Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Einzelketten-antigenerkennenden
genetischen Konstrukten (scARC), bei dem zusätzlich zu dem herkömmlichen
V 1
/
2-Li-V2/1-C4/3-sc-Konstrukt
eine entsprechende heterodimere konstante Domäne C3/4 koexprimiert
wird. Bevorzugterweise handelt es sich bei den scARC um Einzelketten-TCR
(scTCR) oder Antikörper-scFv-Fragmente, die
weiter bevorzugt tumorassoziierte Peptidantigene (TAA) erkennen.
Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung rational
mutierten MDM2-Protein-spezifische T-Zell Antwort vermittelnden α/β T-Zell Rezeptoren und
dessen Verwendungen.
Unter den TAA, die im Kontext von
MHC-Klasse-I-Molekülen
auf der Oberfläche
von Tumorzellen präsentiert
werden, sind die sogenannten "universellen" TAA von besonderem
Interesse. Diese TAA leiten sich überwiegend von zellulären Proteinen
ab, die in normalen Zellen schwach exprimiert und in Tumorzellen überexprimiert
werden. Zu diesen Proteinen gehört
unter anderem das humane Homolog des "Mouse-Double-Minute-2" Proto-Onkogens (mdm2),
das sogenannte "humane
mdm2" oder abgekürzt "MDM2" Proto-Onkoprotein
(Roth et al. 1998), das nicht nur in einer Reihe solider Tumore,
sondern auch bei den hämatologischen Neoplasien
(malignen hämatologischen
Systemerkrankungen) AML, ALL und CLL überexprimiert wird (Zhou et
al, 2000).
Oligopeptide des MDM2-Proteins können im
Kontext mit MHC-Klasse-I-Molekülen
auf der Zelloberfläche
präsentiert
werden und repräsentieren
attraktive Zielstrukturen für
CD8-positive T-Zellen.
Das Ausmaß der T-Zell
Antwort verläuft
hierbei in einem definierten kinetischen Fenster (Kersh et al.,
1998). Der Komplex aus Peptid-MHC und TCR-CD3 multimeri siert, um
eine effiziente Signaltransduktion zu bewirken, wobei die genaue
Stöchiometrie
und das Ausmaß der
Oligomerisierung noch umstritten ist.
Die vorliegende Erfindung behandelt
grundsätzlich
ein biochemisches Problem im Bereich der angewandten Immunologie
und Onkologie: Fokus der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung
hoch-effektiver T-Zellen (CTL), die über ihre cytotoxische Effektor-Funktion
in der Lage sind, humane (Hu) Tumorzellen spezifisch zu erkennen
und zu lysieren. Dazu werden allgemein CTL-Klone, die spezifisch
Tumor-assoziierte Antigene (TAA) erkennen, im transgenen murinen
(Mu) oder Maus-Modell isoliert (Stanislawski & Voss et al., 2001).
Verantwortlich für die Onkoprotein-abgeleitete
Peptid-Erkennung auf Seite der T-Zelle ist der membranständige T-Zell-Rezeptor
(TCR), der den Komplex aus membranständigem MHC-Molekül und präsentiertem Peptid, das aus
der proteosomalen Prozessierung von Onkoproteinen hervorgegangen
ist, auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), oder
auch Tumorzelle, erkennt und ein aktivierendes Signal an die Signaltransduktionskaskade
der cytotoxischen T-Zelle (CTL) vermittelt.
Die klinische Anwendung sieht daher
vor, periphere T-Zellen des Blutes eines Tumorpatienten zu isolieren,
diesen die Gene der TAA-spezifischen TCR durch den adoptiven, gentechnischen
Transfer hinzuzufügen
und nach massiver Expansion zu reinfundieren (Rosenberg, 1999; Schumacher,
2002). Der TCR ist ein heterodimeres α/β-Molekül, dessen Ketten jeweils die
Transmembrane (TM) einmalig durchspannen (siehe 1a ). Jede Kette besteht aus zwei globulären Domänen, die
eine Immunglobulin-ähnliche
Faltung vornehmen: die aminoterminale Domäne wird als variable Domäne (Vα bzw. Vβ) bezeichnet,
da diese aus genetischem Rearrangement hervorgegangen ist und für die individuelle
Peptiderkennung zuständig
ist.
Die sich anschließende Domäne wird die Invariante oder
auch konstante Domäne
(Cα bzw.
Cβ) genannt.
Sie nimmt eine stabile, Immunglobulin-ähnliche Faltung vor (Garcia
et al., 1998). Die konstante Domäne gliedert
sich im Wesentlichen in drei Regionen: eine extrazellulär gelegene
Domäne,
an dessen Ende im Fall der Cα das "Connecting-Peptide"-Motiv FETDxNLN der
gleichnamigen Subdomäne α-CPM liegt,
die vom letztständigen,
inter-α/βTCR-Ketten
Cystein bis zum Beginn der Transmembrane des TCRα reicht.
Daran anschließend folgt eine transmembrane
Region und ein kurzes carboxyterminales cytoplasmatisches Ende,
welche zusammen mit der TM-Region und der α-CPM zum einem mit der β-Kette des
TCR (βTCR)
und zum anderen mit dem CD3-Komplex interagieren kann, wodurch signaltransduzierende
und Oberflächenexpression-stabilisierende
Effekte erzielt werden (Bäckström et al.,
1996, Trop et al., 1999, Naeher et al., 2002).
Dieser Aufbau gilt gleichermaßen für humane
und murine TCR: das Proteinrückgrat
der Spezies-fremden TCR ist mit einem marginalen Unterschied von
nur 1,04 Angstroem superpositionierbar (siehe 2). Insbesondere in der konstanten Domäne sind
zahlreiche Aminosäuren
homolog bzw. identisch (siehe 3).
Reife T-Zellen gehen aus den Vorläuferzellen
des Thymus, den Thymozyten hervor, welche während ihrer Reifung einen prä-TCR exprimieren.
Dieser besteht aus der rearrangierten β-Kette des späteren T-Zell-Rezeptors, der
mit einer Invarianten prä-TCRa-Kette
(pTα), deren
Aufbau mit dem der Cα-Domäne vergleichbar
ist, assoziiert ist. Hierbei hat der pTα die Funktion, den Vorläufer-TCR
in seiner Oberflächenexpression
als Platzhalter für
das anschließende
Rearrangement der α-Kette
des TCR zu stabilisieren und führt
zur weiteren Entwicklung des späteren
vollständig
prozessierten T-Zell-Rezeptors und somit zur Entwicklung einer reifen
T-Zelle (Kruisbeek et al., 2000, Aifantis et al., 2002). Die p7α-Kette besteht,
parallel zur Cα-Domäne, aus einem
extrazellulären
Anteil, einer transmembranen Region und einem cytoplasmatischen
Anteil, welches im Vergleich zur Cα-Domäne um einige Aminosäuren (AS)
verlängert
ist. Die α-CPM
ist im pTα nicht
konserviert, so daß angenommen
wird, daß hieraus
regulatorische Unterschiede der Signaltransduktion über die
Assoziation zu CD3-ζ im Vergleich
des pTα zum αTCR resultieren
(Trop et al., 1999).
Das zentrale Problem des oben genannten
klinischen Ansatzes der Verwendung von rekombinanten TCR besteht
darin, daß die
polyklonale T-Zellpopulation des Patienten eigene, sogenannte endogene, T-Zell-Rezeptoren
unbekannter Spezifität
trägt.
Ein funktioneller TCR formiert sich aus der Paarung der beiden Ketten
im Wege des Endoplasmatischen Retikulum (ER)- und Golgi-prozessonalen
Vorganges zu einem an die Zell-Oberfläche geleiteten TCR/CD3-Komplexes.
Da die heterodimeren Ketten zunächst
vereinzelt exprimiert werden und zudem hinreichende Homologie zwischen
den humanen und murinen Ketten bestehen, können die exogen hinzugefügten TCR
mit den endogenen Ketten paaren und unbekannte, im ungünstigen
Fall ungewünschte
Spezifitäten
(Autoimmun-Reaktionen) hervorrufen. Im ein fachsten Fall ergeben
sich aus den vier vorhandenen Ketten (zwei endogene und zwei exogene
Ketten) einer mit den Genen für
einen TCR-transduzierten T-Zelle vier denkbare Kombinationen, von
denen zwei ungewünschte
Hu αTCR/Mu βTCR und Mu αTCR/Hu βTCR-Hybride sind. Die
Situation verkompliziert sich zusätzlich dann, wenn mehrere,
für verschiedene
TAA spezifische TCR-Gene transduziert werden bzw. dadurch, daß zuweilen
in einer T-Zelle
zwei funktionelle TCR aufgrund eines insuffizienten allelischen
Ausschlusses der einen von zwei genomischen α-Ketten exprimiert werden. Zudem
werden im Rahmen einer klinischen Applikation voraussichtlich nicht-klonale T-Zell-Populationen
transduziert, so daß hieraus
eine Vielzahl denkbarer hybrider TCR auf Populationsebene vorliegen.
Eine solche hybride Form muriner
und humaner Ketten ist bisher nicht bewiesen worden, kann aber aufgrund
der bisher vorliegenden strukturellen Daten wie TCR-Protein-Kristallstrukturen
(Garcia et al., 1998; Ding et al., 1998) nicht ausgeschlossen werden.
