약을 제거하였다. Dig-DPCs는 HT29 종양 세포 (인간 대장선암; ATCC 번호 HTB-38)를 함유하는 동물에 주사하기 전 적어도 30분에 멸균 PBS 내 동 몰량의 IGF1R-Dig bsAb 또는 CD33-Dig bsAb 또는 bsAb 없이 혼합하고, DPCs와 함께 주사하였다. HT29 세포는 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 단백질 (IGF1R)을 과발현하고, IGF1R-Dig 이중특이적 항체를 결합하고 내재화할 수 있다. 동물 (n=3)은 DPCs (320 ㎍ 고분자)를 수여받았다. 24시간 후 주사를 반복하였다. 혈청 및 조직 시료를 두 번째 용량 후 48시간에 모았다. 종양 세포 내 인간 Aha1의 녹다운은 26-38% 이었다 (표 6). CDM-DPCs와 비교하여, FCit-DPCs는 비-표적 간 Aha1 녹다운 (24-36%에 비해 78-83%)을 덜 나타내었다. 또한, FCit-DPCs는 CDM-DPCs에 비해 감소된 간 축적을 나타내었다.
[표 6] 디펩티드 절단할 수 있는 Aha1 siRNA DPCs에 의한 HT29 대장선암 전이성 간 종양에서 Aha1 녹다운.
Figure pct00048

실시예 17.
고분자 Ant 41658-111를 이치환된 말레익 무수물 (CDM) 차폐제 또는 이치환된 말레익 무수물 차폐제와 페닐알라닌-시트룰린(FC) 디펩티드 차폐제의 조합으로 변형시켰다. 그 다음, 200 μL의 150 ㎍ 변형된 고분자를 200 μL의 콜레스테롤에 결합된 40 ㎍ apoB siRNA (콜레스테롤-siRNA)와 함께 공동-주입하였다. 양성 대조로서, 이치환된 말레익 무수물 변형된 고분자 (150 ㎍ 고분자) 결합된 40 ㎍ siRNA를 사용하였다. 주입 후 48시간에, ApoB를 ELISA로 검출하였다.
[표 7] a) ApoB siRNA에 결합된 변형된 Ant 41658-111 고분자 또는 b) 콜레스테롤-ApoB siRNA와 함께 공-주입된 변형된 Ant 41658-111 고분자로 처리된 마우스에서 Apo B의 녹다운.
Figure pct00049

실시예 18. 양극성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체- siRNA 컨쥬게이트에 의한 siRNA 전달 후에 in vivo 에서 내인성 유전자 발현의 억제.
하기 표 8-11에 나타낸 폴리(아크릴레이트) 고분자를 차폐하고, 상기 기재된 바와 같이 siRNAs에 결합하였다. 컨쥬게이트를 랫트에 주사한 다음, 표적 유전자 발현에 대한 효과를 측정하였다.
[표 8] 표시된 고분자를 CDM-PEG 및 CDM-NAG로 변형시켰다. 가역적으로 차폐된 고분자를 60 ㎍ 인자 VII siRNA에 결합한 다음, Wistar Han 랫트에 1.0 mL 주입 용량으로 주입하고, 인자 VII 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00050
[표 9] 표시된 ㎍의 CDM 변형된 NAR 42020-117A-fr1 고분자를 50 ㎍ 인자 VII siRNA에 결합하고, Wistar Han 랫트에 1.0 mL 주입 용량으로 주입하였다. 주입 후 48시간에, 인자 VII 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00051
[표 10] 표시된 고분자를 CDM-PEG 및 CDM-NAG로 변형시켰다. 가역적으로 차폐된 고분자를 50 ㎍ 인자 VII siRNA에 결합한 다음, Wistar Han 랫트에 1.0 mL 주입 용량으로 주입하였다. 주입 후 48시간에, 인자 VII 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00052
[표 11] 표시된 ㎍의 CDM 변형된 NAR 41439-71B-fr1 (NAR 41439-117AB-fr1) 고분자를 인자 VII siRNA에 결합하고, Wistar Han 랫트에 1.0 mL 주입 용량으로 주입하였다. 주입 후 48시간에, 인자 VII 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00053

실시예 19. 콜레스테롤- siRNA 및 차폐된 양극성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체의 병용-투여 후에 in vivo 에서 내인성 유전자 발현의 억제.
하기 표 12-13에 나타낸 폴리(아크릴레이트) 고분자를 상기 기재된 바와 같이 차폐하였다. 차폐된 고분자를 콜레스테롤-siRNA와 함께 마우스에 공동 주입한 다음, 표적 유전자 발현에 대한 효과를 측정하였다.
[표 12] 표시된 고분자를 CDM-PEG 및 CDM-NAG로 변형시켰다. 가역적으로 차폐된 고분자를 C57BL/6 또는 ICR 마우스에 0.2 mL 주입 용량으로 20 ㎍ 콜레스테롤-ApoB siRNA와 함께 공동-주입하였다. 주입 후 48시간에, ApoB 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00054
[표 13] 표시된 고분자를 CDM-PEG 및 CDM-NAG로 변형시켰다. 가역적으로 차폐된 고분자를 C57BL/6 또는 ICR 마우스에 0.2 mL 주입 용량으로 40 ㎍ 콜레스테롤-ApoB siRNA와 함께 공동-주입하였다. 주입 후 48-72시간에, ApoB 녹다운을 측정하였다.
Figure pct00055
Figure pct00056

