BRPI0610499A2 - moléculas de ácido nucléico , composições e usos das referidas moléculas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de doenças envolvendo neovascularização (NV) indesejável. A invenção apresenta tratamentos que controlam a NV mediante inibição seletiva de vias bioquímicas prá-angiogónicas, incluindo a inibição da expressão do gene da via VEGF e inibição localizada em tecidos NV patológicos. Apresentam-se composições de nanopartículas direcionadas a tecido compreendendo conjugados de polímeros e moléculas de ácidos nucléicos que induzam interferência de RNA (RNAi). As composições de nanopartículas da invenção podem ser usadas isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos, como antagonistas da via VEGF. As composições e métodos podem ser usados para o tratamento de doenças NV, como câncer, doença ocular, artrite e doenças inflamatórias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO E MÉTODOS TERAPÊUTICOS COM RNAi PARA TRATAMENTO DECÂNCER E OUTRAS DOENÇAS DE NEOVASCULARIZAÇÃO".

Este pedido de patente reivindica prioridade ao pedido de paten-te norte-americano 60/670.717, depositado em 12 de abril de 2005, cujo con-teúdos são aqui incorporados por referência em sua inteireza. Este pedidode patente também se refere aos seguintes pedidos de patente, cujos conte-údos também são incorporados por referência em suas inteirezas:

PCT/US03/24587, Métodos de Regulação Negativa da Expressão de GeneAlvo In Vivo por Introdução de RNA de Interferência; PCT/US2005/003857,Terapêutica com RNAi Para Tratamento de Doenças de Neovascularizaçãodo Olho; PCT/US2005/003858, Composições e Métodos para Terapia comRNAi de Combinação.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições e métodos paratratamentos de doenças com neovascularização (NV) indesejável, freqüen-temente uma proliferação e crescimento anormais ou excessivos de vasossangüíneos. O desenvolvimento da própria NV muitas vezes tem conse-qüências adversas ou pode ser uma etapa patológica precoce na doença. Adespeito da introdução de novos antagonistas terapêuticos da angiogênese,incluindo antagonistas da via VEGF, as opções de tratamento para controlede NV são inadequadas e ainda há uma necessidade clínica não atendidagrande e crescente de tratamentos de NV, para inibir a progressão da doen-ça ou para reverter angiogênese indesejável. Como a NV também pode serum processo biológico normal, a inibição de NV indesejável é realizada, depreferência, com seletividade para um tecido patológico, que requer, de pre-ferência, a distribuição seletiva de moléculas terapêuticas ao tecido patológico.

A presente invenção supera esse obstáculo apresentando trata-mentos para controlar NV mediante inibição seletiva de vias bioquímicas pró-angiogênicas, incluindo a inibição da expressão do gene da via VEGF e ainibição localizada em tecidos de NV patológica. A presente invenção apre-senta composições e métodos para uso de uma composição de nanopartícu-la direcionada a tecido compreendendo conjugados de polímeros e tambémcompreendendo moléculas de ácido nucléico que induzam interferência deRNA (RNAi). A presente invenção apresenta composições e métodos para ainibição de genes individuais ou de combinações de genes ativos em NV e,mais preferivelmente, na via VEGF. As composições de nanopartículas dedsRNA da invenção podem ser usadas isoladamente ou em combinaçãocom outros agentes terapêuticos, incluindo agentes terapêuticos direciona-dos, incluindo antagonistas da via VEGF, como anticorpos monoclonais einibidores de molécula pequena, e agentes terapêuticos direcionados queinibam EGF e seu receptor ou PDGF e seus receptores ou MEK ou Bcr-Abl,e imunoterapia e quimioterapia. A presente invenção também apresentacomposições e métodos para o tratamento de doença de NV em um sujeito,incluindo câncer, doença ocular, artrite e doenças inflamatórias.

Antecedentes da Invenção

Agentes terapêuticos recentemente aprovados pelo FDA norte-americano, incluindo Avastin e Macugen, apresentam alguns benefícios paradoenças de NV. Alguns desses agentes agem por ligação a e inibição daação do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), mas esses agen-tes não são eficazes para muitos pacientes. Outros agentes que estão sendoavaliados em estudos clínicos mostram sinais de que podem apresentar al-guns benefícios por ligação a e inibição da ação dos receptores de VEGF,ou de proteínas "a jusante" usadas por esses receptores para transdução desinais. O quadro que surgiu é que meios para controlar essa "via" VEGF po-dem proporcionar um nível de controle de NV que apresente benefício paraalguns pacientes. Além disso, estudos de uma série de inibidores de quinasede molécula pequena descobriram que um inibidor chamado de sunitinib quetem atividade controla múltiplas proteínas quinase, receptor de VEGF, recep-tor de PDGF, FLT3 e Kit oferece melhores benefícios clínicos para doençasde NV. Entretanto, esses benefícios ainda são inadequados para a maioriados pacientes, e ainda são necessários melhores meios terapêuticos paracontrolar a via VEGF. Os agentes até agora desenvolvidos são principalmen-te antagonistas de VEGF ou seus receptores, VEGF R1 e VEGF R2. Umproblema que surgiu com o uso de antagonistas parece ser uma respostados tecidos patológicos de aumento da produção de VEGF. Assim, um meioatraente para melhorar o controle terapêutico de NV é inibir a produção dasproteínas da via VEGF, isto é, regular negativamente sua expressão genéti-ca, e fazê-lo por indução de interferência de RNA mediante distribuição invivo de pequenos oligonucleotídeos de dsRNA de interferência (siRNA).

A interferência de RNA (RNAi) é um processo pós-transcricional,em que um RNA de filamento duplo inibe a expressão do gene de maneiraespecífica para a seqüência. O processo de RNAi ocorre em pelo menosduas etapas: durante uma etapa, um dsRNA longo é clivado por uma ribonu-clease endógena em dsRNAs mais curtos de 21 ou 23 nucleotídeos de com-primento. Em outra segunda etapa, o dsRNA menor medeia a degradaçãode uma molécula de mRNA com uma seqüência correspondente e, comoresultado, regula negativamente de maneira seletiva a expressão desse ge-ne. Esse efeito de RNAi pode ser conseguido pela introdução de RNA defilamento duplo mais longo (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno emais curto (siRNA) na seqüência alvo dentro das células. Recentemente,demonstrou-se que RNAi também pode ser conseguida por introdução deplasmídios que gerem complementariedade de dsRNA com o gene alvo.

Métodos de RNAi foram usados com sucesso em experimentosde determinação da função de genes em Drosophila'20'22,23,25), C. elegans'14,15,16) e peixe-zebra(20). Nesses organismos de modelo, foi relatado que tantoo siRNA mais curtc^qüimicamente sintetizados, quanto o dsRNA mais longotranscrito in vitro podem inibir eficazmente a expressão do gene alvo. Foramrelatados métodos que conseguiram com sucesso efeitos de RNAi em cultu-ras de células de mamíferos não humanos e humanas(39'56). Entretanto, efei-tos de RNAi têm sido difíceis de observar em modelos de animais adultos'57'.

Isso é por várias razões, incluindo: introdução de um RNA de filamento duplolongo em células de mamíferos pode desencadear uma resposta imune anti-viral, incluindo regulação positiva de interferon, resultando em apoptose emorte das células, o que pode ser prejudicial ou benéfico para o efeito tera-pêutico desejado: a eficiência da entrada de dsRNA na célula alvo é baixa,particularmente em animais; moléculas de dsRNA curtas são rapidamenteexcretadas do sangue para a urina; e moléculas de RNA podem ser degra-dadas por atividade da nuclease RNAse. Embora RNAi tenha aplicações empotencial tanto na validação de alvo de gene, quanto na terapêutica com á-cidos nucléicos, o progresso da tecnologia foi prejudicado devido à distribui-ção ruim de moléculas de RNAi em modelos de doenças em animais.

Conseqüentemente, fica claro que métodos aperfeiçoados paraa distribuição de moléculas de RNAi in vivo são de grande importância.Também fica claro que a distribuição direcionada a tecido de moléculas deácido nucléico que induzam RNAi é de grande importância. Também estáclaro que métodos para distribuição moléculas de ácido nucléico que indu-zam RNAi seletivamente para genes da via VEGF serão de grande benefíciopara o tratamento de doenças de NV. Essas necessidades são atendidaspelas composições e métodos da invenção.

Sumário da Invenção

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invenção utilizarRNAi para modular o processo de angiogênese para reverter o processopatológico por regulação negativa da expressão do gene envolvido na pato-gênese de NV, mais especificamente genes na via VEGF.

Conseqüentemente, é um objetivoda invenção apresentar com-posições e métodos para inibir a expressão de um ou mais genes da viaVEGF em um mamífero. É um objetivo adicional da invenção apresentarcomposições e métodos para o tratamento dè doenças de NV por inibição daexpressão de um ou mais genes da via VEGF isoladamente ou em combina-ção com outros agentes, incluindo antagonistas da mesma via VEGF.

Para atingir esses objetivos, apresentaram-se composições eum método para regular negativamente genes da via VEGF endógenos,compreendendo a administração a um tecido do mamífero de uma composi-ção compreendendo uma molécula de RNA de filamento duplo, em que amolécula de RNA reduz ou inibe especificamente a expressão do gene davia VEGF endógeno. Essa regulação negativa de um gene endógeno podeser usada para tratar uma doença que seja causada ou exacerbada pelaatividade da via VEGF. A doença pode ser em um ser humano.

Também se apresenta um método para tratar uma doença emum mamífero associada à expressão indesejável de um gene da via VEGF,compreendendo a aplicação de uma composição de ácido nucléico compre-endendo um oligonucleotídeo de dsRNA, como o ingrediente farmacêuticoativo (API), associado a uma formulação, em que a formulação pode com-preender umpolímero, em que a composição do ácido nucléico é capaz dereduzir a expressão dos genes da via VEGF e inibir a NV na doença. A do-ença pode ser câncer ou um crescimento pré-canceroso, e o tecido podeser, por exemplo, um tecido de rim, tecido de mama, tecido de cólon, tecidode próstata, tecido pulmonar ou tecido ovariano.

Conforme aqui usado, "oligonucleotídeos" e termos similaresbaseados nele se referem a oligos curtos compostos por nucleotídeos deocorrência natural, assim como a oligos compostos por nucleotídeos sintéti-cos ou modificados. Os oligonucleotídeos podem ter 10 ou mais nucleotí-deos de comprimento, ou 15, ou 16, ou 17, ou 18, ou 19, ou 20 ou mais nu-cleotídeos de comprimento, ou 21, ou 22, ou 23, ou 24 ou mais nucleotídeosde comprimento, ou 25, ou 26, ou 27, ou 28, ou 29, ou 30 ou mais nucleotí-deos de comprimento, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, até cerca de 50nucleotídeos de comprimento:

Um oligonucleotídeo que seja um siRNA pode ter qualquer nú-cleo de nucleotídeos entre 15 e 30 nucleotídeos. Em muitas modalidades,um siRNA pode ter qualquer número de nucleotídeos entre 19 e 27 nucleotí-deos.

Em muitas modalidades, um siRNA pode ter duas extremidadesrombas com uma extremidade pegajosa. Os nucleotídeos excedentes deuma extremidade pegajosa pode variar de um a quatro nucleotídeos oumais.

Em uma modalidade preferida, a invenção apresenta siRNA de25 pares de base com extremidades rombas.

Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são aqui usa-dos como sinônimos.

A composição também pode compreender um veículo poliméri-co. O veículo polimérico pode compreender um polímero catiônico que seligue à molécula de RNA e forme nanopartículas. O polímero catiônico podeser um copolímero de aminoácidos contendo, por exemplo, resíduos histidi-na e lisina. O polímero pode compreender um polímero ramificado. A com-posição pode compreender um vetor sintético direcionado. O vetor sintéticopode compreender um polímero catiônico como um veículo de ácido nucléi-co, um polímero hidrofílico como um material protetor esférico e um ligantede direcionamento como um agente seletivo para célula alvo. O polímeropode compreender uma polietilenoimina ou um copolímero de polihistidina-lisina ou uma polilisina modificada quimicamente ou outros veículos policati-ônicos eficazes que possam ser usados como o módulo de veículo de ácidonucléico, o polímero hidrofílico pode compreender um polietileno glicol ou umpoliacetal ou uma polioxazolina, e o ligante de direcionamento pode compre-ender um peptídio compreendendo uma seqüência RGD ou um açúcar ouum análogo de açúcar ou um mAb ou um fragmento de um mAb, ou quais-quer outras porções de direcionamento eficazes.

Em qualquer um desses métodos, pode-se aplicar um campoelétrico a um tecido de maneira substancialmente contemporânea com acomposição ou subseqüentemente à aplicação da composição. A composi-ção e o método da invenção compreendem oligonucleotídeos de dsRNAcom uma seqüência correspondente a um gene da via VEGF endógeno ouum gene endógeno com mutação, e pelo menos uma mutação no gene commutação pode ser uma região de codificação ou reguladora do gene. Emqualquer um desses métodos, o gene endógeno pode ser selecionado dogrupo que consiste em genes da via VEGF, incluindo genes de fator decrescimento, genes da proteína serina/treonina quinase, genes da proteínatirosina quinase, genes da proteína serina/treonina fosfatase, genes da pro-teína tirosina fosfatase e genes do fator de transcrição. O gene selecionadopode incluir um ou mais genes do grupo que consiste em VEGF, VEGF-R1,VEGF-R2, VEGF-R3, VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, RAF-a,RAF-c, AKT, Ras, NF-Kb. O gene selecionado pode incluir um ou mais ge-nes de outras vias bioquímicas associadas a NV, incluindo, HIF, EGF, EGFr,bFGF, bFGFr, PDGF e PDGFr. O gene selecionado pode incluir um ou maisgenes de outras vias bioquímicas operacionais em conjunto com NV, inclu-indo Her-2, c-Met, c-Myc e HGF.

A presente invenção também apresenta composições e métodospara agentes de ácidos nucléicos que induzam RNAi para inibir múltiplosgenes, incluindo coquetéis de siRNA (siRNA-OC). As composições e méto-dos da invenção podem inibir múltiplos genes de maneira substancialmentecontemporânea ou podem inibir múltiplos genes seqüencialmente. Em umamodalidade preferida, agentes de siRNA-OC inibem três genes da via VEGF:VEGF, receptor 1 de VEGF e receptor 2 de VEGF. Em outra modalidadepreferida, siRNA-OC são administrados de maneira substancialmente con-temporânea. A presente invenção apresenta agentes com seletividade deinibição de genes derivados da grande correspondência da seqüência dosiRNA com uma seqüência no mRNA do gene alvo. Também apresenta a-gentes de siRNA com propriedades físico-químicas substancialmente simila-res, que inibem diferentes genes na via VEGF. Também apresenta composi-ções de nanopartículas grandemente independentes da seqüência de siR-NA. Também apresenta métodos para o tratamento de doenças humanas,particularmente doenças relacionadas a NV, que possam ser tratadas cominibidores de múltiplos genes endógenos. Também apresenta métodos parao tratamento de doenças humanas por combinações de agentes terapêuti-cos administrados de maneira substancialmente contemporânea em .algunscasos e, em outros casos, seqüencialmente.

Um aspecto da presente invenção apresenta composições e mé-todos para o tratamento de câncer, artrite, cegueira, doenças infecciosas edoenças inflamatorias. Em outro aspecto da presente invenção, usam-seagentes de ácidos nucléicos indutores de RNAi em conjunto com outros a-gentes terapêuticos, como, mas não limitados a, pequenas moléculas e anti-corpos monoclonais (mAb), no mesmo regime terapêutico.

Outros objetivos, características e vantagens da presente inven-ção ficarão claras com a descrição detalhada a seguir. Deve-se entender,entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, emboraindicando modalidades preferidas da invenção, são dados apenas a título deilustração, pois várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbitoda invenção ficarão claras para aqueles versados na técnica com essa des-crição detalhada.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra a inibição do crescimento do tumor de xeno-enxerto de cólon DLD-1 por composições de nanopartículas de siRNA da viaVEGF direcionadas por um ligante peptídio RGD isoladamente ou em com-binação com tratamento com Avastin. Observou-se uma eficácia antitumoralmais forte usando-se uma terapêutica de câncer em combinação com inibi-dor de VEGFR2-siRNA e Avastin (Bevacizumab) no mesmo regime de tra-tamento em um modelo de tumor de xenoenxerto de carcinoma de cólonhumano (DLD-1).

A Figura 2. Nanopartículas de VEGFR2-SÍRNA direcionadas pa-ra neovascularização mediante distribuição sistêmica demonstraram potenteeficácia no modelo em camundongo de xenoenxerto de carcinoma de cólon(tumor DLD-1) após quatro administrações repetidas a cada três dias. Osresultados de RT-PCR ilustram o derrubamento da expressão do gene deVEGFR2 no nível do mRNA.

A Figura 3. Nanopartículas de VEGFR2-siRNA humano direcio-nado a neovascularização mediante distribuição sistêmica demonstrarampotente eficácia no modelo em camundongo de xenoenxerto de carcinomade cólon (tumor DLD-1) após quatro administrações repetidas a cada trêsdias. Imagens de imunohistoquímica mostram a regulação negativa da ex-pressão de VEGFR2 e CD31 no tecido tumoral.

A Figura 4. Embora nanopartículas de VEGFR2-SÍRNA humanodirecionadas a neovascularização mediante distribuição sistêmica demons-trassem potente eficácia no modelo em camundongo de xenoenxerto de car-cinoma de cólon (tumor DLD-1), nenhuma indução significativa de IFN-oc foiobservada na corrente sangüínea do camundongo 24 horas após a 2- distri-buição.

A Figura 5. VEGF-siRNA humano (19 pares de bases com ex-tremidades 3' excedentes) é eficaz para silenciar a expressão de hVEGF invitro e in vivo, tanto no nível de mRNA, quanto no nível de proteínas, avalia-do por RT-PCR e ELISA. Duas figuras superiores demonstraram derruba-mento significativo de hVEGF tanto no nível de mRNA, quanto de proteínas.

O painel inferior mostra a atividade antitumoral do derrubamento de hVEGFmediada por siRNA em um modelo de xenoenxerto induzido por célulasMCF-7/VEGF165, em que a expressão de hVEGF foi significativamente re-guiada negativamente no tecido tumoral.

A Figura 6. VEGF-siRNA humano (19 pares de bases com ex-tremidades 3' excedentes) é eficaz para silenciar a expressão de hVEGF invivo, resultando em inibição do crescimento tumoral (célula HNSCC 1483).Distribuição intratumoral repetida cinco vezes com intensificação por eletro-poração com um intervalo de 7 dias.

A Figura 7. VEGF-siRNA humano (25 pares de bases com ex-tremidade romba) é mais eficaz para selecionar a expressão de hVEGF invitro e mais forte do que o siRNA de 19 pares de bases.

A Figura 8. VEGF-siRNA humano (25 pares de bases com ex-tremidade romba) é eficaz para selecionar a expressão de hVEGF in vitro etem uma duração mais longa do que o siRNA de 19 pares de bases.

A Figura 9. VEGFR1 -siRNA humano (25 pares de bases comextremidade romba) é eficaz para silecionar a expressão de hVEGFRI invitro após 48 h.

A Figura 10. VEGFR1 -siRNA humano (25 pares de bases comextremidade romba) é eficaz para silecionar a expressão de hVEGFRI invitro após 72 h.

A Figura 11. VEGFR2-siRNA humano (25 pares de bases comextremidade romba) é eficaz para silecionar a expressão de hVEGFR2 invitro em dois momentos diferentes.

A Figura 12. VEGF-siRNA humano (25 pares de bases com ex-tremidade romba) é eficaz para selecionar a expressão de hVEGF in vitro,resultando em inibição do crescimento tumoral, com uma linhagem celularde carcinoma de mama MDA-MB-435.

A Figura 13. Quadro conceituai para o uso de coquetel de siRNAdirecionado a VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 no mesmo tratamento para blo-quear a via de angiogenese.

A Figura 14. Inibição mediada por siRNA de VEGF da expressãode VEGF em tecidos oculares de um modelo murino de HSK.

A Figura 15. Inibição mediada por siRNA da via VEGF dos ge-nes da via VEGF individualmente ou em combinação em tecidos oculares deum modelo murino de HSK.

A Figura 16. O coquetel de siRNA direcionado a VEGF, VEGFR1e VEGFR2 é mais eficaz do que qualquer siRNA único direcionado ao geneindividual na mesma dosagem testada no modelo em camundongo de angi-ogenese ocular induzida por HSV, com distribuições local (esquerda) ou sis-têmica (direita).

A Figura 17. Comparação da inibição da angiogenese consegui-da por administração local e sistêmica de coquetel de siRNA da via VEGFem tecidos oculares de um modelo murino de HSK.