Zu einer erhöhten
Sicherheit bei der Anwendung des adoptiven TCR-Transfers gilt es
daher, solche Hybridformen so weit wie möglich auszuschließen. Da
die murinen TCR-Ketten weitgehend, zumindest im Bereich der konstanten
Domänen,
die maßgeblich
die Dimerisierung diktieren (Li et al., 1996), humanisiert werden
sollen, um Abstoßungsreaktionen
gegen diese im Empfänger
zu vermeiden, besteht eine Gefahr der Heterodimerisierung solcher
chimären
Ketten um so mehr. Im Fall eines partiell humanisierten MDM2-spezifischen
TCR gibt es hierfür
bereits erste experimentelle Hinweise.
Ein Lösungsweg zur Umgehung der ungewünschten
Kettenpaarung ist das Design von Einzelketten-T-Zell-Rezeptoren.
Dieses scTCR-Konzept dient dazu, ungewünschte Kettenpaarungen von
endogenen zu exogenen Ketten zu verhindern. Solche Konstrukte sind
gentechnisch beliebig konzipierbar und gewährleisten eine kovalente 1:1-Stöchiometrie
der heterodimeren, variablen Domänen
(siehe 1b). Das scTCR-Konzept
wurde ursprünglich
für Antikörper entwickelt
(Eshhar et al., 1993; 2001), konnte aber aufgrund der strukturellen
Homologien zwischen Antikörpern
und 7-Zell-Rezeptoren auf letztere übertragen werden. (Chung et
al., 1994; Weijtens et al., 1998; Willemsen et al., 2000). Hierbei
werden die variablen Domänen über ein
kurzes Peptid, einen "Linker", miteinander kovalent
unter Wegfall der einen von beiden konstanten Domänen verknüpft. Solche
Konstrukte sind gentechnisch beliebig konzipierbar und gewährleisten
eine biochemisch gekoppelte 1:1-Stöchiometrie der heterodimeren,
variablen Domänen.
Alternativ werden an die jeweiligen
Ketten des heterodimeren Moleküls
kurze Peptidsequenzen als Affinitäts-Anhängsel gentechnisch angefügt, die
für eine
spezifische Kettenpaarung Sorge tragen: hierzu wurden T-Zell-Rezeptoren
30 Aminosäure
lange, carboxyterminale "tags", ein sogenannter "leucine zipper", als Dimerisierungsmotiv
angefügt
(Chang et al., 1994). Diese letztgenannten Verfahren haben den Nachteil,
aufgrund ihres rekombinanten Charakters potentielle Fremdantigene
darzustellen, die zu Abstoßungsreaktionen
im Empfängerorganismus
führen.
In der Vergangenheit zeigt sich,
daß die
Stabilität
und Funktionalität
der scTCR über
die Kopplung an die Vollängen ζ-Kette des
CD3-Komplexes erheblich verbessert werden konnte (Chung et al.,
1994; Willemsen et al., 2000). Auch Doppelketten-TCR in Fusion zur
CD3ζ-Kette werden eingesetzt
(Willemsen et al., 2000).
Statt der konstanten TCR-Domäne werden
auch Invariante Domänen
funktionsfremder (Membran-) Proteine verwendet: CH2 / CH3 von Antikörpern, die
Transmembrane des Korezeptors CD4 (Weijtens et al., 1998), die membranverankernde
/ signalgebende Domäne
des FcεRIγ- (Hombach
et al., 2000).
Es wurden bisher zahlreiche Chimäre eines
MDM2(81-88)-spezifischen scTCR entwickelt, die sich exprimieren
ließen,
aber bisher keine Effektorfunktion nach Transfer in humane T-Zellen aufwiesen.
Eine Effektorfunktion zeigten bisher nur solche scTCR, die in Fusion
zur humanen CD3ζ-Kette
konzipiert wurden (Willemsen et al., 2000; Chung et al., 1994).
Die CD3ζ-Domäne dient
hierbei der Signaltransduktion.
Wesentlicher Nachteil der scTCR-CD3ζ-Konstrukte
ist die Notwendigkeit der Kopplung an das eigentlich signalgebende
Molekül
CD3ζ der
T-Zelle. Dies könnte
ein Risiko der T-Zell-Aktivierung
darstellen, aus der allo-Reaktivitäten (Autoimmun-Reaktionen)
entstehen. Zudem ist der chimäre
Charakter der scTCR-CD3ζ-Ketten
derart erhöht,
daß Immunreaktionen
gegen das Fremdprotein, insbesondere gegen den Fusionsbereich zur
humanen CD3ζ-Kette
zu befürchten
sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu
stellen, das die Herstellung eines Einzelketten-Antigen-erkennenden
rekombinanten genetischen Konstrukts (scARC) mit einer verbesserten
Expressionstabilisierung ermöglicht,
so daß zum
Beispiel bei der Herstellung rekombinanter scTCR nicht gemischte
Pärchen
mit den endogenen Ketten der T-Zellen ausgebildet werden. Zusätzlich zu
der Stabilisierung der Zell-Oberflächenexpression
des scTCR sollte eine meßbare – und vor
allem spezifische – Effektor-Funktion der humanen
T-Zelle erreicht werden. Das Verfahren der Stabilisierung durch
die geeignete Koexpression sollte sich zudem auch auf andere Einzelketten-Antigen-erkennende
rekombinante genetische Konstrukte anwenden lassen, wie zum Beispiel
scFv-Fragmente (Eshhar et al., 1993).
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch
ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Einzelketten-Antigen-erkennenden
genetischen Konstrukts (scARC) gelöst. Das Verfahren umfaßt die Schritte
von: a) zur Verfügung
stellen eines genetischen Konstrukts des scARC, umfassend die Domänen V1/2-Li-V2/1-C4/3, b) zur Verfügung stellen eines genetischen
Konstrukts umfassend die entsprechende hetero-/(homo-)dimere konstante
Domäne
C3/4, direktes Einbringen der genetischen
Konstrukte über
nicht-viralen Gentransfer und/oder indirektes Einbringen der genetischen
Konstrukte über
viralen Gentransfer der scARC-Fragmente in eine Zelle, d) Koexpression
der genetischen Konstrukte der scARC-Fragmente, und e) Präsentation
des stabilisierten heterodimeren scARC durch die Zelle (siehe dazu
schematisch 1c).
Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei
der scARC ein Einzelketten-TCR (scTCR) oder ein Antikörper scFv-Fragment
ist. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren
zur Herstellung eines stabilisierten Einzelketten-TCR (scTCR). Das
Verfahren umfaßt
die Schritte von: a) zur Verfügung
stellen eines genetischen Konstrukts umfassend den scTCR mit einer
konstanten Domäne,
b) zur Verfügung
stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende
hetero-/(homo-)dimere konstante Domäne, c) Einbringen der genetischen
Konstrukte der TCR-Fragmente in eine T-Zelle, d) Koexpression der
genetischen Konstrukte der TCR-Fragmente, und e) Präsentation
des stabilisierten heterodimeren scTCR durch die T-Zelle. Ein weiterer
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur
Herstellung eines stabilisierten scFv-Fragments. Das Verfahren umfaßt die Schritte
von: a) zur Verfügung
stellen eines genetischen Konstrukts umfassend das scFv-Konstrukt
mit einer konstanten Domäne,
b) zur Verfügung
stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende
hetero-/(homo-)dimere konstante Domäne, c) Einbringen der genetischen
Konstrukte des scFv-Fragments in eine geeignete humane Zelle, d)
Koexpression der geneti schen Konstrukte des scFv-Fragments, und
e)Produktion des stabilisierten heterodimeren scFv-Fragments durch
die Zelle.
Der erfindungsmäßige Ansatz basiert somit auf
einer Expressionstabilisierung von Einzelketten-TCR (scTCR) durch
die Koexpression der hetero-/(homo-)dimeren konstanten Domäne als Bindungspartner
und auf einer Expressionstabilisierung von scFv-Fragmenten durch
die Koexpression der hetero-/(homo-)dimeren konstanten Domäne als Bindungspartner.
Es wurde erfindungsgemäß bevorzugt
eine Cα-Domäne konzipiert,
die mit einem scTCR kotransferiert und somit koexprimiert werden
kann. Hiermit sollte eine Stabilisierung der Zell-Oberflächenexpression
des scTCR und eine meßbare
Effektor-Funktion der humanen T-Zelle
erreicht werden. Zusätzlich
kann hierdurch eine unerwünschte
Paarung mit endogenen Ketten verhindert werden. Nach dem Einschleusen
der Kettenkombinationen in humane T-Zellen mußten diese in Hinblick auf
ihre strukturelle Avidität,
d.h. ihre strukturelle Integrität,
als auch in Hinblick auf ihre funktionelle Avidität, d.h.
das Aufrechterhalten der Peptidabhängigen Effektor -Funktion,
getestet werden (Bullock et all., 2001). Als Modellsystem dienten
die in unserem Labor identifizierten murinen MDM2(81-88)-spezifischen
T-Zell-Rezeptoren.
MDM2 ist ein humanes, regulatorisches Proto-Onkoprotein, das die
Expression des Tumorsuppressor-Proteins p53 gegenreguliert (Stanislawski & Voss et al.,
2001). Die zusätzlich
vorhandene, im scTCR jeweils fehlende konstante Domäne, dient
der Stabilisierung des Einzelketten-T-Zell-Rezeptors. Mit der Erhöhung der
Stabilität
ist eine Verbesserung der Expression und der Funktionalität im Kontext
der T-Zell-Effektor-Funktion verbunden.