실시예 20. 양극성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 랜덤 공중합체.
도 14에 열거된 조성을 가진 다양한 양극성 폴리(아크릴레이트) 고분자를 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 도 15에 열거된 폴리(아크릴레이트) 고분자를 차폐하고 상기 기재된 바와 같이 siRNA에 결합하였다. 컨쥬게이트를 지시된 동물에 주입한 다음, 표적 유전자 발현에 대한 효과를 측정하였다 (도 15). 도 16에 열거된 폴리(아크릴레이트) 고분자를 상기 기재된 바와 같이 차폐하였다. 차폐된 고분자를 동물에 콜레스테롤-siRNA와 함께 공동-주입한 다음, 표적 유전자 발현에 대한 효과를 측정하였다 (도 16).
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Claims (20)

  1. 하기 구조를 가진 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체:
    Figure pct00057

    여기서,
    N은 -NH2 또는 -N-CO-O-C-(CH3)3이고,
    Y는 -(CH2) a - 또는 -(CH2-CH2-O) b -(CH2) c - 이며, 여기서 a, b, 및 c는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고,
    N'는 -NR5H, -NR5R6, -NR5R6R7, 질소 헤테로고리, 알디민, 히드라지드, 히드라존, 또는 이미다졸이며, 여기서 R5, R6, 및 R7은 독립적으로 -CH3 및 -CH2-CH3로부터 선택되고,
    Y'는 1-12 탄소 원자를 함유하며, 이들 중 하나 이상은 헤테로원자로 치환될 수 있는 비전하 링커 기이고,
    R은 2-6 탄소 원자를 가진 소수성 기 또는 알콕실 에틸기이며,
    R'는 12-20 탄소 원자를 가진 소수성 기이고,
    R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소 (-H) 및 메틸 (-CH3)로부터 선택되며,
    m 및 p는 독립적으로 영(0)보다 큰 정수이고,
    n 및 q는 독립적으로 영(0)보다 크거나 같은 정수이며,
    (m+n)/(p+q) 비는 0.67-5.7이고,
    (m+n+p)/(q) 비는 19보다 크거나 같으며, 이때 q는 1보다 크거나 같은 정수이고, 및
    폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체의 다분산도는 1.5 미만이다.
  2. 제 1항에 있어서, R1은 수소인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  3. 제 2항에 있어서, Y는 -(CH2) a - 이고, 여기서 a는 2, 3, 또는 4인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  4. 제 2항에 있어서, Y는 -CH2-CH2-O-(CH2)2- 인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  5. 제 2항에 있어서, R은 -(CH2) k -CH3(여기서 k는 1, 2, 또는 3이다), -CH(CH3)-CH2-CH3, 및 -(CH2) l -O-CH2-CH3 (여기서 l은 2, 3, 또는 4이다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  6. 제 5항에 있어서, R은 -CH2-CH2-O-CH2-CH3인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  7. 제 2항에 있어서, n은 0인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  8. 제 7항에 있어서, q는 0인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  9. 제 2항에 있어서, R3은 수소인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  10. 제 9항에 있어서, (m+n)/(p+q) 비는 1-1.86인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  11. 제 2항에 있어서, R3은 메틸인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  12. 제 9항에 있어서, (m+n)/(p+q) 비는 1.86-3인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  13. 제 1항에 있어서, Y는 -(CH2-CH2-O)-CH2-CH2- 이고,
    R은 -CH2-CH2-CH3 이며,
    R1은 수소이고,
    R3은 메틸이며,
    n 및 q는 둘 다 0이고,
    m/p는 2.2-3인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  14. 제 1항에 있어서, Y는 -(CH2-CH2-O)-CH2-CH2- 이고,
    R은 -CH2-CH2-CH3 이며,
    R1 및 R3은 둘 다 수소이고,
    n 및 q는 둘 다 0이며,
    m/p는 1-1.86인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  15. 제 1항에 있어서, Y는 -(CH2-CH2-O)-CH2-CH2- 이고,
    R은 -CH2-CH2-CH2-CH3 이며,
    R1 및 R3은 둘 다 수소이고,
    n 및 q는 둘 다 0이며,
    m/p는 1-1.86인 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  16. 제 1항에 있어서, 고분자는 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드에 결합된 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  17. 제 1항에 있어서, 50% 보다 큰 N은 이치환된 말레익 무수물 차폐제, 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제, 또는 이치환된 말레익 무수물 차폐제와 디펩티드-아미도벤질-카보네이트 차폐제의 조합과 반응하여 가역적으로 변형되는 것을 특징으로 하는, 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체.
  18. 약학적으로 허용가능한 담체에서 제 17항의 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체 및 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드를 포함하는 in vivo 유전자 발현 억제용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 폴리(아크릴레이트) 랜덤 공중합체에 공유결합된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 제 18항에 있어서, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 적어도 20 탄소 원자를 함유하는 소수성 기에 결합된 것을 특징으로 하는, 조성물.
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