A Figura 18. Efeitos farmacodinâmicos da inibição mediada porcoquetel de siRNA da via VEGF da patologia em tecidos oculares de ummodelo murino de HSK.

A Figura 19. Inibição da angiogenese por administração de co-quetel de siRNA da via VEGF no dia 17 ou no dia 14 após a indução da do-ença em tecidos oculares de um modelo murino de angiogenese retinianaem uma medição de perfusão/montagem plana.

A Figura 20. O coquetel de siRNA direcionado a VEGF, VEGFR1e VEGFR2 demonstra atividade antiangiogênica muito eficaz na retinopatiado modelo em camundongo prematuro (ROP) induzida por hipóxia.

A Figura 21. O coquetel de siRNA direcionado a VEGF, VEGFR1e VEGFR2 demonstra atividade antiangiogênica muito eficaz na retinopatiado modelo em camundongo prematuro (ROP) induzida por hipóxia.

A Figura 22. O coquetel de siRNA direcionado a VEGF, VEGFR1e VEGFR2 inibe a angiogênese ocular significativamente com diferentes viasde administração com diferentes veículos. A distribuição IP foi mediada poruma nanopartícula direcionada por ligante.

A Figura 23. Nanopartícula automontada para distribuição desiRNA. Quando a solução aquosa de conjugado RGD-PEG-PEI pré-preparada é misturada com a solução aquosa de siRNA, as nanopartículasse automontam conforme descrito. As nanopartículas são de tamanho relati-vamente uniforme de 50 nm a 100 nm.

A Figura 24. Nanopartículas de siRNA direcionadas a neovascu-larização demonstraram propriedades de direcionamento a tumores usando-se uma carga de siRNA marcada (esquerda) e uma carga de plasmídios queexpressamo gene repórter de Luciferase (direita).

A Figura 25. Nanopartículas de VEGFR2-siRNA direcionadas aneovascularização demonstraram potente eficácia no modelo em camun-dongo singênico de neuroblastoma (tumor N2A) após quatro administraçõesrepetidas a cada três dias.

A Figura 26. Nanopartículas de VEGFR2-siRNA direcionadas aneovascularização demonstraram potente eficácia no modelo em camun-dongo de xenoenxerto de carcinoma renal (tumor 786-0) após cinco admi-nistrações repetidas a cada três dias.

A Figura 27. Nanopartículas de VEGFR2-siRNA direcionadas aneovascularização demonstraram potente eficácia no modelo em camun-dongo de xenoenxerto de carcinoma de cólon (tumor DLD-1) após quatroadministrações repetidas a cada três dias. Foram usadas três dosagens dife-rentes no estudo.

A Figura 28. Nanopartículas de VEGFR2-siRNA direcionadas aneovascularização demonstraram potente eficácia no modelo em camun-dongo de xenoenxerto de carcinoma de cólon (tumor DLD-1) após quatroadministrações repetidas a cada três dias. Quatro mg por quilograma de do-sagem de VEGFR2 resultaram na mesma eficácia antitumoral que 5 mg porquilograma.

A Figura 29. Fluxograma de fabricação para a produção de umconjugado de RGD-polímero e uma preparação de nanopartícula-siRNA par-tindo-se das matérias-primas PEG ativado homobifuncional, um peptídioRGD-2C, um agente contendo poliamina e uma mistura de dsRNA.

A Figura 30. O uso de um misturador estático para fabricar umapreparação de nanopartícula-siRNA partindo-se de duas soluções, uma so-lução de polímero compreendendo conjugados de polímeros e uma soluçãode siRNA compreendendo três agentes de dsRNA.

Descrição Detalhada

A presente invenção apresenta composições e métodos para otratamento de doenças de NV, que são tipicamente caracterizadas por atri-butos de múltiplas proteínas e genes causadores de doenças anormalmentesuperexpressados e múltiplos mau funcionamentos de proteínas causadorasde doenças. A presente invenção apresenta agentes de ácidos nucléicos,como oligonucleotídeos de siRNA, que ativam a interferência de RNA (RNAi)e são inibidores altamente seletivos da expressão de genes de maneira es-pecífica para a seqüência. A presente invenção apresenta a inibição de NVpor modulação de atividade de proteínas, incluindo a redução dos níveis deexpressão de proteínas e a modificação pós-transcricional de proteínas.

No câncer, acredita-se que o processo de gênese tumoral seja oresultado de superexpressão anormal de oncogenes, fatores de angiogêne-se, fatores de crescimento e supressores tumorais mutantes, mesmo que asuperexpressão de outras proteínas também desempenhe um papel crítico.Cada vez mais provas sustentam a noção de que moléculas de siRNA sãocapazes de "derrubar" genes tumorigênicos tanto in vitro, quanto in vivo, re-sultando em efeitos antitumorais significativos. As composições e métodosda presente invenção demonstram um derrubamento substancial de VEGFem células MCF-7, células MDA-MB-435 e modelos tumorais de xenoenxer-to induzidos por células 1483, conseguindo uma inibição do crescimento tu-moral de 40 - 80% usando-se uma distribuição intratumoral de siRNA espe-cificamente direcionado para seqüências do gene da via VEGF humano. De-ve-se notar que a inibição da expressão do gene da via VEGF induz efeitosantiangiogênicos que alteram a microvascularização de tumores e que ati-vam a apoptose de células tumorais e podem aumentar a eficácia de fárma-cos quimioterápicos citotóxicos. Entretanto, para se conseguir uma eficáciaantitumoral significativamente melhor de agentes antiangiogênicos e fárma-cos quimioterápicos, é necessário um método de distribuição altamente efi-caz, de modo que concentrações elevadas dos fármacos se acumulem notecido tumoral local e, em muitos casos, mediante uma administração sistêmica.

Os presentes inventores descreveram um método para validaralvos de fármacos que determina que alvos controlam vias patológicas e,conseqüentemente, justificam esforços de desenvolvimento de fármacos(veja PCT/US02/31554). Os presentes inventores também descreveram tec-nologias adequadas para a distribuição de ácidos nucléicos a tecidos ani-mais. Veja WO 01/47496, cujo conteúdo é aqui incorporado por referênciaem sua inteireza. Esses métodos permitem a administração de ácidos nu-cléicos e obter um aumento significativo (por exemplo, de sete vezes) daeficiência, em comparação com o "padrão ouro" de reagentes de distribuiçãode nucleotídeos. Portanto, os métodos proporcionam uma forte atividade deácidos nucléicos em tecidos, incluindo a atividade de candidatos a proteínasalvo. Essa plataforma é uma ferramenta poderosa para a validação de can-didatos a genes em um tecido.

Além disso, os presentes inventores-usaram esses métodos pa-ra conseguir silenciar genes em tecidos de animais, o que é altamente dese-jável para validação de candidatos a genes alvo e como uma modalidadeterapêutica. Recentemente, demonstrou-se que o RNA de filamento duploinduz silenciamento específico para gene por um fenômeno chamado deinterferência de RNA (RNAi). Embora o mecanismo da RNAi ainda não sejacompletamente compreendido, os primeiros resultados sugerem que o efeitode RNAi pode ser conseguido in vitro em vários tipos de células, incluindocélulas de mamíferos. Um RNA de filamento duplo direcionado contra ummRNA alvo resulta na degradação do alvo, causando, dessa forma, o silen-ciamento do gene correspondente. RNA de filamento duplo grande é clivadoem fragmentos menores de 21 - 23 nucleotídeos de comprimento por umaatividade do tipo RNase III envolvendo uma enzima Dicer. Acredita-se queesses fragmentos mais curtos, conhecidos como siRNA (RNA de interferên-cia pequeno) medeiem a clivagem de mRNA.

Embora a regulação negativa de genes pelo mecanismo deRNAi tenha sido estudada em C. elegans e outros organismos inferiores nopassado recente, sua eficácia em células de mamíferos em cultura só foidemonstrada recentemente. Um efeito de RNAi foi recentemente demons-trado em camundongos usando o sistema repórter de gene de luciferase devaga-lume. Para desenvolver uma plataforma de tecnologia de RNAi parainibição de gene in vivo para pesquisa e para aplicação clínica de terapêuti-cas com ácidos nucléicos para tratar doenças humanas, os presentes inven-tores realizaram vários estudos in vivo em modelos de doença em camun-dongos. Nesses experimentos, siRNA ou dsRNA direcionado a um liganterelacionado a tumor (VEGF humano) ou receptor (VEGFR2 de camundongo)foi distriuído a camundongos sem pêlo portadores do tumor derivado deMCF-7 humano xenoenxertado ou tumores MDA-MB-435 humanos. Pelaprimeira vez, fomos capazes de demonstrar que RNAi pode silecionar efi-cazmente um gene alvo em células tumorais in vivo e que, como resultado, ocrescimento tumoral era inibido.

Os presentes inventores conseguiram pela primeira vez compo-sições terapêuticas e métodos para o tratamento de uma ampla variedadede doenças de NV usando oligonucleotídeos de dsRNA que inibem genes davia VEGF. A invenção é aqui descrita em detalhes, mas aqueles versados natécnica perceberão todo o alcance da invenção.

A. siRNA Potente Para Inibição do Gene da Via VEGF

A presente invenção apresenta agentes de ácidos nucléicos di-recionados a e que inibem seqüências do gene da via VEGF com várias es-truturas físico-químicas. Uma modalidade preferida da presente invençãousa agentes de ácidos nucléicos chamados de siRNA incluindo 19 pares debases de dsRNA com extremidades 3' excedentes e 25 pares de bases dedsRNA com extremidades rombas. O siRNA da invenção com 25 pares debases de dsRNA com extremidades rombas se mostraram alguns dos inibi-dores mais potentes com algumas das maiores durações de inibição. Alémdisso, a incorporação de análogos de ocorrência não natural é utilizável nainvenção, incluindo análogos 2'-0-metil ribose de RNA, DNA e oligonucleotí-deos quiméricos de RNA, e outros análogos químicos de oligonucleotídeosde ácidos nucléicos. O siRNA de 25 pares de bases com e sem 2'-0-metilribose na filamento de sentido do siRNA e direcionado para a seqüência deVEGF humano apresenta um efeito inibitório forte e durável, de até 70 - 80%em células MCF-7/VEGF165 e em tumores crescendo em animais. Esseefeito inibitório em células MCF-7/VEGF165 em cultura durou 5 dias. Umaspecto apresentado pela invenção é siRNA direcionado a genes humanos ea seqüência codificada também direcionada a outras espécies de mamífe-ros, como outros primatas, camundongos e ratos, mas não limitados a essasespécies. Métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podemser usados para identificar e selecionar o osiRNA apresentado pela inven-ção. Muitas outras formas de siRNA direcionado a genes da via VEGF sãoapresentados pela invenção, e outros serão compreendidos por aqueles ver-sados na técnica.

a. siRNA específico para VEGF humano:

pares de bases com extremidades rombas:

hVEGF-25-siRNA-a:

Filamento sentido: 5'-r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCA-GG)-3'

hVEGF-25-siRNA-b:

Filamento sentido: 5'-r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCU-

CUC)-3'

hVEGF-25-siRNA-c:

Filamento sentido: 5'-r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUU-

GUG)-3'

b. siRNA específico para receptor 1 de VEGF humano:25 pares de bases com extremidades rombas:hVEGFR1-25-siRNA-a:

Filamento sentido: 5'-r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUU-GGC)-3'

hVEGFR1-25-siRNA-b:

Filamento sentido: 5'-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGA-GGG)-3'

19 pares de bases com 2 extremidades 3' excedentes de nucleotí-deo (TT):

VEGF R1 (FLT) 5'-GGAGAGGACCUGAAACUGUTT

c. siRNA específico para receptor 2 de VEGF humano:25 pares de bases com extremidades rombas:

hVEGFR2-25-siRNA-a:

Filamento sentido: 5'-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGA-GG)-3'

hVEGFR2-25-siRNA-b:

Filamento sentido: 5'-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAA-GGG)-3'

hVEGFR2-25-siRNA-c:

Filamento sentido: 5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'Filamento anti-sentido: 5'-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACU-UGG)-3'

19 pares de bases com 2 extremidades 3' excedentes de nucleotí-deo (TT):

VEGF R2 (KDR) 5'-CAGUAAGCGAAAGAGCCGGTT-3'

Oligos de siRNA com 25 pares de bases podem ser direciona-dos aos genes correspondentes tanto de seres humanos, quanto de camun-dongos.Em outra modalidade, as seqüências de siRNA de 25 pares debases foram selecionadas contra as seqüências de mRNA correspondentes,incluindo os genes de VEGF humano, VEGFR1, VEGFR2, PDGFR-alfa,PDGFR-beta e EGFR. As seqüências selecionadas são não apenas especí-ficas para genes humanos, mas também específicas para os genes de ca-mundongo correspondentes, como as seqüências como mRNAs de VEGFhumano e também contra mRNAs de VEGR de camundongo.

Os oligos de siRNA de 25 pares de bases são muito úteis paraestudos de tumor de xenoenxerto em camundongo, pois a eficácia antitumo-ral se baseia no derrubamento tanto de genes humanos, quanto de camun-dongos no tecido tumoral. Por exemplo, o derrubamento da expressão deVEGF tanto de células tumorais (origem humana), quanto células endoteliais(origem de camundongo) com os oligos de siRNA direcionados a ambas es-sas seqüências proporcionará uma melhor eficácia antitumoral.

Ao mesmo tempo, o estudo de toxicidade com os oligos de siR-NA direcionados tanto a genes de animais de teste (por exemplo, camun-dongo ou macaco), quanto genes humanos será muito útil, pois os farmacosreais foram testados tanto quanto à toxicologia do agente medicamentoso,quanto à farmacologia exagerada.

As seguintes seqüências são as seqüências de oligo de siRNAcom 25 pares de bases direcionados a mRNAs de VEGF, VEGFR2, VEG-FR1, PDGFR-alfa, PDGFR-beta e EGFR tanto de genes humanos, quantode camundongo, alguns dos quais também pode estar direcionados a suascontrapartidas de macaco e de cachorro.

siRNA de VEGF com 25 pares de bases direcionado a seqüên-cias de mRNA de VEGF humano, de camundongo, de rato, de macaco, de cão:

mhVEGF25-1: sentido, 5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAU-GUU-3';

anti-sentido, 5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGF25-2: sentido, 5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUA-CU-3'anti-sentido, 5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGF25-3: sentido, 5'-CAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUU-3'

anti-sentido, 5'-AAGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUG-3'mhVEGF25-4: sentido, 5'-CCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUG-CA-3'

anti-sentido, 5'-TGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGG-3'mhVEGF25-4: sentido, 5'-CACAUAGGAGAGAUGAGCUUC-CUCA-3'

anti-sentido, 5'-UGAGGAAGCUCAUCUCUCCUAUGUG-3'Seqüências de siRNA de VEGF R2 com 25 pares de bases dire-cionadas a seqüências de mRNA de VEGFR2 tanto humano, quanto de ca-mundongo:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCC-AAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhVEGF225-2: sentido, 5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAU-CCUCA-3'

anti-sentido: 5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAC-3'mhVEGF225-3: sentido, 5'-CUCAUGGUGAUUGUGGAAUU-CUGCA-3' "

anti-sentido: 5'-UGCAGAAUUCCACAAUCACCAUGAG-3'mhVEGF225-4: sentido, 5'-GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGA-CUC-3'

anti-sentido: 5'-GAGUCCAGAAUCCTCUUCCAUGCTC-3'mhVEGF225-5: sentido, 5'-CAGAACAGUAAGCGAAAGAGGC-CGGC-3'

anti-sentido: 5'-GCCGGCUCUUUCGCUUACUGUUCUG-3'mhVEGF225-6: sentido, 5'-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUC-UCA-3'

anti-sentido: 5'-UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC-3'mhVEGF225-7: sentido, 5'-CCUGACCUUGGAGCAUCU-CAUCUGU-3'

anti-sentido: 5'-ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG-3'mhVEGF225-8: sentido, 5'-GCUAAGGGCAUGGAGUUCUUG-GCAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC-3'Seqüências de siRNA de VEGF R1 com 25 pares de bases dire-cionadas a seqüências de mRNA de VEGFR1 tanto humano, quanto de ca-mundongo:

mhVEGF125-1: sentido, 5'-CACGCUGUUUAUUGAAAGAGU-CACA-3'

anti-sentido: UGUGACUCUUUCAAUAAACAGCGUG-3'mhVEG.F125-2: sentido, 5'-CGCUGUUUAUUGAAAGAGU-CACAGA-3'

anti-sentido: 5'-UCUGUGACUCUUUCAAUAAACAGCG-3'mhVEGF125-3: sentido, 5'-CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGA-UGU-3'

anti-sentido: 5'-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG-3'mhVEGF125-4: sentido, 5'-CCAACUACCUCAAGAGCAAAC-GUGA-3'

anti-sentido: 5'-UCACGUUUGCUCUUGAGGUAGUUGG-3'mhVEGF125-5: sentido, 5'-CUACCUCAAGAGCAAACGUGA-CUUA-3'

anti-sentido: 5'-UAAGUCACGUUUGCUCUUGAGGUAG-3'mhVEGF125-6: sentido, 5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGG-ACCU-3'

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3'mhVEGF125-7: sentido, 5'-CAUUCAUCGGGACCUGGCAG-CGAGA-3'

anti-sentido: 5'-UCUCGCUGCCAGGUCCCGAUGAAUC-3'mhVEGF125-8: sentido, 5'-CAUCGGGACCUGGCAGCGAG-AAACA-3'

anti-sentido: 5'-UGUUUCUCGCUGCCAGGUCCCGAUG-3'mhVEGF125-9: sentido, 5'-GAGCCUGGAAAGAAUCAAAAC-

CUUU-31

anti-sentido: 5'-AAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGCUC-3'mhVEGFI25-10: sentido, 5'-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCU-

UUGA-3'

anti-sentido: 5'-UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC-3'mhVEGF125-11: sentido, 5'-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCU-

UUGA-3*

anti-sentido: 5'-UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC-3'mhVEGF125-12: sentido, 5'-CUGAACUGAGUUUAAAAGGCAC-

CCA-3'

anti-sentido: 5'-UGGGUGCCUUUUAAACUGAGUUCAG-3'mhVEGF125-13: sentido, 5'-GAACUGAGUUUAAAAGGCACCC-

AGC-3'

anti-sentido: 5'-GCUGGGUGCCUUUUAAACUCAGUUG-3'Seqüências de siRNA com 25 pares de bases direcionadas tantoa PDGFR-alfa humano, quanto de camundongo:

mhPDGFRa25-1: sentido, 5-GAAGAUAAUGACUCACCUGG-

GGCCA-3'

anti-sentido: UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC-3*mhPDGFRa25-2: sentido, 5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCC-

ACAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhPDGFRa25-3: sentido, 5'-CUCACCUGGGGCCACAUUUGA-

ACAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGUUCAAAUGUGGCCCCAGGUGAG-3'mhPDGFRa25-4: sentido, 5'-CUUGCUGGGAGCCUGCACCAA-

GUCA-3'

anti-sentido: 5'-UGACUUGGUGCAGGCUCCCAGCAAG-3'mhPDGFRa25-5: sentido, 5'-GAUUCUACUUUCUACAAUAAGA-

UCA-3'

anti-sentido: 5'-UGAUCUUAUUGUAGAAAGUAGAAUC-3'mhPDGFRa25-6: sentido, 5'-CAGAGACUGAGCGCUGACAGU-GGCU-3'

anti-sentido: 5'-AGCCACUGUCUGCGCUCAGUCUCUG-3'mhPDGFRa25-7: sentido, 5'-GACCUGGGCAAGAGGAACAG-ACACA-3'

anti-sentido: 5'-UGUGUCUGUUCCUCUUGCCCAGGUC-3'mhPDGFRa25-8: sentido, 5'-CCACCUUCAUCAAGAGAGAGG-ACGA-3'

anti-sentido: 5'-UCGUCCUCUCUCUUGAUGAAGGUGG-3'mhPDGFRa25-9: sentido, 5'-UAUGGAUUAAGCCGGUCCCA-ACCUGU-3'

anti-sentido: 5'-ACAGGUUGGGACCGGCUUAAUCCAUA-3'Seqüências de siRNA com 25 pares de bases direcionadas tantoa PDGFRbeta humano, quanto de camundongo:

mhPDGFRB25-1: sentido, 5'-CUGCAGAGACCUCAAAAGGUG-UCCA-3'

anti-sentido: 5'-UGGACACCUUUUGAGGUCUCUGCAG-3'mhPDGFRB25-2: sentido, 5'-CAGAGACCUCAAAAGGUGUC-CACGU-3'

anti-sentido: S^ACGUGGACACCUUUUGAGGUCUCUG-S'mhPDGFRB25-3: sentido, 5'-GUGGUGGUGAUCUCAGeCAUC-CUGG-3'

anti-sentido: 5'-CCAGGAUGGCUGAGAUCACCACCAC-3'mhPDGFRB25-4: sentido, 5'-GGUGGUGAUCUCAGCCAUCCU-GGCC-3'

anti-sentido: 5'-GGCCAGGAUGGCUGAGAUCACCACC-3'mhPDGFRB25-5: sentido, 5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGU-GACU-3'

anti-sentido: 5'-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-3'mhPDGFRB25-6: sentido, 5'-GCAAGCUGGUCAAGAUCUGU-GACUU-3'

anti-sentido: 5'-AAGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGC-3'mhPDGFRB25-7: sentido, 5'-GGGUGGCACCCCUUACCCAG-