Durch die stabilisierende Wirkung
der zusätzlichen
konstanten Domäne
in Kombination mit einem scTCR ist es gelungen, funktionsfähige chimäre Rezeptoren
ohne eine notwendige Fusion zur CD3ζ-Kette, zu entwickeln. Es ist
möglich,
dieses erfindungsgemäße Konzept
allgemein auch auf humanisierte bzw. humane Konstrukte auszuweiten.
Die Kotransduktion mit (z.B.) Cα komplettiert
die im Wildtyp-TCR vorhandenen vier extracytosolischen Domänen Cα, Cβ, Vα, Vβ und verändert ausschließlich die
Verknüpfung
dieser vier Domänen.
Im cytosolischen und transmembranen Bereich als maßgebliche,
signalinduzierende Wirkorte ergibt sich somit kein struktureller
Unterschied zum heterodimeren Wildtyp-TCR, ganz im Gegensatz zum
TCR-CD3ζ-Konzept
(1c). Ein analoges Konzept
besteht für
den Fall der Komplettierung von konstanten Domänen bei scFv-Fragmenten. Zudem
wird der Anteil der variablen Domänen der scARC, welcher der
Antigenerkennung dient, durch die koexprimierte Domäne nicht
sterisch benachteiligt.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren
der vorliegenden Erfindung, wobei die Zelle eine Säuger-, insbesondere
humane, T-Zelle ist. Weiter bevorzugt wird der scTCR in der Orientierung
SP-Vα-Li-Vβ-Cβ zusammen
mit der konstanten Domäne
SP-Cα oder
der scTCR in der Orientierung SP-Vβ-Li-Vα-Cα zusammen mit der konstanten
Domäne
SP-Cβ koexprimiert.
Diese Paarungen bilden dann optimale stabilisierte und richtig gepaarte
scTCR aus. Das Signalpeptid (SP) wird normalerweise im Endoplasmatischen
Retikulum (ER) abgespalten, kann aber in artifiziellen Fusionen
zum Memebranprotein auch weiterhin existent sein.
Neben dem MHC-restringierten scTCR-Konzept
ermöglicht
das oben genannte scFv-Konzept die MHC-unabhängige Erkennung von Antigenen:
hierbei werden die Antigen-spezifischen variablen Domänen der
schweren und leichten Kette eines Antikörpers mittels eines mindestens
14 Aminosäuren
langen Linkers verknüpft
und üblicherweise über eine "hinge"-Region, die als
Abstandshalter zur Zellmembran dient, an membranständige, signalgebende
Moleküle
der CD3ζ-Kette
oder der γ-Kette
des Immunglobulin-Rezeptors FcR fusioniert. Als Abstandshalter fungieren,
die "hinge"-Region von CD8,
die "hinge"-Region von Igel
(Eshhar, 1997) bzw. die Immunglobulin-ähnlichen Domänen CH2CH3 von Antikörpern (Weijtens
et al., 1998). Das scFv-Konzept impliziert, daß beliebige der oben erwähnten "hinge"-Regionen mit beliebigen
der oben zitierten signalgebenden Komponenten chimärisiert
werden können
und diese mit beliebigen Antigen(Ag)-spezifischen Einzelketten-Fv-Fragmenten
fusioniert werden können.
Das hier beschriebene Konzept zur Stabilisierung und Funktionssteigerung
von Einzelketten-TZR unter Wegfall der signalgebenden Komponente
(CD3ζ) mittels
der komplementären
konstanten Domäne
ist auf das scFv-Konzept projezierbar: scFv-Fragmente werden z.B.
an die konstante Cβ eines
beliebigen TZR fusioniert und analog mit einer Cα-Domäne kotransferiert. Auch ist
es vorstellbar, die CH
2CH3-Domänen
eines Antikörpers
zu verwenden, die auf der einen Seite mit dem scFv und auf der anderen
Seite mit der membranständigen
Domäne
eines TCR chimärisiert
wurden. Entsprechend wird eine Chimäre aus SP-CH2CH3-TM(TCR) – Cyt(TCR)
hergestellt (Kürzel
siehe Erklärung
unten), die als komplementäre
Domäne
mit dem chimären
scFv heterodimerisiert (Roberts et al., 1994). Analog den natürlichen
Gegebenheiten eines Antikörpers
homodimerisieren die CH2CH3-Domänen unter
Ausbildung eines bivalenten Antigen-spezifischen Moleküls. Sowohl
CH2CH3-Domänen untereinan der
als auch Cα/Cβ-Domänen zwischeneinander
bilden stabilisierende Disulfidbrücken aus. Denkbar wäre auch
die in den Fab-Fragmenten von Antikörpern liegende CL-Domäne der leichten
Kette mit der CH1-Domäne der schweren Kette zu heterodimerisieren.
Diesen beschriebenen konstanten Domänen gemeinsam
ist ihre Immunglobulin-ähnliche
Faltung und ihre Neigung, sich durch Homo- bzw. Heterodimeriserung
zu einer komplementären
Domäne
zu stabilisieren. Beispielhaft sind folgende TCR-abgeleitete wie
auch Antikörperabgeleitete
Chimäre
vorstellbar:
SP = Signalpeptid
V
L = F
V-Fragment der
leichten Kette eines Antikörpers
V
H = F
V-Fragment der
schweren Kette eines Antikörpers
Hinge
= Verknüpfungsregion
aus Antikörpern
TM(Cβ) = Transmembrane
der konstanten Domäne
eines β-Ketten
TCR
Cyt(Cβ)
= Cytoplasmatische Anteil der konstanten Domäne eines β-Ketten TCR
Die Beschreibung
in den eckigen Klammern präzisiert
das zuvor benannte Einzelketten(sc)-Konstrukt. Senkrechte Striche deuten
Wechselwirkungen zwischen benachbarten Domänen an.
Die Integration einer aus Antikörpern entnommenen "hinge"-Region gilt nicht
notwendig. Das in diesem Absatz beschriebene Konzept läßt die Bedeutung
und Notwendigkeit der α-CPM-Domäne der α-Kette eines
TCR im Fall der Verwendung von CH2-CH3 bzw. CH1 oder
CL unberücksichtigt.
Vorstellbar wäre
die Integration von CH2CH3 bzw.
CH1 oder CL anstelle
der in oben skizzierten Konstrukten verwendeten Cβ bzw. Cα. Die Anordnung
der variablen Domänen
in den Einzelketten (z.B. Vα-Li-Vβ versus Vβ-Li-Vα) ist beliebig
und diktiert nicht notwendigerweise die Verwendung der sich direkt
anschließenden
konstanten Domäne
(z.B. Vα versus Vβ).
Das "T-body"-genannte Konzept umfaßt alle
chimären
Doppelketten- und Einzelketten-Rezeptoren, die
neben dem Membrananker als wesentliches Bestandteil die variablen
Domänen
Antigen-spezifischer Antikörper
(Anti-"body") beinhalten (Eshhar
et al; 1993, 1997) und z.B. durch viralen und/oder nicht-viralen
Gentransfer in einen Thymozyt ("T"-cell) eingebracht
werden.
Durch die Möglichkeit in dem hier vorgestellten,
neuen Verfahren auf die signalgebende CD3ζ-Domäne am C-Terminus der scTCR-
bzw. scFv-Chimären
verzichten zu können,
könnten
funktionell andere signalgebende Molelüle wie die der zu der Syk-Familie
gehörigen
Tyrosinkinasen fusioniert werden (Fitzer-Attas et al., 1998). Hierdurch
kann neben dem Erhalt der konformationellen Stabilität zusätzlich eine
Optimierung der Signaltransduktion erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der Linker
(Li) ausgewählt
ist aus Li(Gly4Ser)3,
Li218 (Whitlow et al., 1993) und LiSL7 (Robinson et al., 1998).
Es können
aber auch andere geeignete Linker verwendet werden, da das erfindungsgemäße Verfahren
nicht auf die hier genannten Linker beschränkt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für alle Einzelketten-Antigen-erkennenden
Konstrukte verwendet werden. Als Antigene kommen alle durch diese
Konstrukte erkannten Antigene in Frage, so zum Beispiel Erkrankungs-spezifische
Oberflächen-Antigene,
wie zum Beispiel TAA oder Infektions-spezifische Oberflächen-Antigene,
wie zum Beispiel HIV-spezifische Oberflächen-Antigene oder CMV-spezifische
Oberflächen-Antigene.
Natürlich
können
auch weitere eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, in dem die oben
genannten Schritte c) und d) durch die folgenden Schritte ersetzt
werden:
- c')In
vitro-Translation oder in vivo-Translation der genetischen Konstrukte
aus Schritt a) und/oder b) und gegebenenfalls anschließende Isolierung
und/oder Reinigung der solubilisierien scARC-Fragmente, und
- d') Rekonstitution
der translatierten scARC-Fragmente in eine T-Zelle ("Liposomen-Transfer").
Die Einbringung in die T-Zielzellen
kann auf jede bekannte Weise erfolgen, die eine anschließende Expression
des stabilisierten scTCR durch die T-Zelle ermöglicht. Wege sind zum Beispiel über die
Induktion von Phagocytose durch die Zellen oder ein Verfahren, wobei
die Einbringung durch Lipid-vermittelten Transfer, wie zum Beispiel über Micellen
oder Liposomen-Transfer erfolgt. Eine Übersicht über die Verwendung von Liposomen
gibt u.a. der Artikel Banerjee R. Liposomes: applications in medicine.
