DE19910419A1

DE19910419A1 - Zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP)

Info

Publication number: DE19910419A1
Application number: DE19910419A
Authority: DE
Inventors: Roland Kontermann; Dirk Nettelbeck; Hans-Harald Sedlacek; Rolf Mueller
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1999-03-10
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2000-09-21
Also published as: JP2002537847A; AU3282900A; WO2000053790A1; EP1161550A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein zielzellspezifisches, multivalentes Protein (MVP), dadurch charakterisiert, daß das MVP aus folgenden kovalent miteinander verbundenen Komponenten besteht: DOLLAR A a) einer Bindestruktur (a)¶n¶ spezifisch für den Vektor, DOLLAR A b) einem Linker (b)¶m¶ und DOLLAR A d) mindestens zwei Bindestrukturen (c)¶o¶ für die Zielzelle; wobei unabhängig voneinander n = 1, m = 1-10 und o = 2-10 sind, DOLLAR A seine Herstellung und Verwendung.

Description

1. Einleitung

In der Natur kommen zahlreiche monovalente Proteine vor. Diese monovalenten Proteine binden mit ihrem Bindungspartner, z. B. einem Zellmembranrezeptor, in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1 : 1. Beispiele für derartige monovalente Proteine sind Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Peptidhormone und Komplementrezeptoren. Des weiteren kommen in der Natur auch Bindungen in einem stöchiometrischen Verhältnis von ≧ 2 : 1 vor. So binden beispielsweise zwei Moleküle des Wachstumsfaktors VEGF in Form eines Dimers an einen Zellmembranrezeptor, den VEGF-Rezeptor, um diesen zu aktivieren, während die Bindung von Monomeren keine Aktivierung dieses Rezeptors bewirken kann.

Die Menge an Bindungsprodukten zwischen derartigen monovalenten Proteinen und beispielsweise ihren Rezeptoren wird hierbei bestimmt von der Stärke der Bindungskräfte zwischen beiden Bindungspartnern und ihren jeweiligen Konzentrationen.

Zur Erhöhung der Menge an Bindungsprodukten werden von der Natur bereits bivalente und multivalente Proteine hergestellt. Derartige bivalente und multivalente Proteine sind beispielsweise Dimere oder Multimere von monovalenten Proteinen. Beispiele hierfür sind Antikörper (über SH-Gruppen miteinander verbundene Dimere zweier gleicher, über SH-Gruppen miteinander verbundener Hefierodimere, jeweils bestehend aus einer L-Kette und einer H-Kette) oder der T-Zell-Rezeptor, bestehend aus einer α-Kette und einer β-Kette.

Die in natürlicher Weise vorkommenden bivalenten und multivalenten Proteine haben jedoch folgende Nachteile:

- sie binden nur an einen Bindepartner
- ihre Molekülgröße ist beträchtlich
- ihre Penetrationsfähigkeit durch Zellmembranen und durch die extrazelluläre Matrix ist äußerst gering
- sie binden nur homogene, nicht heterogene Bindepartner
- ihre biotechnologische Herstellung ist äußerst aufwendig.

Gegenstand der Erfindung sind nunmehr neue zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche mindestens zwei Bindestrukturen haben, die an ein Molekül eines Bindepartners oder mindestens an zwei unterschiedliche Bindepartner binden.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche ein fusiogenes Peptid enthalten und mit Hilfe dieses fusiogenen Peptids durch Zellmembranen penetrieren können.

Gegenstand der Erfindung sind desweiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), welche eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist darüber hinaus die Verwendung eines derartigen zielzellspezifischen, multivalenten Proteins für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose einer Erkrankung.

Zielzellspezifische, multivalente Proteine sind bereits als Liganden für virale oder nicht virale Vektoren beschrieben worden.

Zur Zielsteuerung von Adenoviren wurden bisher zwei verschiedene Strategien beschrieben (Curiel, D. T. et al., 1998, Tumor Targeting 3 : 59). Eine Möglichkeit ist die Modifikation des adenoviralen "fiber"-Proteins an der für die Bindung an Zellen verantwortlichen "knob"-Domäne. Dazu muß das adenovirale Genom modifiziert werden. Bei der zweiten Strategie werden Fusionsproteine aus einer neutralisierenden Domäne und einem Liganden an die Viren gebunden. Als neutralisierende Domäne werden bisher Antikörper verwendet, die an die "knob"- Domäne des Adenovirus binden und so die Bindung des Virus an Zellen verhindern, d. h. die Adenoviren "neutralisieren". Der fusionierte Ligand bedingt durch Bindung an den entsprechenden, spezifischen zellulären Rezeptor eine Zielsteuerung des Virus an jene Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren. Eine Modifikation des fiber- Gens ist bei diesem Ansatz nicht notwendig und es können mit vergleichsweise geringem Aufwand viele verschiedene Liganden getestet werden.

Im Sinne der oben beschriebenen Strategien sind folgende Techniken beschrieben worden:

- die genetische Modifikation von Viren (im besonderen Adenoviren), so daß auf ihrer Oberfläche zusätzliche Peptidsequenzen zur Konjugation von den gewünschten Liganden exprimiert werden (WO 95/26412)
- die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus)mit einem Fusionsprotein bestehend aus dem zellexternen Teil des zellulären Rezeptors für das Virus, einem Linker und einem Liganden für einen Rezeptor auf der gewünschten Zielzelle (WO 98/33929)
- die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus) mit einem Fusionsprotein bestehend aus einem Antikörper bzw. Antikörperfragment spezifisch für ein Protein auf dem Viruskapsid und einem Liganden spezifisch für die gewünschte Zielzelle (WO 94/10323, WO 98/40508)
- die Komplexierung eines Virus (im besonderen Adenovirus) mit einem Fusionsprotein (bestehend aus einem Antikörper bzw. Antikörperfragment spezifisch für ein Epitop in der Hexonregion des Virus und einem kationischen Peptid) und einem Plasmid (EP A 0 535 576 A1).

Des weiteren wurden beispielsweise mit gentechnologischen Methoden zellspezifische Bindestrukturen wie Heregulin (Han et al., PNAS 92, 9747 (1995)), Erythropoietin (Kasahara et al., Science 266, 1373 (1994)), Antikörperfragmente wie "single chain Fv" (Marin et al., J. Virol. 70, 2957 (1996)) oder Rezeptoren wie der extrazelluläre Teil des Fc-Rezeptors (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)) in die Hüllglykoproteine von retroviralen Vektoren eingebaut und hierdurch eine Zielzellspezifität bewirkt.

Nichtvirale Vektoren bestehen im einfachsten Falle aus Plasmiden komplexiert mit kationischen Molekülen, wie beispielsweise kationische Polymeren oder kationische Lipiden. Um derartige Vektoren selektiv in Zellen eines bestimmten Typs einbringen zu können, wurden beispielsweise mit chemischen Methoden zellspezifische Bindestrukturen, wie das Asialoglykoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 1152 (1994)) oder synthetische Derivate hiervon (Merwin et al., Bioconjugate Chem. 5, 612 (1994)) mit Polylysin verknüpft und dieses entweder mit dem Genkonstrukt komplexiert oder an Hüllproteine von adenoviralen Vektoren chemisch gebunden.

Eine weitere Methode war zellspezifische Bindestrukturen an Streptavidin zu binden, welches sich wiederum an Biotin, konjugiert an die Phospholipidkopfgruppen von Liposomen bindet, wobei die Liposomen mit Genkonstrukten komplexiert sind (Redelmeir et al., Drug Deliv. J. Deliv. Targeting Therap. Agents 2, 98 (1995)). Eine Weiterentwicklung bestand in der Herstellung künstlicher Ligandensysteme bestehend aus einer zielzellspezifischen Bindestruktur, einer vektorspezifischen Bindestruktur und ggf. einem fusiogenen Peptid. ein erstes derartiges Ligandensystem wurde von Fominaga et al., J. Biol. Chem. 271, 10560 (1996) vorgestellt.

Dieses Ligandensystem besteht aus einem Antikörperfragment spezifisch für den Erb B2-Rezeptor auf Tumorzellen, dem fusiogenen Peptid des Pseudomonas Exotoxin A und der DNA-bindenden Domäne des Gal4-Proteins der Hefe, die an die korrespondierende Gal4-Bindesequenz, eingefügt in ein das Transgen enthaltende Plasmid, bindet. Dieses Ligandensystem führt zwar zu einer zielzellspezifischen Transfektion, besitzt jedoch den Nachteil der Immunogenität des Gal4-Proteins der Hefe.

Eine deutliche Verbesserung fusiogener Ligandensysteme für virale und nicht virale Vektoren erfolgte mit dem Aufbau von mehrfach funktionellen Ligandensystemen unter Bevorzugung nicht oder nur gering immunogener Komponenten (EP-A 0 846 772). Des weiteren ermöglicht die Technologie für einzelkettige, zweifachantigenbindende Moleküle (DE 19 81 61 417, nicht veröffentlicht), relativ einfach zielzellspezifische, künstliche Ligandensysteme mit oder ohne fusiogene Peptide für virale oder nichtvirale Vektoren herzustellen.

Die Funktionsfähigkeit dieser verschiedenen Techniken für zielzellspezifische Liganden von Vektoren wurde in den aufgeführten unterschiedlichen Veröffentlichungen und Patentanmeldungen beschrieben. Gemeinsam ist diesen Ligandensystemen jedoch der Nachteil, daß die Aufnahme der Vektoren in die Zelle durch Pinozytose oder Endozytose nur unzureichend ist. Es besteht somit ein beträchtlicher Bedarf an einer Verbesserung von künstlichen zielzellspezifischen Ligandensystemen auch in der Gentherapie.

2. Kurzbeschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP) für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose einer Erkrankung, dadurch charakterisiert, daß das MVP mindestens zwei gleiche Bindestrukturen aufweist, die an ein Molekül eines Bindepartners auf der Zielzelle binden. Gegenstand der Erfindung sind des weiteren MVP, welche mindestens zwei unterschiedliche Bindestrukturen spezifisch für gleiche oder unterschiedliche Bindepartner auf der Zielzelle aufweisen. Durch die erfindungsgemäßen Moleküle wird eine verbesserte Bindung an, Aufnahme in die oder Vernetzung mit der Zielzelle ermöglicht. Die vorliegende Erfindung ist eine Weiterentwicklung der Erfindung, offenbart in der Patentanmeldung EP-A 0 846 772, in welcher multifunktionelle Liganden beschrieben werden, sowie eine Weiterentwicklung der Technologie zur Herstellung einzelkettiger, zweifach antigenbindender Moleküle (DE 19 81 61 417, nicht veröffentlicht). Auf beide Patentanmeldungen wird mit dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen.

Die zellspezifischen Bindestrukturen gemäß der vorliegenden Erfindung können sein zellmembranbindende Wirkstoffe, wie beispielsweise Homodimere oder Homomultimere eines Adhäsionsmoleküles, eines Wachstumsfaktors, eines Cytokins, eines Chemokins, eines Hormons, eines Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes oder aber die zellmembranbindenden Teile dieser Wirkstoffe, welche nur an ein Molekül eines Zellmembranrezeptors binden.

Diese Bindestrukturen können des weiteren sein Heterodimere oder Heteromultimere aus zellmembranbindenden Wirkstoffen, wie beispielsweise aus Adhesionsmolekülen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Hormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder aber die zellmembranbindenden Teile dieser Wirkstoffe, welche an mindestens zwei unterschiedliche Zellmembranrezeptoren binden und diese vernetzen.

Die erhöhte Bindung an oder die Kreuzvernetzung von gleichen oder unterschiedlichen Zellmembranrezeptoren hat beispielsweise zur Folge, daß die erfindungsgemäße MVP verstärkt an die Zielzelle binden und/oder in die Zielzelle aufgenommen werden (beispielsweise durch Pinozytose, Endozytose oder Phagozytose).

Die erhöhte Bindung an andere Zielstrukturen als Zellmembranrezeptoren kann beispielsweise eine verstärkte Komplexbildung mit der Zielstruktur zu Folge haben.

Entsprechend dieser Erfindung kann das MVP aus folgenden Komponenten aufgebaut sein:

a) aus mindestens einem Wirkstoff [Komponente (a)n]
b) aus einem oder mehreren Linkem, die ein fusiogenes Peptid und/oder eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten können [Komponente b)m]
c) aus mindestens zwei Bindestrukturen, (Komponente c)o],

wobei unabhängig voneinander n = 1-10, m = 1-10 und o = 2-10 sind und n, m und o ganze Zahlen sind.

Im Sinne der Erfindung sind hierbei die Komponenten a)n, b)m und c)o durch eine beliebige Peptidsequenz mit einer Länge von vorzugsweise 0-30 Aminosäuren derartig miteinander zu verbinden, daß das hieraus resultierende MVP einen Proteineinzelstrang darstellt und die Funktion bzw. Wirkung jeder einzelnen Komponente a)n, b)m und c)o vollständig erhalten bleibt.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren zielzellspezifische, multivalente Proteine, bei welchen mindestens zwei MVP miteinander verbunden sind. Diese Verbindung kann zwischen den Komponenten a)n, b)m und/oder c)o erfolgen und nicht kovalent oder kovalent sein, beispielsweise im Sinne einer Peptidbindung oder einer -S-S-Bindung.

Beispiele für die sich aus dieser Erfindung ergebenden Möglichkeiten sind schematisch in den Fig. 1 und 2 (a-c) dargestellt.

Entsprechend dieser Erfindung kann die Komponente a)n gleich oder unterschiedlich zur Komponente c)o sein. Die Komponente a) bzw. die Komponente c) kann ausgewählt sein aus einer Gruppe beispielsweise umfassend:

- eine Bindestruktur für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HJV
- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab)₂, Fab, rec. Fv, Diabody oder einzelkettiges, doppelantigenbindendes Protein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise LexA, Gal4 oder die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors oder ein Antikörper
- eine Transmembrandomäne oder ein Glykophospholipidanker,
- einen Wirkstoff wie beispielsweise der den Liganden bindenden Teil eines Rezeptors, der Ligand für einen Rezeptor oder die den Rezeptor bindende Teilsequenz des Liganden; ein Peptidhormon; ein Cytokin; ein Wachstumsfaktor; ein Wachstumsfaktorinhibitor; ein Chemokin; ein Interferon; ein Mediator; ein kreislaufwirksames Peptid; ein Enzym, welches eine inaktive Vorstufe eines Wirkstoffes in einen aktiven Wirkstoff überführt; ein Protein, welches die Gerinnung aktiviert oder inhibiert; ein Protein, welches die Fibrinolyse aktiviert oder inhibiert; ein Protein, welches das Komplementsystem aktiviert oder inhibiert; eine oder mehrere konstante Domänen eines Immunglobulins; ein zytotoxisches Peptid; ein die Apoptose induzierendes Peptid; ein die Apoptose hemmendes Peptid; ein Tumorantigen oder das Antigen eines Infektionserregers, wie beispielsweise ein bakterielles Antigen oder ein virales Antigen; ein Peptid enthaltend Cystein zur Herstellung von Dimeren des erfindungsgemäße Moleküls: und/oder ein di- bzw. multimerisierendes Peptid (Plückthun und Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997))

oder eine Bindestruktur für eine Zielzelle ausgewählt aus einer Gruppe beispielsweise umfassend:

- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für eine Membranstruktur auf der Zielzelle, beispielsweise IgG, F(ab)2, Fab, rec. Fc, Diabody oder einzelkettige, doppelantigenbindende Proteine
- das Fc-Teil eines Immunglobulins
- einen Wachstumsfaktor
- ein Cytokin
- ein Chemokin
- ein Peptidhormon
- ein Adhäsionsmolekül
- einen Mediator
- die Zellmembran-bindende Domäne eines Virushüllproteins.

Des weiteren kann entsprechend dieser Erfindung die Komponente b)m einen oder mehrere Linker enthalten, ausgewählt aus einer Gruppe beispielsweise umfassend

- ein Peptid beliebiger Länge
- ein Peptid mit mindestens zwei Cysteinen
- die Hingeregion eines Immunglobulins
- ein homo- oder heterodimerisierendes Peptid
- eines der bereits aufgeführten Peptide verbunden mit einem fusiogenen oder Translokationspeptid
- eines der bereits aufgeführten Peptide mit einer Spaltstelle für Proteinase.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Molekül. Die Nukleinsäure ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA.

Für die gegebenenfalls gewünschte Sekretion des erfindungsgemäßen Expressionsproduktes enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Signal- oder Transmembransequenz (siehe z. B. EP-A 0 848 063 oder EP-A 0848 061). Ein Beispiel für geeignete Signal- oder Transmembransequenzen ist die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA- Position ≦ 63 bis ≧ 107, die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position ≦ 33 bis ≧ 134) oder die Signalsequenz des Human Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuresequenzen ≦38 bis ≧50 oder 48 bis 65).

In einer weiteren Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende einen Promotor und/oder Aktivator. Der Aktivator ist vorzugsweise zellspezifisch, zellzyklusspezifisch, metabolisch-spezifisch und/oder durch einen Wirkstoff aktivierbar oder suprimierbar. Derartige Aktivatorsequenzen einschließlich ihrer Kombinationen sind in EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063, EP-A 0 848 061, EP-A 0 857 781, EP-A 0 860 445 bzw. EP-A 0 864 651 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure am 5'-Ende des Startkodons die Sequenz GCCACC oder GCCGCC, welche eine Verstärkung der Translation bewirken kann.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Der Vektor kann hierbei ein viraler oder nicht viraler Vektor sein. Ein nicht viraler Vektor ist bevorzugterweise ausgewählt aus einer Gruppe umfassend ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, ein kationisches Peptid oder ein kationisches Porphyrin.

Ein viraler Vektor ist bevorzugterweise ausgewählt aus einer Gruppe umfassend RTV, AV, AAV, HSV, Vaccinia V., Lenti Virus, Influenzavirus.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Moleküle wird die beschriebene Nukleinsäure in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein geeignetes Plasmid kloniert, in eine geeignete Zelle, beispielsweise in eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle eingebracht, die so transformierte oder transfizierte Zelle kultiviert und das Expressionsprodukt gegebenenfalls isoliert. Die Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und beispielsweise bei Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A. Laboratory Handbook 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, näher beschrieben.

In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung exprimieren diese Zellen ein erfindungsgemäßes Molekül mit einer Bindestruktur [Komponente a)n oder c)o], wobei diese Bindestruktur vorzugsweise eine Transmembrandomäne ist.

So kann beispielsweise die DNA-Sequenz kodierend für die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position ≦ 1485 bis ≧ 1554) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytical Virus (RSV)- Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren Teilsequenz Aminosäuren 38 bis 63) oder die DNA-Sequenz kodierend für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis 27) zwischen der Promotorsequenz und der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Moleküls oder auch am 3'-Ende des Gens eingefügt werden.

Zur Verankerung des erfindungsgemäßen Moleküls in die Zellmembran der das erfindungsgemäße Molekül exprimierenden Zellen kann jedoch auch eine Nukleotidsequenz kodierend für einen Glykophosphoüpid-Anker in das Nukleinsäurekonstrukt eingefügt werden.

Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt im allgemeinen am 3'-Ende der Nukleotidsequenz kodierend für das erfindungsgemäße Molekül und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.

Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1, beschrieben worden.