AGCUG-3'

anti-sentido:5'-CAGCUCUGGGUAAGGGGUGCCACCC-3'mhPDGFRB25-8: sentido, 5'-GCACCCCUUACCCAGAGCUG-

CCCAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGGGCAGCUCUGGGUAAGGGGUGC-3'mhPDGFRB25-9: sentido, 5'-CUUACCCAGAGCUGCCCAUGA-

ACGA-3'

anti-sentido: 5'-UCGUUCAUGGGCAGCUCUGGGUAAG-3'mhPDGFRB25-10: sentido, 5'-CAUGCCUCCGACGAGAUCU-

AUGAGA-3'

anti-sentido: 5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG-3'mhPDGFRB25-11: sentido, 5'-GCCUCCGACGAGAUCUAUG-

AGAUCA-3'

anti-sentido: 5'-UGAUCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGC-3'mhPDGFRB25-12: sentido, 5'-CCGACGAGAUCUAUGAGAU-

CAUGCA-3'

anti-sentido: 5'-UGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUCGG-3'mhPDGFRB25-13: sentido, 5'-GACGAGAUCUAUGAGAUCAU-

GCAGA-3'

anti-sentido: Õ^UCUGCAUGAUCUCAUAGAUCUCGUC-S'Seqüências de siRNA com 25 pares de bases direcionadas tantoa EGFR humano, quanto de camundongo:

mhEGFR-1: sentido, 5-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-

3'

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'mhEGFR-2: sentido, 5'-CAGCAUGUCAAGAUCACAGAUUUUG-

3'

anti-sentido: 5'-CAAAAUCUGUGAUCUUGACAUGCUG-3'mhEGFR-3: sentido, 5'-GAUCACAGAUUUUGGGCUGGCCAAA-

3'

anti-sentido: 5'-UUUGGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUC-3'mhEGFR-4: sentido, 5'-CAGAUUUUGGGCUGGCCAAACU-

GCU-3'

anti-sentido: 5'-AGCAGUUUGGCCAGCCCAAAAUCUG-3'mhEGFR-5: sentido, 5'-CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA-

3'

anti-sentido: 5'-UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG-3'mhEGFR-6: sentido, 5'-CCAUCGAUGUCUACAUGAUCAUGGU-

3'

anti-sentido: 5'-ACCAUGAUCAUGUAGACAUCGAUGG-3'mhEGFR-7: sentido, 5'-CGAUGUCUACAUGAUCAUGGUCA-

AGU-3'

anti-sentido: 5'-ACUUGACCAUGAUCAUGUAGACAUCG-3'mhEGFR-8: sentido, 5'-CUACAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGG-

3'

anti-sentido: 5'-CCAGCACUUGACCAUGAUCAUGUAG-3'mhEGFR-9: sentido, 5'-CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAU-

GA-3'

anti-sentido: 5'-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'mhEGFR-10: sentido, 5'-GGAUGAAAGAAUGCAUUUGCCA-

AGU-3'

anti-sentido: 5'-ACUUGGCAAAUGCAUUCUUUCAUCC-3'mhEGFR-11: sentido, 5'-GACAACCUGACUACCAGCAGGACU-

3'

anti-sentido: 5'-AGUCCUGCUGGUAGUCAGGGUUGUC-3'mhEGFR-12: sentido, 5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGA-

GGU-3'

anti-sentido: 5'-ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG-3'Outra modalidade é o uso de uma combinação desses oligos namesma carga de fármaco. Quando três ou mais desses siRNAs com 25 pa-res de bases direcionados a três ou mais genes envolvidos no processo pa-tológico são acondicionados nas mesmas nanopartículas e distribuídos atra-vés das mesmas vias de administração (ou de diferentes vias), o tratamentoé mais eficaz, pois o derrubamento das expressões de múltiplos genes podebloquear eficazmente a via tumorigênica particular. As seguintes combina-ções também podem ser realizadas usando-se os mesmo princípios geraisaqui aplicados.

Combinações de oligos de siRNA com 25 pares de bases, cadaum deles podendo estar direcionado aos genes correspondentes tanto deseres humanos, quanto de camundongos e podendo atingir uma eficáciaterapêutica mais pontente (múltiplos alvo):

1. Direcionado a vias VEGF:

VEGF-VEGFR1-VEGFR2 coquetel A:

mhVEGF25-1: sentido, 5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAA-UGUU-3';

anti-sentido: 5-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR125-3: sentido, 5'-CAAGGAGGGCCUCUGAUGG-UGAUGU-3';

anti-sentido: 5'-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG-3'mhVEGFR225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGG-CCAAU-3';

anti-sentido: 5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'VEGF-VEGFR1-VEGFR2 coquetel B:

mhVEGF25-1: sentido, 5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAU-GUU-3';

anti-sentido: 5-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR125-6: sentido, 5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGG-GACCU-3';

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3'mhVEGFR225-2: sentido, 5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUC-CUCA-3';

anti-sentido: 5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'VEGF-VEGFR1-VEGFR2 coquetel C:

mhVEGF25-2: sentido, 5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAAC-GUACU-3';anti-sentido: 5-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR125-6: sentido, 5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGG-ACCU-3';

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3'mhVEGFR225-2: sentido, 5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAU-CCUCA-3';

anti-sentido: 5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'

Muitas outras combinações com os oligos de siRNA com 25 pa-res de bases direcionados a VEGF, VEGFR1 e VEGFR2, respectivamente,podem ser compostos para a melhor eficácia antiangiogenese, com razõesiguais ou diferentes de cada componente.

2. Direcionado tanto à via VEGF, quanto à EGF:VEGF-VEGFR2-EGFR coquetel A:

mhVEGF25-1: sentido, 5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAA-UGUU-3';

anti-sentido: 5-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGG-CCAAU-3";

anti-sentido: 5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3';

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGF-VEGFR2-EGFR coquetel B:

mhVEGF25-1: sentido, 5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAA-UGUU-3';

anti-sentido: 5-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR225-2: sentido, 5'-CUCAUGUCUGUUCUCAA-GAUCCUCA-3';

anti-sentido: 5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'mhEGFR-5: sentido, 5'-CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA-3';

anti-sentido: 5'-UGCCAUCCACUUGAUAGGCACUUUG-3'VEGF-VEGFR2-EGFR coquetel C:

mhVEGF25-2: sentido, 5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3';

anti-sentido: 5-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR225-2: sentido, 5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3';

anti-sentido: 5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'mhEGFR-9: sentido, 5'-CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA-3';

anti-sentido: 5'-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'

Muitas outras combinações podem ser feitas com outras seqüências direcionadas àqueles três genes, com diferentes composições €razões iguais ou diferentes de oligos de siRNA.

3. Direcionamento às vias VEGF, PDGF e EGF:

VEGRF2-PDGFRa-EGFR coquetel A:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGC-CAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-1: sentido, 5'-GAAGAUAAUGACUCACCUG-GGGCCA-3'

anti-sentido: UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUeUUC-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3' .

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR-VEGFR2-PDGFRa-EGFR coquetel B:

mhVEGF125-6: sentido, 5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGG-GACCU-3'

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3'mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGG-CCAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3'

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRa-EGFR coquetel C:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUGCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2: sentido, 5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhEGFR-12: sentido, 5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU-3'

anti-sentido: 5'-ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR coquetel A:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGG-CCAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-5: sentido, 5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUG-UGACU-3'

anti-sentido: 5'-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3' -

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR coquetel B:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGC-

CAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-10: sentido, 5'-CAUGCCUCCGACGAGAUC-UAUGAGA-3'

anti-sentido: 5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3'

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR coquetel C:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGC-CAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-5: sentido, 5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUG-UGACU-3'

anti-sentido: 5'-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-3'mhEGFR-12: sentido, 5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAG-GAGGU-3'

anti-sentido: 5'-ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG-3'Muitas outras combinações podem ser feitas com outras se-qüências direcionadas àqueles três genes com diferentes composições erazões iguais ou diferentes de oligos de siRNA.

As combinações também podem ser feitas com mais de três se-qüências:

VEGFR2-PDGFRab-EGFR coquetel A:

mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCC-AAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2: sentido, 5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGC-CACAU-3' -

anti-sentido: 5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhPDGFRB25-5: sentido, 5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGU-GACU-3'

anti-sentido: 5'-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3'

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR1 -VEGFR2-PDGFRb-EGFR-VEGF coquetel A:mhVEGF125-6: sentido, 5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGA-CCU-3'

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3'mhVEGFR225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-10: sentido, 5'-CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA-3'

anti-sentido: 5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG-3'mhEGFR-1: sentido, 5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG3"

anti-sentido: 5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'mhVEGF25-2: sentido, 5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3'

anti-sentido, 5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'VEGFR1-VEGFR2-PDGFRÒ-EGFR-VEGF coquetel C:mhVEGFR125-6: sentido, 5*-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGG-ACCU-3'

anti-sentido: 5'-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3"mhVEGF225-1: sentido, 5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGG-CCAAU-3'

anti-sentido: AUUGGCCCGUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2: sentido, 5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCC-ACAU-3'

anti-sentido: 5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhPDGFRB25-5: sentido, 5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGU-GACU-3'

anti-sentido: 5'-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-3'mhEGFR-12: sentido, 5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAG-GAGGU-3'

anti-sentido: 5'-ACCUCCUGGAUGGUCUUUAAGAAGG-3'mhVEGF25-2: sentido, 5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAAC-GUACU-3'

anti-sentido, 5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'B. Inibição do Gene da Via BEGF Combinada

Inúmeros fatores foram considerados durante o desenvolvimentodas composições e métodos da presente invenção para a inibição de NV.

Em primeiro lugar, doenças de NV são complexas e resultado de múltiplasproteínas e genes causadores de doenças anormalmente superexpressadose múltiplos mau funcionamentos de proteínas causadores de doenças. Emsegundo lugar, agentes de ácidos nucléicos que ativam interferência de RNA(RNAi) são inibidores altamente seletivos da expressão de genes de maneiraespecífica para a seqüência. Em terceiro lugar, a inibição de NV por modula-ção da atividade de proteínas pode ser conseguida por inúmeros métodos,incluindo uma inibição da função da proteína (antagonistas), estimulação dafunção da proteína (agonistas), redução dos níveis de expressão da proteínae modificação pós-transcricional de proteínas. O tratamento de uma doençade NV requer idealmente ações terapêuticas sofisticadas para fechar efi-cazmente uma via biológica particular que seja crítica para a progressão dadoença, incluindo o bloqueio simultâneo de funções tanto de ligantes, quantode seus receptores, o bloqueio simultâneo da atividade do receptor e de pro-teínas de sinalização a jusante, e o bloqueio simultâneo de elementos re-dundantes de uma via. Esse é o caso de uma doença de NV e da via VEGF.

Entretanto, a identificação de um único agente seletivo para du-as ou três ou mais proteínas é difícil e às vezes impraticável, se nãcr impos-sível. Para superar essa dificuldade, o uso de uma combinação de medica-mentos foi como uma tendência na medicina moderna. Em aplicações deoncologia, quimioterapias combinadas conseguiram uma eficácia anticâncernotável. Um exemplo é o uso da terapia de combinação de docetaxel, ifos-famida e cisplatina para o tratamento de câncer de orofaringe com múltiplasmetástases ósseas de câncer de próstata (2). Em outras áreas terapêuticas,outro exemplo é o tratamento de colite ulcerativa com uma combinação decorticosteróides, metronidazol e vancomicina (3). Para o tratamento de dia-betes do tipo 2 insuficientemente controlado, avaliaram-se a eficácia e a se-gurança da adição de rosiglitazona a uma terapia de combinação de glimepi-rida e metformin (4).Embora esses estudos clínicos tenham demonstrado eficáciasterapêuticas notáveis, as toxicidades de dosagens mais elevadas e as segu-ranças de um tempo mais longo são sempre grandes preocupações, devidoa suas diferentes fontes de origem, diferentes processos de fabricação ediferentes propriedades químicas. Para superar esses problemas, um aspec-to da presente invenção é o uso de oligonucleotídeos de siRNA inibidores degenes para proporcionar uma vantagem única que consiga uma combinaçãode efeitos com uma combinação de siRNA que tenham como alvo múltiplosgenes causadores de doença no mesmo tratamento. Uma vantagem propor-cionada pela presente invenção é o resultado de que todos os oligonucleotí-deos de siRNA são química e farmacologicamente muito similares, e podemser da mesma fonte de origem e do mesmo processo de fabricação. Outravantagem proporcionada pela presente invenção é que múltiplos oligonucle-otídeos de siRNA podem ser formulados em uma única preparação, comouma preparação de nanopartículas.

Portanto, um aspecto da presente invenção é combinar agentesde siRNA para conseguir uma inibição específica e seletiva de múltiplos ge-nes da via VEGF e, como resultado, conseguir uma inibição da doença deNV e um melhor benefício clínico. A presente invenção apresenta muitascombinações de direcionamento de siRNA, incluindo combinações que te-nham como alvo o próprio VEGF juntamente com seus receptores, incluindoVEGF R1 (Flt1) e VEGF R2 (KDR), fatores de crescimento paralelos, inclu-indo PDGF e EGF e seus receptores, fatores de sinalização a jusante, inclu-indo RAF e AKT, e fatores de transcrição, incluindo NFKB, e suas combina-ções. Uma modalidade preferida é uma combinação de siRNA que inibaVEGF e dois de seus receptores, VEGF R1 (Flt1) e VEGF R2 (KDR). Outramodalidade preferida é uma combinação de siRNA que iniba VEGF e seusreceptores, PDGF e seus receptores e EGF e seus receptores. Ainda outramodalidade preferida é uma combinação de siRNA que iniba VEGF e seusreceptores e a sinalização a jusante.

Esses oligonucleotídeos de dsRNA podem ser combinados emuma terapêutica para o tratamento de doença de NV. Em uma modalidadeda presente invenção, podem ser misturados entre si como um coquetel e,em outra modalidade, podem ser administrados seqüencialmente pela mes-ma via ou por diferentes vias e formulações e, em ainda outra modalidade,alguns podem ser administrados como um coquetel, e alguns administradosseqüencialmente. Outras combinações de siRNA e métodos para sua com-binação serão compreendidos por aqueles versados na técnica para se con-seguir o tratamento de doenças de NV.

C. Antagonista da Via VEGF e Inibição de Gene Combinados

A doença é complicada e freqüentemente envolve múltiplos pro-cessos patológicos, assim como variações na gravidade dos sintomas dadoença e, freqüentemente, variações de um paciente para outro. Muitas do-enças são causadas por superexpressão anormal de genes causadores dedoença ou de controle de doença ou por organismos infecciosos estranhosou ambos. A progressão da doença, o desenvolvimento de uma respostareduzida a tratamentos com o tempo e a resistência ao fármaco também li-mitam o benefício clínico de um tratamento ou modalidade única. Um meiopara superar essas limitações é mediante uso de combinações de tratamen-tos e fármacos.

Conseqüentemente, um aspecto da presente invenção é combi-nar agentes de siRNA com outros agentes para se conseguir uma inibiçãoforte, durável e robusta da doença de NV e um benefício clínico superior. Apresente invenção apresenta múltiplas combinações de agentes de siRNAjuntamente com outros agentes, incluindo combinações de siRNA terapêuti-co para o próprio VEGF e seus receptores com antagonistas do próprioVEGF e seus receptores (como Avastin). A presente invenção também apre-senta combinações de agentes de siRNA terapêuticos com inibidores dequinase disponíveis por via oral (como SU11248). A presente invenção tam-bém apresenta combinações de agentes de siRNA terapêuticos com imuno-terapia. Ainda outra modalidade da presente invenção é combinar siRNAcom agentes antiproliferativos. Outras combinações de agentes de siRNA eoutros agentes serão compreendidas por aqueles versados na técnica parase conseguir um tratamento de doenças de NV.D. Formulação e Administração

Recentes esforços com vistas ao desenvolvimento de sistemasde distribuição de ácidos nucléicos direcionáveis a tecidos baseados em re-agentes sintéticos produziram resultados promissores. Para serem robustos,sistemas de distribuição eficazes devem ter múltiplos níveis de seletividade,isto é, localização seletiva no tecido doente e inibição seletiva de vias bio-químicas que provoquem a patologia. Além do mais, as terapias atuais maiseficazes requerem terapêuticas de "múltiplos alvo", isto é, fármacos "sujos"projetados com múltiplos mecanismos de atividade, bloqueando vias patoló-gicas redundantes. Uma abordagem superior usaria nanopartículas "inteli-gentes" que simultaneamente tenham como alvo a doença e distribuam a-gentes de ácidos nucléicos às células alvo e ao compartimento subcelularcorreto.

Em uma modalidade, a presente invenção apresenta formula-ções para oligonucleotídeos de siRNA dsRNA que compreendem distribui-ção direcionável ao tecido e três propriedades adicionais. Essas proprieda-des são: ligação de ácido nucléico em um núcleo que possa liberar o siRNAno citoplasma, proteção contra interações não específicas e direcionamentoa tecido, que proporcione uma captação celular. Nenhum material tem todasessas propriedades requeridas em uma molécula. A invenção apresentacomposições e-métodos que usam conjugados modulares de três materiaispara combinar e montar as múltiplas propriedades requeridas. Podem serprojetados e sintetizados para incorporar várias propriedades e, então, mis-turados com a carga de siRNA para formar as nanopartículas. Com basenessas modalidades, uma modalidade preferida compreende um conjugadode polímero modular que tenha como alvo a neovascularização por acopla-mento de um ligante peptídico específico para essas células em uma extre-midade de um polímero protetor, acoplado, em sua outra extremidade, a umveículo cationico para ácidos nucléicos. Esse conjugado de polímero temtrês domínios funcionais, às vezes chamado de polímero trifuncional (TFP).O projeto modular desse conjugado permite a substituição e otimização decada componente separadamente. Uma abordagem alternativa foi a de fixarrevestimentos de superfície a nanopartículas pré-formadas. A adsorção deum revestimento de polímero estérico sobre polímeros é autolimitativa; umavez que comece a se formar uma camada esférica, ela impedirá a adiçãoposterior de polímero. As composições e métodos da invenção permitem ummétodo eficiente para a otimização de cada uma das três funções, grande-mente independentes das outras duas funções.

Formação de Partícula de Núcleo de Ácido NucléicoAgentes de distribuição para ácidos nucléicos têm de auxiliar emseu ganho de acesso ao interior das células e de maneira que possam exer-cer sua atividade biológica. Esforços para resolver esse desafio da terapêu-tica de ácidos nucléicos com materiais sintéticos incluem o uso de comple-xos de lipídios e polímeros catiônicos simples desenvolvidos como reagen-tes de transfecção de DNA in vitro. Descobriu-se rapidamente que tanto fa-zer com que ácidos nucléicos entrem em células, quanto obter atividade bio-lógico é extremamente difícil. Por exemplo, conseguir um pacote de ácidonucléico estável para transporte é possível, mas nem sempre fácil de recon-ciliar com a necessidade de liberar o ácido nucléico no núcleo ou, no casode siRNA, no citoplasma. Da mesma forma, um grande número de lipídios epolímeros catiônicos que são eficazes in vitro não retêm atividade quandoadministrados in vivo, infelizmente por razões ainda grandemente desconhe-cidas, apresentsando pouco valor preditivo para o desenvolvimento de com-plexos ativos in vivo. O interesse em estudos com RNA tinha ficado, até ago-ra, muito atrás até o recente surgimento de interesse no siRNA. Entretanto, otecido pulmonar pode ser freqüentemente transfectado com uma administra-ção intravenosa de complexos de DNA. Observou-se uma atividade biológi-ca similar quando se usou siRNA como a carga.

Estudos recentes identificaram uma classe de polímeros catiôni-cos compostos por estruturas polipeptídicas definidas que parecem ter am-plas capacidades. Um grande número de membros dessa classe podem sersintetizados com estruturas definidas cobrindo formas lineares e ramificadase se mostraram capazes de oferecer atividade biológica tanto in vitro, quantoin vivo. Eles mostraram ter atividade com vários tipos de ácidos nucléicos,incluindo plasmídios e oligonucleotídeos de DNA ou RNA. O sucesso comessa classe de polímeros catiônicos parece resultar de um projeto que in-corpora estruturas específicas, incluindo ramificação, e usa uma mistura debases fortes e fracas para formar um polímero com propriedades catiônicasmistas. Outra vantagem dessa classe particular é sua natureza biodegradá-vel, sendo construídos inteiramente com aminoácidos naturais, embora rami-ficação não natural. Ter um polímero com pelo menos duas propriedadespara usar na otimização, continuando o desenvolvimento de materiais para aformação de complexos de núcleo eficazes com siRNA, pode ser refinado efocalizar em aperfeiçoamentos adicionais que equilibrem a estabilidade e aliberação citoplasmática. Polímeros formadores de núcleo otimizados podemser usados como a base para as outras funções.