J Biomater Appl 2001 Jul;16(1):3-21. Der
Transfer über
Mizellen ist dem Fachmann im Stand der Technik aus zahlreichen Publikationen
bekannt.
Dabei erfolgt somit eine Expression
des z.B. scTCR außerhalb
der zuletzt vorgesehenen exprimierenden T-Zelle und eine anschließende Einbringung
des scTCR und der ebenfalls vorhandenen heterologen konstanten Domäne in dieselbe.
Bei der in vitro Translation kann die Translation in zellfreien
Systemen erfolgen, die käuflich
erhältlich
sind. Die "Translation" umfaßt aber
auch die rein synthetische Herstellung der Peptidketten, die weiter
unten im Rahmen der Peptide genauer erläutert wird. Im Falle der in
vivo Translation kann diese in einer geeigneten Wirtszelle erfolgen,
die vorher mit einem Expressionskonstrukt der Kette transformiert
wurde und diese anschließend
herstellt. Geeignete Vektoren und Verfahren zur Expression sind
dem Fachmann im Stand der Technik ausreichend bekannt. Nach der
Expression kann es erforderlich sein, die Expressionsprodukte entweder
aus den Zellen zu reinigen oder aus dem Medium zu extrahieren, in
das sie gegebenenfalls durch die Wirtszelle sekretiert wurden. Geeignete
Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und können Hefe, CHO-Zellen, Insektenzellen,
Bakterien oder andere sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung können
beide scARC-Fragmente auf einem genetischen Konstrukt lokalisiert
sein. Dadurch werden der scARC und die heterologe konstante Domäne in der
richtigen Stöchiometrie
von 1:1 exprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung können
die Bestandteile der scARC-Fragmente aus einem Säugetier stammen, und insbesondere
humanen und/oder murinen Ursprungs sein. So können gemäß einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren
die zu mutierenden Domänen
der scTCR-Ketten ausgewählt
sein aus Säugetier-,
und dabei insbesondere aus menschlichen und/oder Maus-Domänen. Besonders bevorzugt
ist dabei eine scTCR-Kette oder scFv-Fragment, die/das humanisiert
ist, was zu u.a. einer verbesserten Verträglichkeit des TCR oder Fragments
fuhrt.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als scARC
ein humanisierter oder partiell humanisierter scARC, ein mit zusätzlichen
(funktionellen) Domänen
versehener scARC oder ein mit alternativen Domänen versehener scARC, z.B mit
einer anderen Transmembran-Domäne
als Membrananker versehener scARC, verwendet.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als scTCR
ein alphalbeta scTCR, gamma/delta scTCR, einen humanisierten oder
partiell humanisierten scTCR, einen mit zusätzlichen (funktionellen) Domänen versehenen
scTCR oder einen mit alternativen Domänen versehenen scTCR, z.B mit
einer anderen Transmembran-Domäne
als Membrananker versehenen scTCR verwendet. Dabei können als
alpha-Kette und Beta-Kette die alpha- und Beta-Ketten eines MDM2(81-88)-spezifischen
scTCR verwendet werden. Anhand dieses scTCR konnte das erfindungsgemäße Prinzip
erstmals erfolgreich angewendet werden.
Bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren,
wobei als Transfektionssystem ein retroviraler Vektor, insbesondere
pBullet verwendet wird. In den Vektoren können auch IRES-Elemente verwendet werden
(Jackson et al., Jang et al., 1990).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen stabilisierten scARC, der nach einem Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wird. Weiter besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäß stabilisiertes
scARC, der ein TAA-spezifischer scTCR oder ein TAA-spezifischer
scFv-ARC ist, insbesondere ein mutierter MDM2(81-88)-spezifischer
TCR. Dieser stabilisierte scTCR gemäß der vorliegenden Erfindung
kann auch in Form eines Fusionsproteins, umfassend die erfindungsgemäß modifizierten
Polypeptide oder Teile davon vorliegen. Das Fusionsprotein kann
dadurch gekennzeichnet sein, daß es
die ζ-Region
von CD3 oder CD8 oder CD16 oder Teile davon umfaßt, insbesondere die ζ-Region von
humanem CD3 oder CD8 oder CD16 oder Teile davon. Insbesondere kann
das erfindungsgemäße Fusionsprotein
die ζ-Kette
des CD-Komplexes oder ITAM-Motive der ζ-Kette oder Teile davon umfassen,
insbesondere die ζ-Kette
von humanem CD oder Teile davon. Das Fusionsprotein kann weiterhin
dadurch gekennzeichnet sein, daß es
CD8α oder das
Lck-Bindungsmotiv
von CD8α umfaßt oder
Teile davon, insbesondere von humanem CD8α.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft eine isolierte Nukleinsäure,
die eine für
eine konstante Domäne
SP-Cα oder
konstante Domäne
SP-Cβ 1
oder SP-Cβ2
kodierende Sequenz eines stabilisierten scTCR umfaßt. Diese
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann
eine DNA, RNA, PNA (Peptide nucleic acid) oder p-NA (Pyranosyl nucleic
acid), vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA
mit einer Länge von
mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden,
insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden sein. Die Nukleinsäure kann
dadurch gekennzeichnet sein, daß die
Sequenz der Nukleinsäure mindestens
ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Sie kann auch in
Form ihrer antisense-Sequenz vorliegen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft auch ein DNA- oder RNA-Vektormolekül, das mindestens eine oder
mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäure(n) umfaßt und das
in Zellen exprimierbar ist. Für
die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA
bevorzugt, wobei der für
das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser
Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Konsensus Sequenz
(Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15:8125-48) liegenden Start-Codon
(ATG) bis zum nächsten
Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG
liegt. Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
ist die Konstruktion von antisense Oligonukleotiden (Zheng und Kemeny,
1995, Clin. Exp. Immunol. 100:380-2) und/oder Ribozymen (Amarzguioui,
et al. 1998, Cell. Mol. Life Sci. 54:1175-202; Vaish, et al., 1998,
Nucleic Acids Res. 26:5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol.
15:921-2). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verringern
und/oder die Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure inhibieren.
So kann beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in
Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Oligonukleotide
können
sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich
beispielsweise auch für
Haut, epidermale und dermale Zellen, insbesondere, wenn die antisense
Oligonukleotide mit Liposomen komplexiert werden (Smyth et al.,
1997, J. Invest. Dermatol. 108:523-6; White et al., 1999, J. Invest.
Dermatol. 112:699-705). Für
die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA
oder RNA bevorzugt.
Neben den aus Zellen isolierten natürliche Nukleinsäuren können alle
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder
deren Teile auch synthetisch hergestellt worden sein. Weiterhin
kann zur Durchführung
der Erfindung eine Nukleinsäure
verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann
die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise
chemisch anhand der beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen
des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert
werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman,
A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584).
Oligonukleotide werden in der Regel
schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der
Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft,
die Nukleinsäure
zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen
langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der
Zelle beibehalten wird (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240;
Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche
Stabilisierung durch die Einführung
von einer oder mehrerer Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch
die Einführung
einer oder mehrerer Nicht-Phosphor-Internukleotide,
erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide
sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (WO 95/11910;
Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116).
Modifizierte Internukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphorbrücken in
einer Nukleinsäure,
die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen
eingesetzt werden können,
enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat,
Phosphorodithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise
Siloxanbrücken,
Carbonatbrücken,
Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder
Thioetherbrücken
enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen
eingesetzt werden kann, verbessert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids,
shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, adenoviralen
Vektors, retroviralen Vektors (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene
transfer and expression",
BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) und/oder gentherapeutisch
wirksamen Vektors, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem
Vektor vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch
wirksamen Vektor enthalten sein. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch
wirksame Vektor T-Zell-spezifische regulatorische Sequenzen, die
funktionell mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden
sind. Die Expressionsvektoren können
prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele
für prokaryotische
Expressionsvektoren sind für
die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische
Expressionsvektoren für
die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25
oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768),
für die
Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in
EP-B1-0 127 839 oder
EP-B1-0 549 721 offenbart,
und für
die Expression in Säugerzellen
z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche
alle allgemein erhältlich
sind.
Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren
auch für
die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor
für die
Expression in E. coli (siehe z. B.
EP-B1-0 154 133 ), den Met 25, GAL 1 oder
ADH2-Promotor für
die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258,
2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression
in Insektenzellen (siehe z. 13.
EP-B1-0 127 839 ). Für die Expression in Säugetierzellen
sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive,
regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische
Expression in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer
und/oder Repressorsequenzen. Beispiel für geeignete regulierbare Elemente,
die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die
von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren,
CMV-Enhancer, CMV-Promotor, CMV-LTR-Hybride, SV40 Promotor oder
LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et
al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und
Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV,
HPV, EBV, HTLV oder HIV. Ein Beispiel für ein regulierbares Element,
das eine regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglicht,
ist der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entsprechenden
Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die
T-Zell spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder
Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen,
die für
Proteine kodieren, die nur in diesen Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die
Zellzyklus-spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen,
sind Promotoren folgender Gene: cdc25, Cyclin A, Cyclin E, cdc2,
E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet.
13, 3-6). Beispiele für
regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in
Eukaryonten ermöglichen,
sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukosemangel, durch Phosphatkonzentration
oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zur Transfektion
einer Wirtszelle verwendet werden, bei der es sich bevorzugterweise
um eine T-Zelle handelt. Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle,
die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie auf ihrer Oberfläche einen
erfindungsgemäß stabilisierten
scTCR oder Fusionsprotein oder stabilisiertes scFv-Fragment exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft somit ein Verfahren
zur Herstellung eines Polypeptids zur Diagnose und/oder Behandlung
von mit Onkoproteinen in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder
zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten
Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure auf
geeignete Weise exprimiert wird.
