WO2004056845A2 - Verfahren zur herstellung eines t-zell-rezeptors (tcr), der aus einem einzelketten-tcr (sctcr) und einer konstanten region eines tcr besteht - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines t-zell-rezeptors (tcr), der aus einem einzelketten-tcr (sctcr) und einer konstanten region eines tcr besteht Download PDF

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WO2004056845A2
WO2004056845A2 PCT/EP2003/014565 EP0314565W WO2004056845A2 WO 2004056845 A2 WO2004056845 A2 WO 2004056845A2 EP 0314565 W EP0314565 W EP 0314565W WO 2004056845 A2 WO2004056845 A2 WO 2004056845A2
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Ralf-Holger Voss
Simone Thomas
Matthias Theobald
Jürgen Kuball
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Johannes Gutenberg-Universität Mainz
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing stabilized single chain antigen recognized genetic constructs (scARC), in addition to the conventional V ⁇ / 2 -Li V 2 / ⁇ -C 4/3 -sc construct a corresponding heterodimeric constant Domain C 3/4 is co-expressed.
  • the scARC are preferably single-chain TCR (scTCR) or antibody scFv fragments which more preferably recognize tumor-associated peptide antigens (TAA).
  • the present invention further relates to an ⁇ / ⁇ T-cell receptor which mediates MDM2 protein-specific T-cell response by means of the method of the present invention and its uses.
  • TAA tumor necrosis factor receptor 2
  • mdm2 human mdm2
  • MDM2 proto-oncoprotein
  • Oligopeptides of the MDM2 protein can be presented in the context of MHC class I molecules on the cell surface and represent attractive target structures for CD8-positive T cells.
  • the extent of the T cell response runs in a defined kinetic window (Kersh et al., 1998).
  • the present invention basically deals with a biochemical problem in the field of applied immunology and oncology:
  • the focus of the present invention is the development of highly effective T cells (CTL) which, through their cytotoxic effector function, are capable of producing human (Hu) tumor cells to recognize and lyse specifically.
  • CTL clones which specifically recognize tumor-associated antigens (TAA) are generally isolated in the transgenic murine (Mu) or mouse model (Stanislawski & Voss et al., 2001).
  • TCR membrane-bound T cell receptor
  • Clinical application therefore provides for the isolation of peripheral T cells in the blood of a tumor patient, the addition of the genes of the TAA-specific TCR through adoptive genetic engineering transfer and the reinfusion after massive expansion (Rosenberg, 1999; Schumacher, 2002).
  • the TCR is a heterodimeric ⁇ / ⁇ molecule, the chains of which each span the transmembrane (TM) once (see FIG. 1 a).
  • Each chain consists of two globular domains that perform an immunoglobulin-like folding: the amino-terminal domain is referred to as a variable domain (V ⁇ or Vß), since this originated from genetic rearrangement and is responsible for the individual peptide recognition.
  • V ⁇ or Vß variable domain
  • the subsequent domain is called the invariant or constant domain (C ⁇ or Cß). It performs a stable, immunoglobulin-like folding (Garcia et al., 1998).
  • the constant domain is essentially divided into three regions: an extracellular domain, at the end of which, in the case of the C ⁇ , lies the "connecting peptide" motif FETDxNLN of the subdomain ⁇ -CPM of the same name, which is derived from the last, inter- ⁇ / ßTCR- Chains of cysteine extend to the beginning of the TCR ⁇ transmembrane.
  • transmembrane region and a short carboxy-terminal cytoplasmic end which can interact with the TM region and the ⁇ -CPM on the one hand with the ⁇ chain of the TCR (ßTCR) and on the other hand with the CD3 complex, whereby signal transducing and surface expression stabilizing effects can be achieved (Bêtström et al., 1996, Trop et al., 1999, Naeher et al., 2002).
  • Mature T cells emerge from the progenitor cells of the thymus, the thymocytes, which express a pre-TCR during their maturation.
  • This consists of the rearranged ß chain of the later T cell receptor, which is associated with an invariant pre-TCR ⁇ chain (pT ⁇ ), the structure of which is comparable to that of the C ⁇ domain.
  • pT ⁇ has the function of stabilizing the surface expression of the precursor TCR as a placeholder for the subsequent rearrangement of the ⁇ chain of the TCR and leads to the further development of the later fully processed T cell receptor and thus to the development of a mature T cell Cell (Kruisbeek et al., 2000, Aifantis et al., 2002).
  • the pT ⁇ chain consists, parallel to the C ⁇ domain, of an extracellular part, a transmembrane region and a cytoplasmic part, which is extended by a few amino acids (AS) compared to the C ⁇ domain.
  • AS a few amino acids
  • the ⁇ -CPM is not conserved in the pT ⁇ , so it is assumed that this results in regulatory differences in signal transduction via the association with CD3- ⁇ in comparison to the pT ⁇ with the ⁇ TCR (Trop et al., 1999).
  • TCR central problem of the above-mentioned clinical approach to the use of recombinant TCR is that the patient's polyclonal T cell population carries its own, so-called endogenous, T cell receptors of unknown specificity.
  • a functional TCR is formed from the pairing of the two chains by means of the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi process to a TCR / CD3 complex directed to the cell surface. Since the heterodimeric chains are initially expressed individually and there is sufficient homology between the human and murine chains, the exogenously added TCR can pair with the endogenous chains and cause unknown, in the worst case undesirable specificities (autoimmune reactions).
  • Such a hybrid form of murine and human chains has not yet been proven, but cannot be ruled out on the basis of the structural data available to date, such as TCR protein crystal structures (Garcia et al., 1998; Ding et al., 1998). For increased security when using adoptive TCR transfer, it is therefore important to exclude such hybrid forms as far as possible. Since the murine TCR chains are to be largely humanized, at least in the region of the constant domains that largely dictate dimerization (Li et al., 1996), in order to avoid rejection reactions against these in the recipient, there is a risk of heterodimerization of such chimeric chains even more. In the case of a partially humanized MDM2-specific TCR, there are already initial experimental indications.
  • This scTCR concept serves to prevent unwanted chain pairings from endogenous to exogenous chains.
  • Such constructs can be genetically engineered as desired and ensure covalent 1: 1 stoichiometry of the hetero-dimeric, variable domains (see FIG. 1b).
  • the scTCR concept was originally developed for antibodies (Eshhar et al., 1993; 2001), but could be transferred to the latter due to the structural homologies between antibodies and T cell receptors. (Chung et al., 1994; Weijtens et al., 1998; Willemsen et al., 2000).
  • variable domains are covalently linked to one another via a short peptide, a "linker”, with the elimination of one of the two constant domains.
  • a short peptide a "linker”
  • Such constructs can be genetically engineered and ensure biochemically coupled 1: 1 stoichiometry of the heterodimeric, variable domains.
  • short peptide sequences are genetically added to the respective chains of the heterodimeric molecule as affinity tags, which ensure specific chain pairing.