Revestimento Estérico Protetor

Mesmo lipossomos com uma bicamada lipídica externa seme-lhantes à membrana celular externa são rapidamente reconhecidos e depu-rados do sangue. Diferentemente de partículas virais, todavia, a nanotecno-logia abriu uma ampla frente na química dos polímeros sintéticos. Polímeroshidrofílicos, como PEG e poliacetáis e polioxazolinas, se mostraram eficazespara formar uma camada protetora "estérica" sobre a superfície de sistemasde distribuição de fármacos coloidais, quer nanopartículas de lipossomos,polímeros ou eletrostáticas, reduzindo a depuração imune dosangue. O uso,dessa camada de PEG estérica foi primeiro desenvolvida e mais amplamen-te estudada com lipossomos estericamente estabilizados. A presente inven-ção apresenta abordagens alternativas, como redução química da carga su-perficial, além de um revestimento polímero estérico.

As evidências são fortes de que a barreira estérica e as conse-qüências biológicas derivam de propriedades físicas, não químicas. Váriosoutros polímeros hidrofílicos foram relatados como alternativas ao PEG. Es-tudos físicos sobre lipossomos estericamente estabilizados proporcionaramum forte fundamento mecanicista para o comportamento físico da camadade polímero e podem ser usados para conseguir revestimentos similaressobre outros tipos de partículas. Entretanto, embora estudos físicos tenhammostrado a formação de uma camada polimérica similar sobre a superfíciede complexos de polímeros com ácidos nucléicos, e a obtenção de proprie-dades biológicas similares, ainda não temos informações suficientes parausar as propriedades físicas para predizer com precisão as propriedadesbiológicas desejadas, a proteção da depuração imune do sangue.

Estudos avançados estão construindo complexos de nanopartí-culas com variações controladas em suas propriedades físicas, seguido pordeterminação de suas propriedades biológicas. A partir de muitos estudoscom lipossomos, está claro que as propriedades físicas com o maior impactosobre a atividade biológica podem ser obtida por síntese de uma. matriz deconjugados variando o tamanho dos dois polímeros e a densidade de enxer-tio. Deve-se notar que, embora a função de camada esférica da superfícieseja devida a propriedades físicas, a química de conjugação ótima aindadepende da natureza química específica do polímero estérico e do veículoao qual é acoplado.

Métodos para a formação das nanopartículas com a camada depolímero estérico de superfície também são um parâmetro relevante. Umamodalidade da presente invenção apresenta métodos em que o polímeroestérico é acoplado ao polímero de veículo para fornecer um conjugado quese automonte com o ácido nucléico, formando uma nanopartícula com a ca-mada superficial de polímero estérico. Outra modalidade é fixar revestimen-tos superficiais a nanopartículas pré-formadas. Na automontagem, a forma-ção da camada esférica de superficial depende de interações do polímero deveículo com a carga, não na penetração mediante uma camada estérica emformação para reagir com a superfície da partícula. Nesse caso, os efeitosdo polímero estérico sobre a capacidade do polímero de veículo para se ligarà carga de ácido nucléico podem ter efeitos adversos sobre a formação dapartícula e, portanto, sobre a camada estérica de superfície. Se isso ocorrer,a densidade de enxertia do polímero estérico sobre o veículo terá excedidoseu máximo, ou a natureza estrutural da enxertia não é adequada.Liqantes Expostos na Superfície Direcionados a Tecidos Específicos

A capacidade da nanopartícula de atingir o interior das célulasalvo seletivamente reside em sua capacidade de induzir uma captação me-diada por receptor específica. Isso é conseguido na presente invenção porligantes expostos com a especificidade de ligação. Embora muitos tipos deligantes tenham sido amplamente estudados para o direcionamento de sis-temas de distribuição coloidais, muitos se basearam em anticorpos. Mais devinte anos atrás, essa idéia foi desenvolvida para o acoplamento de anticor-pos à superfície de lipossomos, normalmente chamados de imunoliposso-mos. Um parâmetro importante que surgiu foi o impacto da densidade deligante. Os amplos estudos obtiveram sucesso in vitro, mas apenas recen-temente começaram a produzir resultados positivos in vivo, agora atingindoo estágio de desenvolvimento clínico para distribuição de fármacos de molé-cula pequena.

Anticorpos tendem a atender a muitas exigências para uso comoligante, incluindo boa seletividade de ligação e preparação quase rotineirapara quase qualquer receptor e ampla aplicabilidade de métodos de acopla-mento de proteínas, independentemente do tipo de nanopartícula. Anticor-pos monoclonais mostram até sinais de utilidade para cruzar a barreira he-matoencefálica. Por outro lado, não são ideais. Como ligantes de direciona-mento, anticorpos são proteínas muito grandes, de cerca de 150 Kd. Issotorna a conjugação para fornecer uma orientação específica difícil, a menosque um resíduo aminoáoido Cys extra possa ser introduzido, ou outro sítioúnico identificado, para acoplamento químico. Formas truncadas podem serusadas para reduzir o tamanho, mas pode ocorrer perda de afinidade, comoem construções "scFv".

Outra propriedade preocupante de anticorpos é sua multiplicida-de de atividades biológicas, muitas trazidas em domínios não associados àligação antigênica, que são parte de sua função no sistema imune de mamí-feros. Essas atividades imunes podem ser exploradas, mas também podeminterferir na função de camada estérica da nanopartícula de evitar a depura-ção imune. Outras proteínas que são ligantes naturais também foi conside-radas para direcionamento de nanopartículas, como transferrina para o re-ceptor de transferrina e proteínas de Fator VII e Fator Vila e seus fragmen-tos. Esses agentes podem ser bons candidatos, mas seu uso bem sucedidorequer um esforço considerável para identificar um química de acoplamentoespecífica, acoplamento sem perda de atividade de ligação e exposição napartícula, sem reintroduzir a depuração imune.

Uma classe preferida de ligantes são compostos de pequenopeso molecular com forte afinidade de ligação seletiva por receptores de in-ternalização. Estudos avaliaram metabólitos naturais, como vitaminas comoo folato e tiamina, polissacarídeos como aglutinina de germe de trigo ou sialilLewisx para e-selectina, e domínios de ligação de peptídios, como RGD paraintegrinas. Peptídios oferecem uma classe versátil de ligantes, pois bibliote-cas de apresentação de fagos podem ser usadas para a triagem de seqüên-cias naturais ou não naturais, mesmo com métodos de panelamento in vivo.Esses métodos de apresentação de fagos podem permitir a retenção de umresíduo Cys não pareado em uma extremidade para facilidade de acopla-mento, independentemente da seqüência. O recente sucesso in vivo usandoum peptídio RGD para distribuição direcionada de nanopartículas a neovas-cularização indica que essa abordagem pode ser muito eficaz para atenderàs principais exigências de ligantes eficazes: química específica que nãointerfere na ligação do ligante ou induz depuração imune, todavia permitecaptação mediada por receptor seletiva nas células alvo.

Uma modalidade preferida da invenção compreende um conju-gado ligante de peptídio RGD-2C. O ligante RGD-2C garante a localizaçãona neovascularização, assim como em células tumorais próximas à neovas-cularização do tumor, internalização intracelular das nanopartículas conten-do ácido nucléico e a liberação do ácido nucléico, proporcionando uma ativi-dade biológica eficaz do ácido nucléico.

Outra modalidade preferida da invenção compreende misturasde ligante-conjugados de dois ou mais ligantes, ou conjugados de dois oumais ligantes. Uma modalidade preferida da invenção compreende misturasde ligantes de peptídio RGD com proteínas de Fator VII ou seus fragmentospeptídicos ou análogos químicos. Outra modalidade preferida da invençãocompreende misturas de ligantes de peptídio RGD com ligantes que se li-guem a e-selectinas. Outra modalidade preferida da invenção compreendemisturas de ligantes de peptídio RGD com proteínas apoE ou seus fragmen-tos peptídicos ou análogos químicos. Outra modalidade preferida da inven-ção compreende misturas de ligantes de peptídio RGD com ligantes de liga-ção a células tumorais, como folato, transferrina, porfirina, bFGF e EGF. Ou-tra modalidade preferida da invenção compreende misturas de três ou maisdesses ligantes.

Uma modalidade preferida da invenção compreende um conju-gado de dois ou mais lligantes em um domínio de um veículo e um agentede poliamina em um segundo domínio do dito veículo.

Outra modalidade preferida da invenção compreende misturasde conjugados de ligantes. A mistura de conjugados de ligantes pode com-preender os ligantes conjugados ao mesmo agente de veículo e, opcional-mente, ao mesmo domínio do veículo, ou a mistura de conjugados de ligan-tes pode compreender ligantes conjugados a diferentes agentes de veículoou, opcionalmente, a domínios diferentes de agentes de veículo. A misturade conjugados d eligantes também pode ser composta por agentes proteto-res, fusogênicos ou de veículo, como PEG ou poliacetáis ou polímeros sen-síveis ao pH ou poliaminas ou copolímeros de histidina-lisina.

As composições e métodos da presente invenção proporcionama administração de RNAi compreendendo polímeros, conjugados de políme-ros, lipídios, micelas, colóidos automontáveis, nanopartículas, nanopartículasestericamente estabilizadas ou nanopartículas direcionadas por ligantes.Vetores sintéticos direcionados do tipo descrito no WO 01/49324, que é aquiincorporado por referência em sua inteireza, podem ser usados para a distri-buição sistêmica de ácidos nucléicos da presente invenção, induzindo RNAi.Em uma modalidade, um vetor sintético de PEI-PEG-RGD (ácido polietileno-imina-polietileno glicol-arginina-glicina-aspártico) pode ser preparado e usa-do, por exemplo, como nos Exemplos 53 e 56 do WO 01/49324. Esse vetorfoi usado para distribuir RNAi sistemicamente mediante injeção intravenosa.Aqueles versados na técnica reconhecerão que outras moléculas de vetorsintético direcionado conhecidas na técnica podem ser usadas. Por exemplo,o vetor pode ter um invólucro interno composto por um complexo de núcleocompreendendo o RNAi e pelo menos um reagente formador de complexo.

O vetor também pode conter uma porção fusogênica, que podecompreender um invólucro que esteja ancorado no complexo de núcleo, oupode ser incorporado diretamente no complexo de núcleo. O vetor tambémpode ter uma porção de invólucro externo que estabilize o vetor e reduza aligação não específica a proteínas e células. A porção de invólucro externopode compreender um polímero hidrofílico e/ou pode estar ancorada na por-ção fusogênica. A porção de invólucro externo pode estar ancorada no com-plexo de núcleo. O vetor pode conter uma porção de direcionamento queintensifique a ligação do vetor a um tecido e população de células alvo. Por-ções de direcionamento adequadas são conhecidas na técnica e estão des-critas em detalhes no WO 01/49324.

a. Preparação de nanopartículas direcionadas por RGD conten-do siRNA de via VEGF:

Uma modalidade da presente invenção apresenta composiçõese métodos para preparações de nanopartículas direcionadas por ligante me-diado por RGD de moléculas de dsRNA curtas de siRNA anti-via VEGF. AsFiguras 29 e 30 mostram um método para a fabricação de nanopartículasdirecionadas a tecido mediadas por RGD-2C contendo siRNA. O ligante dedirecionamento, peptídio contendo RGD de (ACRGDMFGCA), é conjugado aum polímero estérico, como polietileno glicol ou outros polímeros com pro-priedades similares. Esse conjugado de ligante-polímero estérico é adicio-nalmente conjugado a um policátion, como polietilenoimina ou outro materialeficaz, como um copolímero de histidina-lisina. Os conjugados podem ser deligações covalentes ou não covalentes, e as ligações covalentes podem sernão cliváveis ou podem ser cliváveis, como por hidrólise ou por agentes re-dutores. Os conjugados podem ser preparados com polímeros hétero-bifuncionais, como um reagente NHS-PEG-VS comercialmente disponível(Nektar), ou agentes heterobifunconais preparados para fabricação, ou compolímeros homobifuncionais, como o reagente NHS-PEG-NHS comercial-mente disponível (Rapp Polymere) ou agentes homobifuncionais preparadospara fabricação. Uma modalidade preferida da presente invenção compre-ende o uso de um agente NHS-PEG-NHS homobifuncional, como um rea-gente comercialmente dipsonível na RAPP Polymere, primeiro para acoplarcom um peptídio RGD-2C preparado por síntese em fase sólida e envio paraacoplar comum polímero contendo poliamina,corno PEI comercialmente dis-ponível ou um copolímero de histidina-lisina preparado por síntese em fasesólida.

Outra modalidade preferida da presente invenção compreendeuma primeira combinação de um conjugado de RGD-PEG-poliamina com umpolímero de poliamina, como PEI ou um copolímero de histidina-lisina, euma segunda combinação da dita mistura de polímeros com uma segundamistura de oligonucleotídeos de dsRNA. Uma solução compreendendo oconjugado de polímeros, ou compreendendo uma mistura de um conjugadode polímeros com outro polímero, lipídio ou micela, como materiais compre-endendo um ligante ou um polímero estérico ou fusógeno, é misturada comuma solução compreendendo o ácido nucléico, em uma modalidade umsiRNA direcionado contra genes específicos de interesse, em razões dese-jáveis para se obter nanopartículas que contenham siRNA.

Nessa modalidade, formam-se nanopartículas por automonta-gem de nanopartículas em camadas compreendendo a misturação do con-jugado de polímeros com o ácido nucléico. Interações eletrostáticas não co-valentes entre o ácido nucléico negativamente carregado e o segmento posi-tivamente carregado do conjugado de polímeros acionam o processo de au-to-montagem que leva à formação das nanopartículas. Esse processo envol-ve a misturação simples de duas soluções, em que uma das soluções con-tendo o ácido nucléico é adicionada à outra solução contendo o conjugadode polímeros, seguido por ou concomitantemente à agitação. Em uma moda-lidade, a razão entre os componentes positivamente carregados e os com-ponentes negativamente carregados na mistura é determinada por ajusteapropriado das concentrações de cada solução ou por ajuste do volume desolução adicionado. Em outra modalidade, as duas soluções são misturadassob condições de fluxo contínuo usando-se um aparelho de misturação, co-mo um misturador estático (Figura 30). Nessa modalidade, duas ou maissoluções são introduzidas em um misturador estático a taxas e pressões quedêem origem a uma razão das soluções, em que as correntes de soluçõesficam misturadas dentro do misturador estático. São possíveis arranjos demisturadores em paralelo ou em série.

E. Formulação Combinada e Campo Elétrico

Para certas aplicações, RNAi pode ser administrado com ou semaplicação de um campo elétrico. Esse pode ser usado, por exemplo, paradistribuir as moléculas de RNAi da invenção mediante injeções diretas, porexemplo, em tecido tumoral e diretamente ou próximo a um tecido angiogê-nico ou um tecido com neovascularização. O siRNA pode estar em um veí-culo farmacêutico adequado como, por exemplo, uma solução salina ou umasolução salina tamponada.

A presente invenção, assim geralmente descrita, será mais pron-tamente compreendida com referência aos exemplos a seguir, que são a-presentados a título de ilustração e não se destinam a limitar a presente in-venção.

Exemplos

Exemplo 1: Inibição do crescimento tumoral com uso combinado de dúplexde siRNA direcionados a VEGFR2 e Bevacizumab (Avastin) contra VEGF.

Material e Métodos

Reagentes: Avastin, anticorpo monoclonal contra VEGF (25mg/mL, Genetech); siRNA contra VEGFR2 de camundongo, seqüência (a)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC; (b) AATGCGGCGGTGGTGACAGTA);

siRNA contra luciferase (Qiagen); Avertin preparado com 1,5 grama de2,2,2-tribromoetanol e 1,5 mL de álcool t-amílico (Cat. ng T4840-2, Cat. n924048-6, Aldrich) em 100 mL de água destilada, St. Louis, MO). Camundon-gos: camundongos sem pêlo fêmea atímicos, de 5 a 6 semanas de idade,foram comprados na TACONIC e alojados convencionalmente. Todas asinvestigações seguiram as diretrizes do Comitê Sobre Cuidados com Recur-sos de Animais Laboratoriais, Comissão de Ciências da Vida, Conselho Na-cional de Pesquisa. As instalações para animais do Instituto de PesquisaBiomédica em Rockville Maryland são completamente autorizadas pela As-sociação Americana de Cuidados com Animais Laboratoriais. Células: umalinhagem celular de carcinoma de cólon, DLD-1 (CCL-221, ATCC) foi culti-vada em meio RPMI 1640 com 2 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicarbonatode sódio, 4,5 g/L de glicose, 10 mM de HEPES e 1,0 mM de piruvato de só-dio, 10% de soro bovino fetal.

Procedimento: 1) Células DLD-1 próximas à confluência foramcolhidas e ressuspendidas em meio RPMI livre de soro. 2) Os camundongosforam anestesiados com Avertin, 0,4 mL/camundongo i.p. 3) 100 milhões decélulas em 0,1 mL de meio RPMI livre de soro foram injetados nas costasdos camundongos s.c. no lado esquerdo, para estabelecimento de um mo-delo de tumor de xenoenxerto. 4) 5 dias após a inoculação das células tumo-rais, os tamanhos dos tumores em crescimento foram medidos com um cali-bre. Os camundongos foram, então, aleatoriamente agrupados em 6 gruposde 8 camundongos por grupo. 5) O projeto do experimento e o esquema dedosagem foram os seguintes. 6) siRNA foi distribuído através de injeção daveia caudal após terem formado com complexo com RPP.Tabela I. Regime de tratamento com siRNA/mAb antianqioaênese do modelo de tumor DLD-1

<table>table see original document page 45</column></row><table>Resultados e Discussão

1. A própria nanopartícula direcionada por ligante RGD e portan-do dsRNA de siRNA específico para VEGF R2 era capaz de conseguir umainibição do crescimento tumoral após administrações intravenosas sistêmi-cas repetidas (Figura 1) com apenas 2 mg/kg de siRNA.

2. Essa atividade antiangiogênese à base de siRNA (direcionadaa VEGF R2) era capaz de intensificar a antiangiogênese mediada por anti-corpo monoclonal (mAb) contra VEGF, resultando em inibição adicional docrescimento tumoral (Figura 1).l

3. Embora muitas vias bioquímicas possam ser críticas indepen-dente ou coletivamente para a neoplasia maligna, é amplamente reconheci-do que a neoangiogênese é crítica para o crescimento de muitos tipos decânceres. Conseqüentemente, o processo de neoangiogênese naturalmentese tornou uma das áreas mais visadas para desenvolvimento de farmacospara tumores. Entre os muitos fatores envolvidos na neoangiogênese, acre-dita-se que o VEGF seja um importante fator de controle, e um que possapermitir um efeito terapêutico, proporcionando um benefício clínico como oconseguido pelo Avastin, um anticorpo monoclonal contra VEGF e que de-monstrou inibir o crescimento de câncer do cólon. A combinação de inibiçãode gene por siRNA de VEGF direcionada a NV mostra evidências de ser adi-tiva com uma terapêutica antagonista, quando administradas em um proto-colo de combinação.

4. O exemplo mostra o grande benefício do uso de inibidores degenes com antagonistas, como inibidores de mAb, no mesmo regime de tra-tamento para melhorar o resultado terapêutico.

5. Resultados de RT-PCR demonstraram diretamente que o ní-vel de mRNA de VEGFR2 nas amostras de tumor tratadas com o siRNA es-pecífico para VEGFR2 distribuído por nanopartícula foi dramaticamente re-gulado negativamente, em comparação com os níveis de expressão nos tu-mores não tratados (Figura 2).

6. A química imunohistológica (análise IHC) indicou que o derru-bamento do nível de proteína ocorreu para VEGFR2 e CD31, que é um mar-cador para neovascularização (Figura 3).

7. A medição por ELISA da atividade de IFN-alfa nas amostrasde sangue do tratamento com apenas nanopartícula/siRNA de VEGFR2 eem combinação com Avastin não mostrou nenhuma regulação positiva signi-ficativa (detectável) ou indução de atividade de IFN (Figura 4), indicando quea inibição de NV e a inibição do crescimento tumoral não eram devidas a umefeito mediado por interferon não específico.