Das Polypeptid wird so beispielsweise
durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem
geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach
dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen
eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der
Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, Insektenzellinien, z. B. von
Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293,
HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.
Um die Einführung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und
damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen
Zelle durch Transfektion, Transduktion, Transformation oder Infektion
zu ermöglichen,
kann die Nukleinsäure
als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors oder
Partikels vorliegen. Als virale Vektoren oder Partikel eignen sich
hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Retroviren, Adenoviren,
adenoassozüerte
Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Träger eignen sich hierbei besonders:
Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte
DNA.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen
Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Adenovirusvektoren oder
retrovirale Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer
et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Weijtens et al. "A retroviral vector
system ,,STITCH,;
in combination with an optimized single chain antibody chimeric
receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression
in human T-lymphocytes",
Gene Therapy (1998) 5,1995-1203).
Ein bevorzugter Mechanismus, erfindungsgemäße Polypeptide
in vivo zur Expression zu bringen, ist der virale Gen-Transfer,
insbesondere mit Hilfe retroviraler Partikel. Diese werden vorzugsweise
genutzt, entsprechende Zielzellen, vorzugsweise T-Lymphozyten, des
Patienten ex vivo mit den für
erfindungsgemäße Polypeptide
kodierenden Genen oder Nukleotidsequenzen durch Transduktion zu
versehen. Die Zielzellen können
daraufhin im Sinne eines adoptiven Zelltransfers wieder in den Patienten
reinfundiert werden, um mit der de novo eingefügten Spezifität tumorizide
und/oder immunmodulierende Effektorfunktionen zu übernehmen. Jüngst wurden
auf diesem Wege sehr gute gentherapeutische Erfolge in der Behandlung
der durch Immuninkompetenz gekennzeichneten SCID-X1- Krankheit bei
Neugeborenen erzielt, in dem hämatologische
Vorläuferzellen
mit einem analogen intakten Transgen einer in den Kindern vorkommenden
nicht-funktionellen mutierten Variante des γ-Kettengens, das für die Differenzierung in die
verschiedenen Effektorzellen des adaptiven Immunsystems essentiell
ist, retroviral versehen wurden (Cavazzana-Calvo et al., 2000).
Weiterhin besteht die Möglichkeit
den Gentransfer in vivo durchzuführen,
einerseits durch präferentiell stereotaktische
Injektion der infektiösen
Partikel, andererseits durch direkte Applikation von Viren-produzierenden
Zellen (Oldfield, et al. Hum. Gen. Ther., 1993, 4:39-69).
Die zum Transfer von Genen häufig eingesetzten
viralen Vektoren sind nach heutigem Stand der Technik vorwiegend
retrovirale, lentivirale, adenovirale und adeno-assoziierte virale
Vektoren. Diese sind von natürlichen
Viren abgeleitete zirkuläre
Nukleotidsequenzen, in denen zumindest die viralen Strukturprotein-kodierenden
Gene durch das zu transferierende Konstrukt ausgetauscht werden.
Retrovirale Vektorsysteme schaffen
die Voraussetzung für
eine langanhaltende Expression des Transgens durch die stabile,
aber ungerichtete Integration in das Wirtsgenom. Vektoren der jüngeren Generation
besitzen keine irrelevanten und potentiell immunogenen Proteine,
des weiteren gibt es keine vorbestehende Immunität des Empfängers gegenüber dem Vektor. Retroviren
enthalten ein RNA-Genom, das in eine Lipidhülle verpackt ist, die aus Teilen
der Wirtszellmembran und Virusproteinen besteht. Zur Expression
viraler Gene wird das RNS-Genom
revers transkribiert und mit dem Enzym Integrase in die Zielzell-DNS
integriert. Diese kann daraufhin von der infizierten Zelle transkribiert
und translatiert werden, wodurch virale Bestandteile entstehen, die
sich zu Retroviren zusammenfigen. RNS wird ausschließlich dann
in die neu entstandenen Viren eingefügt. Das Genom der Retroviren
besitzt drei essentielle Gene: gag, das für virale Strukturproteine,
sogenannte gruppenspezifische Antigene kodiert, pol für Enzyme
wie Reverse Transkriptase und Integrase und env für das Hüllprotein
("envelope"), das für die Bindung
des wirtsspezifischen Rezeptors verantwortlich ist. Die Produktion
der replikationsinkompetenten Viren findet nach Transfektion in
sogenannten Verpackungszelllinien statt, die zusätzlich mit den gag/pol-kodierenden
Genen ausgestattet wurden und diese "in trans" exprimieren und somit die Ausbildung
replikationsinkompetenter (d.h. gag/pol-deletierter) transgener
Viruspartikel komplementieren. Eine Alternative ist die Cotransfektion
der essentiellen Virusgene, wobei nur der das Transgen enthaltende
Vektor das Verpackungssignal trägt.
Die Separation dieser Gene ermöglicht einerseits
die beliebige Kombination des gal/pol-Leserahmens mit aus verschiedenen Stämmen gewonnenen
env-Leserahmen, wodurch Pseudotypen mit verändertem Wirtstropismus entstehen,
andererseits kann dadurch die Bildung replikationskompetenter Viren
innerhalb von Verpackungszellen drastisch reduziert werden. Das
aus "gibbon ape
leukemia virus" (GALV)
abgeleitete Hüllprotein,
das im "stitch" bzw. "bullet"-Vektorsystem Verwendung
findet, ist in der Lage humane Zellen zu transduzieren und ist in
der Verpackungszelllinie PG13 mit amphotropen Wirtsbereich etabliert
(Miller et al., 1991). Zusätzlich
wird die Sicherheit durch selektive Deletion von nicht-essentiellen
Virussequenzen zur Verhinderung einer homologen Rekombination und
somit der Produktion replikationskompetenter Partikel erhöht.
Neue, nicht-virale Vektoren bestehen
aus autonomen, sich selbst-integrierenden DNS-Sequenzen, den Transposonen, die durch
z.B. liposomale Transfektion in die Wirtszelle eingeschleust werden
und erstmals erfolgreich zur Expression humaner Transgene in Säugerzellen
eingesetzt wurden (Yant et al., 2000).
Gentherapeutisch wirksame Vektoren
lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit
Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz,
insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und
Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Hilfsstoffe, die den
Transfer von Nukleinsäuren
in die Zelle erhöhen,
können
beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder
synthetische Peptid-DNA-Moleküle,
die den Transport der Nukleinsäure
in den Kern der Zelle ermöglichen,
sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al.
(1999) Nature Biotech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die
die Freisetzung von Nukleinsäuren
in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen
(Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al.
(1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann
und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form
von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die
erfindungsgemäße Nukleinsäure auf
Goldpartikeln aufgingt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, bevorzugt
in die Haut, oder Zellen schießt
(Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112:775-81).
Für
die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist
es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein
oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen,
vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder
eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz
oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung
der mRNA erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14
und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
478-482).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die ein DNA- oder RNA-Vektormolekül gemäß der Erfindung
enthält.
Diese kann insbesondere eine T-Zelle sein, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor
oder einem anderen erfindungsgemäßen Genkonstrukt
transformiert ist. Wirtszellen können
sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele
für prokaryotische
Wirtszellen sind E. coli und für
eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.
Ein weiterer Aspekt betrifft somit
eine rekombinante T-Zelle, die mindestens einen stabilisierten scTCR gemäß der vorliegenden
Erfindung exprimiert. Eine besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle
ist eine transgene T-Vorläuferzelle
oder eine Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein
erfindungsgemäßes Genkonstrukt
oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette
umfaßt.
Verfahren zur Transformation oder Transduktion von Wirtszellen und/oder
Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Bei spiel
Elektroporation oder Mikroinjektion. Eine besonders bevorzugte transformierte
Wirtszelle ist eine patienteneigene T-Zelle, die nach der Entnahme
mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt
transfiziert wird. Erfindungsgemäße Wirtszellen
können
insbesondere dadurch erhalten werden, daß dem Patienten eine oder mehrere
Zellen, bevorzugterweise T-Zellen, insbesondere CD8+-T-Zellen
entnommen werden, die dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen
Konstrukten transfiziert oder transduziert werden, um so erfindungsgemäße Wirtszellen
zu erhalten. Die ex vivo generierten spezifischen T-Zellen können dann
anschließend
in den Patienten reimplantiert werden. Das Verfahren ähnelt somit
dem bei Darcy et al. ("Redirected
perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically
engineered CTL" J.
Immunol., 2000, 164:3705-3712) beschriebenen Verfahren unter der
Verwendung von scFv anti-CEA Rezeptor transduzierten ZTL, Perforin
und γ-IFN.
Die erfindungsgemäß modifizierten (Poly)peptide
und deren Derivate können
zum Beispiel auch zur aktiven und/oder passiven Immunisierung von
Patienten mit Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, die
zum Beispiel mit MDM2 in Zusammenhang stehen, eingesetzt werden.
Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft
somit eine Verwendung bei der eine Krebserkrankung behandelt wird,
insbesondere eine Krebserkrankung, die mit einer veränderten
Expression von MDM2 in Zusammenhang steht, um so die Induktion,
Erzeugung und Zunahme vom Onkogen-spezifischen, z.B. MDM2-spezifischen ZTL zu
erreichen und die Tumor- und Leukämiezellen der betreffenden
Patienten spezifisch abzutöten.