  • T-cell receptors 30 amino acid long, carboxy-terminal tags, a so-called “leucine zipper", were used "as a motif for dimerization (Chang et al., 1994).
  • invariant domains of non-functional (membrane) proteins are also used: CH2 / CH3 of antibodies, the transmembrane of the receptor CD4 (Weijtens et al., 1998), the membrane-anchoring / signaling domain of the Fc ⁇ RI ⁇ - (Hombach et al., 2000).
  • a major disadvantage of the scTCR-CD3 ⁇ constructs is the need for coupling to the actually signaling molecule CD3 ⁇ of the T cell. This could pose a risk of T cell activation, from which allo-reactivities (autoimmune reactions) arise.
  • the chimeric character of the scTCR-CD3 ⁇ chains is increased such that immune reactions against the foreign protein, in particular against the fusion region to the human CD3 ⁇ chain, are to be feared.
  • scARC single-chain antigen-recognizing recombinant genetic construct
  • scTCR single-chain antigen-recognizing recombinant genetic construct
  • a measurable - and above all specific - effector function of the human T cell should be achieved.
  • the method of stabilization by means of suitable coexpression should also be applicable to other single-chain antigen-recognizing recombinant genetic constructs, such as scFv fragments (Eshhar et al., 1993).
  • this object is achieved by a method for producing a stabilized single chain antigen-recognizing genetic construct (scARC).
  • the method comprises the steps of: a) making available a genetic construct of the scARC, comprising the domains V ⁇ / 2 -Li-V 2 / ⁇ -C 4/3 , b) making available a genetic construct comprising the corresponding hetero- / (Homo-) dimeric constant domain C 3/4 , direct introduction of the genetic constructs via non-viral gene transfer and / or indirect introduction of the genetic constructs via viral gene transfer of the scARC fragments into a cell, d) coexpression of the genetic constructs of the scARC Fragments, and e) presentation of the stabilized heterodimeric scARC by the cell (see schematically Figure lc).
  • scARC is a single chain TCR (scTCR) or an antibody scFv fragment.
  • scTCR single chain TCR
  • One aspect of the present invention thus relates to a method for producing a stabilized single chain TCR (scTCR).
  • the method comprises the steps of: a) providing a genetic construct comprising the scTCR with a constant domain, b) providing a genetic construct comprising the corresponding hetero - / (homo-) dimer constant domain, c) introducing the genetic Constructs of the TCR fragments in a T cell, d) coexpression of the genetic constructs of the TCR fragments, and e) presentation of the stabilized heterodimeric scTCR by the T cell.
  • Another aspect of the present invention then relates to a method for producing a stabilized scFv fragment.
  • the method comprises the steps of: a) providing a genetic construct comprising the scFv construct with a constant domain, b) providing a genetic construct comprising the corresponding hetero - / (homo-) dimeric constant domain, c) introducing the genetic constructs of the scFv fragment in a suitable human cell, d) coexpression of the genetic see constructs of the scFv fragment, and e) production of the stabilized heterodimeric scFv fragment by the cell.
  • the inventive approach is thus based on expression stabilization of single chain TCR (scTCR) by the coexpression of the hetero - / (homo-) dimeric constant domain as a binding partner and on expression stabilization of scFv fragments by the coexpression of the hetero - / (homo-) dimeric constant domain as binding partner.
  • scTCR single chain TCR
  • a C ⁇ domain was preferably designed which can be co-transferred with an scTCR and thus co-expressed.
  • the aim was to stabilize the cell surface expression of the scTCR and to measure the effector function of the human T cell. In addition, this can prevent undesired pairing with endogenous chains.
  • the murine MDM2 (81-88) -specific T cell receptors identified in our laboratory served as a model system.
  • MDM2 is a human, regulatory proto-oncoprotein that counter-regulates the expression of the tumor suppressor protein p53 (Stanislawski & Voss et al., 2001).
  • the additional constant domain that is missing in the scTCR serves to stabilize the single chain T cell receptor.
  • the increase in stability is associated with an improvement in expression and functionality in the context of the T cell effector function.
  • a method of the present invention is particularly preferred, the cell being a mammalian, in particular human, T cell. More preferably, the scTCR is co-expressed in the orientation SP-V ⁇ -Li-Vß-Cß together with the constant domain SP-C ⁇ or the scTCR in the orientation SP-Vß-Li-V ⁇ -C ⁇ together with the constant domain SP-Cß. These pairings then form optimally stabilized and correctly paired scTCR.
  • the signal peptide (SP) is normally cleaved in the endoplasmic reticulum (ER), but can still exist in artificial fusions to the membrane protein.
  • the above-mentioned scFv concept enables the MHC-independent detection of antigens: the antigen-specific variable domains of the heavy and light chain of an antibody are linked by means of a linker that is at least 14 amino acids long and usually via a linker "hinge" region, which serves as a spacer from the cell membrane, fused to membrane-bound, signaling molecules of the CD3 ⁇ chain or the ⁇ chain of the immunoglobulin receptor FcR.
  • the scFv concept implies that any of the "hinge” regions mentioned above can be chimerized with any of the signaling components cited above and these can be fused with any antigen (Ag) -specific single-chain Fv fragments.
  • scFv fragments are fused, for example, to the constant Cß of any TZR and analog co-transferred with a C ⁇ domain. It is also conceivable to use the CmCm domains of an antibody which have been chimerized on one side with the scFv and on the other side with the membrane-bound domain of a TCR.
  • a chimera is produced from SP-CH2C H3 -TM (TCR) -cyt (TCR) (abbreviation see explanation below), which heterodimerizes as a complementary domain with the chimeric scFv (Roberts et al., 1994).
  • TCR SP-CH2C H3 -TM
  • TCR cyt
  • the CmCi- tf domains homodimerize to form a bivalent molecule specific antigen analogous to the natural conditions of an antibody.
  • Both C H2 C H3 domains with each other the as well as the C ⁇ / Cß domains form stabilizing disulfide bridges. It would also be conceivable to heterodimerize the light chain CL domain lying in the Fab fragments of antibodies with the heavy chain Cm domain.
  • TCR-derived and antibody-derived chimera are conceivable as examples:
  • V L Fy fragment of the light chain of an antibody
  • V H Fy fragment of an antibody heavy chain
  • TM (Cß) transmembrane of the constant domain of a ß-chain TCR
  • Cyt (Cß) cytoplasmic part of the constant domain of a ß-chain TCR
  • T-body concept includes all chimeric double-chain and single-chain receptors which, in addition to the membrane anchor, contain the variable domains of antigen-specific antibodies (anti-"body”) as an essential component (Eshhar et al; 1993, 1997) and e.g. by viral and / or non-viral gene transfer into a thymocyte ("T" cell).
  • the linker (Li) being selected from Li (Gly 4 Ser) 3 , Li218 (Whitlow et al., 1993) and LiSL7 (Robinson et al., 1998).
  • the linker (Li) being selected from Li (Gly 4 Ser) 3 , Li218 (Whitlow et al., 1993) and LiSL7 (Robinson et al., 1998).