Sumário

Este exemplo ilustra a presente invenção, pois apresenta com-posições e métodos para o tratamento de câncer com inibidores pequenosdo gene de oligonucleotídeo de dsRNA de interferência em combinação comanticorpos monoclonais (mAb) no mesmo regime terapêutico, em que osagentes inibem tanto a expressão de genes causadores de doença, quantoas funções biológicas de proteínas causadoras de doença, resultando emuma eficácia terapêutica intensificada. Além disso, o exemplo apresenta umailustração do bloqueio simultâneo tanto do ligante (por exemplo, VEGF),quanto de seu receptor (por exemplo, VEGF R2) para proporcionar uma ini-bição eficaz de uma via biológica particular (por exemplo, via de angiogêne-se), proporcionando, dessa forma, um tratamento que inibe a progressão dadoença. Conseqüentemente, aplicações combinadas de atividades inibitóriascontribuídas por dois inibidores biológicos potentes e direcionados, RNAi emAb, são um meio para o tratamento eficaz de doenças de NV, incluindo câncer.

Exemplo 2. Silenciamento de VEGF mediado por siRNA in vitro e in vivo

siRNA específico para VEGF165 humano foi transfectado emcélulas MCF-7/VEGF165 (superexpressão de hVEGF) por Lipofectamina,resultando no derrubamento do mRNA de hVEGF na célula (Figura 2, painelsuperior). Usando-se um procedimento de eletrporação, as células MCF-7/VEGF165 foram transfectadas por siRNA específico para hVEGF165, re-sultando na regulação negativa da expressão de hVEGF, conforme determi-nado com uma análise ELISA.

Quando o siRNA específico para hVEGF165 foi distribuído atra-vés de uma administração intratumoral repetida, o crescimento de tumoresde xenoenxerto induzidos por células células MCF-7/VEGF165 foi significati-vamente inibido. Essa inibição foi adicionalmente validada quando os tecidostumorais foram coletados para testes da expressão de mRNA de hVEGF,que resultou em regulação negativa significativa com base na análise RT-PCR. Usando-se o mesmo siRNA específico para hVEGF165, também se écapaz de demonstrar a inibição do crescimento tumoral no modelo de xeno-enxerto de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC,células 1483), mediante 5 administrações repetidas intratumorais com setedias de intervalos. Cada injeção requer 10 |ig do siRNA específico em 15 a30 uL de solução aquosa livre de RNAse.

Exemplo 3. siRNA de filamento duplo de extremidade romba e com 25 paresde bases é mais potente do que siRNA regular com 19 pares de bases comextremidades 3' excedentes no silenciamento da expressão do gene alvo

Em um dos estudos de transfecção com siRNA in vitro, as célu-las de câncer de mama MCF/165 que superexpressam VEGF humano(hVEGF) foram transfectadas com siRNA de filamento duplo de extremidaderomba e com 25 pares de bases (hVEGF-25-siRNA-a, hVEGF-25-siRNA-b,hVEGF-25-siRNA-c, Luc-25-siRNA) ou siRNA com 19 pares de bases comextremidades 3' excedentes (hVEGF-siRNA-a, GFP-siRNA-a) usando-se ummétodo de transfecção mediado por eletroporação. 4 x 106 célulasMCF7/165 foram ressuspendidas em 200 /liL de Tampão de Eletroporaçãode siRNA siPORT (Ambion) misturado com 5 |ig de siRNA e, então, subme-tidas ao tratamento de eletroporação usando-se um Electro Square PoratorECM830 (BTX, Fisher Scientific). Os parâmetros para a eletroporação são:tensão de 500 V; duração do pulso de 60 |is; número de pulsos de 2; inter-valo de pulso de 1 segundo. As células transfectadas foram semeadas emuma placa de 24 cavidades a uma densidade de 5 x 104 células/cavidade ecultivadas em um incubador a 37°C com 5% de C02. 24 horas após a trans-fecção, os meios de cultura de cada cavidade foram colhidos, e a concentra-ção da proteína VEGF humana nos meios foi medida usando-se um kithVEGF EKISA comercial (R&D Systems).Observou-se uma inibição do gene alvo de hVEGF significativa-mente mais forte nas células tratadas com hVEGF-siRNA de 25 pares debases do que em células tratadas com hVEGF-siRNA de 19 pares de basesregular. Havia mais de 75% de redução da proteína hVEGF secretada nosmeios de cultura de células transfectadas com moléculas de hVEGF-25-siRNA de filamento duplo e com extremidade romba e 25 pares de bases 24horas após a transfecção com siRNA, em comparação com uma redução deproteína hVEGF de cerca de 60% em células transfectadas com hVEGF-siRNA-a de 19 pares de bases regular. Tanto siRNA de filamento duplo eextremidade romba com 25 pares de de base e seqüência de controle nãoespecífica (Luc-25-siRNA), quanto GFP-siRNA com extremidades 3' exce-dentes não afetaram a expressão de VEGF sob as mesmas condições detransfecção de siRNA (Figura 7).

Exemplo 4. siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 pares debases mediou um silenciamento de gene alvo alongado

Em outro dos estudos de transfecção de siRNA in vitro, as célu-las de câncer de mama MCF/165 superexpressando VEGF humano(hVEGF) foram transfectadas com siRNA de filamento duplo de extremidaderomba e com 25 pares de bases (hVEGF-25-siRNA-a, hVEGF-25-siRNA-b,hVEGF-25-siRNA-c, Luc-25-siRNA) ou siRNA com 19 pares de bases comextremidades 3' excedentes (hVEGF-siRNA-a, GFP-siRNA-a) usando-se ummétodo de transfecção mediado por eletroporação. 4 x 106 célulasMCF7/165 foram ressuspendidas em 200 pL de Tampão de Eletroporaçãode siRNA siPORT (Ambion) misturado com 2 |ig ou 5 fig de siRNA e, então,submetidas ao tratamento de eletroporação usando-se um Electro SquarePorator ECM830 (BTX, Fisher Scientific). Os parâmetros para a eletropora-ção são: tensão de 500 V; duração do pulso de 60 |is; número de pulsos de2; intervalo de pulso de 1 segundo. As células transfectadas foram semea-das em uma placa de 24 cavidades a uma densidade de 5 x 104 célu-las/cavidade e cultivadas em um incubador a 37°C com 5% de C02. 24, 28,72, 96 e 120 horas após a transfecção, os meios de cultura de cada cavida-de foram colhidos e substituídos com meio de cultura fresco. A concentraçãoda proteína VEGF humana nos meios foi medida em vários momentos usan-do-se um kit hVEGF EKISA comercial (R&D Systems). O derrubamento dehVEGF mediado por siRNA foi normalizado com os níveis de proteínahVEGF medidos em células tratadas com os respectivos siRNA de controlenão específicos.

Observou-se uma inibição do gene alvo de hVEGF significativa-mente mais forte e prolongada nas células tratadas com hVEGF-siRNA de25 pares de bases do que em células tratadas com hVEGF-siRNA de 19 pa-res de bases regular a cada momento testado. 120 horas após o tratamentocom siRNA, ainda havia mais de 60% de redução da proteína hVEGF secre-tada nos meios de cultura de células transfectadas com 5 uxj de moléculasde hVEGF-25-siRNA de filamento duplo e com extremidade romba e 25 pa-res de bases, em comparação com uma redução de proteína hVEGF de me-nos de 20% observada em células transfectadas com hVEGF-siRNA-a de 19pares de bases regular (Figura 8). Também observou-se uma inibição dogene de hVEGF mediada por siRNA dependendo da dose para as moléculasde hVEGF-25-siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 paresde base.

Com base nestas observações, as moléculas de hVEGF-25-siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 pares de base nãoapenas proporcionam uma inibição do gene de VEGF-alvo mais forte, mastambém resultam em uma duração significativamente mais longa de umainibição eficaz do gene de VEGF alvo. Por exemplo, em comparação comapenas 48 horas de mais de 60% de redução da proteína hVEGF consegui-da usando-se 5 |ig de hVEGF siRNA de 19 pares de bases regular, pelomenos 120 horas de redução de mais de 60% da proteína foram consegui-das usando-se hVEGF siRNA de filamento duplo e extremidade romba com25 pares de bases. Conseqüentemente, siRNA de filamento duplo e extre-midade romba com 25 pares de bases são inibidores de gene alvo mais po-tentes, que podem levar a uma eficácia terapêutica mais significativa.

Informações adicionais incluem (1) Luc-25-siRNA tem a seqüên-cia de (filamento sentido 5'-rGGAACCGCUGGAGAGCAACUGCAUA-3' e defilamento anti-sentido 5'-RCCUUGGCGACCUCUCGUUGACGUAU-3'); (2)hVEGF-siRNA-a tem a seqüência de (filamento sentido, 5'-rUCGAGACCCUGGUGGACAUdTT-3' e de filamento anti-sentido 5'-rAUGUCCACCAGGGUCUCGAdTT-3,); (3) GFP-siRNA tem a seqüência de(filamento sentido 5'-rGCUGACCCUGAAGUUCAUCdTT-3' e de filamentoanti-sentido 5'-rGAUGAACUUCAGGGUCAGCdTT-3'); (4) hVEGFR2-25-siRNA-c: 5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'.

Exemplo 5. siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 pares debases derruba eficientemente a expressão de VEGFR1 e VEGFR2 humanosin vitro

Três siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 pa-res de bases especificamente direcionados para VEGFR1 humano foramtransfectados em células HUVEC mediante eletroporação. O VEGFR1 ligadoa membrana e o fragmento extracleular livre de VEGFR1 foram medidos 96horas após a transfecção, mediante ensaio ELISA. O dúplex VEGFR1-siRNAdemonstrou a atividade de selecionamento de VEGFR1 mais forte, em com-paração com dois outros siRNA, tanto para proteína de lisado celular, quantonos fragmentos livres na solução sobrenadante de cultura celular (Figura 9 e10). Quando se usa a mesma abordagem para avaliar três siRNA de fila-mento duplo e extremidade romba com 25 pares de bases direcionados aogene de VEGFR2 humano, descobriu-se que todos os três dúplices exibempotente atividade de silencionamento tanto 24 horas, quanto 72 horas após atransfecção (Figura 11).

Exemplo 6. siRNA de filamento duplo e extremidade romba com 25 pares debases mediou uma forte eficácia antitumoral em tumor de xenoenxerto MDA-MB-435

Um dúplex de siRNA com 25 pares de bases de comprimentodirecionado à seqüência do gene de VEGF1654 humano demonstrou umaforte atividade de inibição do crescimento tumoral após três administraçõesintratumorais repetidas de 10 uxj a cada 5 dias (Figura 12), usando-se umalinhagem celular de carcinoma de mama MDA-MB-435 conhecida por terelevada expressão de proteínas VEGF e bFGF.Exemplo 7. Coquetel de siRNA direcionado aos genes de VEGF,VEGFR1 e VEGFR2 é mais potente do que qualquer um dos siRNA indivi-duais direcionados a apenas um desses genes no modelo de neovasculari-zação ocular induzido por HSV

Recentemente, demonstrou-se que o coquetel de siRNA conten-do siRNA direcionado a VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 pode conseguir umaeficácia antiangiogênese mais potente do que o direcionamento a apenasum desses genes, à mesma dosagem, no modelo de doença em animal.Usando-se essa abordagem, fomos capazes de bloquear eficientemente avia VEGF que desempenha o papel chave na angiogênese patológica (Figura 13).

DNA de HSV que contém abundantes motivos contendo CpGpotencialmente bioativos pode induzir o potente fator de angiogênese fatorde crescimento endotelial vascular (VEGF), e essa neutralização de VEGFcom anticorpo minimizou a angiogênese induzida por HSV. Também se es-tabeleceu um modelo conveniente em que se mostrou que os oligodesoxinu-cleotídeos contendo CpG bioativos (ODNs) induzem neovascularização me-diante indução de VEGF. Esse modelo é usado no presente estudo para a-valiar o potencial terapêutico de interferência de RNA (RNAi) para suprimirexpressão de VEGF e sensibilidade.Materiais e MétodosReaqentes

Fosforotioato ODNs foram gentilmente fornecidos por Dennis M.Klinman (Avaliação e Pesquisa de Substâncias Biológicas, Administração deAlimentos e Fármacos, Washington, DC). As seqüências de ODNs estimula-tórios usados neste estudos foram: 1466, TCAACGTTGA, e 1555, GCTA-GACGTTAGCGT. Realizaram-se estudos subseqüentes usando uma mistu-ra equimolar de ODNs 1466 e 1555.

Projeto Molecular de Genes Alvo e siRNA

Três fatores da via mVEGF, mVEGF A e dois receptores deVEGF (mVEGFRI e mVEGFR2) serviram de alvo para RNAi. Para cada ge-ne alvo, duas seqüências alvo foram atribuídas em diferentes localizaçõesno mesmo mRNA. Foram projetados siRNA correspondentes às seqüênciasalvo acima. Esses siRNA foram projetados de acordo com as diretrizes pro-postas por Tuschl 14,15. Os siRNA projetados (dúplex de filamentos sentidoe anti-sentido) foram sintetizados pela Qiagen (Valencia, CA). Todos os siR-NA foram oligos de RNA de filamento duplo com 21 nucleotídeos de com-primento com uma excedente de dois nucleotídeos (TT) na extremidade 3.As seqüências alvo de mVEGFA foram (a) AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTGe (b) AACGATGAAGCCCTGGAGTGC.

As seqüências alvo de mVEGFRI foram: (a) AAGTTAAA-AGTGCCTGAACTG e (b) AAGCAGGCCAGACTCATCTTTC. As seqüênciasalvo de mVEGFR2 foram (a) AAGCTCAGCACACAGAAAGAC e (b)ATGCGGCGGTGGTGACAGTA. Para a síntese de controles de siRNA nãorelacionados, duas seqüências alvo cada para LacZ e luciferase de vaga-lume, foram usadas. Elas foram: LacZ (a) AACAGTTGCGCAGCCTGAATG e(b) AACTTAATCGCCTTGCAGCAC, Luc (a) AAGCTATGAAACGA-TATGGGC e (b) AACCGCTGGAGAGCAACTGCA. Estudos subseqüentesforam conduzidos usando-se uma mistura equimolar de a e b para siRNAindividuais.

Camundongos

Camundongos BALB/c fêmea (H-2d), de 5 a 6 semanas de ida-de, foram adquiridos na Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN) e alojadosconvencionalmente. Todas as investigações seguiram as diretrizes do Comi-tê Sobre Cuidados com Recursos de Animais Laboratoriais, Comissão deCiências da Vida, Conselho Nacional de Pesquisa. As instalações para ani-mais da Universidade do Tennessee (Knoxville, TN) são completamente au-torizadas pela Associação Americana de Cuidados com Animais Laboratori-ais.

Vírus

HSV-1 cepa RE (gentilmente fornecido pelo Dr. Robert Laushc,Universidade de Alabama, Mobile, AL) foi usado em todos os procedimentos.O vírus foi cultivado em monocamadas de células Vero (catálogo nQ CCL81;Coleção Americana de Cultura de Tipo, Manassas, VA), titulado e armaze-nado em alíquotas a -80°C até o uso.

Eficácia in vitro de siRNA

Para testar a eficácia de RNAi in vitro, usaram-se as seguinteslinhagens celulares. Células RAW264.7 gama NO (CRL-2278, ATCC) foramusadas para testar a eficiência do derrubamento siVEGFA específico do ge-ne de VEGFA que é espontaneamente expressado nessas células. As célu-las foram plaqueadas em uma placa de seis cavidades em RPMI com 10%de soro bovino fetal durante uma noite a 37°C em 5% de C02. Um dia apóso plaqueamento das células, as células foram transfectadas com diferentesconcentrações de siVEGFA ou siLuc (a 0, 0,1, 0,5, 1,0 ou 2,0 g/2mL/cavidade, respectivamente) usando-se Lipofectamina 2000 (Invitrogen,Carlsbad, CA). Vinte e quatro horas depois, o RNA dessas células foi extraí-do para Extração de RNA por transcriptase reversa-polimerase e RT-PCR.Células SVR (CRL-2280, ATCC) foram usadas para testar a eficiência doderrubamento siVEGFRI específico do gene de VEGFR1 que é constituti-vamente expressado nessas células. As células foram plaqueadas em umaplaca de seis cavidades em meio de Eagle modificado com Dulbecco com5% de soro bovino fetal durante uma noite a 37°C em 5% de C02. Um diaapós o plaqueamento das células, as células foram transfectadas com dife-rentes concentrações de siVEGFRI ou siLuc (a 0, 0,1, 0,5 ou 1,0 g/2mL/cavidade, respectivamente) usando-se Lipofectamina 2000.-Quarenta eoito horas depois, o RNA dessas células foi extraído para RSPCR para de-tecter VEGFR1 (veja Extração de RNA e PCR Específico Para Molde NA)(RS-PCR). As células 293 (CRL-1573, ATCC) foram usadas para transfec-ção com plasmídio que expressa mVEGFR2 para a detecção do derruba-mento de mVEGFR2 exógeno. As células foram plaqueadas em uma placade seis cavidades em meio de Eagle modificado com Dulbecco com 5% desoro bovino fetal durante uma noite a 37°C em 5% de CO2. Um dia após oplaqueamento das células, as células foram co-transfectadas com o plasmí-dio pCI-VEGFR2 (0,2 g/2 mL/cavidade ) e SÍVEGFR2 (a, b, a_b) ou siLuc (0,0,1, 0,5 ou 1,0 g/2 mL/cavidade, respectivamente) usando-se Lipofectamina2000. Quarenta e oito horas depois, o RNA dessas células foi extraído paraRSPCR para detecter VEGFR2.

Ensaio de Microbolso Córneo

O ensaio de microbolso córneo usado neste estudo observou oprotocolo geral de Kenyon e colegas. Péletes para inserção na córnea forampreparados por combinação de quantidades conhecidas de CpG ODNs, su-cralfato (10 mg, Bulch Meditec, Vaerlose, Dinamarca) e polímero hydron emetanol (120 mg/1 ml_ de etanol; Interferon Sciences, New Brunswick, NJ) eaplicação da mistura a um pedaço de 15 mm2 de malha sintética (Sefar A-merica, Inc., Kansas City, MO). A mistura foi deixada secar ao ar, e fibras damalha foram separadas, fornecendo péletes contendo CpG ODNs. O micro-bolso foi preparado sob um estereomicroscópio (Leica Microsystems, Wet-zlar, Alemanha) (quatro olhos por grupo), e péletes contendo CpG ODNsforam inseridos no microbolso. A angiogênese foi avaliada nos dias 4 e 7após o implante da pélete usando-se calibres (Biomedical Research Instru-ments, Rockville, MD) com um estereomicroscópio. O comprimento dos neo-vasos originados do anel de vasos límbico na direção do centro da córnea ea largura dos neovasos apresentado como em um mostrador de relógio foimedida 4. Cada hora é igual a 30Q na circunferência. A área angiogênica foicalculada de acordo com a fórmula para uma elipse.

Distribuição In Vivo de siRNA

O limbo foi monitorizado tanto no-dia 4, quanto no 7 após o im-plante do pélete. Uma inibição significativa da neovascularização córnea re-sultou com todos os três siRNA de teste, em comparação com aqueles quereceberam o controle siLacZ no dia 4 após o implante do pélete (p < 0,05). Acombinação dos três siRNA testados foi o inibidor mais eficaz, proporcio-nando uma redução de aproximadamente 60% da neovascularização (p <0,01).

Inibição de neovascularização induzida por CpG pela distribuição sistêmicade siRNA direcionado a genes da via VEGF

Para testar o efeito antiangiogênico de siRNA individuais dire-cionados e a eficiência da distribuição sistêmica de siRNA, camundongoscom microbolsos contendo CpG ODN receberam uma única dose i.v. de 40ug de siRNA contendo siVEGFA, siVEGFRI, siVEGFR2, uma mistura dostrês ou o controle siLacZ 6 e 24 h após o implante do pélete. Nesses expe-rimentos, usou-se um polímero ("Targetran") que se mostrou em estudosanteriores de angiogênese tumoral capaz de facilitar a distribuição extravas-cular de siRNA. Nos dias 4 e 7 após o implante do pélete, mediu-se a exten-são da angiogênese. Todos os reagentes usados individualmente induziramuma inibição significativa da neovascularização em comparação com o gru-po tratado com LacZ no dia 4 após o implante do pélete (p < 0,05). Confor-me observado com a administração local, a mistura dos três reagentes deteste proporcionou a inibição mais eficaz (média de 40% de inibição, p <0,01). Em experimentos adicionais, a função do veículo polimérico foi avalia-da por comparação da atividade antineovascularização da mistura de testeem suspensão no polímero ou dada em PBS. Esses experimentos revelaramque o uso do veículo polimérico resultou em antineovascularização 16 maiseficaz do que era evidente quando o veículo PBS era usado, embora o resul-tado só fosse significativo no período de teste inicial (p < 0,05). Os resulta-dos demonstram que a neovascularização ocular pode ser controlada pelaadministração i.v. de siRNA que tem como alvo os genes do sistema VEGFe que o uso da distribuição de nanopartículas de dsRNA mediadas por RGDaumentou a eficácia do efeito terapêutico.