Solche Erkrankungen umfassen zum Beispiel solide Tumorerkrankungen,
lymphohämatopoetische
Neoplasien, maligne hämatologische
Erkrankungen, auch in Form eines multiplen Myeloms (oder Plastozytoms),
eines histiozytischen Lymphoms und eines CML-Blastenschubs. Damit
zusamenhängende
TAAs, gegen die entsprechende TCR entwickelt werden können, sind
zum Beispiel p53, Her-2/neu, Ras, Tyrosinase, MART, Gp100, MAGE, BAGE,
MUC-1, TRP-1, TRP-2, CD45, CD19 und PRDI-BF1.
Ein besonders bevorzugter Aspekt
der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch eine Zusammensetzung,
insbesondere pharmazeutische Zusammensetzung, die eine rekombinante
T-Zelle gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung eines stabilisierten scTCR
gemäß der vorliegenden
Erfindung, eines mutierten TCR gemäß der vorliegenden Erfindung
und/oder einer rekombinanten T-Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung
zur Herstellung von Therapeutika und/oder Prophylaktika zur Behandlung
von Krebserkrankungen. Bei einer besonders bevorzugten Art der Behandlung
wird dem Patienten eine oder mehrere Zellen, bevorzugterweise T-Zellen,
insbesondere CD8+-T-Zellen entnommen, die
dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen
Konstrukten transduziert oder transfiziert werden. Die ex vivo generierten
spezifischen T-Zellen können
dann anschließend
in den Patienten re-implantiert werden. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann weiterhin geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist auch ein Arzneimittel zur Indikation und Therapie von mit Onkoprotein-Protein
assoziierten Erkrankungen, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält, sowie
ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung
von mit Onkoprotein-Protein assoziierten Erkrankungen, bei dem eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure oder
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird. Als Therapeutika
und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe, rekombinante
Partikel oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als
Wirkstoff (a) das erfindungsgemäße stabilisierte
scTCR-Rezeptor Polypeptid und/oder seine Derivate und/oder (b) eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten
und/oder (c) in vitro oder ex vivo erzeugte T-Lymphozyten, die einen
spezifisch mutierten gegen Onkoprotein gerichteten scTCR enthalten.
Für
die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein
Arzneimittel und/oder rekombinanter Partikel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter
Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch
wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter
Form enthält.
Der pharmazeutische Träger
ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem
pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbesondere von
ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität
von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter.
Zusätzlich kann
der pharmazeutische Träger
geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise
Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe
enthalten.
Es ist denkbar, die Effizienz des
Cα/scTCR-Konzeptes
weiter durch Chimärisierung
an signalgebende Domänen
wie CD3ζ oder
Tyrosinkinasen zu verbessern (z.B. Cα-ζ/scTCR-ζ). Verschiedene scTCR-Konstrukte,
unabhängig
ob humanen oder murinen Ursprungs sowie der Natur des Linkers und
der gewählten
Orientierung der variablen Domänen,
werden in diesem Ansatz mitberücksichtigt.
CD3ζ-Ketten besitzen neben ihrer
signalgebenden Funktion, das Potential zur Homodimerisierung und
erleichtern somit die Assoziation einer chimären Caζ-Kette mit dem chimären scTCRζ (Bolliger,
Johannsson, 1999). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, inverse
scTCR-Konstrukte der Orientierung SP-Vβ-Li-Vα-Cαv zu konzipieren, welche anstelle
der Cβ-Domäne eine
Cα-Domäne beinhalten
und in Kombination mit einer SP-Cβ-Domäne kotransferiert
werden (1b). Ferner
ist es denkbar, beliebige variable Domänen, von Antikörpern oder
T-Zell-Rezeptoren abgeleitet, an beliebige Invariante Domänen in ihrer
Funktion als a) Abstandshalter zur Transmembranen, b) als Dimerisierungsdomäne, c) als
Membrananker und d) als Adapterprotein zur Signalkopplung zu fusionieren
(1c). Das vorgestellte
Konzept ist zudem Spezies-unabhängig
und kann auf humane Moleküle übertragen
werden.
Zudem ist es denkbar, daß das scTCR
stabilisierende konstante Domänen-Konzept
auf Einzelketten- Antikörper
(scFv) durch die Koexpression der komplementären CHL-
bzw CL-Kette auszudehnen. Das Konzept ist
somit generalisiert (1c).
Alle bisher und künftig entwickelten TAA-spezifischen
TCR, ob murinen oder auch humanen Ursprungs, die in der adoptiven
Immuntherapie durch Gentransfer in humane T-Zellen von Tumorpatienten
verwendet werden sollen, können
mit geringem Aufwand nach beschriebenem Modell entwickelt werden.
Der vorgestellte Ansatz könnte
somit eine weite Verbreitung in der klinischen Applikation finden
(Bolhuis et al., 1998; Cavazzana-Calvo et al., 2000; Fischer et
al., 2002).
Der Begriff "stabilisierter scARC" bezieht sich auf ein stabilisiertes
Einzelkettenantigenerkennendes genetisches Konstrukt (scARC), bei
dem zusätzlich
zu dem herkömmlichen
V1/2-Li-V2/1-C4/3-sc-Konstrukt eine entsprechende heterodimere
konstante Domäne
C4/3 koexprimiert wird. Bevorzugterweise
handelt es sich bei den scARC um stabilisierte Einzelketten-TCR
(scTCR) oder stabilisierte Antikörper-scFv-Fragmente,
die weiter bevorzugt tumorassoziierte Peptidantigene (TAA) erkennen.
Der Begriff "stabilisierter
scTCR" bezieht sich auf
die Kombination des jeweiligen scTCR, z.B. in der Orientierung SP-Vα-Li-Vβ-Cβ zusammen
mit der konstanten Domäne
SP-Cα oder
des scTCR in der Orientierung SP-Vβ-Li- Vα-Cα zusammen
mit der konstanten Domäne
SP-Cβ. Diese
Paarungen bilden dann optimale stabilisierte und richtig gepaarte
scTCR aus. Dabei können
die stabilisierten scTCR aus der Expression eines oder zweier verschiedener
genetischer Konstrukte stammen.
Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz,
die für
ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Vorläufer kodiert.
Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder
jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische,
beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
Es ist bekannt, daß kleine
Veränderungen
in der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorhanden
sein können,
zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder
daß nicht
translatierte Sequenzen am 5, und/oder 3,-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen
Aktivität wesentlich
verändert
wird. Diese Erfindung umfaßt
deshalb auch sogenannte "funktionelle
Varianten" der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen
zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer,
gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration
erfolgt und stabil bleibt.
Die Erfindung soll nun weiter anhand
der beigefügten
Beispiele und Figuren erläutert
werden, ohne durch diese eingeschränkt zu werden. Es zeigt:
SEQ
ID Nr. 1: die Nukleinsäuresequenz
des Konstrukts SP-Cα-Domäne, und
SEQ
ID Nr. 2: die Aminosäuresequenz
des Konstrukts SP-Cα-Domäne.
1 zeigt
eine Darstellung der einzelnen Modellsysteme:
- a)
Schematische Darstellung eines Wildtyp T-Zell-Rezeptor bestehend
aus konstanter α-
und β-Domäne, sowie
variabler α-
und β-Domäne.
- b) Einzelketten-TCR in zwei Orientierungen. Die beiden variablen
Domänen
sind jeweils über
einen Linker miteinander verbunden. Die jeweils nicht im scTCR vorhandene
konstante Domäne
wird koexprimiert und führt
zu einer Stabilisierung des Konstruktes.
- c) Generalisierte Darstellung des erfindungsgemäßen stabilisierten
scARC-Konzepts. V1/2 bezeichnet variable
Domänen,
während
C3
/
4 für Invariante
Domänen
steht. Das Konzept läßt sich
sowohl für
scTCR als auch scFv-Fragmente verwenden.
2 zeigt
eine Superposition des Protein-Rückgrats
von Protein-Kristallstrukturen eines murinen H2-Kb-restringierten
(1tcr, Garcia et al. 1998) und eines humanen HLA-A2-restringierten (1bd2,
Ding et al., 1998) 7-Zell-Rezeptors. Der heterodimere humane TCR
ist dunkelgrau (in der farbigen Darstellung: rot) (αTCR) und
hellgrau (in der farbigen Darstellung: blau) (ζ3TCR) für die jeweiligen Ketten dargestellt;
der murine TCR ohne Farbcodierung für die einzelnen Ketten insgesamt
grau.
3 zeigt
eine Darstellung des Protein-Rückgrats
von 1tcr mit ausschließlich
denjenigen Seitenketten, die zu 1bd2 identisch sind. Die obere Graphik
illustriert das Vorhandensein weniger identischer Reste im Kontaktbereich
der variablen Domänen
(Vα, Vβ) der beiden
Ketten. Die untere Graphik ist zur oberen um die Achse in der Papierebene
derart gedreht, so dass diese das zahlreiche Vorhandensein identischer
Aminosäuren
im Kontaktbereich der konstanten Domänen (Cα, Cβ) dokumentiert.
4 zeigt
die Aminosäure-
bzw. Basensequenz des Konstruktes SP-Cα-Domäne analog zu SEQ ID No. 1.
Das Signalpeptid der Vα-Domäne wurde
mittels PCR zur konstanten Cα-Domäne fusioniert.