  • other suitable linkers can also be used, since the method according to the invention is not restricted to the linkers mentioned here.
  • the method according to the invention can be used for all single-chain antigen-recognizing constructs. All antigens recognized by these constructs can be considered as antigens, for example disease-specific surface antigens such as TAA or infection-specific surface antigens such as HIV-specific surface antigens or CMV-specific surface antigens , Of course, other ones known to the person skilled in the art can also be used.
  • a still further aspect of the present invention relates to a method according to the invention in which the above-mentioned steps c) and d) are replaced by the following steps: c ') / tt v / tro translation or in v / vo translation of the genetic constructs from step a) and / or b) and, if appropriate, subsequent isolation and / or purification of the solubilized scARC fragments, and d ') Reconstitution of the translated scARC fragments in a T cell ("liposome transfer").
  • the introduction into the T target cells can be carried out in any known manner which enables the subsequently stabilized scTCR to be expressed by the T cell. Ways are, for example, via the induction of phagocytosis by the cells or a method, the introduction being carried out by lipid-mediated transfer, such as, for example, via micelles or liposome transfer.
  • lipid-mediated transfer such as, for example, via micelles or liposome transfer.
  • both scARC fragments can be located on a genetic construct.
  • the scARC and the heterologous constant domain are expressed in the correct stoichiometry of 1: 1.
  • the components of the scARC fragments can come from a mammal, and in particular can be of human and / or murine origin.
  • the domains of the scTCR chains to be mutated can be selected from mammalian, and in particular from human and / or mouse domains.
  • a scTCR chain or scFv fragment that is humanized is particularly preferred, which leads, inter alia, to an improved tolerance of the TCR or fragment.
  • a humanized or partially humanized scARC, a scARC provided with additional (functional) domains or a scARC provided with alternative domains, e.g. with a different transmembrane domain as membrane anchor, is preferably used as scARC.
  • an alpha / beta scTCR, gamma / delta scTCR, a humanized or partially humanized scTCR, a scTCR provided with additional (functional) domains or a scTCR provided with alternative domains, for example with a different transmembrane domain as membrane anchor is preferably used as scTCR scTCR used.
  • the alpha and beta chains of an MDM2 (81-88) -specific scTCR can be used as the alpha chain and beta chain. Using this scTCR, the principle according to the invention was successfully used for the first time.
  • a method according to the invention is furthermore preferred, a retroviral vector, in particular pBullet, being used as the transfection system.
  • IRES elements can also be used in the vectors (Jackson et al., Jang et al., 1990).
  • a stabilized scARC that is produced by a method according to the present invention.
  • a scARC which is stabilized according to the invention and which is a TAA-specific scTCR or a TAA-specific scFv-ARC, in particular a mutated MDM2 (81-88) -specific TCR, is further particularly preferred.
  • This stabilized scTCR according to the present invention can also be in the form of a fusion protein comprising the polypeptides modified according to the invention or parts thereof.
  • the fusion protein can be characterized in that it comprises the ⁇ region of CD3 or CD8 or CD 16 or parts thereof, in particular the ⁇ region of human CD3 or CD8 or CD 16 or parts thereof.
  • the fusion protein according to the invention can comprise the ⁇ chain of the CD3 complex or ITAM motifs of the ⁇ chain or parts thereof, in particular the ⁇ chain of human CD3 or parts thereof.
  • the fusion protein can further be characterized in that it comprises CD8 ⁇ or the Lck binding motif of CD8 ⁇ or parts thereof, in particular human CD8 ⁇ .
  • a further aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid which comprises a sequence of a stabilized scTCR coding for a constant domain SP-C ⁇ or constant domain SP-Cßl or SP-Cß2.
  • This nucleic acid according to the invention can be a DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid) or p-NA (pyranosyl nucleic acid), preferably a DNA, in particular a double-stranded DNA with a length of at least 8 nucleotides, preferably with at least 18 nucleotides, in particular with at least 24 nucleotides.
  • the nucleic acid can be characterized in that the sequence of the nucleic acid has at least one intron and / or a polyA sequence. It can also be in the form of its antisense sequence.
  • Another aspect of the invention also relates to a DNA or RNA vector molecule which comprises at least one or more nucleic acid (s) according to the invention and which can be expressed in cells.
  • a double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question, the DNA region coding for the polypeptide being particularly preferred. This area begins with the first start codon (ATG) in a Kozak consensus sequence (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) until the next stop codon (TAG, TGA or TAA) , which is in the same reading frame as the ATG.
  • a further use of the nucleic acid sequences according to the invention is the construction of antisense oligonucleotides (Zheng and Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2) and / or ribozymes (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sci. 54: 1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 921-2).
  • Anti-sense oligonucleotides can be used to reduce the stability of the nucleic acid according to the invention and to inhibit the translation of the nucleic acid according to the invention.
  • Oligonucleotides can therefore be used as therapeutic agents.
  • This strategy is also suitable, for example, for skin, epidermal and dermal cells, in particular if the antisense oligonucleotides are complexed with liposomes (Smyth et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 108: 523-6; White et al. , 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 699-705).
  • a single-stranded DNA or RNA is preferred for use as a probe or as an "antisense" oligonucleotide.
  • nucleic acids according to the invention can also have been produced synthetically.
  • a nucleic acid can be used, which has been prepared synthetically.
  • the nucleic acid according to the invention can be chemically described using the protein sequences described, using the genetic code, e.g. B. can be synthesized by the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584).
  • oligonucleotides are rapidly degraded by endo- or exonucleases, in particular by DNases and RNases occurring in the cell. It is therefore advantageous to modify the nucleic acid in order to stabilize it against degradation so that a high concentration of the nucleic acid is maintained in the cell over a long period of time (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98 / 37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typically, such stabilization can be obtained by introducing one or more internucleotide phosphor groups or by introducing one or more non-phosphor internucleotides.
  • Suitable modified internucleotides are summarized in Uhlmann and Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116).
  • Modified internucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges in a nucleic acid which can be used in one of the uses according to the invention contain, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate, phosphorodithioate, phosphate ester, while non-phosphorus internucleotide analogs, for example siloxane bridges, carbonate bridges , Carboxymethyl ester, acetamidate bridges and / or thioether bridges. It is also intended that this modification improve the shelf life of a pharmaceutical composition that can be used in one of the uses of the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector, preferably in the form of a plasmid, shuttle vector, phagemid, cosmid, expression vector, adenoviral vector, retroviral vector (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) and / or gene therapy-effective vector which contains a nucleic acid according to the invention.
  • a vector preferably in the form of a plasmid, shuttle vector, phagemid, cosmid, expression vector, adenoviral vector, retroviral vector (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) and / or gene therapy-effective vector which contains a nucleic acid according to the invention.
  • the nucleic acid according to the invention can preferably be contained in a vector in an expression vector or a gene therapy vector.
  • the gene therapy-active vector T-cell-specific regulatory sequences which are functionally linked to the nucleic acid of the invention.