Para determinar-a dose antiangiogênica eficiente de siRNA nadistribuição sistêmica, camundongos com microbolsos contendo CpG ODNreceberam uma única dose i.v. de 10, 20, 40, 80 \xg de siRNA contendo umamistura de siVEGFA, siVEGFRI e siVEGFR2 ou o controle siLuc com veícu-lo TargeTran 6 e 24 h após o implante da pélete. Uma administração desiRNA inibiu a angiogênese induzida por CpG de maneira dependente dadose.

Aplicação terapêutica de siRNA contra genes da via VEGF no modelo HSK

Estudos anteriores demonstraram que o VEGF é o fator angio-gênico crítico para a indução de angiogênese específica por HSV no modeloHSK. Para avaliar se a administração de siRNA direcionado aos genes davia VEGF inibe o desenvolvimento de HSK, as córneas de camundongosforam escarifiçadas e infectadas com 1 x 105 HSV-1 RE. Então, os camun-dongos receberam uma única dose de 10 |ig (injeção subconjuntival paradistribuição local) ou de 40 |ig (injeção na veida caudal para distribuição sis-têmica) de uma mistura de siRNA (uma mistura equimolar de siVEGFA, si-VEGFR1 e siVEGFR2) com veículo polimérico nos dias 1 e 3 após a infec-ção com o vírus. Conforme mostrado na Fig. 4, a angiogênese e a gravidadede HSK foi significativamente reduzida em camundongos tratados com siR-NA direcionado a genes da via VEGF local ou sistemicamente, em compara-ção com animais tratados com o controle siLuc (p < 0,05). Embora 80% dosolhos tratados com o controle siLuc desenvolvessem lesões clinicamenteevidentes (contagem de 2 ou mais no dia 10 p.i.), apenas 42% (distribuiçãolocal) ou 50% (distribuição sistêmica) dos olhos tratados com siRNA direcio-nado a genes da via VEGF desenvolveram essas lesões. Além disso, no dia10 p.i., a contagem de angiogênese era maior do que 6 em 9 dos 12 olhosde controle, mas apenas em 5 dos 12 olhos de camundongos tratados comsiRNA contra genes da via VEGF por distribuição local ou sistêmica. Toma-dos juntos, esses resultados mostram que a administração de siRNA contragenes da via VEGF reduziram o desenvolvimento de HSK mediante inibiçãoda angiogênese.

Exemplo 8. Coquetel de siRNA direcionado a genes de VEGF. VEGFR1 eVEGFR2 é um agente antiangioqênese muito potente no modelo de neovas-cularizacão ocular ROP

A neovascularização no olho está associada a vários distúrbios,freqüentemente causando perda grave de visão e, por fim, cegueira. Entreesses distúrbios, são prevalentes a retinopatia diabética (DR), degeneraçãomacular relacionada à idade (AMD), oclusão da veia retineana (RVO) e reti-nopatia de prematuridade (ROP). O desequilíbrio entre fatores estimuladorese fatores inibitórios resulta na NV (NV), e o fator de crescimento endotelialvascular (VEGF) é o fator mais importante dos fatores estimuladores quecausam permeabilidade vascular, dilatação e migração e proliferação de cé-lulas endoteliais

A interferência de RNA (RNAi) é o processo de silencionamentode gene pós-transcricional específico para seqüência em uma ampla faixade organismos, iniciada por RNA e filamento duplo (dsRNA) que seja de se-qüência homóloga ao gene alvo. Neste exemplo, oligonucleotídeos de dsR-NA de pequena interferência (siRNA) direcionados à via VEGF foram usadospara inibir a NV induzida por retinopatia induzida por oxigênio.

Materiais e Métodos

Projeto e Síntese de siRNA

siRNA foi gentilmente fornecido pela Intradigm Corporation. Trêsfatores da via mVEGF, mVEGF A e dois receptores de mVEGF (mVEGFRIe mVEGFR2) foram o alvo de RNAi e chamados de siMix. O siRNA direcio-nado a luciferase foi chamado de siLuc como controle.

Modelo em camundongo da neovascularização retineana induzida por oxi-gênio

O modelo usado (Smith et al.[2]) imita a retinopatia de prematuri-dade. No dia sete pós-natal (P7), os camundongos e sua mãe amamentado-ra foram colocados em um incubador estanque ao ar (produção própria) ven-tilado por uma mistura de oxigênio e ar a uma porção de oxigênio final de 75± 2%. Os níveis de oxigênio foram verificados pelo menos 3 vezes por dia.Em P12, os camundongos foram devolvidos ao ar ambiente. Em P17, osanimais foram sacrificados.

Camundongos

Os camundongos C57B/6 foram adquiridos no centro de animaisexperimentais da escola médica Guangzhou e na Universidade Guangzhoude medicina chinesa tradicional. Todas as investigações seguiram as diretri-zes do Comitê Sobre Cuidados com Recursos de Animais Laboratoriais,Comissão de Ciências da Vida, Conselho Nacional de Pesquisa.Distribuição In Vivo de siRNA

Para distribuição local, siMix (4 u.g/2 ul por olho) foi distribuídopor via subconjuntival ou intravítrea no olho esquerdo, e siLuc (4 jig/2 juL porolho) no olho direito por uma seringa Hamilton calibre 32 (Hamilton Co., Re-vo, NV) em P12 e P13 sob anestesia profunda. Para administração sistêmi-ca, siRNA (15 u,g/50 jllL por camundongo) foi misturado com a preparação deconjugado de polímero RGD-PEG-PEI (TargeTran) e distribuído por via in-traperitoneal em P12 e P13.

Anqioqrafia retineana[4]

Em P17, os animais foram sacrificados por perfusão cardíacacom uma solução de 50 mg/mL de dextrano marcado com fluoresceína emcloreto de sódio conforme anteriormente descrito. Ambos os olhos foramenucleados e fixados durante 0,5-1 h em formaldeído tamponado a 10% àtemperatura ambiente. O segmento anterior foi cortado, e a retina neurosen-sorial foi cuidadosamente removida. A retina foi cortada radialmente e mon-tada plana em glicerina, com os fotorreceptores voltados para baixo. Colo-cou-se uma lamínula sore a retina, que foi lacrada com esmalte de unhas.Montagens de retina total foram examinadas por microscopia de fluorescên-cia. As áreas de NV retineana foram medidas por soft Image-Pro Plus (Me-dia Cybernetics, EUA).

Criossecão[5]

Os olhos foram removidos e congelados em composto de incrus-tação a temperatura de corte ótima (Miles Diagnostics). As seções congela-das oculares (10 |j.m) foram histoquimicamente tingidas com GSA biotinilada.As lâminas foram incubadas em metanol/H202 durante 10 min a 4°C, lava-das com solução salina tamponada com Tris a 0,05 M (TBS), pH 7,6, e incu-badas durantes 30 min em 10% de soro bovino normal. As lâminas foramincubadas 1 h a 37°C com GSA biotinilada e, depois de enxaguar com TBSa 0,05 M, foram incubadas com avidina acoplada a fosfatase alcalina (VectorLaboratories) durante 45 min à temperatura ambiente. Depois de serem la-vadas durante 10 min com TBS a 0,05 M, as lâminas foram incubadas comdiaminobenzidina para fornecer um produto de reação marrom e foram con-tratingidas com eosina, montadas com Cytoseal. Para realizar avaliaçõesquantitativas, seções seriadas de 10 |i.m foram cortadas através do olho in-teiro e, partindo-se da 1- seção que continha íris e estendendo-se até a últi-ma seção no outro lado do olho que continha íris, cada décima seção foi tin-gida com GSA, e um total de 15 seções foram tingidas. As seções tingidascom GSA foram examinadas com um microscópio, e as imagens foram digi-talizadas usando-se uma câmera de vídeo em cores digital. O software Ima-ge-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) foi usado para de-linear células tingidas com GSA sobre a superfície da retina, e sua área foimedida. Para injeção local, as medições totais de cada olho foram usadascomo um único valor experimental. Para injeção sistêmica, a média de am-bos os olhos foi usada como um único valor experimental.

RT-PCR

Em P14 e P17, os camundongos foram sacrificados, e o RNAtotal foi extraído das retinas com reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). O RNAtotal foi quantificado a uma razão de 260 a 280 nm, e 2 p.g de RNA foramconvertidos em cDNA mediante um kit de síntese de cDNA (Fermentas, EU-A). cDNAs gerados por RT codificando VEGF, VEGFR1, VEGFR2 e b-actina(agindo como um controle de integridade de RNA e como um padrão interno)foram amplificados com RT-PCR. A amplificação de 1,5 u,L de cDNA foi rea-lizada com 1 jxL de sentido e anti-sentido e 2,5 U de Taq polimerase. As se-qüências de iniciador de oligonucleotídeos foram: mVEGF (430 pb): "for-ward" 5' - GAT GTC TAC CAG CGA AGC TAC TGC CGT CCG - 3'; "rever-se" 5' - GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA CAA GCT GCCTGC CCT TG - 3'; mVEGFRI (404 pb): "forward" 5' - GTC AGC TGC TGGGAC ACC GCG GTC TTG CCT - 3'; reversa 5' - GAA CAT CGA TGA CAAGCT TAG GTA TCG ATA TAG ATT GAA GAT TCC GC - 3'; mVEGFR2 (485pb): "forward" 5' - TGG CTG GTC AAA CAG CTC ATC - 3'; reversa 5' -CTC ATC CAA GGG CAA TTC ATC - 3'; p-actina (232 pb): "forward" 5' -CAT TGT GAT GGA CTC CGG AGA CGG - 3'; reversa 5' - CAT CTC CTGCTG AAG TCT AG A GC - 3'.ELISA para VEGR e VEGF1, VEGFR2

Em P14 e P17, os camundongos foram sacrificados, e as retinasforam extraídas rapidamente em gelo. As amostras foram homogeneizadasem um tampão de lise celular (Kit de lise de células de mamíferos, Departa-mento de Biotecnologia, Bio Basid Inc., Canadá) e foram subseqüentementecentrifugadas a 12.000 rpm durante 30 min. Os sobrenadantes foram anali-sados quanto às concentrações de proteína mediante o kit de análise quanti-tativa de proteínas BCA (Shenery Biocolor Bioscience & Technology Com-pany, China). As amostras foram diluídas a uma concentração final de 1mg/mL. Os nvieis de VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 foram determinados u-sando-se kits de imunoensaios de VEGF, sVEGFRI e SVEGFR2 murinosQuantikine M, respectivamente (R&D Systems Inc., Mineápolis, MN). Seis a12 amostras de tecido foram analisadas para cada grupo e cada momento.

Resultados e Discussão

Avaliação angiográfica de fluoresceína do efeito de siRNA sobreNV retineana

As retinas de camundongos normais em P17 tinham tanto ascamadas vasculares superficiais, quanto profundas (unidas por vasos deconexão) que se estendiam do nervo óptico até a periferia. As retinas decamundongos de controle em P17 expostas a hiperóxia continha muitos tu-fos neovasculares (alta fluoresceína) estendendo-se da superfície da retinana junção entre a retina perfundida e não perfundida. Depois da injeção sub-conjuntival de siLuc ou siMix, as retinhas também tinham muita NV, e as á-reas não tinham nenhuma diferença óbvia. Todavia, as áreas de NV após ainjeção intravítrea e intraperitoneal de siMix eram significativamente menoresque no controle.

Avaliação dos efeitos de siRNA por quantificação histológica da NV retinea-na -

A NV retineana também foi avaliada histologicamente por medi-ção das células positivas para GSA (neovascularização) anteriores à mem-brana limitativa interna (ILM). As retinas de camundongos normóxicos emP17 tinham vasos superficiais, médios e profundos e não continham célulasendoteliais anteriores à ILM. As retinas de camundongos em P17 submeti-dos a hiperóxia continham múltiplos tufos neovasculares na superfície, comalguns estendendo-se para dentro do vítreo. As retinas de camundongostratados com injeção subconjuntival de siLuc ou siMix não tinham nenhumadiferença nas áreas de NV. As áreas de NV após a injeção intravítrea e in-traperitoneal de siMix estavam obviamente reduzidas em comparação com ainjeção de siLuc.Nível diminuído de mRNA de VEGF, VEGFR1. VEGFR2 após injeção intraví-trea e intraperitoneal de siRNA

Para se determinar se o tratamento de siRNA contra os genesda via VEGF reduz os níveis de mRNA de VEGF, VEGFR1, VEGFR2, asretinas foram coletadas em P14 e P17 após a injeção intravítrea e intraperi-toneal de siRNA. Os níveis de mRNA foram medidos por RT-PCR. A expres-são de mRNA de VEGF, VEGFR1, VEGFR2 estava reduzido nas retinastratadas com siMix contra os genes da via VEGF, em comparação com asretinas de controle tratadas com siLuc (p < 0,05).

Expressão diminuída de níveis de proteínas VEGF, VEGFR1, VEGFR2 apósa aplicação intravítrea e intraperitoneal de siRNA

Para avaliar se o tratamento de siRNA direcionado aos genes davia VEGF diminui a produção de proteínas VEGF, VEGFR1, VEGFR2, usou-se ELISA para medir as proteínas VEGF, VEGFR1, VEGFR2 em retinas tra-tadas com siRNA em P14 e P17. Conforme mostrado nas tabelas 1 e 2, osníveis de proteínas VEGF, VEGFR1, VEGFR2 eram menores naquelas quereceberam siMix, em comparação com controles que receberam siLuc.

O desequilíbrio na demanda e suprimento de oxigênio e nutrien-tes é o fator iniciador da neovascularização que induz a regulação positivade VEGF. VEGF é não apenas o potente fator mitogênico para células endo-tefiais, ele também induz permeabilidade e dilatação vascular. Essas ativida-des biológicas são mediadas por se levar o VEGF a receptores de tirosinaquinase autofosforilante transmembrana de alta afinidade'51. Três receptoresde VEGF distintos foram identificados, a saber, VEGFR1 (tirosina quinase-1do tipo fms ou FIM), VEGFR2 (receptor contendo domínio de enxerto dequinase ou KDR) e VEGFR3 (tirosina quinase-4 do tipo fms ou Flt-4). VEG-FR1 e VEGFR2 são predominentemente expressados no endotélio vascular,VEGFR3 no linfático'61. Níveis intravítreos e intra-retineanos aumentados deVEGF estão associados a neovascularização retineana não apenas em mo-delos animais, mas também em pacientes com retinopatia isquêmica. Essesdados sugerem que a sinalização com VEGF é um bom alvo para o trata-mento da neovascularização retineana151.A retinopatia induzida por oxigênio em camundongos é ampla-mente reconhecida no mundo. Eric AP et al.[7] relataram que os níveis demRNA de VEGF aumentaram dramaticamente entre 6 e 12 h após a hipóxia,e que permaneceram elevados durante vários dias e, então, diminuíram paraa linha basal com regressão da retinopatia. Assim, distribuiu-se siRNA emP12 e P13 para interferir com a síntese de VEGF antes da regulação positi-va. Os resultados da montagem inteira e das criosseções provaram que asáreas de NV de retinas tratadas com injeção intravítrea ou intraperitoneal desiMix eram menores que as de injeção de siLuc. Isto é, siMix pode obvia-mente inibir a NV retineana. Para explorar o mecanismo, as expressões reti-neanas de VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 em P14 e P17 foram exploradas, eos níveis de mRNA e de proteínas eram menores que nos controles de si-Luc. Isso sugeriu que é mediante inibição dos genes da via VEGF que siMixinibe a NV retineana.

Entretanto, não há nenhuma diferença distinta após a injeçãosubconjuntival, portanto, concluiu-se que não tinha atingido a concentraçãoeficaz no local. Depois da injeção intravítrea, havia uma alta concentraçãode siRNA no vítreo, e o siRNA foi transfectado nas células endoteliais neo-vasculares retineanas. Porém, essa injeção pode resultar em hemorragiaintraocular e endoftalmite e outros. A injeção intraperitoneal é relativamentesegura, e o siRNA pode ser absorvido no sangue através dos abundantescapilares celíacos. Porém, siRNA é facilmente aprisionado em órgãos nãoespecíficos, incluindo fígado, pulmões e baço. Assim, é muito importantecomo aumentar a eficiência de transfecção de siRNA. O veículo TargeTran écomposto por polietileno imina (PEI), polietileno glicol (PEG) e seqüênciaspeptídicas de arginina-glicina-aspartato (RGD). PEI se liga a cargas negati-vas em fosfatos do siRNA. O motivo RGD foi identificado como um ligante deintegrina de células endoteliais ativadas. Células endoteliais expressam inú-meras integrinas diferentes, e as integrinas avp3 e oc5p1 se mostraram im-portantes durante a angiogênese. Ambas as integrinas são receptores paraproteínas de matriz com uma porção tripeptídica RDG exposta e são maisproeminentes em células endoteliais ativadas durante a angiogênese. Assim,a aplicação de Targetran pode melhorar a eficiência de transfecção de siR-NA. Kim B. et al.[8] relataram que a injeção subconjuntival e intravenosa desiMix pode inibir a neovascularização córnea induzida por CPG em camun-dongos. Também pode se aplicar a outras doenças neovasculares.

Exemplo 9. siRNA em nanopartícula direcionado por liqante pode se distribu-especificamente em tumor com administração sistêmica

Essa nanopartícula de siRNA automontada demonstrou a pro-priedade de direcionamento à neovascularização, quando são administradassistemicamente através de injeção IV. A capacidade de direcionamento es-pecífico a tumor desse sistema de siRNA e nanopartícula foi revelado comum sistema de gene repórter de luciferase.

Exemplo 10. siRNA em nanopartícula direcionado por ligante é um potenteagente antitumoral validado no modelo sinqênico de camundongo (neurogli-oblastoma)

A distribuição direcionada a tumor de siRNA usando o sistemade nanopartículas direcionadas por administração iv é demonstrada usando-se siRNA fluorescentemente marcado acondicionado em nanopartículas deRGD-PEG-PEI.

Modelo de tumor em camundongo

Camundongos sem pêlo fêmeos (6-8 semanas de idade) foramobtidos na Taconic (Germantown, NY), mantidos em gaiolas com topo defiltro com ração padrão para roedores e água disponível à vontade e um ci-clo de claro/escuro de 12 h. Os experimentos foram realizados de acordocom os regulamentos nacionais e aprovados pelo comitê local de ética emexperimentos com animais. Tumores N2A subcutâneos foram induzidos porinoculação de 1 x 106 células N2A no flanco dos camundongos. A um volu-me de tumor de aproximadamente 0,5 - 1 cm3, os camundongos receberamnanoplexos ou siRNA livre por injeção i.v. de uma solução de 0,2 ml_ pelaveia caudal. 40 u£) de siRNA marcados fluorescentemente foram injetadosna forma livre ou como uma nanopartícula de PEI ou RGD-PEG-PEI. Uma hapós a injeção, os tecidos foram dissecados e examinados com um micros-cópio de dissecção equipado para fluorescência. O exame microscópico dostecidos foi realizado em um microscópio de fluorescência Olympus SZX12equipado com uma câmera digital e conectado a um PC operando o softwa-re de câmera MagnaFier 2.0 (Optronics, Goleta, CA). As fotografias foramtiradas a tempos de exposição iguais para cada tecido.Resultado:

A injeção intravenosa pela veia caudal de siRNA marcado fluo-rescentemente livre não mostrou nenhum acúmulo significativo nos pulmões,fígado ou tecido tumoral. siRNA distribuído com a nanopartícula de PEI mos-trou o maior acúmulo no tecido pulmonar, seguido pelo fígado e tumor. siR-NA distribuído com a nanopartícula de RGD-PEG-PEI mostrou o nível maiselevado de acúmulo no tecido tumoral. Houve uma redução considerável noacúmulo pulmonar em comparação com as nanopartículas de PEI e muitopouco acúmulo no fígado. Esse experimento demonstra a distribuição dire-cionada a tumor de siRNA usando a nanopartícula de RGD-PEG-PEI.

A inibição mediada por RNAi da angiogênese tumoral e do cres-cimento tumoral foram estudadas usando-se formulação de nanopartículasdirecionadas a tumor contendo siRNA direcionado contra VEGFR2. Camun-dongos portadores de tumores subcutaneos foram tratados por injeção intra-venosa da formulação de nanopartículas a uma dose de 40 jug de siRNA porinjeção. As injeções foram repetidas a cada terceiro dia, e o crescimento dotumor foi avaliado e comparado com animais tratados com formulações decontrole. A inibição da angiogênese foi avaliada ao término do experimento.