Die Basensequenz ist jeweils in die zugehörige Aminosäuresequenz übersetzt und wird im 1-Buchstaben-Code
dargestellt.
5 zeigt
eine FACS-Analyse der humanen transduzierten T-Zellen, die die beschriebenen
Konstrukte exprimieren. Dargestellt ist eine 2-fach-Färbung von
vbeta6-FITC und CD8-PCS: nur CD8-positive, transduzierte T-Zellen
zeigen die gewünschte
Effektorfunktion. Die vβ6-Anfärbung erbringt
den Nachweis der β-Kette.
6 zeigt
einen Cytotoxizitäts-Test
(Stanislawski & Voss
et al., 2001) mit den beschriebenen Konstrukten. TAP-defiziente
T2 wurden exogen mit den angegebenen MDM2(81-88)-Peptid-Konzentrationen beladen und auf
Erkennung durch die transduzierten T-Zellen getestet: das Ausmaß der Lyse
spiegelt sich in der Quantität
des zellulär
aufgenommenen und durch Lyse freigesetzten 51Cr
wieder. Als irrelevantes Peptid diente ein p53-abgeleitetes Peptid.
Es sind sowohl die "Effektor:
Target" – Verhältnisse,
als auch die korrigierten CD8+vβ6+-Verhältnisse
dargestellt.
Beispiele
Die Konzeption der z.B. Cα-Domäne sollte
derart erfolgen, daß diese
stabil an der Zelloberfläche
exprimiert werden kann und zudem durch die Interaktion mit der Cβ-Domäne eines
scTCR dessen Oberflächenexpression
stabilisiert und letztendlich zu einer erleichterten Signaltransduktion
und somit Effektorfunktion der humanen T-Zelle führt. Hierzu wird der Cα-Domäne das Signalpeptid
der αTCR-Kette
vorgeschaltet. Dies dient nur als Beispiel, es können auch andere als die von
der αTCR-Kette
abgeleiteten Signalpeptide verwendet werden, solange wie die Proteine
korrekt post-translational prozessiert werden. Somit besteht das
vorhandene Konstrukt aus dem angefügten aminoterminal gelegenen
Signalpeptid, der konstanten Domäne
mit der sich direkt anschließenden α-CPM, einer
transmembranen Region und der carboxyterminal gelegenen cytoplasmatischen
Region. Sowohl die DNA-Sequenz des Signalpeptides als auch die der
darauf folgenden Cα-Domäne wurden
von der DNA-Sequenz des o.g. murinen MDM2(81-88)-spezifischen T-Zell-Rezeptors übernommen. Die
entsprechende Fusion zwischen Signalpeptid und Cα-Domäne wurde mit Hilfe einer konventionellen
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) durchgeführt. Hierbei wurde das Signalpeptid
mittels des 5'-komplementären Primers
eingefügt.
Das entstandene PCR-Produkt wurde in den retroviralen Vektor pBullet
kloniert (Willemsen et al., 2000). Das Transfektionssystem (Weijtens
et al., 1998), das eine Kotransfektion einzelner Plasmide, jeweils
kodierend für
einen Einzelketten-T-Zell-Rezeptor oder für die Cα-Domäne vorsieht, ermöglichte
die Kombination verschiedener Einzelketten-TCR-Konstrukte mit dem
Konstrukt der Cα-Domäne in Fusion
zum Signalpeptid. Die scTCR sollten für sich sowie in Kombination
mit dem beschriebenen SP-Cα-Konstrukt
strukturell über
FACS-Analyse und funktionell über
cytotoxische Lyse von antigenpräsentierenden
Zellen (APC) analysiert werden. Die in den humanen T-Zellen vorliegenden
endogenen TCR störten
hierbei die Analyse der exogen transferierten Konstrukte nicht,
da die scTCR eine unerwünschte
Paarung mit den endogenen Rezeptoren verhindern und dadurch keine
funktionellen, autoreaktiven T-Zell-Rezeptoren gebildet werden.
Zudem ist es von Bedeutung, diese Experimente in einem experimentellen "setting" durchzuführen, das
möglichst
nahe an der klinischen Applikation liegt.
Die variablen Domänen werden hierbei über ein
kurzes Peptid, einen "Linker" (Li), unter Wegfall
einer von beiden konstanten Domänen,
in diesem Modell-System unter Wegfall der Cα-Domäne, kovalent miteinander verknüpft. Um
eine stabile Zell-Oberflächen
Expression zu erreichen, werden diese TCR der Orientierung SP-Vα-Li-Vβ-Cβ zusammen
mit der im Konstrukt nicht vorhandenen Cα-Domäne in humane T-Zellen kotransferiert.
Dabei bilden jeweils ein Cystein der Cα- bzw. Cβ-Domäne eine Disulfidbrücke. Der
Ansatz beruht auf der vergleichbaren Struktur und Funktion der Cα-Domäne mit der
pTα-Kette.
Um eine membranständige
Expression der Cα-Domäne zu erreichen,
ist diese mit dem Signalpeptid (SP) der αTCR-Kette fusioniert (4). Dieses wird im Wege
der posttranslationalen Modifikation im Endoplasmatischen Reticulum
(ER) durch Signalpeptidasen abgespalten. Das gewählte Signalpeptid besteht aus
21 überwiegend
hydrophoben Aminosäuren
des scTCR, welches für
die membranständige
Verankerung im ER und spätere
Translokation der T-Zell-Rezeptor-Ketten
in der Zellmembran benötigt
wird. Des weiteren erfüllt
die Cα-Domäne Aufgaben
der Signaltransduktion, die nach Antigen-Erkennung in Gang gesetzt
wird. Hierbei ist besonders ein konserviertes Motiv innerhalb der
CP-Domäne
mit folgender Struktur von Bedeutung: FETDxNLN. Dieses Motiv vermittelt einen
Signaltransfer zwischen TCR und CD3ζ-Komplex (Bäckström et äl., 1996; Trop et al., 1999).
Um davon auszugehen, daß alle T-Zellen
das Transgen beherbergen, wurden nach Transduktion die T-Zellen über G418
(Selektionsmarker für
die SP-Cα-Domäne, über ein
IRES-Element dem
Transgen nachgeschaltet), als auch über Puromycin selektiert (Selektionsmarker
für die
Einzelketten-T-Zell-Rezeptor-Ketten). Somit überlebten nur diejenigen T-Zellen,
die sowohl die bicistronische mRNA aus SP-Cα-Domäne und G418-Marker als auch
die bicistronische mRNA aus scTCR-Transgen und Puromycin bildeten.
Unterschiede in der FACS-Anfärbung rühren daher
nicht von unterschiedlichen Transduktionseffizienzen der humanen T-Zellen
her, sondern sind Ausdruck der jeweiligen TCR-Stabilität. Die strukturelle
Avidität
als Ausdruck stabiler Expression der verschiedenen TCR-Konstrukte
wurde über
die subfamilienspezifische Anfärbung
der β-Kette
analysiert (vβ6-FITC; 5). Es zeichnet sich bereits
in der vβ6-Anfärbung ab,
daß die
kotransduzierten T-Zellen (scTCR / Cα) eine deutlich stabilere scTCR-Expression
(vβ 6+) aufweisen, als diejenigen, die lediglich
den scTCR exprimieren. Im FACS als auch im Cytotoxizitätstest wurden
drei verschiedene scTCR analysiert, die sich jeweils in ihrer Linkersequenz
sowie Linkerlänge
unterscheiden. Das scTCR-Li218-Konstrukt weist
eine Linkerlänge
von 18 AS auf (Whitlow et al., 1993), während der Linker von scTCR-LiSL7
aus 19 AS besteht (Robinson et al., 1998). Hinsichtlich der Sequenz
läßt sich
Linker SL7 mit dem Standardlinker (GGGGS)3 vergleichen,
jedoch weist Linker SL7 eine differente Abfolge der Aminosäuren Glycin
und Serin auf. Zusätzlich
befindet sich an Position 2 die AS Threonin. Für diesen Linker ist eine erhöhte thermodynamische und auch
proteolytische Stabilität
gegenüber
Proteolyse sowie eine verbesserte Expressionseigenschaft im Vergleich
zu Standardlinkern beschrieben (Robinson et al., 1998).
Die Lyseeffizienz als Maß der funktionellen
Avidität
wurde im Chrom-Freisetzungstest oder auch Cytotoxizitätstest gemessen.
Hierzu wurde die Zelllinie T2, die nicht in der Lage ist, endogen
prozessierte Peptide auf MHC-Moleküle zu laden und diese Komplexe
an die Zelloberfläche
zu transportieren, exogen mit dem MDM2(81-88)-Peptid konzentrationsabhängig beladen
und in einer Peptidtitration die halbmaximalen Lysen als Maß der Erkennung
gemessen. Die unterschiedliche vβ6-
als auch CD8-Positivität
der transduzierten T-Zell-Populationen
wurde unter Angabe der CD8+vβ6+:T – Verhältnis zuzüglich zu
den üblichen
E:T (Effektor zu Target)-Verhältnissen
angegeben: Unterschiede in der Lyseeffizienz sind somit ein Spiegelbild
der verschieden kombinierten TCR-Konstrukte unter Korrektur der
beiden T-Zell-Phänotyp-Marker
als Ausdruck der prozentualen Expressionsstärke des βTCR (vβ6+)
und der prozentualen Stärke
der cytotoxischen T-Zell-Population (CD8+).