  • the expression vectors can be prokaryotic or eukaryotic expression vectors. Examples of prokaryotic expression vectors for expression in E. coli are, for example, the vectors pGEM or pUC derivatives and for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl.
  • Acids Res., 22, 5767-5768 for expression in insect cells e.g. B. baculovirus vectors as disclosed in EP-B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721, and for expression in mammalian cells e.g. B. the vectors Rc / CMV and Rc / RSV or SV40 vectors, all of which are generally available.
  • the expression vectors also contain suitable promoters for the respective host cell, e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see e.g. EP-B1-0 154 133), the Met 25, GAL 1 or ADH2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983 ), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see, for example, 13. EP-B1-0 127 839).
  • promoters are suitable for expression in mammalian cells, which allow a constitutive, regulatable, tissue-specific, cell cycle-specific or metabolically specific expression in eukaryotic cells.
  • Controllable elements according to the present invention are promoters, activator sequences, enhancers, silencers and / or repressor sequences.
  • suitable regulatable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by the RNA polymerase III or viral promoters, CMV enhancers, CMV promoters, CMV-LTR hybrids, SV40 promoters or LTR promoters, e.g. B. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) and other viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV or HIV.
  • regulatable element which enables regulatable expression in eukaryotes is the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
  • regulatable elements which enable T cell-specific expression in eukaryotes are promoters or activator sequences from promoters or enhancers of those genes which code for proteins which are only expressed in these cell types.
  • Examples of regulatable elements which enable cell cycle-specific expression in eukaryotes are promoters of the following genes: cdc25, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F, B-myb or DHFR (Zwicker J. and Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
  • Examples of regulatable elements which enable metabolically specific expression in eukaryotes are promoters which are regulated by hypoxia, by glucose deficiency, by phosphate concentration or by heat shock.
  • the vector according to the invention can be used for the transfection of a host cell, which is preferably a T cell.
  • a host cell is particularly preferred which is characterized in that it expresses an scTCR or fusion protein or scFv fragment stabilized according to the invention on its surface.
  • Another object of the invention thus relates to a method for producing a polypeptide for the diagnosis and / or treatment of diseases associated with oncoproteins or for the identification of pharmacologically active substances in a suitable host cell, which is characterized in that a nucleic acid according to the invention in a suitable manner is expressed.
  • the polypeptide is thus produced, for example, by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable expression system, as already described above, using methods which are generally known to the person skilled in the art.
  • suitable host cells are, for example, the E. coli strains DHS, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, insect cell lines, eg. B. from Spodoptera frugiperda, or the animal cells COS, Vero, 293, HaCaT, and HeLa, all of which are commonly available.
  • the nucleic acid can be present as a plasmid, as part of a viral or non-viral vector or particle.
  • viral vectors or particles baculoviruses, vaccinia viruses, retroviruses, adenoviruses, adenoas-associated viruses and herpes viruses.
  • non-viral carriers virosomes, liposomes, cationic lipids or poly-lysine-conjugated DNA.
  • virus vectors for example adevirus vectors or retroviral vectors (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al, 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Weijtens et al. "A retroviral vector system, 'STITCH'; in combination with an optimized Single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T-lymphocytes", Gene Therapy (1998) 5,1995-1203).
  • a preferred mechanism for expression of the polypeptides according to the invention in vivo is viral gene transfer, in particular with the aid of retroviral particles. These are preferably used to provide corresponding target cells, preferably T-lymphocytes, of the patient ex vivo with the genes or nucleotide sequences coding for the polypeptides according to the invention by transduction. The target cells can then be reinfused into the patient in the sense of an adoptive cell transfer in order to take over tumorizide and / or immunomodulating effector functions with the specificity inserted de novo.
  • the viral vectors frequently used for the transfer of genes are predominantly retroviral, lentiviral, adenoviral and adeno-associated viral vectors. These are circular nucleotide sequences derived from natural viruses, in which at least the viral structural protein-encoding genes are exchanged for the construct to be transferred.
  • Retroviral vector systems create the prerequisites for long-term expression of the transgene through the stable but non-directional integration into the host genome. Younger generation vectors have no irrelevant and potentially immunogenic proteins, furthermore there is no pre-existing immunity of the recipient against the vector.
  • Retroviruses contain an RNA genome that is packaged in a lipid envelope that consists of parts of the Host cell membrane and virus proteins exist. To express viral genes, the RNA genome is reverse transcribed and integrated with the enzyme integrase in the target cell DNA. This can then be transcribed and translated by the infected cell, creating viral components that combine to form retroviruses. RNS is only then inserted into the newly created viruses.
  • the retrovirus genome has three essential genes: gag, which codes for viral structural proteins, so-called group-specific antigens, pol for enzymes such as reverse transcriptase and integrase, and env for the envelope protein, which is responsible for the binding of the host-specific receptor.
  • gag which codes for viral structural proteins
  • group-specific antigens pol for enzymes such as reverse transcriptase and integrase
  • env for the envelope protein, which is responsible for the binding of the host-specific receptor.
  • packaging cell lines which have been additionally equipped with the gag / pol-coding genes and express them "in trans” and thus complement the formation of replication-incompetent (ie gag / pol-deleted) transgenic virus particles.
  • An alternative is the cotransfection of the essential virus genes, whereby only the vector containing the transgene carries the packaging signal.
  • the separation of these genes on the one hand enables any combination of the gal / pol reading frame with ew reading frames obtained from different strains, which creates pseudotypes with altered host tropism, and on the other hand drastically reduces the formation of replication-competent viruses within packaging cells.
  • the coat protein derived from "gibbon ape leukemia virus” (GALV), which is used in the "stitch” or “bullet” vector system, is able to transduce human cells and is established in the packaging cell line PG13 with an amphotropic host region (Miller et al., 1991).
  • security is increased by selective deletion of non-essential virus sequences to prevent homologous recombination and thus the production of replication-competent particles.
  • New, non-viral vectors consist of autonomous, self-integrating DNA sequences, the transposons, which are e.g. liposomal transfection were introduced into the host cell and were successfully used for the first time to express human transgenes in mammalian cells (Yant et al., 2000).
  • Gene therapy-effective vectors can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes, since this enables a very high transfection efficiency, in particular of skin cells, to be achieved (Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85).
  • Excipients that increase the transfer of nucleic acids into the cell can be, for example, proteins or peptides that are bound to DNA or synthetic peptide-DNA molecules that enable the transport of the nucleic acid into the nucleus of the cell (Schwartz et al. ( 1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784).
  • Auxiliaries also include molecules that enable the release of nucleic acids into the cytoplasm of the cell (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) or for example liposomes (Uhlmann and Peymann (1990) supra).
  • Another particularly suitable form of gene therapy vectors can be obtained by applying the nucleic acid according to the invention to gold particles and using the so-called “gene gun” to shoot them into tissue, preferably into the skin, or cells (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81).
  • the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide has one or more non-coding sequences including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the polypeptide, and / or a polyA sequence , in particular the naturally occurring polyA sequence or an SV40 virus polyA sequence, especially at the 3 'end of the gene, since this can stabilize the mRNA (Jackson, RJ (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter, RD et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).