Modelo de tumor em camundongo

Camundongos sem pêlo fêmeos (6-8 semanas de idade) foramobtidos na Taconic (Germantown, NY), mantidos em gaiolas com topo defiltro com ração padrão para roedores e água disponível à vontade e um ci-clo de claro/escuro de 12 h. Os experimentos foram realizados de acordocom os regulamentos nacionais e aprovados pelo comitê local de ética emexperimentos com animais. Tumores N2A subcutaneos foram induzidos porinoculação de 1 x 106 células N2A no flanco dos camundongos. A um volu-me de tumor de aproximadamente 0,5 - 1 cm3, os camundongos receberamnanoplexos ou siRNA livre por injeção i.v. de uma solução de 0,2 ml_ pelaveia caudal. As formulações de nanopartículas contendo siRNA foram prepa-radas por misturação simples de soluções de siRNA com solução de políme-ro a uma dada razão de N/P.

Para os estudos de inibição do crescimento tumoral, o experi-mento foi iniciado quando os tumores se tornaram palpáveis, 7 dias após ainoculação das células tumorais. O tratamento consitiu em 40 jig de siRNApor camundongo em RPP-nanoplexos a cada 3 dias por via intravenosa naveia caudal. O crescimento tumoral foi medido a intervalos regulares usan-do-se um calibre digital por um observador cego quanto à alocação de tra-tamento. Cada medição consistiu no diâmetro do tumor em duas direçõesaproximadamente 90 graus entre si. O volume do tumor foi calculado como0,52 x o diâmetro mais longo x o diâmetro mais curto2. Ao término do expe-rimento, os animais foram sacrificados, e o tecido tumoral e pele adjacenteforam excisados e colocados em uma lâmina de microscópio. O exame dotecido quanto à vascularização e angiogênese foi realizado por microscopiausando-se o microscópio Olympus e o equipamento de câmera descrito aci-ma para medições de tecido fluorescente. O tecido foi transiluminado parase visualizarem vasos sangüíneos na pele, e se tirou uma imagem digital,que foi armazenada conforme descrito acima. O tecido foi rapidamente con-gelado imediatamente depois disso para Western Blotting.

Resultado:

Observou-se uma inibição significativa do crescimento tumoralpara animais tratados com formulações de nanopartículas contendo VEG-FR2 siRNA. Animais tratados com siRNA não específico não mostraram ne-nhuma inibição substancial do crescimento tumoral, em comparação com osanimais não tratados. Uma inibição significativa do crescimento de vasossangüíneos foi observada em torno do tecido tumoral, indicando a inibiçãoda angiogênese nos camundongos tratados com VEGFR2-siRNA. Camun-dongos tratados com siRNA de controle mostraram crescimento de vasossangüíneos similar ao de animais não tratados. A análise de Western Blot dolisado de tumor coletado de animais de diferentes grupos de tratamentomostrou uma redução substancial de VEGFR2 em animais tratados comVEGFR2-siRNA, ao passo que não se observou nenhuma redução no VEG-FR2 em animais tratados com siRNA de controle. Esses experimentos de-monstram claramente a distribuição de siRNA no tecido tumoral pela admi-nistração intravenosa. A eficácia de VEGFR2 siRNA acondicionado na na-nopartícula de RGD-PEG-PEI para inibir o crescimento tumoral no modelode carcinoma de células renais foi estudada usando-se um modelo de tumorde xenoenxerto 786-0. Usou-se um procedimento experimental similar aoexemplo 7 neste estudo. Resumidamente, camundongos sem pêlo fêmea (6- 8 semanas de idade) foram obtidos na Taconic (Germantown, NY). Tumo-res 786-0 subcutâneos foram induzidos por inoculação de 5 x 106 células786-0 no flanco do camundongo. Quando o volume do tumor atingiu apro-ximadamente 100 mm3, o tratamento foi iniciado por injeção i.v. de uma so-lução de VEGFR2-siRNA em nanopartículas de RGD-PEG-PEI pela veiacaudal. Os grupos de tratamento de controle receberam nanopartículas con-tendo siRNA não específico ou salina. O tratamento foi repetido durante vá-rios dias com injeções a cada três dias. O volume do tumor foi medido umavez a cada três dias, conforme descrito no exmeplo 7. Resultado: Observou-se uma inibição significativa do crescimento tumoral para animais tratadoscom formulação de nanopartículas com VEGFR2-siRNA. Não se observounenhuma inibição significativa do crescimento tumoral para animais tratadoscom nanopartículas com siRNA de ocntrole. Esse experimento demonstraque VEGFR2 siRNA distribuído por formulação de nanopartículas direciona-das a tumor pode conseguir uma inibição do crescimento tumoral.

As nanopartículas com siRNA direcionadas a ligante foram sis-temicamente administradas em um modelo de camundongo C57 com inocu-lação subcutânea de células de glioblastoma N2A para avaliação do impactodo derrubamento de VEGF sobre a atividade de angiogênese do tumor. Ca-mundongos sem pêlo fêmea (6-8 semanas de idade) foram obtidos na Ta-conic (Germantown, NY), mantidos em gaiolas com topo de filtro com raçãopadrão para roedores e água disponível à vontade e um ciclo de cla-ro/escuro de 12 h. Os experimentos foram realizados de acordo com os re-gulamentos nacionais e aprovados pelo comitê local de ética em experimen-tos com animais. Tumores N2A subcutâneos foram induzidos por inoculaçãode 1 x 106 células N2A no flanco dos camundongos. A um volume de tumorde aproximadamente 0,5 - 1 cm3, os camundongos receberam nanoplexosou siRNA livre por injeção i.v. de uma solução de 0,2 mL pela veia caudal.As soluções de nanoplexos foram preparadas como acima, a uma razão deN/P de 2. Para experimentos de distribuição de tecido, 40 mg de siRNA fluo-rescentemente marcado foram injetados na forma livre ou como P- ou RPP-nanoplexos. Uma hora após a injeção, os tecidos foram dissecados e exa-minados com um microscópio de dissecção equipado para fluorescência. Oexame microscópico de tecidos foi realizado com um microscópio de fluores-cência Olympus SZX12 equipado com câmera digital e conectado a um PCoperando o software de câmera MagnaFier 2.0 (Optronics, Goleta, CA). Asfotografias foram tiradas a tempos de exposição iguais para cada tecido.

Nos experimentos de co-distribuição, plasmídio e siRNA forammisturados a uma razão molar de 1:100, respectivamente (40 mg de pLuccom 13 mg de siRNA) e, nos experimentos de distribuição seqüencial, 40 mgde plasmídio foram distribuídos primeiro, seguidos por 40 mg de siRNA 2 hdepois (razão molar de 1:300). Os tecidos foram dissecados, pesados e co-locados em tampão de lise repórter gelado (Promega) em tubos de 2 mLcontendo glóbulos magnéticos (Q-Biogene, Carlsbad, CA), 24 h após a inje-ção dos nanoplexos. Os tecidos foram homogeneizados com um homoge-neizador magnético Fastprep FP120 (Q-Biogene), e as amostras foram en-saiadas quanto à atividade da enzima repórter usando o sistema de ensaiode luciferase (Promega) em um luminômetro Monolight 2010 (Analytical Lu-minescence Laboratory). Nos estudos de inibição do crescimento tumoral, oexperimento foi iniciado quando os tumores se tornaram palpáveis, 7 diasapós a inoculação das células tumorais. O tratamento consitiu em 40 mg desiRNA por camundongo em RPP-nanoplexos a cada 3 dias por via intrave-nosa na veia caudal. O crescimento tumoral foi medido a intervalos regularesusando-se um calibre digital por um observador cego quanto à alocação detratamento. Cada medição consistiu no diâmetro do tumor em duas direçõesaproximadamente 90 graus entre si. O volume do tumor foi calculado como0,52 x o diâmetro mais longo x o diâmetro mais curto2.

Ao término do experimento, os animais foram sacrificados, e otecido tumoral e pele adjacente foram excisados e colocados em uma lâminade microscópio. O exame do tecido quanto à vascularização é angiogênesefoi realizado por microscopia usando-se o microscópio Olympus e o equipa-mento de câmera descrito acima para medições de tecido fluorescente. Otecido foi transiluminado para se visualizarem vasos sangüíneos na pele, ese tirou uma imagem digital, que foi armazenada conforme descrito acima. Otecido foi rapidamente congelado imediatamente depois disso para WesternBlotting.

Inibição do crescimento tumoral por siRNA RPP-nanoplexos. Oscamundongos foram inoculados com células tumorais N2A e deixados nãotratados ou tratados a cada 3 dias por injejção na veia caudal de RPP-nanoplexos com siLacZ ou siVEGF R2 a uma dose de 40 mg por camun-dongo. O tratamento foi iniciado no momento em que os tumores se torna-ram palpáveis (20 mm3). Apenas siRNA específico para a seqüência deVEGF R2 inibiu o crescimento tumoral, ao passo que o tratamento com LacZsiRNA não afetou a taxa de crescimento tumoral, em comparação com oscontroles não tratados (n = 5).

Exemplo 11. siRNA em nanopartícula direcionado a liqante é um agente anti-tumoral potente, validado em modelo de tumor de xenoenxerto (carcinomarenal)

As nanopartículas com siRNA direcionadas a ligante tambémforam testadas em um modelo de xenoenxerto em camundongo com linha-gens celulares de carcinoma renal. As nanopartículas com siRNA foram fa-bricadas com os mesmos materiais e o mesmo procedimento, usando amesma via de distribuição que o Exemplo 10. Cinco vezes de distribuiçõesrepetidas com três dias de intervalo usando 2 mg/kg de dosagem foram rea-lizados com seis animais por grupo. Observou-se uma inibição significativado crescimento tumoral.

Exemplo 12. siRNA em nanopartícula direcionado a liqante é um agente anti-tumoral potente, validado em modelo de tumor de xenoenxerto (carcinomacolorretal)

Usando-se nanopartículas com siRNA direcionadas ao gene deVEGFR2, também testou-se a eficácia antitumoral no modelo de xenoenxer-to em camundongo com uma linhagem celular de carcinoma colorretal humao, DLD-1.

Materiais e Métodos. Reagentes: Avastin, anticorpo monoclonalcontra VEGF (25 mg/mL, Genetech); siRNA contra seqüência de VEGFR2(Apêndice 1); siRNA contra luciferase (Qiagen); Avertin, composto por 1,5gramas de 2,2,2-tribromoetanol e 1,5 mL de álcool t-amílico (Cat. n- T4840-2, Cat. nQ 24048-6, Aldrich) em 100 mL de água destilada, St. Louis, MO).Camundongos: camundongos sem pêlo fêmea atímicos, de 5 a 6 semanasde idade, foram comprados na TACONIC e alojados convencionalmente.Todas as investigações seguiram as diretrizes do Comitê Sobre Cuidadoscom Recursos de Animais Laboratoriais, Comissão de Ciências da Vida,Conselho Nacional de Pesquisa. As instalações para animais do Instituto dePesquisa Biomédica em Rockville Maryland são completamente autorizadaspela Associação Americana de Cuidados com Animais Laboratoriais. Célu-las: uma linhagem celular de carcinoma de cólon, DLD-1 (CCL-221, ATCC)foi cultivada em meio RPMI 1640 com 2 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bi-carbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, 10 mM de HEPES e 1,0 mM de piru-vato de sódio, 10% de soro bovino fetal.

Reagentes

Avastin, anticorpo monoclonal contra VEGF (25 mg/mL, Genete-ch); siRNA contra seqüência de VEGFR2 (Apêndice 1); siRNA contra lucife-rase (Qiagen); Avertin, composto por 1,5 grama de 2,2,2-tribromoetanol e1,5 mL de álcool t-amílico (Cat. nQ T4840-2, Cat. n9 24048-6, Aldrich) em 100mL de água destilada, St. Louis, MO). Camundongos: camundongos sempêlo fêmeos atímicos, de 5 a 6 semanas de idade, foram comprados na TA-CONIC e alojados convencionalmente. Todas as investigações seguiram asdiretrizes do Comitê Sobre Cuidados com Recursos de Animais Laboratori-ais, Comissão de Ciências da Vida, Conselho Nacional de Pesquisa. As ins-talações para animais do Instituto de Pesquisa Biomédica em Rockville Mar-yland são completamente autorizadas pela Associação Americana de Cui-dados com Animais Laboratoriais. Células: uma linhagem celular de carci-noma de cólon, DLD-1 (CCL-221, ATCC) foi cultivada em meio RPMI 1640com 2 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glico-se, 10 mM de HEPES e 1,0 mM de piruvato de sódio, 10% de soro bovinofetal. Procedimento: 1) Células DLD-1 próximas à confluência foram colhidase ressuspendidas em meio RPMI livre de soro. 2) Os camundongos foramanestesiados com Avertin, 0,4 mL/camundongo i.p. 3) 100 milhões de célu-las em 0,1 mL de meio RPMI livre de soro foram injetados nas costas doscamundongos s.c. no lado esquerdo, para estabelecimento de um modelo detumor de xenoenxerto. 4) 5 dias após a inoculação das células tumorais, ostamanhos dos tumores em crescimento foram medidos com um calibre. Oscamundongos foram, então, aleatoriamente agrupados com 7 camundongospor grupo. Três regimes de dosagem diferentes foram aplicados: 1 mg/kg, 2mg/kg e 4 mg/kg, respectivamente. Embora a alta dose de 4 mg/kg apresen-tasse a atividade antitumoral mais forte, não há nenhuma diferença significa-tiva na quantidade entre os três grupos de tratamento. Usando-se uma com-paração diferente, descobriu-se que a alta dose de nanopartícula com siRNAde 4 mg/kg exibiu uma eficácia antitumoral mais forte do que o tratamentocom 5 mg/kg de Avastin.

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70. Smith LE, Wesolowski E, Mclellan A, et al. Oxygen-inducedretinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sei, 1994, 35: 101-11.Tabela B1-1

Seqüências de siRNA específicas para VEGF humano (25 pares de basescom extremidades rombas):

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Tabela B1-3

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Tabela B1-5

Seqüências de siRNA específicas para VEGFR2 humano (25 pares de ba-ses com extremidades rombas):

<table>table see original document page 75</column></row><table>LISTAGEM PE SEQÜÊNCIA

<110> LIU, YIJIA

LU, PATRICK Y.

SCARIA, PUTHUPPARAMPIL V.

SCHIFFELERS, RAYMOND

TANG, QUINN Q.

WOODLE, MARTIN C.

XIE, FRANK Y.

XU, JUN

ZHOU, QIN

<120> COMPOSIÇÃO E MÉTODOS TERAPÊUTICOS COM RN Ai PARA

TRATAMENTO DE CÂNCER E OUTRAS DOENÇAS DE NEOVASCULA-RIZAÇÃO

<130> INTM/023 CON

<140> 11/824,084<141> 2007-06-29

<150> PCT/US06/013645<151> 2006-04-12

<150> 60/670,717<151> 2005-04-12

<160> 302

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucieotfdeo sintético

<400> 1

ccugaugaga ucgaguacau cuuca

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 2

ugaagaugua cucgaucuca ucagg

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 3

gagagaugag cuuccuacag cacaa

25<210> 4<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 4

uugugcugua ggaagcucau cucuc

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 5

cacaacaaau gugaaugcag accaa

<210> 6

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 6

uuggucugca uucacauuug uugug

<210> 7<211> 21<212> DNA

<213> seqüência artificial

<22Ó><223>

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 7

ucgagacccu gguggacaut t

<210> 8<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 8

gccaacauau ucuacagugu ucuua<210> 9<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 9

uaagaacacú guagaauaug uuggc

<210> 10

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 10

cccucgccgg aaguuguaug guuaa

<210> 11<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 11

uuaaccauac aacuuccggc gaggg

<210> 12<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

<220>

<223> -Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 12

ggagaggacc ugaaacugut t

<210> 13<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 13ccucuucugu aagacacuca caauu

<210> 14<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 34

aauugugagu gucuuacaga agagg

<210> 15

<211> 25

<212> RNA

<2I3> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 15

cccuugaguc caaucacaca auuaa

<210> 16<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 16

uuaauugugu gauuggacuc aaggg

<210> 17<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético<400> 17

ccaagugauu gaagcagaug ccuuu

<210> 18<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 18

aaaggcaucu gcuucaauca cuugg<210> 19<211> 21<212> DNA

<213> Descrição da combinação das moléculas de DNA/RNA oligonucleotídeo sintético<220>

<223> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 19

caguaagcga aagagccggt t

<210> 20

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 20

ccucaagagc aaacgugacu uauuu

<210> 21

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<22Q>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 21

aaauaaguca cguuugcucu ugagg

<210> 22

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 22

caagauccgc agacguguaa auguu

<210> 23<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 23

aacauuuaca cgucugcgga ucuug<210> 24<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 24

gcagcuugag uuaaacgáac guacu

<210> 25<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 25

aguacguucg uuuaacucaa gcugc

<210> 26<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 26

cagcuugagu uaaacgaacg uacuu

<210> 27

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 27

aaguacguuc guuuaacuca agcug

<210> 28<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 28

ccaugccaag uggucccagg cggca

<210> 29<211> 25<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 29

tgcagcctgg gaccacttgg catgg

<210> 30

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 30

cacauaggag agaugagcuu ccuca

<210> 31<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 31

ugaggaagcu caucucuccu augug

<210> 32

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 32

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 33<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 33

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 34<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 34

cucaugucug uucucaagau ccuca

<210> 35<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 35

ugaggaucuu gagaacagac augag

<210> 36<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Qescrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 36

cucaugguga uuguggaauu cugca

<210> 37

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 37

ugcagaauuc cacaaucacc augag

<210> 38<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 38

gagcauggaa gaggauucug gacuc

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição da combinação de moléculas de DNA/RNA: oligonucleotídeo sintético<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 39

gaguccagaa ucctcuucca ugctc

<210> 40

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 40

cagaacagua agcgaaagag ccggc

<210> 41<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 41

gccggcucuu ucgcuuacug uucüg

<210> 42<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 42

gacuuccuga ccuuggagca ucuca

<210> 43<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 43

ugagaugcuc caaggucagg aaguc

<210> 44<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 44

ccugaccuug gagcaucuca ucugu

<210> 45

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 45

acagaugaga ugcuccaagg ucagg

<210> 46<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético<400> 46

gcuaagggca uggaguucuu ggcau

<210> 47

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 47

augccaagaa cuccaugccc uuagc

<210> 48

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 48

cacgcuguuu auugaaagag ucaca

<210> 49

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 49ugugacucuu ucaauaaaca gcgug

<210> 50<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 50

cgcuguuuau ugaaagaguc acaga

<210> 51

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 51

ucugugacuc uuucaauaaa cagcg

<210> 52<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 52

caaggagggc cucugauggu gaugu

<210> 53

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 53

acaucaccau cagaggcccu ccuug

<210> 54<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 54

ccaacuaccu caagagcaaa cguga<210> 55<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 55

ucacguuugc ucuugaggua guugg

<210> 56

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 56

cuaccucaag agcaaacgug acuua

<210> 57

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 57

uaagucacgu uugcucuuga gguag

<210> 58

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 58

ccagaaagug cauucaucgg gaccu

<210> 59

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 59

aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 60<211> 25<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 60

cauucaucgg gaccuggcag cgaga

<210> 61<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 61

ucucgcugcc aggucccgau gaaug

<210> 62

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 62

caucgggacc uggcagcgag aaaca

<210> 63<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 63

uguuucucgc ugccaggucc cgaug

<2Í0> 64<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 64

gagccuggaa agaaucaaaa ccuuu

<210> 65<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 65

aaagguuuug auucuuucca ggcuc

<210> 66

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 66

gccuggaaag aaucaaaacc uuuga

<210> 67

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 67

ucaaagguuu ugauucuuuc caggc

<210> 68<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 68

gccuggaaag aaucaaaacc uuuga

<210> 69

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 69

ucaaagguuu ugauucuuuc caggc

<210> 70<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 70

cugaacugag uuuaaaaggc accca

<210> 71<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 71

ugggugccuu uuaaacugag uucag

<210> 72

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 72

gaacugaguu uaaaaggcac ccagc

<210> 73

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 73

gcugggugcc uuuuaaacuc aguug

<210> 74

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 74

gaagauaaug acucaccugg ggcca

<210> 75

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 75

uggccccagg ugagucauua ucuuc<210> 76<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 76

gauaaugacu caccuggggc cacau

<210> 77<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Qescrjçgo de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 77

auguggcccc aggugaguca uuauc

<210> 78

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 78

cucaccuggg gccacauuug aacau

<210> 79<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 79

auguucaaau guggccccag gugag

<210> 80<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 80

cuugcuggga gccugcacca aguça

<210> 81<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 81

ugacuuggug caggcuccca gcaag

<210> 82

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 82

gauucuacuu ucuacaauaa gauca

<210> 83<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 83

ugaucuuauu guagaaagua gaauc

<210> 84<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 84

-cagagacuga gcgcugacag uggcu

<210> 85<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 85

agccacuguc ugcgcucagu cucug

<210> 86<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 86

gaccugggca agaggaacag acaca

<210> 87<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 87

ugugucuguu ccucuugccc agguc

<210> 88<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 88

ccaccuucau caagagagag gacga

<210> 89<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 89

ucguccucuc ucuugaugaa ggugg

<210> 90<211> 26<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 90

uauggauuaa gccgguccca accugu

<210> 91<211> 26<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 91 26acagguuggg accggcuuaa uccaua