Durch diese Transmembranregion exprimiert die jeweilige Zelle das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran und erhält somit einen "Rezeptor", der für diejenigen Ziel- oder Effektorstrukturen spezifisch ist, welche durch die antigenbindenden Teile des erfindungsgemäßen Moleküls erkannt werden.

Eine andere bevorzugte Bindestruktur ist die transmembran- bzw. signaltransduzierende Domäne eines Rezeptors, beispielsweise der T-Zell-Rezeptor oder der M-CSF-Rezeptor. Hierdurch kann die das erfindungsgemäße Molekül auf der Zellmembran exprimierende Zelle durch Bindung der Zielstrukturen zu spezifischen Funktionen aktiviert werden. Derartige spezifische Funktionen können beispielsweise eine zytotoxische Reaktion von T-Lymphozyten, Phagozytosereaktionen von Makrophagen und Granulozyten oder Exozytosereaktionen von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen sein.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Zelle enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder eine erfindungsgemäßen Vektor, insbesondere eine Bakterien-, Insekten-, Hefe- oder Säugerzelle. Als Säugerzellen sind neben den allgemein bekannten Zellen zur Expression von Nukleinsäuren, wie z. B. CHO- oder BHK-Zellen, auch ein Lymphozyt, ein Makrophage, eine Gliazelle, eine Epithelzelle, eine Leberzelle, eine Nierenzelle, eine Knochenmarkszelle, eine Endothelzelle, eine glatte oder quergestreifte Muskelzelle oder ein Fibroblast geeignet.

Die zuletzt genannten Zellen sind insbesondere für eine gentherapeutische Anwendung geeignet, da diese Zellen, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt enthalten, einem Patienten lokal oder parenteral, z. B. intravenös, intraarteriell, in eine Körperhöhle, in ein Organ oder subkutan injiziert werden können, um so zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung zu dienen.

Für die gentherapeutische Behandlung von Erkrankungen können jedoch auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte direkt dem Patienten lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in das Blutgefäßsystem, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes MVP, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierend für ein MVP oder eine erfindungsgemäße Zelle, welche ein MVP exprimiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnostikum enthalten ein erfindungsgemäßes Molekül, welches mit seiner Bindestruktur [Komponente a)n oder c)o] gegen einen Analyten gerichtet ist.

Das erfindungsgemäße MVP, die erfindungsgemäße Nukleinsäure, der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Zelle eignen sich somit zur Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von beispielsweise Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen, Erkrankungen des Blutes, insbesondere des Blutgerinnungs- und/oder Blutkreislaufsystems, Erkrankungen des Nervensystems und/oder Infektionserkrankungen.

Die Wahl der einzelnen Komponenten a)n, b)m und c)o richtet sich hierbei im allgemeinen nach der Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände. Im folgenden werden die einzelnen Komponenten und deren Verwendungen allgemein und beispielhaft näher beschrieben:

3. Beschreibung der Komponente a)n und/oder Komponente c)o

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthält die Komponente a) und/oder Komponente c)o bevorzugterweise mindestens ein ganzes Antikörpermolekül oder mindestens ein Epitop-bindendes Fragment eines Antikörpers. Diese Antikörper sind bevorzugt komplett humanen Ursprungs.

Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente und rekombinante Fv-Fragmente werden entsprechend dem Stand der Technik, und wie nachfolgend beschrieben, hergestellt.

Die Spezifität des Antikörpers kann gerichtet sein gegen ein oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Epitope auf den Hüllproteinen des Virus.

- Antikörper gegen Hüllproteine von Viren, die als Vektoren Verwendung finden können, sind beispielsweise Antikörper gegen das
murine Leukämie Virus
HIV-Virus
Adenovirus
Herpes Simplex Virus
Cytomegalovirus
Minute Virus of mice
adenoassoziiertes Virus
Sindbis-Virus
Vaccinia Virus.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Komponente a)n und/oder c)o mindestens einen zellexternen Teil eines Fc- Rezeptors. An diesen Fc-Rezeptor bindet über sein Fc-Teil einer der bereits erwähnten Antikörper, welcher mit seinem antigenbindenden Teil direkt oder indirekt an das Genkonstrukt bindet.

In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform enthält die Komponente a)n und/oder c)o den Rezeptor für das Hüllprotein eines Virus.

Derartige Rezeptoren sind beispielsweise für folgende Viren beschrieben worden:

- HIV
das CD4-Molekül (löslich oder nativ)
Galactosylceramid
Rezeptoren für Chemokine
- HBV
der IL-6 Rezeptor
Annexin oder Apolipoprotein
- HTLV
der IL-2 Rezeptor (die β- wie auch die γ-Kette)
- Masern Virus
das CD46 Molekül
- Friend Leukemia Virus
der Erythropoietin Rezeptor
- Varizella Zoster
das Fc-Fragment von humanem Immunglobulin G
- Sendai Virus
das Glycophorin
- Influenza C-Virus
die N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminsäure
die 9-0-acetyl-N-acetylneuraminsäure
- Foot and Mouth Disease Virus
das integrin αVß3
- EBV
der Complement Rezeptor 2 (CD21)
- Herpes simplex Virus
der 275-kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder der 46-kDa Mannose-6- Phosphat-Rezeptor
- adenovirales Virus
der CAR (Cocksackie-Adenovirus-Rezeptor).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Komponente a)n und/oder c)o mindestens einen Wirkstoff, der zugleich auch eine Bindestruktur für eine Zelle sein kann.

Die Wahl dieses Wirkstoffes richtet sich nach der Erkrankung, welche durch Gabe des MVP oder des das MVP kodierenden Genes verhütet (prophylaktische Anwendung) oder behandelt (therapeutische Anwendung) werden soll. Bei Verabreichung einer Nukleotidsequenz für ein MVP sind die Promotorsequenzen für die Nukleotidsequenz, welche den Wirkstoff kodiert im Hinblick auf die Art der Therapie der Erkrankung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen.

Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Wirkstoffe bzw. folgende Kombinationen von Promotorsequenzen (Beispiele siehe Abschnitt C I) und Nukleotidsequenzen kodierend für die Wirkstoffe zu wählen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 804 601, EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063 und EP-A 0 848 061, auf die Bezug genommen wird).

d) Therapie von Tumoren

1. Zielzellen:
proliferierende Endothelzellen oder
der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
Tumorzellen oder Leukämiezellen
2. Promotoren:
endothelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
zellunspezifisch oder muskelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
tumorzellspezifisch (solide Tumoren, Leukämien) und zellzyklusspezifisch.

3) Wirkstoffe oder deren Nukleotidsequenzen

1. Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel:
das Retinoblastomprotein (pRb = p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine.
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
das p53 Protein.
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin.
Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
das p21 (WAF-1)
das p16 Protein
andere cdk-Inhibitoren
das GADD45 Protein
das bak Protein
2. Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
PAI-2
PAI-3
Angiostatin, Endostatin
Interferone (IFNα, IFNß oder IFNγ)
Platelet factor 4
IL-12
TIMP-1
TIMP-2
TIMP-3
Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente
3. zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel
Perform
Granzym
IL-2
IL-4
IL-12
Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNß oder IFNγ
TNF, wie TNFα oder TNFß
Oncostatin M
Sphingomyelinase
Magainin und Magainin-Derivate

4. zytostatische oder zytotoxische Antikörper und für Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen.
Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen.
Des weiteren gehören hierzu Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet:

Zellen
Membranantigen
AML	CD13 CD15 CD33 CAMAL Sialosyl-Le
B-CLL	CD5 CD1c CD23 Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL	CD33 M38 IL-2-Rezeptoren T-Zell-Rezeptoren
ALL	CALLA CD19 Non-Hodgkin Lymphoma

Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol.
Immunol. 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt gleichermaßen entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik.

5. Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel
IL-1
IL-2
RANTES (MCP-2)
monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
IL-8
macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β)
neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
IL-3
IL-5
human leukemia inhibitory factor (LIF)
IL-7
IL-11
IL-13
GM-CSF
G-CSF
M-CSF
Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln
bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebstellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
6. Enzyme für die Aktivierung vvn Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
Herpes Simplex Virus thymidinkinase
Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
bakterielle Nitroreduktase
bakterielle β-Glucuronidase
pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
humane β-Glucuronidase
humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB- B des Pankreas oder bakterielle Carboxy peptidase
bakterielle β-Laktamase
bakterielle Cytosine deaminase
humane Catalase bzw. Peroxidase
Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
Peroxidase, im besonderen humane Gluthation Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
Galaktosidase

d) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen

(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 807 183 und EP-A 0 848 061, auf die Bezug genommen wird).