  • a host cell containing a DNA or RNA vector molecule according to the invention can be a T cell that is transformed with a vector according to the invention or another gene construct according to the invention.
  • Host cells can be both prokaryotic and eukaryotic cells, examples of prokaryotic host cells are E. coli and Saccharomyces cerevisiae or insect cells for eukaryotic cells.
  • a particularly preferred transformed host cell is a transgenic T precursor cell or a stem cell, which is characterized in that it comprises a gene construct according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • Methods for transforming or transducing host cells and / or stem cells are well known to those skilled in the art and include, for example, play electroporation or microinjection.
  • a particularly preferred transformed host cell is a patient's own T cell which, after removal, is transfected with a gene construct according to the invention.
  • Host cells according to the invention can in particular be obtained by removing one or more cells, preferably T cells, in particular CD8 + T cells, from the patient, which are then transfected or transduced ex vivo with one or more genetic constructs according to the invention, in order to thus according to the invention To maintain host cells.
  • the specific T cells generated ex vivo can then be re-implanted in the patient.
  • the process is thus similar to that in Darcy et al. ("Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000, 164: 3705-3712) described methods using scFv anti-CEA receptor transduced ZTL, perforin and ⁇ -IFN.
  • the (poly) peptides and their derivatives modified according to the invention can also be used, for example, for the active and / or passive immunization of patients with diseases, in particular tumor diseases, which are associated, for example, with MDM2.
  • diseases in particular tumor diseases, which are associated, for example, with MDM2.
  • a particularly preferred aspect of the present invention thus relates to a use in which cancer is being treated, in particular a cancer which is associated with an altered expression of MDM2, in order thus to induce, generate and increase the oncogene-specific, e.g. To achieve MDM2-specific CTL and specifically kill the tumor and leukemia cells of the patients concerned.
  • Such diseases include, for example, solid tumor diseases, lymphohematopoietic neoplasms, malignant hematological diseases, also in the form of multiple myeloma (or plastocytoma), histiocytic lymphoma and a CML blast relapse.
  • Related TAAs against which the corresponding TCR can be developed are, for example, p53, Her-2 / new, Ras, tyrosinase, MART, GplOO, MAGE, BAGE, MUC-1, TRP-1, TRP-2, CD45, CD19 and PRDI-BF1.
  • a particularly preferred aspect of the present invention thus also relates to a composition, in particular pharmaceutical composition, which comprises a recombinant T cell according to the present invention. It is further preferred to use a stabilized scTCR according to the present invention, a mutated TCR according to the present invention and / or a recombinant T cell according to the present invention for the production of therapeutic agents and / or prophylactic agents for the treatment of cancer.
  • the patient one or more cells, preferably T cells, in particular CD8 + T cells, which are then transduced or transfected ex vivo with one or more genetic constructs according to the invention.
  • the specific T cells generated ex vivo can then be re-implanted in the patient.
  • the composition according to the invention can furthermore contain suitable additives and auxiliary substances.
  • the present invention also relates to a medicament for the indication and therapy of diseases associated with oncoprotein protein, which contains a nucleic acid or a polypeptide according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, and a process for the preparation of such a medicament for the treatment of oncoprotein proteins.
  • Protein-associated diseases in which a nucleic acid or a polypeptide according to the invention is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Suitable therapeutic agents and / or prophylactic agents are in particular vaccines, recombinant particles or injections or infusion solutions which contain as active ingredient (a) the stabilized scTCR receptor according to the invention polypeptide and / or its derivatives and / or (b) a nucleic acid according to the invention and / or (c) T lymphocytes generated in vitro or ex vivo, which contain a specifically mutated anti-oncoprotein directed scTCR.
  • a drug and / or recombinant particle which contains the nucleic acid according to the invention in naked form or in the form of one of the above-described gene therapy-effective vectors or in a form complexed with liposomes or gold particles is particularly suitable for gene therapy use in humans.
  • the pharmaceutical carrier is, for example, a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0-8.0, preferably approximately 6.8-7.8. In particular of approximately 7.4 and / or an osmolarity of approximately 200-400 milliosmol / liter, preferably of approximately 290-310 milliosmol / liter.
  • the pharmaceutical carrier can contain suitable stabilizers, such as e.g. B. nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
  • CD3 ⁇ chains In addition to their signaling function, CD3 ⁇ chains have the potential for homodimerization and thus facilitate the association of a chimeric C ⁇ chain with the chimeric scTCR ⁇ (Bolliger, Johannsson, 1999). Another possibility is to design inverse scTCR constructs of the orientation SP-Vß-Li-V ⁇ -C ⁇ , which contain a C ⁇ domain instead of the Cß domain and are co-transferred in combination with an SP-Cß domain ( Figure lb ).
  • variable domains derived from antibodies or T cell receptors to any invariant domains in their function as a) spacers from the transmembranes, b) as dimerization domains, c) as membrane anchors and d) as adapter proteins for signal coupling merge (Figure lc).
  • the concept presented is also species-independent and can be applied to human molecules.
  • scTCR stabilizing constant domain concept can be extended to single chain antibodies (scFv) by coexpression of the complementary CH L or C L chain.
  • scFv single chain antibodies
  • TAA-specific TCR whether of murine or human origin, which are to be used in adoptive immunotherapy by gene transfer into human T cells from tumor patients, can be developed with little effort according to the described model.
  • the approach presented could thus be widely used in clinical application (Bolhuis et al., 1998; Cavazzana-Calvo et al., 2000; Fischer et al., 2002).
  • stabilized scARC refers to a stabilized single chain antigen-recognizing genetic construct (scARC) in which, in addition to the conventional V ⁇ / 2 -Li-V 2 / ⁇ -C 4 / -sc construct, a corresponding heterodimeric constant domain C 3 / is co-expressed.
  • the scARC are preferably stabilized single-chain TCR (scTCR) or stabilized antibody scFv fragments which more preferably recognize tumor-associated peptide antigens (TAA).
  • stabilized scTCR refers to the combination of the respective scTCR, for example in the orientation SP-V ⁇ -Li-Vß-Cß together with the constant domain SP-C ⁇ or the scTCR in the orientation SP-Vß-Li V ⁇ -C ⁇ together with the constant domain SP-Cß. These pairings then form optimally stabilized and correctly paired scTCR.
  • the stabilized scTCR can originate from the expression of one or two different genetic constructs.
  • coding nucleic acid refers to a DNA sequence which codes for an isolatable bioactive polypeptide according to the invention or a precursor.
  • the polypeptide can be encoded by a full-length sequence or any part of the coding sequence, as long as the specific, for example enzymatic activity is retained.
  • “Stringent hybridization conditions” are understood to mean those conditions in which hybridization takes place at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C. in a lower buffer concentration and remains stable.