<210> 92<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleottdeo sintético

<400> 92 25cugcagagac cucaaaaggu gucca

<210> 93<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 93 25uggacaccuu uugaggucuc ugcag

<210> 94

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 94 25cagagaccuc aaaagguguc cacgu

<210> 95<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 95 25acguggaeac cuuuugaggu cucug

<210> 96<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 96

guggugguga ucucagccau ccugg

25<210> 97<211> 25<212> RNA

<2l3>- seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 97

ccaggauggc ugagaucacc accac

<210> 98<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 98

gguggugauc ucagccaucc uggcc

<210> 99<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrjção de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 99

ggccaggaug gcugagauca ccacc

<210> 100

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 100

ggcaagcugg ucaagaucug ugacu

10125

RNA

Seqüência artificial

Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 101

agucacagau cuugaccagc uugcc

<210><211><212><213>

<220><223>

<210> 102<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 102

gcaagcuggu caagaucugu gacuu

<210> 103

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial, oligonucleotídeo sintético

<400> 103

aagucacaga ucuugaccag cuugc

<210> 104<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 104

ggguggcacc ccuuacccag agcug

<210> 105

<211> 25-

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 105

cagcucuggg uaaggggugc caccc

<210> 106

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 106

gcaccccuua cccagagcug cccau

<210> 107<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 107

augggcagcu cuggguaagg ggugc

<210> 108<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 108

cuuacccaga gcugcccaug aacga

<210> 109<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético<400> 109

ucguucaugg gcagcucugg guaag

<210> 110

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 110

caugccuccg acgagaucua ugaga

<210> 111

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 111

ucucauagau cucgucggag gcaug

<210> 112

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético<400> 112

gccuccgacg agaucuauga gauca

<210> 113

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 113

ugaucucaua gaucucgucg gaggc

<210> 114

<211> 25

<212> kNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 114

ccgacgagau cuaugagauc augca

<210> 115

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificiai: oligonucleotídeo sintético

<400> 115

ugcaugaucu cauagaucuc gucgg

<210> 116

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 116

gacgagaucu augagaucau gcaga

<210> 117<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 117ucugcaugau cucauagauc ucguc

<210> 118<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético<400> 118

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 119

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 119

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 120

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 120

cagcauguca agaucacaga uuuug

<210> 121

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 121

caaaaucugu gaucuugaca ugcug

<210> 122

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 122

gaucacagau uuugggcugg ccaaa<210> 123<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 123

uuuggccagc ccaaaaucug ugauc

<210> 124

<212> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 124

cagauuuugg gcug^ccaaa cugcu

<210> 125<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 125

agcaguuugg ccagcccaaa aucug

<210> 126<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 126

caaagugccu aucaagugga uggca

<210> 127<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 127

ugccauccac uugauaggca cuuug

<210> 128<211> 25<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 128

ccaucgaugu cuacaugauc auggu

<210> 129<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 129

accaugauca uguagacauc gaugg

<210> 130<211> 26<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 130

cgaugucuac augaucaugg ucaagu

<210> 131

<211> 26

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 131

acuugaccau gaucauguag acaucg

<210> 132<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 132

cuacaugauc auggucaagu gcugg

<210> 133

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220><223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 133

ccagcacuug accaugauca uguag

<210> 134<211> 26<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético<400> 134..

caugaucaug gucaagugcu ggauga

<210> 135<211> 26<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 135

ucauccagca cuugaccaug aucaug

<210> 136

,<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 136

ggaugaaaga augcauuugc caagu

<210> 137

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 137

acuuggcaaa ugcauucuuu caucc

<210> 138

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético<400> 138

gacaacccug acuaccagca ggacu

<210> 139

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oügonucleotídeo sintético

<400> 139

aguccugcug guagucaggg uuguc

<210> 140

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oügonucleotídeo sintético

<400> 140

ccuucuuaaa gaccauccag gaggu

<210> 141<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oügonucleotídeo sintético

<400> 141

accuccugga uggucuuuaa gaagg

<210> 142

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oügonucleotídeo sintético

<400> 142

caagauccgc agacguguaa auguu

<210> 143'

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oügonucleotídeo sintético

<400> 143

aacauuuaca cgucugcgga ucuug<210> 144<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial, oligonucleotídeo sintético

<400> 144

caaggagggc cucugauggu gaugu

<210> 145

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 145

acaucaccau cagaggcccu ccuug

<210> 146

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 146

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 147<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 147

auuggcccge uuaacggucc guagg

<210> 148

<211> 25

<212> RNÁ

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 148

caagauccgc agacguguaa auguu

<210> 149<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 149

aacauuuaca cgucugcgga ucuug

<210> 150<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 150

ccagaaagug gauucaucgg gaccu

<210> 151

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 151

aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 152<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 152

cucaugucug uucucaagau ccuca

<210> 153<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 153

ugaggaucuu gagaacagac augag

<210> 154

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 154

gcagcuugag uuaaacgaac guacu

<210> 155

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 155

aguacguucg uuuaacucaa gcugc

<210> 156<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 156

ccagaaagug cauucaucgg gaccu

<210> 157

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 157

aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 158

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 158

cucaugucug uucucaagau ccuca

<21"0> 159<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 159

ugaggaucuu gagaacagac augag

<210> 160<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 160

caagauccgc agacguguaa auguu

<210> 161

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 161

aacauuuaca cgucugcgga ucuug

<210> 162

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 162

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 163<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 163

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 164<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 164

cucuggaucc cagaagguga gaaag<210> 165<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 165

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 166

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 166

caagauccgc agacguguaa auguu

<210> 167

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 167

aacauuuaca cgucugcgga ucuug

<210> 168

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 168

cucaugucug uucucaagau ccuca

<210> 169

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 169

ugaggaucuu gagaacagac augag

<210> 170<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 170

caaagugccu aucaagugga uggca

<210> 171

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 171

ugccauccac uugauaggca cuuug

<210> 172

<2U> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 172

gcagcuugag uuaaacgaac guacu

<210> 173

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 173

aguacguucg uuuaacucaa gcugc

<210> 174<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 174

cucaugucug uucucaagau ccuca

<210> 175<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 175

ugaggaucuu gagaacagac augag

<210> 176<211> 26<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 176

caugaucaug gucaagugcu ggauga

<210> 177

<211> 26

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 177

ucauccagca cuugaccaug aucaug

<210> 178<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 178

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 179<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 179

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 180

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 180

gaagauaaug acucaccugg ggcca

<210> 181<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 181

uggccccagg ugagucauua ucuuc

<210> 182

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 182

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 183

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 183

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 184

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 184

ccagaaagug cauucaucgg gaccu

<210> 185

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 185aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 186<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 186

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 187

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 187

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 188

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 188

gauaaugacu caccuggggc cacau

<210> 189

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 189

auguggcccc aggugaguca uuauc

<210> 190

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 190

cucuggaucc cagaagguga gaaag<210> 191<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleottdeo sintético

<400> 191

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 192

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 192

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 193

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 193

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 194

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleottdeo sintético

<400> 194

gauaaugacu caccuggggc cacau

<210> 195

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 195

auguggcccc aggugaguca uuauc

<210> 196<211> 25<212> RNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 196

ccuucuuaaa gaccauccag gaggu

<210> 197

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 197

accuccugga uggucuuuaa gaagg

<210> 198<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 198

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 199

<211> 25

<2Í2> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 199

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 200

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 200

ggcaagcugg ucaagaucug ugacu

<210> 201<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220><223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 201

agucacagau cuugaccagc uugcc

<210> 202

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 202

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 203

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 203

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 204<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 204

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 205

<211> 25

<212> RNA .

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 205

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 206

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 206

caugccuccg acgagaucua ugaga

<210> 207<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 207

ucucauagau cucgucggag gcaug

<210> 208<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 208

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 209

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 209

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 210

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 210

ccuacggâcc guuaagcggg ccaau

<210> 211

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 211

auuggcccgc uuaacggucc guagg<210> 212<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 212

ggcaagcugg ucaagaucug ugacu

<210> 213<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 213

agucacagau cuugaccagc uugcc

<210> 214<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 214

ccuucuuaaa gaccauccag gaggu

<210> 215<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 215

accuccugga úggucuuuaa gaagg

<210> 216<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 216

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 217<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 217

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 218

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 218

gauaaugacu caccuggggc cacau

<210> 219

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 219

auguggcccc aggugaguca uuauc

<210> 220

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 220

ggcaagcugg ucaagaucug ugacu

<210> 221

<211> 25

<212> RNÁ

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Qescrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 221

agucacagau cuugaccagc uugcc

<210> 222<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 222

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 223

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 223

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 224

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 224

ccagaaagug cauucaucgg gaccu

<210> 225

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 225

aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 226

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 226

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 227<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 227

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 228<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 228

caugccuccg acgagaucua ugaga

<210> 229<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 229

ucucãuagau cucgucggag gcaug

<210> 230

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 230

cucuggaucc cagaagguga gaaag

<210> 231<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 231

cuuucucacc uucugggauc cagag

<210> 232<211> 25.<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

t<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 232

gcagcuugag uuaaacgaac guacu<210> 233

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 233

aguacguucg uuuaacucaa gcugc

<210> 234

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 234

ccagaaagug cauucaucgg.gaccu

<210> 235

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 235

aggucccgau gaaugcacuu ucugg

<210> 236<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 236

ccuacggacc guuaagcggg ccaau

<210> 237<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 237

auuggcccgc uuaacggucc guagg

<210> 238<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 238

gauaaugacu caccuggggc cacau

<210> 239 .<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oescrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 239

auguggcccc aggugaguca uuauc

<210> 240<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 240

ggcaagcugg ucaagaucug ugacu

<210> 241<211> .25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 241

agucacagau cuugaccagc uugcc

<210> 242<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oescrição de seqüência artificial: oligonucleotfdeo sintético

<400> 242

ccuucuuaaa gaccauccag gaggu

<210> 243<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 243

accuccugga uggucuuuaa gaagg

<210> 244

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 244

gcagcuugag uuaaacgaac guacu

<210> 245<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 245

aguacguucg uuuaacucaa gcugc

<210> 246<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 246 ,

Ala Cys Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala

15 10

<210> 247 -<211> 21<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 247

aagctcagca cacagaaaga c

<210> 248<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<460> 248

aatgcggcgg tggtgacagt a

<210> 249<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 249

ggaaccgcug gagagcaacu gcaua

<210> 250<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 250

ccuuggcgac cucucguuga cguau

<210> 251<211> 21<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de molécula de DNA/RNA combinada: oligonucleotídeo sintético<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 251

ucgagacccu gguggacaut t

<210> 252<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de molécula de DNA/RNA combinada: oligonucleotídeo sintético

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 252

auguccacca gggucucgat t

<210> 253<211> 21

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<223> Descrição de molécula de DNA/RNA combinada: oligonucleotídeo sintético

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 253

gcugacccug aaguucauct t

<210> 254<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial■<220>

<223> Descrição de molécula de DNA/RNA combinada: oligonucleotídeo sintético

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 254

gaugaacuuc agggucagct t

<210> 255<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 255

ccaagugauu gaagcagaug ccuuu

<210> 256<211> 10<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 256tcaacgttga

<210> 257

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 257gctagacgtt agcgt

<210> 258

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 258

aagccgtcct gtgtgccgct g

<210> 259

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 259

aacgatgaag ccctggagtg c

<210> 260

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 260

aagttaaaag tgcctgaact g

<210> 261<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 261

aagcaggcca gactctcttt c

<210> 262<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 262

aagctcagca cacagaaaga c<210> 263<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 263

atgcggcggt ggtgacagta

<210> 264

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 264

aacagttgcg cagcctgaat g

<210> 265

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 265

aacttaatcg ccttgcagca c

<210> 266

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 266

aagctatgaa acgatatgggc

<210> 267

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotideo sintético

<400> 267

aaccgctgga gagcaactgc a

<210> 268<211> 30<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético<400> 268

gatgtctacc agcgaagcta ctgccgtccg

<210> 269<211> 47<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 269

gáacatcgat gacaagctta ggtatcgata caagctgcct cgccttg

<210> 270<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 270

gtcagctgct gggacaccgc ggtcttgcct

<210> 271<211> 47<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 271

gáacatcgat gacaagctta ggtatcgata tagattgaag attccgc

<210> 272

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 272

tggctggtca aacagctcat c

<210> 273<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 273

ctcatccaag ggcaattcat c

<210> 274<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético<400> 274

cattgtgatg gactccggag acgg

<210> 275<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 275

catctcctgc tgaagtctag age

<210> 276

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 276

ceugaugaga uegaguacau cuuca

<210> 277<211> 25<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotldeo sintético

<400> 277

gaguecaaca ucaccaugca gauua

<210> 278

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 278

aguccaacau caccaugeag auuau

<210> 279<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 279

ccaacaucac caugcagauu augcg

<210> 280

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 280

caccaugeag auuaugcgga ucaaa

<210> 281

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 281

gcacauagga gagaugageu uecua

<210> 282

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 282

gagagaugag cuuccuacag cacaa

<210> 283

<211> 25:

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 283

caaaggacuu uauacuuguc gugua<210> 284<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 284

cccucgccgg aaguuguaug guuaa

<210> 285

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 285

caucacucag cgcauggcaa uaaua

<210> 286<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 286

ccaccacuuu agacugucau gcuaa

<210> 287<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 287

cggacaaguc uaaucuggag cugau

<210> 288<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 288

ugacccacau uggccaccau cugaa

<210> 289<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 289

gagggccucu gauggugauu guuga

<210> 290

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 290

cgagcuccgg cuuucaggaa gauaa

<210> 291

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 291

caaucaaugc cauacugaca ggaaa

<210> 292<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 292

gaaaguauuu cagcuccgaa guuua

<210> 293<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 293

ccucggucau uuaugucuau guuca

<210> 294<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 294

cagaucucca uuuauugcuu cuguu

<210> 295

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 295

gaccaacaug gagucgugua cauua

<210> 296

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 296

cccuugaguc caaucacaca auuaa

<210> 297

<211> 25

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 297

ccauguucuu cuggcuacuu cuugu

<210> 298<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 298

ucauucauau uggucaccau cucaa

<210> 299<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Qescrjçgo de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético<400> 299

gaguucuugg caucgcgaaa gugua

<210> 300<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 300

cagcaggaau cagucaguau cugca

<210> 301<211> 25<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 301

cagugguaug guucuugccu cagaa

<210> 302

<211> 25

<212> RNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de seqüência artificial: oligonucleotídeo sintético

<400> 302

ccacacugag cucuccuccu guuua

Claims (37)

1. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos umagente de ácido nucléico e um veículo farmaceuticamente aceitável, em queo dito agente de ácido nucléico é capaz de induzir interferência de RNA emum sujeito e inibir a expressão de um gene que intensifique a neovasculari-zação indesejável ou inapropriada no dito sujeito.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoagente de ácido nucléico é selecionado de dsRNA ou dsDNA.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a ditacomposição compreende pelo menos dois agentes de ácido nucléico capa-zes de induzir interferência de RNA em um sujeito e inibir a expressão depelo menos dois genes que intesifiquem a neovascularização indesejável ouinapropriada no dito sujeito.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 4, em que cada gene é selecionado do grupo que consiste em genesque intensifiquem a neovascularização na via VEGF, na via EGF, na viaFGF, na via HIF, nas vias de proliferação cleular, nas vias de sobrevivênciacelular e em suas combinações.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que pelo menos um agente de ácido nucléico compreendeuma molécula de RNA de filamento duplo, em que cada filamento de RNAtem um comprimento de 25 nucleotídeos.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o dito agente de ácido nucléico é um RNAi direcionadoa um gene da via VEGF selecionado de VEGF165, VEGF Ri, VEGF R2.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, em que umafilamento de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)-3'.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, em que umfilamento de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC)-3'.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que umfilamento de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)-3'.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a ditaintereferência de RNA resulta em uma redução de mais de 75% nos níveisde proteína VEGF humana nas células transfectadas com siRNA no dito su-jeito 24 horas após o tratamento com siRNA.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a ditainterferência de RNA resulta em uma redução de mais de 60% nos níveis deproteína VEGF humana nas células transfectadas com siRNA no dito sujeito-120 horas após o tratamento com siRNA.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoagente de ácido nucléico é uma molécula de RNA de filamento duplo de ex-tremidades rombas, em que cada filamento de RNA tem um comprimento de-25 nucleotídeos, em que a dita molécula de RNA (siRNA de 25 pares de ba-ses) é capaz de inibição de alvo específico da expressão do gene VEGFR2humano em células ou tecidos de mamíferos.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que umfilamento de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3', e a outra fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)-3\

14. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que umafilamento de RNA (filamento de sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UUAAUUGUGUGAUUGGACUCAAGGG)-3'.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que umfilamento de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3', e a outra fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)-3'.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que ainterferência de RNA resulta em uma redução de mais de 75% nos níveis deproteína VEGFR2 humana nas células transfectadas com siRNA no dito su-jeito 24 horas após o tratamento com siRNA.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 12, em que adita interferência de RNA resulta em uma redução de mais de 60% nos ní-veis de proteína VEGFR2 humana nas células transfectadas com siRNA nodito sujeito 120 horas após o tratamento com siRNA.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoagente de ácido nucléico é uma molécula de RNA de filamento duplo de ex-tremidades rombas, em que cada filamento de RNA tem um comprimento de-25 nucleotídeos, em que a dita molécula de RNA (siRNA de 25 pares de ba-ses) é capaz de inibição de alvo específico da expressão do gene VEGFR1humano em células de mamíferos.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, em que umfilamento-de RNA (filamento sentido) tem a seqüência de:-5'-r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA)-3V e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC)-3'.Composição, de acordo com a reivindicação 18, em que umfilamento de RNA (filamento de sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de:-5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)-3'.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 18, em que umfilamento de RNA (filamento de sentido) tem a seqüência de:-5'-r(CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU)-3', e o outro fila-mento de RNA (filamento anti-sentido) tem a seqüência de: -5'-r(AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG)-3'.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 18 a 20, em que a interferência de RNA resulta em uma redução demais de 75% nos níveis de proteína VEGFR1 humana nas células transfec-tadas com siRNA no dito sujeito 24 horas após o tratamento com siRNA.

22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções de 18 a 20, em que a dita interferência de RNA resulta em uma redu-ção de mais de 60% nos níveis de proteína VEGFR1 humana nas célulastransfectadas com siRNA no dito sujeito 120 horas após o tratamento comsiRNA.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 2, compreen-dendo pelo menos três oligos de siRNA de 25 meros, e em que os ditos oli-gos inibem a expressão de hVEGF, hVEGFRI e hVEGFR2. _

24. Composição, de acordo com a reivindicação 2, compreen-dendo pelo menos três oligos de siRNA, e em que os ditos oligos inibem aexpressão de três selecionados do grupo que consiste em hVEGF, hEGF ehPDGF e seus receptores.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoagente de ácido nucléico é um vetor sintético direcionado.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, em que odito vetor é direcionado a neovascularização tumoral.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 25, em que odito vetor compreende um peptídio de direcionamento, um ligante PEG ati-vado homobifuncional e um agente contendo poliamina.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, em que odito peptídio de direcionamento é um peptídio RGD.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que odito vetor é um vetor automontável preparado a partir de um PEG ativadohomobifuncional, um peptídio RGD-2C, um agente contendo poliamina euma mistura de moléculas de siRNA.

30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções precedentes, compreendendo adicionalmente um agente terapêuticonão ácido nucléico que iniba a função de uma via genética associada a neo-vascularização indesejável ou inapropriada.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, em que odito agente terapêutico é um anticorpo monoclonal.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, em que odito anticorpo se liga a VEGF.

33. Método de tratamento de uma doença associada a neovas-cularização indesejável ou inapropriada em um sujeito, compreendendo aadministração ao dito sujeito de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações precedentes.

34. Método de tratamento de uma doença associada a neovas-cularização indesejável ou inapropriada em um sujeito, compreendendo aadministração ao dito sujeito de uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações de 1 a 29, em combinação com um agente terapêu-tico não ácido nucléico que iniba a função de uma via genética associada aneovascularização indesejável ou inapropriada.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o ditoagente terapêutico é um anticorpo monoclonal.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o ditoanticorpo se liga a VEGF.

37. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que adita neovascularização é um tecido tumoral, compartimentos oculares outecido articular.