1. Zielzellen:
proliferierende Endothelzellen oder
Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
Synovialzellen
2. Promotoren:
endothelzellspezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
makrophagen- und/oder lymphozytenspezifisch und/oder zellzyklusspezi fisch oder
synovialzellspezifisch und/oder Zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukleotidsequenzen

1. Wirkstoffe zur Therapie von Allergien, zum Beispiel
IFNß
IFNγ
IL-10
Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
lösliche IL-4-Rezeptoren
IL-12
TGFß
2. Wirkstoffe zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel
IL-10
TGFß
lösliche IL-1-Rezeptoren
lösliche IL-2-Rezeptoren
IL-1-Rezeptorantagonisten
lösliche IL-6-Rezeptoren
immunsuppressive Antikörper oder deren V_H und V_L enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene V_H- und V_L- Fragmente. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1-Rezeptor oder IL- 4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1, CD28 oder CD40
3. Wirkstoffe zur Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
TGFβ
IFNα
IFNβ
IFNγ
IL-12
lösliche IL-4-Rezeptoren
lösliche IL-6-Rezeptoren
immunsuppressive Antikörper oder dessen V_H- und V_L-enthaltende Fragmente
4. Wirkstoffe zur Therapie von Zell-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
IL-6
IL-9
IL-10
IL-13
TNFα oder TNFβ
einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen V_H- und V_L enthaltende Fragmente
5. Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika
Beispiele für Wirkstoffe oder für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt "Strukturgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der Erfindung Wirkstoffe verwendet werden, welche für Fusionsproteine aus Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o.a. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen und Enzymen darstellen.
6. Wirkstoffe zur Therapie der Arthritis
Im Sinne der Erfindung werden Wirkstoffe bzw. deren Nukleinsäuresequenzen ausgewählt, die die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmen und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördern.
Hierzu gehören zum Beispiel
IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA);
IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, β
löslicher IL-1-Rezeptor;
löslicher IL-1-Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
IL-6
IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
löslicher TNF-Rezeptor
löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF
IL-4
IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP
IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
Insulin-like growth factor (IGF-1)
IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix
TGFβ, im speziellen TGFβ1 und TGFβ2
TGFβ stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix
Superoxiddismutase
TIMP, im speziellen TIMP-1, TIMP-2 oder TIMP-3

e) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes

(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP A 0 807 183, auf die Bezug genommen wird)

1. Zielzellen:
proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
2. Promotoren:
spezifisch für blutbildende Zellen und/oder zellzyklusspezifisch
zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen

1. Wirkstoffe zur Therapie der Anämie, zum Beispiel
Erythropoietin
2. Wirkstoffe zur Therapie der Leukopenie, zum Beispiel
G-CSF
GM-CSF
M-CSF
3. Wirkstoffe zur Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel
IL-3
Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
IL-11
Thrombopoietin

d) Therapie von Schäden des Nervensystems

1. Zielzellen:
Gliazellen oder
proliferierende Endothelzellen
2. Promotoren:
Gliazell-spezifisch und zellzyklusspezifisch oder
Endothelzell-spezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
unspezifisch und Zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukeinsäuresequenzen

1. neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
FGF
Nerve growth factor (NGF)
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
Neurotrophin-3 (NT-3)
Neurotrophin-4 (NT-4)
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
2. Enzyme, zum Beispiel
Tyrosinhydroxylase
Dopadecarboxylase
3. Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel
TGFβ
lösliche TNF-Rezeptoren
TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
lösliche IL-1-Rezeptoren
IL-1-Rezeptor I
IL-1-Rezeptor II
lösliche IL-1-Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
IL-1-Rezeptor-Antagonist
lösliche IL-6-Rezeptoren

e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems

(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 777 739, EP-A 0 805 209 und EP-A 0 848 063, auf welche Bezug genommen wird)

1. Zielzellen:
Endothelzellen oder
proliferierende Endothelzellen oder
somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder
Makrophagen
2. Promotoren:
zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen und zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen

1. Wirkstoffe zur Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel
Tissue Plasminogen Activator (tPA)
Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
Hybride von tPA und uPA
Protein C
Hirudin und Analoga von Hirudin
Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S- Inhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III
Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
2. Wirkstoffe zur Förderung der Gerinnung, zum Beispiel
F VIII
F IX
von Willebrand factor
F XIII
PAI-1
PAI-2
Tissue Factor and Fragmente hiervon
3. Angiogenesefaktoren, zum Beispiel
VEGF (1-4)
FGF
TIE-2
4. Wirkstoffe zur Blutdrucksenkung, zum Beispiel
Kallikrein
Endothelzell "nitric oxide synthase"
5. Wirkstoffe zur Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel
ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt oder
ein Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
6. Blutplasmaproteine, zum Beispiel
Albumin
C1-Inaktivator
Serum Cholinesterase
Transferrin
1-Antritrypsin

f) Impfungen

(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 807 183, EP-A 0 805 209, EP-A 0 848 063 und EP-A 0 848 061, auf welche Bezug genommen wird)

1. Zielzellen:
Muskelzellen oder
Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Lymphozyten
2. Promotoren:
unspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
zielzellspezifisch und zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen

1. Wirkstoffe zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
Die erfindungsgemäßen MVP, enthaltend ein Protein zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen, versprechen eine größere Wirksamkeit aufzuweisen als konventionelle Impfstoffantigene.
Des weiteren verspricht eine Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein MVP, enthaltend ein Impfstoffantigen, eine größere Wirksamkeit zu besitzen, als eine konventionelle DNA Vakzine. Deren Wirksamkeit ist eingeschränkt (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol 2, 20 (1994)).
Als Wirksubstanz ist ein vom Infektionserreger gebildetes Protein (oder die dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz) auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden als Wirkstoffe die Neutralisationsantigene (oder deren Nukleinsäuresequenzen) folgender Erreger ausgewählt:
Influenza A-Virus
HIV
Tollwut-Virus
HSV (Herpes Simplex Virus)
RSV (Respiratory Syncytial Virus)
Parainfluenza-Virus
Rotavirus
VZV (Varizella Zoster Virus)
CMV (Cytomegalo-Virus)
Masern-Virus
HPV (Humanes Papillomvirus)
HBV (Hepatitis B-Virus)
HCV (Hepatitis C-Virus)
HDV (Hepatitis D-Virus)
HEV (Hepatitis E-Virus)
HAV (Hepatitis A-Virus)
Vibrio Cholera-Antigen
Borrelia Burgdorferi
Helicobacter pylori
Malaria-Antigen
Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch ein Antiidiotyp-Antikörper oder dessen Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
Derartige Antüdiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
Derartige antüdiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in immunopathol. 1% 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
2. Wirkstoffe für "Tumorvakzinen"
Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen die Gene für bzw. folgende Antigene bzw. für folgende Antiidiotypantikörper dar:
Sialyl Lewis
Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
von Onkogenen exprimierte Proteine
Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
Antigene auf Heat Shock Proteinen

g) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen

1. Zielzelle:
Leberzelle
Lymphozyt und/oder Makrophage
Epithelzelle
Endothelzelle
2. Promotoren:
virusspezifisch oder zellspezifisch und zellzyklusspezifisch

3) Wirkstoffe oder deren Nukleinsäuresequenzen

1. Wirkstoffe, beispielsweise
ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist
ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet
2. antivirale Wirkstoffe
antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise lFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFβ, TNFα, IL-1 oder TGFβ
Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen V_H und V_L enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene V_H und V_L Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
anti HBV
anti HCV
anti HSV
anti HPV
anti HIV
anti EBV
anti HTLV
Anti Coxackie Virus
anti Hantaan Virus
ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27
RBP1-8U
RBP1-8D
Pseudogene von RBP1-8
für Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
3. antibakterielle Wirkstoffe
Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
Meningokokken C oder B
E. coli
Borrelia
Pseudomonas
Helicobacter pylori
Staphylococcus aureus

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a)n und/oder c)o einen Wirkstoff, einen Teil des Wirkstoffes oder ein Analogon des Wirkstoffes enthalten, welcher an einen Rezeptor der Zielzelle bindet.

Derartige Wirkstoffe sind beispielsweise:

- Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFβ, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin-1
- Cytokine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 1L-15
- Interferon α, β und γ
- Tumornekrosisfaktoren TNFα, -β
- Chemokine wie RANTES, MCAF, MIP-1 α oder -β, NAP, β-Thromboglobulin
- Peptidhormone wie SRH, SIH oder STH, MRH oder MSH, PRH, PIH oder Prolaktin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH oder FSH, TRH oder TSH, CRH oder ACTH
- Angiotensin, Kinine, Histamin, Homologe oder Analoge hiervon
- Steroidhormone wie Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Homologe oder Analoge hiervon
- Vitamine wie z. B. Folsäure.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a)n und/oder c)o auch ein Adhäsionsmolekül, ein Teil des Adhäsionsmoleküls oder ein Analogon eines Adhäsionsmoleküls sein, welches an ein korrespondierendes zellmembranständiges Adhäsionsmolekül oder an eine andere spezifische Bindestruktur für ein Adhäsionsmolekül auf der Zielzelle bindet.

Derartige als Komponente a)n und/oder c)o funktionsfähige Adhäsionsmoleküle sind beispielsweise

- Lewis X (für GMP-140)
- S-Lewis X (für ELAM-1)
- LFA-1 (für lCAM-1 und ICAM-2)
- MAC-1 (für ICAM-1)
- VLA-4 (für VCAM-1)
- PECAM (für PECAM)
- Vitronectin (für den Vitronectinrezeptor)
- GMP-140 (für Lewis X)
- S-Lewis X (für ELAM-1)
- ICAM-1, ICAM-2 (für LFA-1, MAC-1)
- VCAM-1 (für VLA-4)
- Fibronectin (für VLA-4)
- Laminin (für VLA-6)
- Fibronectin, Laminin (für VLA-1, VLA-2, VLA-3)
- Fibronectin (für VLA-4)
- Fibrinogen (für GPIIb-IIIa)
- B7 (für CD28)
- CD28 (für B7)
- CD40 (für CD40L)
- CD40L (für CD40).

Im Rahmen der vorliegenden Verbindung kann die Komponente a)n und/oder c)o auch der extrazelluläre Teil eines Fc-Rezeptors sein (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), an welchem ein Antikörper spezifisch für die Zielzelle über seinen Fc-Teil gebunden wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente c)o auch ein Antikörpermolekül oder der epitopbindende Teil eines Antikörpermoleküls sein.

Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993) beschriebenen Weise.

Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie aus Bibliotheken muriner bzw. Humaner Antikörperfragmente isoliert. Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für weiter Manipulationen (z. B. der Fusion mit anderen Proteinen) eingesetzt.

Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (V_H, V_L) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente gewonnen. Die V_H- und V_L-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z. B. in Form von Fv-Fragmenten, einzelkettigen Fv- Fragmenten (scFv) oder als Fab-Fragmente kloniert.

Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage-display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom oder in Phagemid-Vektoren in Form von scFv-Fragmenten oder als Fab-Fragmente kloniert. Antigen-bindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen (panning), an antigenkonjugierten, paramagnetischen "beads" oder durch Bindung an Zelloberflächen selektioniert.

Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere oder Patienten. Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden die spezifisch sind für murine oder humane Immunglobulingene bzw. für die humanen Immunglobulin-Genfamilien verwendet.

Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen. Alternativ können Immunglobulin- Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird. Diese sogenannten "single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können.

Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neu Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige, kodonbasierende oder gezielte Mutagenese, durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus naiven Repertoires oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers.

Entsprechend der Erfindung sollen mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche Bindestrukturen für die Zielzeile [Komponente c)o] im erfindungsgemäßen Liganden enthalten sein. Eine besondere Form von bispezifischen oder multispezifischen, rekombinanten Antikörpern stellen einzelkettige, zweifach- oder mehrfach antigenbindende Moleküle dar. Die Herstellung dieser Moleküle wurde in der Patentanmeldung DE 19 81 61 417 (nicht veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird zur beispielsweisen Herstellung der Komponente c)o ausdrücklich Bezug genommen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente c)o auch das Hüllprotein oder ein Teil des Hüllproteins von Viren darstellen, welche über ihr Hüllprotein an ausgewählte Zellen spezifisch binden.

Die Wahl der Bindestruktur für eine Zielzelle richtet sich nach der Zielzelle, an welche das MVP binden soll.

Als Beispiele hierfür gelten:

Bindestrukturen für aktivierte Endothelzellen

Hierzu gehören im Sinne der Erfindung Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.

Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten des weiteren IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).

Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, Vitronectin oder RGD- Peptide wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992)).

Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Zu diesen Viren gehören beispielsweise:

- Filoviren, beispielsweise
das Marburg-Virus mit seinem Hüllprotein GP (glycoprotein) und sGP (second glycoprotein)
oder das Ebola-Virus jeweils mit seinem Hüllprotein GP und sG
- das Cytomegalovirus
besonders mit seinem gB-Protein
- das Herpes Simplex-Virus Type I
- das HIV-1 Virus
- das Masern-Virus
- das Hantaan-Virus
- Alphaviren, wie Semliki Forest-Virus
- das Virus des epidemischen, haemorrhagischen Fiebers
- das Poliovirus
- Enteroviren (wie z. B. Echo 9, Echo 12, Cocksackie B3).

Bindestrukturen für aktivierte Makroohaoen und/oder aktivierte Lymphozyten

Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören des weiteren Substanzen, welche an die Oberfläche von Immunzellen spezifisch binden. Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Immunzellen, wie sie beispielsweise von Powelson et al., Biotech. Adv. 11, 725 (1993) beschrieben wurden.

Des weiteren gehören zu den Bindestrukturen auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihrem antigenbindenden variablen Teil an Fc-γ - oder Fc-ε - oder Fc-µ Rezeptoren von Immunzellen binden (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).

Des weiteren gehört hierzu das Fc-Fragment von humanem monoklonalem oder polyklonalem Immunglobulin. Derartige Fc-Fragmente werden beispielsweise gentechnisch mit Hilfe rekombinierter DNA oder entsprechend der Methoden von Haupt et al., Klin. Wschr. 47, 270 (1969), Kranz et al., Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979); Fehr et al., Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974), Menninger et al., Immunochem. 13, 633 (1976) hergestellt.

Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen binden. Hierzu gehören Zytokine wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF, M-CSF des weiteren Wachstumsfaktoren wie beispielsweise EGF, TGF, FGF, IGF oder PDGF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Immunzellen binden.

Hierzu gehören des weiteren Adhäsionsmoleküle und andere Liganden, welche an Zellmembranstrukturen, wie beispielsweise an den Mannose 6-Phosphat- Rezeptor auf Makrophagen in Milz, Leber, Lunge und andere Gewebe binden.

Eine Auswahl dieser Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) beschrieben.

Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Lymphozyten und/oder Makrophagen haben.

Zu diesen Makrophagen infizierenden Viren gehören beispielsweise:

- HIV-1
besonders solche Stämme mit Mutationen in der V3-Region von gp120, die zu einer erhöhten Bindung an Makrophagen führen
- HIV-2
- Hantaviren, beispielsweise des Punmalavirus
- Cytomegalovirus
- Respiratory Syncytial Virus
- Herpes simplex-Virus
- Filoviren.

Zu den Lymphozyten infizierenden Viren gehören beispielsweise:

- Varizella-Zoster-Virus (VZV);
VZV infiziert besonders T-Zellen
- Herpes Virus 6 (HHV-6);
HHV-6 infiziert besonders T-Zellen
- Rabies-Virus;
das Rabies-Virus Hüllprotein bindet besonders an TH2-Zellen
- HIV-1;
das Glykoprotein gp120 bindet bevorzugt an das CD4 Molekül von T-Zellen
- HTLV-II;
HTLV-II infiziert besonders B-Zellen
- HTLV-I;
HTLV-I infiziert besonders T-Zellen
- Influenza C-Viren;
Influenza-C-Viren binden über das Haemagglutinin-Esterase-Fusions-(HEF)- Protein an N-acetyl-9-β-acetylneuraminsäure (Neu 5,9 Ac), welche bevorzugt auf B-Lymphzyten, weniger oder nicht auf T-Lymphozyten vorkommt
- Influenza C-Viren mit Mutation in der Nukleotidposition 872 (die die Position 284 des HEF der Aminosäuresequenz kodiert), beispielsweise ein Austausch des Threonins durch Isoleucin. Das Oberflächenprotein HEF mit dieser Mutation hat eine deutlich stärkere Affinität zum N-acetyl-9-0- acetylneuraminsäure-Rezeptor als das Wildvirus
- HEF Spaltprodukte des Influenza C-Virus, welche die Bindestruktur für N- acetyl-9-β-acetylneuraminsäure enthalten. Diese Bindestruktur ist definiert durch die katalytische Triade Serin-71, Histidin 368 oder 369 und Arsparaginsäure 261
- Epstein-Barr Virus;
EBV infiziert besonders B-Zellen
- Herpes simplex-Virus-2;
HSV-2 infiziert besonders T-Zellen
- Masernvirus.

Bindestrukturen für Muskelzellen

Hierzu gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Muskelzellen, insbesondere von glatten Muskelzellen. Derartige Antikörper sind beispielsweise

- der Antikörper 10F3
- Antikörper gegen Actin
- Antikörper gegen Angiotensin II-Rezeptoren
- Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren

oder Antikörper gerichtet beispielsweise gegen

- EGF-Rezeptoren
- oder gegen PDGF-Rezeptoren
- oder gegen FGF-Rezeptoren
- oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren.

Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirksubstanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Muskelzellen binden (Übersicht bei Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol 2, 260 (1991)). Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch glatte Muskelzellen binden wie beispielsweise

- PDGF
- EGF
- TGFβ
- TGFα
- FGF
- Endothelin A

Zu den Bindestrukturen im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Muskelzellen haben. Zu diesen Viren gehört beispielsweise das Cytomegalovirus.

Bindestrukturen für blutbildende Zellen

Zu den Bindestrukturen gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Rezeptoren exprimiert auf gering differenzierten Blutzellen.

Derartige Antikörper sind beispielsweise für folgende Rezeptoren beschrieben worden:

- Stern Cell Factor Receptor
- IL-1-Rezeptor (Type I)
- IL-1-Rezeptor (Type II)
- IL-3-Rezeptor α
- IL-3-Rezeptor β
- IL-6-Rezeptor
- GM-CSF-Rezeptor.

Des weiteren gehören zu den Bindestrukturen auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-γ Rezeptoren von Immunzellen binden.

Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von gering differenzierten Blutzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Blutzellen binden.

Bindestrukturen für Synovialzellen und Entzündungszellen

Hierzu gehören monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Synovialzellen oder Entzündungszeilen binden. Solche Membranstrukturen sind beispielsweise

- Vimentin
- Fibronectin oder
- Fc-Rezeptoren.

Hierzu gehören auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-Rezeptor binden.

Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Synovialzellen binden. Beispielsweise gehören hier Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Synovialzellen binden wie beispielsweise IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFβ.

Des weiteren gehören hierzu Bindestrukturen, deren wesentlicher Bestandteil endständige Mannose ist, welche an Mannose-6-Phosphatrezeptoren auf Makrophagen bindet.

Bindestrukturen für mit Viren infizierte Zellen

Zu den Bindestrukturen gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen die Virusantigene exprimiert auf der Zellmembran von virusinfizierten Zellen.

Derartige Antikörper sind beispielsweise für mit folgenden Viren infizierten Zellen beschrieben worden:

- HBV
- HCV
- HSV
- HPV
- HIV
- EBV
- HTLV.

Bindestrukturen für Leberzellen und weitere Gewebezellen

Zu den Bindestrukturen gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen binden.

Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie Zytokine, EGF, TGF, FGF oder PDGF, oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch derartige Zellen binden.

Hierzu gehören des weiteren Bindestrukturen, welche an Zellmembranstrukturen binden, welche selektiv sind für bestimmte Gewebe. Hierzu zählen beispielsweise:

Diese Binde- und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) beschrieben.

Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören jedoch besonders Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für ausgewählte Zellen haben, wie beispielsweise für

- Bronchialepithelzellen
Respiratory syncytial virus
- Leberzellen
Hepatitis C-Virus, Hepatitis B-Virus, Hepatitis A-Virus
Filoviren
Leberzellen binden z. B. das Marburg-Virus über den Asialoglykoprotein- Rezeptor
Hepatitis B-Virus
Leberzellen binden bevorzugt über den Asialoglykoprotein-Rezeptor an der preS2 und preS1 Domäne von HBV
Hepatitis D-Virus
- lebersinusoidale Zellen
Hepatitis V-Virus
HBV wird gebunden über Fibronectin.