  • SEQ ID No. 1 the nucleic acid sequence of the SP-C ⁇ domain construct
  • SEQ ID No. 2 the amino acid sequence of the SP-C ⁇ domain construct
  • FIG. 1 shows a representation of the individual model systems: a) Schematic representation of a wild-type T cell receptor consisting of constant ⁇ and ⁇ domains and variable ⁇ and ⁇ domains. b) Single chain TCR in two orientations. The two variable domains are connected to each other via a linker. The constant domain not present in the scTCR is co-expressed and leads to a stabilization of the construct. c) Generalized representation of the stabilized scARC concept according to the invention. V ⁇ 2 denotes variable domains, while C 3/4 stands for invariant domains. The concept can be used for both scTCR and scFv fragments. FIG.
  • FIG. 2 shows a superposition of the protein backbone of protein crystal structures of a murine H2-K b restricted (ltcr, Garcia et al. 1998) and a human HLA-A2 restricted (lbd2, Ding et al., 1998) T- cell receptor.
  • the heterodimeric human TCR is dark gray (in the color: red) ( ⁇ TCR) and light gray (in the color: blue) (ßTCR) for the respective chains; the murine TCR without color coding for the individual chains is gray overall.
  • FIG. 3 shows a representation of the protein backbone of ltcr with only those side chains that are identical to lbd2.
  • the upper graph illustrates the presence of few identical residues in the contact area of the variable domains (V ⁇ , Vß) of the two chains.
  • the lower graphic is rotated around the axis in the paper plane in such a way that it documents the numerous presence of identical amino acids in the contact area of the constant domains (C ⁇ , Cß).
  • FIG. 4 shows the amino acid or base sequence of the construct SP-C ⁇ domain analogous to SEQ ID No. 1.
  • the signal peptide of the V ⁇ domain was fused to the constant C ⁇ domain by PCR.
  • the base sequence is translated into the corresponding amino acid sequence and is shown in the 1-letter code.
  • FIG. 5 shows a FACS analysis of the human transduced T cells which express the described constructs.
  • a double staining of vbeta6-FITC and CD8-PC5 is shown: only CD8-positive, transduced T cells show the desired effector function.
  • the v6 staining proves the ß chain.
  • FIG. 6 shows a cytotoxicity test (Stanislawski & Voss et al., 2001) with the described constructs.
  • TAP-deficient T2 were loaded exogenously with the specified MDM2 (81-88) peptide concentrations and tested for recognition by the transduced T cells: the extent of the lysis is reflected in the quantity of the 51 Cr which was taken up by the cells and released by lysis , A p53-derived peptide was used as the irrelevant peptide. Both the "effector: target" ratios and the corrected CD8 + vß6 + ratios are shown.
  • the design of the C ⁇ domain should be such that it can be stably expressed on the cell surface and also stabilizes its surface expression through the interaction with the Cß domain of an scTCR and ultimately to facilitate signal transduction and thus effector function of the human T- Cell leads.
  • the signal peptide of the ⁇ TCR chain is connected upstream of the C ⁇ domain.
  • signal peptides other than those derived from the ⁇ TCR chain can also be used, as long as the proteins are correctly processed post-translationally.
  • the existing construct consists of the attached amino-terminal signal peptide, the constant domain with the directly adjoining ⁇ -CPM, a transmembrane region and the carboxy-terminal cytoplasmic region.
  • Both the DNA sequence of the signal peptide and that of the subsequent C ⁇ domain were taken from the DNA sequence of the above-mentioned murine MDM2 (81-88) -specific T cell receptor.
  • the corresponding fusion between signal peptide and C ⁇ domain was carried out using a conventional polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the signal peptide was inserted using the 5 'complementary primer.
  • the resulting PCR product was cloned into the retroviral vector pBullet (Willemsen et al., 2000).
  • the transfection system (Weijtens et al., 1998), which provides for co-transfection of individual plasmids, each coding for a single chain T cell receptor or for the C ⁇ domain, made it possible to combine different single chain TCR constructs with the construct the C ⁇ domain in fusion to the signal peptide.
  • the scTCR should be analyzed by themselves and in combination with the described SP-Ca construct structurally via FACS analysis and functionally via cytotoxic lysis of antigen presenting cells (APC).
  • the endogenous TCRs present in the human T cells did not interfere with the analysis of the exogenously transferred constructs, since the scTCRs prevent an undesired pairing with the endogenous receptors and therefore no functional, autoreactive T cell receptors are formed. It is also important to carry out these experiments in an experimental setting that is as close as possible to the clinical application.
  • variable domains are covalently linked to one another via a short peptide, a "linker” (Li), with the elimination of one of the two constant domains, in this model system with the elimination of the C ⁇ domain.
  • a linker Long peptide
  • a cysteine of the C ⁇ or Cß domain forms a disulfide bridge.
  • the approach is based on the comparable structure and function of the C ⁇ domain with the pT ⁇ chain. In order to achieve a membrane-specific expression of the C ⁇ domain, this is fused with the signal peptide (SP) of the ⁇ TCR chain (FIG. 4).
  • SP signal peptide
  • the selected signal peptide consists of 21 predominantly hydrophobic amino acids of the scTCR, which is required for membrane-anchoring in the ER and later translocation of the T-cell receptor chains in the cell membrane.
  • the C ⁇ domain fulfills signal transduction tasks which are started after antigen recognition.
  • FETDxNLN a conserved motif within the CP domain with the following structure is particularly important: FETDxNLN. This motif mediates a signal transfer between TCR and CD3 ⁇ complex (Badosström et al., 1996; Trop et al., 1999).
  • the T cells were selected via G418 (selection marker for the SP-C ⁇ domain, followed by the transgene via an IRES element) and via puromycin ( Selection marker for the single chain T cell receptor chains).
  • G418 selection marker for the SP-C ⁇ domain, followed by the transgene via an IRES element
  • puromycin Selection marker for the single chain T cell receptor chains.
  • the structural avidity as an expression of stable expression of the various TCR constructs was analyzed via the subfamily-specific staining of the ß chain (vß6-FITC; FIG. 5). It is already evident in the v ⁇ 6 staining that the co-transduced T cells (scTCR / C ⁇ ) have a significantly more stable scTCR expression (vß6 + ) than those which only express the scTCR. In the FACS and the cytotoxicity test, three different scTCRs were analyzed, each of which differ in their linker sequence and linker length.
  • the scTCR-Li218 construct has a linker length of 18 AS (Whitlow et al., 1993), while the linker of scTCR-LiSL7 consists of 19 AS (Robinson et al., 1998).
  • linker SL7 can be compared with the standard linker (GGGGS) 3 , but linker SL7 has a different sequence of the amino acids glycine and serine.
  • the AS threonine is located at position 2.
  • this linker is an increased thermodynamic and also proteolytic stability to proteolysis and an improved expression property compared to standard linkers have been described (Robinson et al., 1998).
  • the lysis efficiency as a measure of the functional avidity was measured in the chromium release test or cytotoxicity test.