Aus den funktionellen Daten konnte abgelesen werden, daß die cotransduzierten
humanen T-Zellen, die sowohl ein Einzelketten-TCR-Konstrukt als
auch die SP-Cα-Domäne exprimieren,
spezifische Lyse gegenüber
MDM2(81-88) Peptid-beladenen Zielzellen bis zu 10–8M
aufweisen (6). Im Vergleich
dazu zeigten die transduzierten humanen T-Zellen, die nur ein Einzelketten-TCR-Konstrukt
exprimieren, keine nachweisbare Cytotoxizität. Als Kontrollen dienten MDM2(81-88)-spezifische-TCR
(Mu WT TCR, Positivkontrolle) sowie mit Leervektor (Mock, Negativkontrolle)
transduzierte T-Zellen.
Die Daten der strukturellen und funktionellen
Avidität
sind somit kongruent und belegen die Wirksamkeit der gewählten scTCR-Konstrukte
in Kombination zu einer SP-Cα-Domäne. Es wird
eine Stabilisierung des Rezeptorkomplexes und daraus resultierende
Effektorfunktion erreicht.
Transduktion humaner peripherer
Blut Lymphozyten (PBLs)
sZur Transduktion humaner peripherer
T-Lymphozyten wurde ein funktionelles Derivat des pStitch-Systems
(Weijtens et al., 1999) verwendet. Die zur Verpackung notwendigen
retroviralen Gene werden über
individuelle Plasmide im Wege einer Cotransfektion der Verpakkungszellinie
293T kodiert (Soneoka et al., 1995): pHit6O kodiert für die gag
pol – Struktur- und Polymerase – Gene aus
dem Moloney murinen Leukämie Virus
(MoMuLV), pColt-Galy für
das env – Hüllprotein
des "gibbon ape
leukemia virus",
das imstande ist, an den Na+- /Phosphat-Synporter
Pit humaner Zellen zu binden und damit letztere zu transduzieren.
Die chimären Viruspartikel
besitzen somit einen amphotropen Pseudotyp und können verschiedene Säugerzellen,
außer Maus,
transduzieren.
Transfektion der Verpackungszelllinie
293T
sDie isolierten bakteriellen Klone
der in das pStitch-Derivat klonierten T-Zell-Rezeptor-Gene wurden über Plasmid-Präparationen,
die eine Entfernung residueller Endotoxine versprechen (Qiagen,
Produkt 12362), gereinigt und zu 1 μg/μl eingestellt. Die DNS wurde über die
Calciumphosphat-Präzipitation
transient in die Verpackungszelllinie 293T eingeführt (GiboBRL-Life Technologies,
Produkt 18306-019). Hierbei werden im Rahmen der stabilisierten
T-Zell-Rezeptoren αTCR und βTCR bis zu
80 μg DNS
eingesetzt:
| 20 μg αTCR | -
Konstrukt |
| 20 μg βTCR | -
Konstrukt |
| 20 μg pColt | -
Galv |
| 20 μg pHit 60 | |
Im Fall von Einzelketten-TCRs werden
60 μg DNS
eingesetzt. 293T wurde in einem modifizierten DMEM-Medium (DMEM/H)
kultiviert:
DMEM, 4,5% Glucose (BioWhittaker)
10% hitzeinaktiviertes
FKS
2mM Glutamin
1 × Penicillin/Streptomycin
1 × nicht-essentielle
Aminosäuren
25
mM HEPES
sAm Vortag der Transfektion wurden
die Zellen 293T auf 0,9·106 Zellen pro T25-Flasche und Transfektionsansatz
in 5ml DMEM/H ausgesät.
4 h vor Transfektion wurde das Medium gegen frisches, auf Raumtemperatur
(RT) erwärmtes
DMEM-H (3ml) ersetzt. Die Transfektion erfolgte laut Vorschrift
des kommerziellen Protokolls (Invitrogen). 1 ml des Transfektionsansatzes
wurde zu der jeweiligen Flasche unter vorsichtigem Hinzutropfen
pipettiert. Das DNS-Ca3(PO4)2-Präzipität sollte
fein verteilt sich auf den adhärenten
Zellen niederlegen.
Am darauffolgenden Morgen wurde das
Medium gegen frisches, auf RT erwärmtes DMEM/H ausgetauscht.
6 h später
erfolgte die Kokultivierung mit den aktivierten PBLs.
Transduktion der aktivierten PBLs – Aktivierung
peripherer Blut-Lymphozyten (PBLs) 3 Tage vor der angesetzten Kokultivierung
wurden fikollisierte PBLs zu 2·106 Zellen/ml in huRPMI-P jeweils in 2 ml einer
24 Well-Platte (Zellgewebe-behandelte Oberflächen) ausgesät. Die Aktivierung
erfolgte über
den kreuz-vernetzenden Antikörper
OKT-3 (Orthoclone-Diagnostics)
zu 20 ng/ml.
huRPMI-P:
RPMI 1640 (2mM Glutamin)
ohne Phosphat (Life Tec., 11877-032 )
10 % humanes, hitzeinaktiviertes
AB-Serum (HLA-A2.1 seropositiv)
25 mMHEPES
1 × Penicillin/Streptomycin
(Life Tec.)
Die Platten wurden in einem Brutschrank
bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert.
Kokultivierung
Zur Kokultivierung wurden die aktivierten
PBLs aus den jeweiligen Vertiefungen einer 24-Well-Platte vereinigt und gezählt. Adhärente Monozyten
wurden verworfen. Die Zellen werden abzentrifugiert (1500 U/min, 5
min, RT) und in einer Konzentration von 2,5·106 Zellen/ml
in frischem huRPMI-P aufgenommen und in den Brutschrank zurückgestellt.
Das Medium wurde zuvor zu 400 U/ml IL-2 (Chiron) und 5 μg/ml Polybren
(Sigma) eingestellt.
Jeder Transfektionsansatz wurde 6h
nach Mediumwechsel nacheinander trypsiniert: hierzu wurde jede T25
mit 3 ml HBSS (Life Technologies) gewaschen, mit 1 ml Trypsin-EDTA
(Life Technologies) für
maximal 5 Minuten inkubiert, die gelösten Zellen quantitativ aufgenommen
und in 4ml vorgelegtes huRPMI-P (RT) unter Rühren getropft. Die 293T Zellen
werden mit 2500 Rad bestrahlt. Diese werden abzentrifugiert (1500
U/min, 5 min, RT) und in 4 ml frisches, eingestelltes huRPMI-P,
mit 400U/ml IL-2 und 5μg/ml
Polybren supplementiert, resuspendiert. Zu dem Ansatz wurde 1 ml
der eingestellten PBLs gegeben und der Ansatz (0,5·106 PBLs/ml) für drei Tage im Brutschrank
(37°C, 5%
CO2) inkubiert.
Am Tag 3 nach Kokultivierung wurden
die suspendierten PBLs abgenommen und in frischem, mit 40 U/ml IL-2
(Chiron) und 2,5 μl
CD3/CD28-Beads supplementiertem Medium huRPMI-P zu 1·106 Zellen/ml resuspendiert. 3 Tage später erfolgte
ein neuerlicher Split in frisches Medium. In diesen 7 Tagen wurde
maximal expandiert bis zum Übergang
auf T75-Flaschen.
Diese Zellen konnten direkt in einer immunologischen Anfärbung (FACS-Analyse)
oder in einem klassischen 51Chrom-Freisetzungstest
eingesetzt werden.
Beispiele der FACS-Analyse
Die oben beschriebenen Konstrukte
wurden nach retroviraler Transduktion im "fluorescence activated cell sorting" (FACS) analysiert.
Hierzu wurden 0,25·106 Zellen sättigend mit Fluorophor-markierten
Antikörpern gefärbt: die
heterolog exprimierte mutierte β-Kette
wurde mit anti-vβ6-FITC
(BD) nachgewiesen; die Gesamtheit der CTL über den Marker anti-CD8-PC5
(Coulter-Beckman). Als Negativ-Kontrolle diente eine mit dem leeren
pStitch-Derivat transduzierte Probe. Die Expression konnte in verschiedenen
Donoren HLA-A2 – positiver T-Zellen reproduziert
werden.
Cytolytische Aktivität der transduzierten
T-Zellen
Die transduzierten T-Zellen wurden
in einem klassischen 51Chrom-Freisetzungstest
auf ihre zytotoxische Spezifität
hin überprüft. In diesem
System wurden Zielzellen radioaktiv durch Inkorporation von 51Chrom markiert. Erkannten die retroviral
modifizierten Effektorzellen die Zielzelle peptidspezifisch, wurden
letztere durch die Effektorfunktionen der 7-Zelle in die Apoptose
getrieben und durch Lyse getötet.
Das Ausmaß des freigesetzten
Chrom-Nuklids trifft eine Aussage über die Effektivität der Zell-Erkennung
und Lyse. Die Effektivität
wurde über
einen weiten Bereich des Verhältnisses
eingesetzter Effektor-Zellen zu Zielzellen (E:T) getestet. Als Referenz
diente ein muriner MDM2-81-88 peptidspezifischer T-Zell-Klon, aus
dem T-Zell-Rezeptor-Gene isoliert wurden. Als Zielzelle diente:
T2:
humane TAP-defiziente Zelllinie die exogen mit beliebigem Peptid
zu beladen war. Das spezifische mutierte Peptid war MDM2-81-88,
ein irrelevantes Kontroll-Peptid entstammte p53 (AS 264-272).
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