Bindestrukturen für Gliazellen

Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Gliazellen, wie sie beispielsweise von Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) und McKeever et al. (Neurobiol 6, 119 (1991)) berichtet wurden. Zu diesen Membranstrukturen gehören desweiteren Neuraladhäsionsmoleküle wie N-CAM, insbesondere dessen Polypeptidkette C.

Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Gliazellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose tragen und an den Mannose-6- Phosphatrezeptor binden, Insulin und Insulin-like growth factor, PDGF und diejenigen Fragmente dieser Wachstumsfaktoren, welche an die zugehörigen Membranrezeptoren binden.

Zu den Bindestrukturen im Sinne der Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben.

Zu diesen Viren gehören beispielsweise:

- HIV-1 Subtyp JRF1
- Herpes simplex-Virus I

Bindestrukturen für Leukämiezellen

Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente mit Spezifität für folgende Antigene geeignet:

Zellen
Membranantigen
AML	CD13 CD14 CD15 CD33 CAMAL Sialosyl-Le
B-CLL	CD5 CD1c CD23 Idiotypen und Isotypen der Membranimmun-globuline
T-CLL	CD33 M38 IL-2-Rezeptoren T-Zell-Rezeptoren
ALL	CALLA CD19 Non-Hodgkin-Lymphoma

Zu den Bindestrukturen gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen binden.

Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). Beispielsweise gehören zu ihnen:

- IFNα bei Non-Hodgkin Lymphomen
- IL-2, besonders bei T-Zell-Leukämien
- FGF bei T-Zell-, monozytären, myeloiden, erythroiden und megarkaryoblastischen Leukämien
- TGFβ bei Leukämien
- Retinoide, z. B. "Retinoic acid" bei akuter promyelozytärer Leukämie.

Bindestrukturen für Tumorzellen

Hierzu gehören Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:

- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine
- Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyi GD3, Fucosyl GM1
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen

4a) Beschreibung des Linkers [Komponente b)m]

Die Wahl des Linkers richtet sich nach der chemischen Natur der Komponenten a)n und c)o und nach der Methode, mit welcher diese Komponenten über den Linker miteinander verbunden werden.

Sind die Bindestrukturen Peptide oder Proteine, so wird vorzugsweise ein Peptid oder Protein als Linker verwendet und die Verbindung des Linkers mit den Komponenten a)n und c)o erfolgt vorzugsweise über eine Peptidbindung. Derartige Moleküle werden vorzugsweise als Fusionsproteine mit Hilfe der rekombinierten DNA-Technologie hergestellt.

Ist die Komponente c)o kein Peptid oder Protein, so stellt der Linker in seiner einfachsten Form eine Struktur dar, welche die Komponente a)n mit der Komponente c)o verbindet. Derartige Strukturen resultieren aus den verschiedenen chemischen Konjugationsmethoden, mit Hilfe derer Moleküle an Aminogruppen, Hydroxygruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen oder an Aldehydgruppen in Proteinen gebunden werden (Übersicht der Methoden siehe Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, 42-49 und 81-85, Karger Verlag, München (1988).

Der Linker [die Komponente b)m und die Komponente a)n] können jedoch auch selbst jeweils ein Peptid oder Protein sein. In diese Falle erfolgt die Verbindung zwischen beiden vorzugsweise über eine Peptidbindung und zur Komponente c)o über eine der chemischen Konjugationsmethoden.

Ob der Linker ein fusiogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält, richtet sich nach der Verwendung des erfindungsgemäßen Moleküls. Soll das erfindungsgemäße Molekül extravaskulär im Bindegewebe oder in der Zelle seine Wirkung entfalten, ist der Linker vorzugsweise ein Molekül mit fusiogener Eigenschaft. Diese fusiogene Eigenschaft erleichtert die Passage des erfindungsgemäßen Moleküls durch die Zellmembran.

Im Sinne dieser Erfindung werden als Linker mit fusiogener Eigenschaft virale oder bakterielle Peptide oder Proteine wie auch synthetische Peptide verwendet.

Moleküle mit fusiogener Eigenschaft sind beispielsweise (Details siehe Patentanmeldung EP-A 0 846 772):
Peptide enthaltend die Translokationsdomäne (Domäne II) des Exotoxins A von Pseudomonas
Peptide enthaltend das Peptid
GLFEALLELLESLWELLLEA (SEQ ID NO.: 1)
Peptide enthaltend das Peptid
AALAEA[LAEA]₄LAAAAGC (SEQ ID NO.: 2)
Peptide enthaltend das Peptid
FAGV-VLAGAALGVAAAAQI (SEQ ID NO.: 3) des Fusionsproteins des Masern-Virus
Peptide enthaltend das Peptid
GLFGAIAGLIEGGWWGMIDG (SEQ ID NO.: 4)
des HA2 Proteins von Influenza A
Peptide enthalten das Peptid
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO.: 5) oder das Peptid
GLFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 6)
ALFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 7)
LFLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 8)
LLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 9)
LILGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 10)
GIFGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 11)
GLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 12)
GLFAAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 13)
GLFEAIAGFIE; (SEQ ID NO.: 14)
GLFGAMAGFIE; (SEQ ID NO.: 15)
GLFGAIAGLIE; (SEQ ID NO.: 16)
GLFGAIAGFIV (SEQ ID NO.: 17)
GLFEAIAELIEGGWEGLIEG (SEQ ID NO.: 18) oder
GLLEALAELLEGGWEGLLEG (SEQ ID NO.: 19).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden desweiteren Proteine von Viren verwendet, welche fusiogene Eigenschaften haben. Eine Reihe von Viren besitzt fusiogene und/oder translozierende Hüllproteine, so beispielsweise Paramyxoviren, Retroviren und Herpesviren. Hierzu gehören beispielsweise das TAT-Protein von HIV oder dessen translokalisierende Aminosäuresequenz oder das VP22-Protein von HSV.

Eine Reihe von Viren besitzen des weiteren Glykoproteine, die verantwortlich sind sowohl für die Virusanheftung als auch nachfolgend für die Zellmembranfusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).

Derartige Proteine werden beispielsweise von Alpha-, Rhabdo- und Orthomyxoviren gebildet.

Virale fusiogene Proteine im Sinne der Erfindung wurden übersichtlich beschrieben von Hughson, Curr. Bio(. 5, 265 (1995); Hoekstra, J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675 (1990); White, Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)).

Fusiogee Proteine im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise:

- das Haemagglutinin von Influenza A- oder B-Viren, insbesondere die HA2-Kom ponente
- das M2-Protein von Influenza A-Viren
alleine oder in Kombination mit dem Haemagglutinin von Influenza eingesetzt oder mit Mutanten von Neuraminidase von Influenza A, denen die Enzymaktivität fehlt, die jedoch Haemagglutination bewirken
- Peptidanaloga des Influenza-Virus Haemagglutinins
- das HEF-Protein des Influenza C-Virus
Die Fusionsaktivität des HEF-Proteins wird aktiviert durch Spaltung des HEFo in die Untereinheiten HEF1 und HEF2
- das Transmembranglykoprotein von Filoviren, wie beispielsweise
des Marburg-Virus
des Ebola-Virus
- das Transmembranglykoprotein des Tollwutvirus
- das Transmembranglykoprotein (G) des Vesicular Stomatitis-Virus
- das Fusionsprotein des HIV-Virus, insbesondere die gp41-Komponente und fusiogene Komponenten hiervon
- das Fusionsprotein des Sendai-Virus, insbesondere die aminoterminalen 33 Ami nosäuren der F1-Komponente
- das Transmembranglykoprotein des Semliki Forest-Virus, insbesondere die E1- Komponente
- das Transmembranglykoprotein des Tickborn Enzephalitis-Virus
- das Fusionsprotein des menschlichen respiratorischen syncytialen Virus (RSV) (im besonderen die gp37-Komponente)
- das Fusionsprotein (S-Protein) des Hepatitis B-Virus
- das Fusionsprotein des Masern-Virus
- das Fusionsprotein des Newcastle Disease Virus
- das Fusionsprotein des Visna-Virus
- das Fusionsprotein vom murinen Leukämie-Virus (im besonderen p15E)
- das Fusionsprotein vom HTL-Virus (im besonderen das gp21)
- das Fusionsprotein des Simian Immunodeficiency Virus (SIV).

Virale fusiogene Proteine werden entweder durch Lösung der Hüllproteine aus einer Virusanreicherung mit Hilfe von Detergentien (wie beispielsweise β-D octylglucopyranosid) und Abtrennung durch Zentrifugation (Übersicht bei Mannio et al., BioTechniques 6, 682 (1988)) gewonnen oder aber mit Hilfe von dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden.

5) Die Verknüpfung der Komponenten zu einem MVP

Die Verknüpfung der Komponenten a)n, b)m und c)o zu einem MVP erfolgt vorzugsweise über Peptidbindungen. Um die Wirksamkeit bzw. die Funktionsfähigkeit der einzelnen Komponenten a)n, b)m oder c)o nicht zu beeinträchtigen, wird zwischen diesen Komponenten eine beliebig lange Peptidsequenz eingefügt, vorzugsweise eine Peptidsequenz von 0-30 Aminosäuren.

6) Herstellung eines Moleküls aus mindestens zwei zielzellspezifischen, multivalenten Proteinen (MVP)

Ein derartiges Molekül wird hergestellt aus der Verbindung mindestens zweier MVPs durch Verbindung der jeweiligen Komponenten a)n, b)m und/oder c)o.

Derartige Verbindungen werden hergestellt in der Form, daß die natürlicherweise vorkommende Dimerisierung (oder Multimerisierung) von Proteinen ausgenutzt wird oder daß Verbindungsteile in die Komponenten a), b) und/oder c) eingefügt werden und diese Verbindungsteile die Verknüpfungen ermöglichen. Derartige Verbindungsteile können entsprechend der Erfindung beispielsweise sein:

- mehr als 3 Cysteine
- die Hinge Region der schweren Kette eines Antikörpers
- der zellinterne Teil von CD4 einerseits und die CD4 Bindedomäne von p56 LcK andererseits
- das Ga180 Protein einerseits und die Ga180 Bindedomäne von Gal4 andererseits.