  • the cell line T2 which is not able to load endogenously processed peptides onto MHC molecules and to transport these complexes to the cell surface, was loaded exogenously with the MDM2 (81-88) peptide, depending on the concentration, and the half-maximal in a peptide titration Lyses measured as a measure of detection.
  • the structural and functional avidity data are thus congruent and demonstrate the effectiveness of the selected scTCR constructs in combination with an SP-C ⁇ domain. Stabilization of the receptor complex and the resulting effector function are achieved.
  • PBLs Human peripheral blood lymphocyte transduction
  • a functional derivative of the pStitch system (Weijtens et al., 1999) was used for transduction of human peripheral T lymphocytes.
  • the retroviral genes necessary for packaging are encoded via individual plasmids by cotransfection of the packaging cell line 293T (Soneoka et al., 1995): pHit60 encodes the gag-pol - structural and polymerase genes from the Moloney murine leukemia Virus (MoMuLV), pColt galv for the env - coat protein of the "gibbon ape leukemia virus", which is able to the Na + - / Phosphate synporter to bind pit of human cells and thus transduce the latter.
  • the chimeric virus particles thus have an amphotropic pseudotype and can transduce various mammalian cells, except for the mouse.
  • the isolated bacterial clones of the T cell receptor genes cloned into the pStitch derivative were purified via plasmid preparations which promise removal of residual endotoxins (Qiagen, product 12362) and adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the DNA was introduced transiently into the packaging cell line 293T via the calcium phosphate precipitation (GiboBRL-Life Technologies, product 18306-019).
  • ⁇ TCR and ßTCR up to 80 ⁇ g DNA are used:
  • the 293T cells were seeded onto 0.9 * 10 6 cells per T25 bottle and transfection batch in 5 ml DMEM / H. 4 h before transfection, the medium was replaced by fresh DMEM-H (3 ml) warmed to room temperature (RT). The transfection was carried out according to the regulation of the commercial protocol (Invitrogen). 1 ml of the transfection batch was pipetted into the respective bottle with careful dropping. The DNA Ca 3 (PO) 2 precipitate should deposit finely distributed on the adherent cells. The following morning the medium was exchanged for fresh DMEM / H warmed to RT. The cultivation with the activated PBLs took place 6 hours later.
  • PBLs peripheral blood lymphocytes
  • OKT-3 Orthoclone-Diagnostics
  • the activated PBLs from the respective wells of a 24-well plate were combined and counted.
  • Adherent monocytes were discarded.
  • the cells are centrifuged off (1500 rpm, 5 min, RT) and taken up in a concentration of 2.5 * 10 6 cells / ml in fresh huRPMI-P and returned to the incubator.
  • the medium was previously adjusted to 400 U / ml IL-2 (Chiron) and 5 ⁇ g / ml polybrene (Sigma).
  • each transfection batch was trypsinized in succession 6 h after changing the medium: for this purpose, each T25 was washed with 3 ml HBSS (Life Technologies), incubated with 1 ml trypsin-EDTA (Life Technologies) for a maximum of 5 minutes, the dissolved cells were taken up quantitatively and placed in 4 ml of huRPMI- P (RT) added dropwise with stirring. The 293T cells are irradiated with 2500 rads. These are centrifuged off (1500 rpm, 5 min, RT) and in
  • the suspended PBLs were removed and in fresh medium supplemented with 40 U / ml IL-2 (Chiron) and 2.5 ⁇ l CD3 / CD28 beads huRPMTP resuspended at 1 * 10 6 cells / ml. 3 days later there was another split into fresh medium. In these 7 days the maximum expansion was made until the transition to T75 bottles. These cells could be used directly in an immunological staining (FACS analysis) or in a classic 51 chromium release test.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the transduced T cells were checked for their cytotoxic specificity in a classic 51 chromium release test.
  • target cells were radioactively labeled by incorporating 51 chromium. If the retrovirally modified effector cells recognized the target cell peptide-specifically, the latter were driven into apoptosis by the effector functions of the T cell and killed by lysis. The extent of the released chromium nuclide makes a statement about the effectiveness of the cell recognition and lysis. The effectiveness was tested over a wide range of the ratio of effector cells to target cells (E: T).
  • a murine MDM2-81-88 peptide-specific T cell clone was used as reference, from which T cell receptor genes were isolated.
  • T2 human TAP-deficient cell line which was to be loaded exogenously with any peptide.
  • the specific mutant peptide was MDM2-81-88, an irrelevant control peptide was derived from p53 (AS 264-272).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Einzelketten-antigenerkennenden genetischen Konstrukten (scARC), bei dem zusätzlich zu dem herkömmlichen V1/2-Li-V2/1-C4/3-sc-Konstrukt eine entsprechende heterodimere konstante Domäne C3/4 koexprirriiert wird. Bevorzugterweise handelt es sich bei den scARC um Einzelketten-TCR (scTCR) oder Antikörper-scFv-Fragmente, die weiter bevorzugt tumorassoziierte Peptidantigene (TAA) erkennen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung rational mutierten MDM2-Protein-spezifische T-Zell Antwort vermittelnden α/β T-Zell Rezeptoren und dessen Verwendungen.

Description

Verfahren zur Expressionsstabilisierung und Verbesserung der spezifischen Effektorfunktion von Einzelketten-Antigen-erkennenden genetischen Konstrukten (scARC) und entsprechend mutierten MDM2-Protein spezifischen scT-Zell Rezeptoren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten Einzel- ketten-antigenerkennenden genetischen Konstrukten (scARC), bei dem zusätzlich zu dem herkömmlichen Vι/2-Li-V2/ι-C4/3-sc-Konstrukt eine entsprechende heterodimere konstante Domäne C3/4 koexprimiert wird. Bevorzugterweise handelt es sich bei den scARC um Einzel- ketten-TCR (scTCR) oder Antikörper-scFv-Fragmente, die weiter bevorzugt tumorassoziierte Peptidantigene (TAA) erkennen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung rational mutierten MDM2-Protein-spezifιsche T-Zell Antwort vermittelnden α/ß T- Zell Rezeptoren und dessen Verwendungen.
Unter den TAA, die im Kontext von MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden, sind die sogenannten "universellen" TAA von besonderem Interesse. Diese TAA leiten sich überwiegend von zellulären Proteinen ab, die in normalen Zellen schwach exprimiert und in Tumorzellen überexprimiert werden. Zu diesen Proteinen gehört unter anderem das humane Homolog des "Mouse-Double-Minute-2" Proto-Onkogens (mdm2), das sogenannte "humane mdm2" oder abgekürzt "MDM2" Proto-Onkoprotein (Roth et al. 1998), das nicht nur in einer Reihe solider Tumore, sondern auch bei den hämatologi- schen Neoplasien (malignen hämatologischen Systemerkrankungen) AML, ALL und CLL überexprimiert wird (Zhou et al, 2000).