Hierdurch resultieren zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP), deren Di- oder Multimerisierung erfolgt ist durch eine nicht kovalente oder kovalente Verbindung (z. B. durch S-S-Brücken, Peptidverbindungen)

- der Komponente a)n
- der Linker (Komponente b)m] oder
- der Komponente c)o.

Das zielzellspezifische, multivalente Protein (MVP) wird anhand folgender Beispiele näher verdeutlicht:

Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens Beispiel 1 Vorarbeiten Herstellung eines homodimeren s.c. Fv anti AV-VEGF2 Moleküls entsprechend dem Stand der Technik zur zielgesteuerten Transduktion von Adenoviren

Die Expression einer scFv-VEGF-Polypeptidkette führt zur Ausbildung eines Homodimers, das zwei Bindungsstellen für Adenoviren und zwei Bindungsstellen für VEGF-Rezeptoren besitzt. Die Verbindung zum Dimer erfolgt hierbei über VEGF (= Zellbindestruktur) unter Ausbildung von Disulfidbrücken. Zur Herstellung dieses Konstruktes wurde zunächst die Rezeptor bindende Domäne des VEGF (Aminosäuren 1-114) in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert und in Säugerzellen exprimiert. Für eine Bindung an Flk-1 ist ein VEGF-Fragment von Aminosäure 11 bis 109 ausreichend (Siemeister et al., J. Biol. Chem. 273, 11115 (1998)). Dieses VEGF-Fragment wurde N-terminal durch einen kurzen Linker mit dem einzelkettigen Fv-Fragment (scFv) anti AV (S11) fusioniert. S11 bindet an die "knob"-Domäne des adenoviralen "fiber"-Proteins und neutralisiert die Bindung an den zellulären Adenovirus-Rezeptor. Die Expression erfolgte ebenfalls in Säugerzellen. Die Funktionalität der Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchfluäzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Transduktion wird mit Hilfe von Adenoviren, die das IacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, durchgeführt.

Klonierung des Expressionsplasmids pSecTag-VEGF

Für die Klonierung sämtlicher Expressionskonstrukte wurde pSecTagA (Invitrogen, Expressionsvektor mit Igk-leader-Sequenz) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierte VEGF-cDNA wurde mittels PCR aus genomischer DNA der humanen Tumorzellinie LNCaP mit Taq-Polymerase (Pharmacia) amplifiziert (30 Zyklen, Annealingtemperatur: 58°C). Dazu wurden folgende Oligonukleotide verwendet (Restriktionsstellen unterstrichen, Nummern = Aminosäureposition VEGF cDNA nach Leader s. Leung et al., Science 246, 1306 (1989)):

Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin- Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tup 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Die Klonierung des s.c. Fv (anti AV)-VEGF-Konstruktes erfolgte durch 2-Fragment- Ligation. Das s.c. Fv (anti AV)-Fragment wurde mittels PCR (s.o) unter Verwendung folgender Oligonukleotide hergestellt:

Dabei diente das Plasmid anti AV-pUC119mycHis (R. Hawkins in: Watkins et al., Gene Therapy 4, 1104 (1997)) als Template. Das PCR-Produkt wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt und mit den Restriktionsenzymen Sfil und NotI verdaut.

Das 2. Fragment, VEGF, wurde durch Restriktionsverdau des VEGF-Plasmids mit den Restriktionsenzymen NotI und EcoRI erhalten. Der Vektor, pSecTagA, wurde mit Sfil und EcoRI verdaut. Nach Auftrennung der Restriktionsverdau-Produkte durch Agarosegelelektrophorese wurde erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die Fragmente 1 und 2 wurden anschließend in den geschnittenen und aufgereinigten Vektor ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts s.c. Fv anti AV-VEGF ist in Fig. 3 dargestellt.

Expression von VEGF

Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des VEGF-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS-Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 20 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen wurde mit Lipofektamin (Gibco) nach Angaben des Herstellers unter Verwendung von 5 µg Plasmid und 30 pl Lipofectamin pro 6 cm Schale durchgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (1. Antikörper: monoklonaler anti-His-Tag, Dianova; 2. Antikörper: Ziege-anti-Maus-Cy3, Dianova) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 µg/µl Zeozin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminaler Histidinreste.

Expression von s.c. anti AV (S11)-VEGF

Die Expression von s.c. anti AV-VEGF erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie VEGF kann auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt werden.

Herstellung des erfindungsgemäßen monomeren scFv-anti AV-scVEGF2-Moleküls zur zielzellspezifischen Transduktion von Adenoviren

In einem scFv-scVEGF2-Molekül (sc für "single chain" = einzelkettig) wird ein scFv- Fragment mit zwei VEGF-Einheiten, die über einen zusätzlichen Peptid-Linker verbunden sind, fusioniert. Dieses Molekül liegt somit als Monomer vor und besitzt eine Bindungsstelle für das adenovirale "fiber"-Protein und zwei Bindungsstellen für die VEGF-Rezeptoren. Die Funktionalität dieser Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Transduktion wird mit Hilfe von Adenoviren, die das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren, durchgeführt.

Klonierung der Expressionsplasmide

Zunächst wurde ein scVEGF2-Konstrukt (Aminosäuren 1-109, GGGSGGGRASG- GGS-Linker (SEQ ID NO.: 26) und Aminosäuren 6-114) kloniert und exprimiert. Zur Klonierung dieses Konstruktes wurden 2 PCR-Reaktionen (siehe unter 1) mit folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:

- mit VEGF back 1 (s. unter 1) und VEGF for 2 (s.u.)
- mit VEGF back 2 (s. u.) und VEGF for 1 (s. unter 1)

Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und AscI (1) bzw. AscI und EcoRI (2) verdaut und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die verdauten PCR-Produkte (1) und (2) wurden anschließend in den entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektor pSeqTagA ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Zur Klonierung von S11-scVEGF2 wurde das scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und unter Verwendung von Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) wurde der einzelsträngige Überhang aufgefüllt.

Anschließend wurde mit NotI verdaut. Als Vektor wurde das S11-VEGF-Plasmid mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, der einzelsträngige Überhang aufgefüllt und anschließend mit NotI verdaut. Die Produkte wurden mit QiAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt und ligiert. Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts S11-scVEGF2 ist in Fig. 4 dargestellt.

Expression von scVEGF2

Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des scVEGF2-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS- Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von etwa 34 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen erfolgte wie unter Beispiel 1 aufgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (s. Beispiel 1) ein deutliches Signal. Hier waren v. a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 ug/ul Zeozin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminalen Histidinresten.

Expression von s.c. Fv-anti AV (S11)-scVEGF2

Die Expression von s.c. Fv anti AV (S11)-scVEGF2 erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie scVEGF2 wird auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt.

Beispiel 2 Vorarbeiten Herstellung eines homodimeren s.c. Fv anti CD3-VEGF2 Moleküls entsprechend dem Stand der Technik

In den hier beschriebenen Beispielen wurden zielzellspezifische multivalente Proteine für eine systemische Therapie von Krebs entwickelt. Ziel ist eine selektive Bindung des MVP an Tumor- oder Tumorendothelzellen. Dies ist eine Voraussetzung für die Verwendung toxischer Proteine oder Prodrug-aktivierender Systeme zur zielgesteuerten Zerstörung von Tumoren ohne toxische Effekte auf gesundes Gewebe.

Durch die Bindung des MVP an Tumorendothelzellen wirkt der im MVP enthaltene Wirkstoff auf die Tumorendothelzellen ein. Deren Zerstörung führt zu einer Behinderung der Blutzufuhr des Tumors und zu dessen Absterben.

Bei den hier dargestellten Beispielen wird als Ligand VEGF ("vascular endothelial growth factor") - in unterschiedlichen Konfigurationen - für eine zielgerichtete Bindung an Tumorendothelzellen eingesetzt. VEGF ist ein Wachstumsfaktor, der an die endothelspezifischen Rezeptoren KDR ("kinase insert domain-containing receptor") und flt-1 ("fms-like tyrosine kinase") bindet (Thomas, K. A., 1996, J. Biol. Chem. 271: 603). Diese sind in Tumorendothelzellen verstärkt exprimiert (Gerber, H.-P., 1997, J. Biol. Chem 272: 23659; Waltenberger J., 1996, Circulation 94: 1647; Takahashi, Y., 1995, Cancer Res. 55: 3964). VEGF bindet als disulfidverbundenes Dimer an seine Rezeptoren.

Als Wirkstoff wurde das rekombinante scFv-Fragment eines ausgewählten Antikörpers verwendet. Dieser Antikörper bindet an das CD3 Molekül des humanen T-Zell-Rezeptors.

Die Expression einer seFv-VEGF-Polypeptidkette führt zur Ausbildung eines Homodimers, das zwei Bindungsstellen für CD3 und zwei Bindungsstellen für VEGF- Rezeptoren besitzt. Die Verbindung zum Dimer erfolgt hierbei über VEGF (= Zellbindestruktur) unter Ausbildung von Disulfidbrücken. Zur Herstellung dieses Konstruktes wurde zunächst die Rezeptor bindende Domäne des VEGF (Aminosäuren 1-114) in einen eukaryotischen Expressionsvektor kloniert und in Säugerzellen exprimiert. Für eine Bindung an Flk-1 ist ein VEGF-Fragment von Aminosäure 11 bis 109 ausreichend (Siemeister et al., J. Biol. Chem. 273, 11115 (1998)). Dieses VEGF-Fragment wurde N-terminal durch einen kurzen Linker mit dem einzelkettigen Fv-Fragment (scFv) anti CD3 fusioniert. Anti CD3 bindet an die CD3 Untereinheit des T-Zell-Rezeptors. Die Expression erfolgte ebenfalls in Säugerzellen. Die Funktionalität der Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Des weiteren durch Bindung von T-Zellen an Endothelzellen über das erfindungsgemäße MVP.

Klonierung des Expressionsplasmids pSecTag-VEGF

Für die Klonierung sämtlicher Expressionskonstrukte wurde pSecTagA (Invitrogen, Expressionsvektor mit Igk-leader-Sequenz) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierte VEGF-cDNA wurde mittels PCR aus genomischer DNA der humanen Tumorzellinie LNCaP mit Taq-Polymerase (Pharmacia) amplifiziert (30 Zyklen, Annealingtemperatur: 58°C). Dazu wurden Oligonukleotide publiziert von Leader s. Leung et al., Science 246, 1306 (1989) verwendet.

Die Klonierung des s.c. Fv anti CD3-VEGF-Konstruktes erfolgte durch 2-Fragment- Ligation.

Das 2. Fragment, VEGF, wurde durch Restriktionsverdau des VEGF-Plasmids mit den Restriktionsenzymen NotI und EcoRI erha 06573 00070 552 001000280000000200012000285910646200040 0002019910419 00004 06454lten. Der Vektor, pSecTagA, wurde mit Sfil und EcoRI verdaut. Nach Auftrennung der Restriktionsverdau-Produkte durch Agarosegelelekarophorese wurde erneut mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt. Die Fragmente 1 und 2 wurden anschließend in den geschnittenen und aufgereinigten Vektor ligiert (T4-Ligase, Promega). Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Korrektheit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Expression von VEGF

Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des VEGF-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS-Polyacrylamidgel mit der erwarteten Größe von ätwa 20 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen wurde mit Lipofektamin (Gibco) nach Angaben des Herstellers unter Verwendung von 5 µg Plasmid und 30 µl Lipofectamin pro 6 cm Schale durchgeführt.

Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (1. Antikörper: monoklonaler anti-His-Tag, Dianova; 2. Antikörper: Ziege-anti-Maus-Cy3, Dianova) ein deutliches Signal. Hier waren v.a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 µg/µl Zeozin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminaler Histidinreste.

Expression von s.c. Fv anti CD3-VEGF

Die Expression von s.c. Fv anti CD3-VEGF erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie VEGF kann auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt werden.

Herstellung eines erfindungsgemäßen monomeren scFv-scVEGF2-Moleküls

In einem scFv-scVEGF2-Molekül (sc für "single chain" = einzelkettig) wird ein scFv- Fragment mit zwei VEGF-Einheiten, die über einen zusätzlichen Peptid-Linker verbunden sind, fusioniert. Dieses Molekül liegt somit als Monomer vor und besitzt eine Bindungsstelle für das CD3 Molekül des T-Zell-Rezeptors und zwei Bindungsstellen für einen VEGF-Rezeptor. Die Funktionalität dieser Bindungsstellen wird immunologisch (ELISA, Immunzytologie, Durchflußzytometrie) bzw. in Proliferationsassays mit primären humanen Endothelzellen verifiziert. Die zielgesteuerte Bindung von T-Zellen wird an Hand deren Zytotoxizität für die Endothelzelle gemessen.

Klonierung der Expressionsplasmide

Zunächst wurde ein scVEGF2-Konstrukt (Aminosäuren 1-109, GGGSGGGRASG- GGS-Linker und Aminosäuren 6-114) kloniert und exprimiert. Zur Klonierung dieses Konstruktes wurden 2 PCR-Reaktionen (siehe unter 1) mit folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:

- mit VEGF back 1 (s. unter 1) und VEGF for 2 (s. u.)
- mit VEGF back 2 (s. u.) und VEGF for 1 (s. unter 1)

Zur Klonierung von s.c. anti CD3-scVEGF2 wurde das scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und unter Verwendung von Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim) wurde der einzelsträngige Überhang aufgefüllt. Anschließend wurde mit NotI verdaut. Als Vektor wurde das s.c. Fv anti CD3- scVEGF2-Plasmid mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, der einzelsträngige Überhang aufgefüllt und anschließend mit NotI verdaut. Die Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen aufgereinigt und ligiert. Eine Plasmid-Präparation erfolgte mit Qiagen tip 500-Säulen nach Angaben des Herstellers. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des Konstrukts BMA031-scVEGF2 ist in Fig. 4 dargestellt.

Expression von scVEGF2

Eine in vitro-Transkription und -Translation (Promega, nach Angaben des Herstellers) des scVEGF2-Konstruktes ergab ein Protein, das im SDS- Polyacrylamidgel mit der ervarteten Größe von etwa 34 kd lief. Die Transfektion des Plasmids in HEK293-Zellen erfolgte wie unter Beispiel 1 aufgeführt. Transient transfizierte Zellen zeigten in der Immunfluoreszenz (s. Beispiel 1) ein deutliches Signal. Hier waren v. a. die Kompartimente des zellulären Sekretionsweges dargestellt. Stabile Klone wurden durch Selektion in 200 ug/ul Zeozin erhalten. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellkulturüberstand durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mittels sechs C-terminalen Histidinresten.

Expression von s.c. Fv anti CD3-scVEGF2

Die Expression von s.c. Fv anti CD3-scVEGF2 erfolgt ebenfalls durch stabil transfizierte HEK293-Zellen. Wie scVEGF2 wird auch dieses Fragment mittels IMAC aufgereinigt.

Beispiel

MVL-IIIb1 = MVL der durch Di- bzw. Multimerisierung der Zellbindestruktur entsteht, wobei diese Zusammenlagerung durch Ausbildung von Disulfidbrücken stabilisiert wird.

Figurenlegende Fig. 1

Erfindungsgemäße MVP's enthaltend mindestens eine Bindestruktur für den Vektor, mindestens zwei Bindestrukturen für die Zielzelle und mindestens einen Linker.

Fig. 2

Erfindungsgemäße MVP's enthaltend mehrere Liganden; A. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Bindestrukturen für den Vektor; B. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Linker; C. mindestens einfach verbunden über gleiche oder verschiedene Bindestrukturen für die Zielzelle.

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims

1. Zielzellspezifisches, multivalentes Protein (MVP), dadurch charakterisiert, daß das MVP aus folgenden kovalent miteinander verbundenen Komponenten besteht:

a) einer Bindestruktur (a)_n spezifisch für den Vektor,
b) einem Linker (b)_m, und
c) mindestens zwei Bindestrukturen (c)₀ für die Zielzelle; wobei unabhängig voneinander n = 1-10, m = 1-10 und o = 2-10 sind.

2. MVP nach Anspruch 1), in welchen die Komponente b) mindestens ein fusiogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält.

3. MVP nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch charakterisiert, daß die Bindestruktur für den Vektor ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend

- einen zellulären Rezeptor für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HJV
- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab)₂, Fab, rec. Fv, Diabody oder einzelkettiges, doppelantigenbindendes Protein
- ein Peptid mit einer reaktiven Gruppe zur Konjugation an ein Virusprotein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise LexA, Gal4 oder die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors.

4. MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch charakterisiert, daß die Bindestruktur für die Zielzelle ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend

- einen rekombinanten Antikörper spezifisch für eine Membranstruktur auf der Zielzelle, beispielsweise IgG, F(ab)2, Fab, rec. Fc, Diabody oder einzelkettige, doppelantigenbindende Proteine
- das Fc-Teil eines Immunglobulins
- einen Wachstumsfaktor
- ein Cytokin
- ein Chemokin
- ein Peptidhormon
- ein Adhäsionsmolekül
- einen Mediator
- die Zellmembran-bindende Domäne eines Virushüllproteins

5. MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem die Komponenten a) und c) humanen Ursprungs sind.

6. Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein MVP nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Ein Bakterium, eine Hefe oder eine Säugerzelle, in welche ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6 eingeführt worden ist.

8. MVP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, an dessen Komponente a) ein Vektor gebunden ist.

9. MVP gemäß Anspruch 8, wobei der Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe umfassend RTV, AdV, AAV, Influenzavirus, HSV, Vacciniavirus und Lentivirus.

10. MVP gemäß Anspruch 8, wobei der Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend einen nichtviralen Vektor, DNA, RNA und Plasmide.

11. MVP gemäß Anspruch 10, wobei der nichtvirale Vektor ausgewählt wird aus einer Gruppe umfassend kationische Lipide, kationische Polymere und Porphyrine.

12. Verwendung eines MVP gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Zellen außerhalb des Gewebeverbandes bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen.

13. Verwendung eines MVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 zur Herstellung eines Heilmittels

a) zur lokalen Verabreichung bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen;
b) zur Injektion bei Erkrankungen der Haut, der Schleimhaut, des Nervensystems, der inneren Organe, der Gerinnung, des blutbildenden Systems, des Immunsystems, der Muskulatur, des Stützgewebes oder der Gelenke und zur Impfung zur Vorbeuge oder Therapie dieser Erkrankungen.

14. Herstellung eines MVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 11 durch Expression eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß Anspruch 8, Reinigung der exprimierten Proteine und gegebenenfalls Assoziierung verschiedener Expressionsprodukte.

15. MVP, bestehend aus einem scFv-Fragment mit einer Bindungsstelle für das adenovirale "fiber"-Protein und zwei VEBF-Einheiten, die über einen Peptidlinker verbunden sind.

16. MVP, bestehend aus einem scFv-Fragment mit einer Bindungsstelle für das CD3-Molekül und zwei VEGF-Einheiten, die über einen Peptidlinker verbunden sind.

17. Komplex, bestehend aus mindestens zwei LVP's gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei bei jedem der einzelnen Liganden o = 1 sein kann.

18. Komplex Anspruch 17, wobei die Verbindung zwischen den Komponenten a), b) oder c) erfolgt.