Oligopeptide des MDM2 -Proteins können im Kontext mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8- positive T-Zellen. Das Ausmaß der T-Zell Antwort verläuft hierbei in einem definierten kinetischen Fenster (Kersh et al., 1998). Der Komplex aus Peptid-MHC und TCR-CD3 multimeri- siert, um eine effiziente Signaltransduktion zu bewirken, wobei die genaue Stöchiometrie und das Ausmaß der Oligomerisierung noch umstritten ist.
Die vorliegende Erfindung behandelt grundsätzlich ein biochemisches Problem im Bereich der angewandten Immunologie und Onkologie: Fokus der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung hoch-effektiver T-Zellen (CTL), die über ihre cytotoxische Effektor-Funktion in der Lage sind, humane (Hu) Tumorzellen spezifisch zu erkennen und zu lysieren. Dazu werden allgemein CTL-Klone, die spezifisch Tumor-assoziierte Antigene (TAA) erkennen, im transgenen murinen (Mu) oder Maus-Modell isoliert (Stanislawski & Voss et al., 2001).
Verantwortlich für die Onkoprotein-abgeleitete Peptid-Erkennung auf Seite der T-Zelle ist der membranständige T-Zell-Rezeptor (TCR), der den Komplex aus membranständigem MHC- Molekül und präsentiertem Peptid, das aus der proteosomalen Prozessierung von Onkoprotei- nen hervorgegangen ist, auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), oder auch Tumorzelle, erkennt und ein aktivierendes Signal an die Signaltransduktionskaskade der cytotoxischen T-Zelle (CTL) vermittelt.
Die klinische Anwendung sieht daher vor, periphere T-Zellen des Blutes eines Tumorpatienten zu isolieren, diesen die Gene der TAA-spezifischen TCR durch den adoptiven, gentechnischen Transfer hinzuzufügen und nach massiver Expansion zu reinfundieren (Rosenberg, 1999; Schumacher, 2002). Der TCR ist ein heterodimeres α/ß-Molekül, dessen Ketten jeweils die Transmembrane (TM) einmalig durchspannen (siehe Figur la). Jede Kette besteht aus zwei globulären Domänen, die eine Immunglobulin-ähnliche Faltung vornehmen: die amino- terminale Domäne wird als variable Domäne (Vα bzw. Vß) bezeichnet, da diese aus genetischem Rearrangement hervorgegangen ist und für die individuelle Peptiderkennung zuständig ist.
Die sich anschließende Domäne wird die invariante oder auch konstante Domäne (Cα bzw. Cß) genannt. Sie nimmt eine stabile, Immunglobulin-ähnliche Faltung vor (Garcia et al., 1998). Die konstante Domäne gliedert sich im Wesentlichen in drei Regionen: eine extrazellulär gelegene Domäne, an dessen Ende im Fall der Cα das "Connecting-Peptide" -Motiv FETDxNLN der gleichnamigen Subdomäne α-CPM liegt, die vom letztständigen, inter- α/ßTCR-Ketten Cystein bis zum Beginn der Transmembrane des TCRα reicht. Daran anschließend folgt eine transmembrane Region und ein kurzes carboxyterminales cytoplasmatisches Ende, welche zusammen mit der TM-Region und der α-CPM zum einem mit der ß-Kette des TCR (ßTCR) und zum anderen mit dem CD3-Komplex interagieren kann, wodurch signaltransduzierende und Oberflächenexpression-stabilisierende Effekte erzielt werden (Bäckström et al., 1996, Trop et al., 1999, Naeher et al., 2002).
Dieser Aufbau gilt gleichermaßen für humane und murine TCR: das Proteinrückgrat der Spezies-fremden TCR ist mit einem marginalen Unterschied von nur 1 ,04 Angstroem superposi- tionierbar (siehe Figur 2). Insbesondere in der konstanten Domäne sind zahlreiche Aminosäuren homolog bzw. identisch (siehe Figur 3).
Reife T-Zellen gehen aus den Vorläuferzellen des Thymus, den Thymozyten hervor, welche während ihrer Reifung einen prä-TCR exprimieren. Dieser besteht aus der rearrangierten ß- Kette des späteren T-Zell-Rezeptors, der mit einer invarianten prä-TCRα-Kette (pTα), deren Aufbau mit dem der Cα-Domäne vergleichbar ist, assoziiert ist. Hierbei hat der pTα die Funktion, den Vorläufer-TCR in seiner Oberflächenexpression als Platzhalter für das anschließende Rearrangement der α-Kette des TCR zu stabilisieren und führt zur weiteren Entwicklung des späteren vollständig prozessierten T-Zell-Rezeptors und somit zur Entwicklung einer reifen T-Zelle (Kruisbeek et al., 2000, Aifantis et al., 2002). Die pTα-Kette besteht, parallel zur Cα-Domäne, aus einem extrazellulären Anteil, einer transmembranen Region und einem cytoplasmatischen Anteil, welches im Vergleich zur Cα-Domäne um einige Aminosäuren (AS) verlängert ist. Die α-CPM ist im pTα nicht konserviert, so daß angenommen wird, daß hieraus regulatorische Unterschiede der Signaltransduktion über die Assoziation zu CD3- ζ im Vergleich des pTα zum αTCR resultieren (Trop et al., 1999).
Das zentrale Problem des oben genannten klinischen Ansatzes der Verwendung von rekombi- nanten TCR besteht darin, daß die polyklonale T-Zellpopulation des Patienten eigene, sogenannte endogene, T-Zell-Rezeptoren unbekannter Spezifität trägt. Ein funktioneller TCR formiert sich aus der Paarung der beiden Ketten im Wege des Endoplasmatischen Retikulum (ER)- und Golgi-prozessonalen Vorganges zu einem an die Zeil-Oberfläche geleiteten TCR/CD3 -Komplexes. Da die heterodimeren Ketten zunächst vereinzelt exprimiert werden und zudem hinreichende Homologie zwischen den humanen und murinen Ketten bestehen, können die exogen hinzugefügten TCR mit den endogenen Ketten paaren und unbekannte, im ungünstigen Fall ungewünschte Spezifitäten (Autoimmun-Reaktionen) hervorrufen. Im ein- fachsten Fall ergeben sich aus den vier vorhandenen Ketten (zwei endogene und zwei exogene Ketten) einer mit den Genen für einen TCR-transduzierten T-Zelle vier denkbare Kombinationen, von denen zwei ungewünschte Hu αTCR/Mu ßTCR und Mu αTCR/Hu ßTCR - Hybride sind. Die Situation verkompliziert sich zusätzlich dann, wenn mehrere, für verschiedene TAA spezifische TCR-Gene transduziert werden bzw. dadurch, daß zuweilen in einer T- Zelle zwei funktionelle TCR aufgrund eines insuffizienten allelischen Ausschlusses der einen von zwei genomischen α-Ketten exprimiert werden. Zudem werden im Rahmen einer klinischen Applikation voraussichtlich nicht-klonale T-Zell-Populationen transduziert, so daß hieraus eine Vielzahl denkbarer hybrider TCR auf Populationsebene vorliegen.
Eine solche hybride Form muriner und humaner Ketten ist bisher nicht bewiesen worden, kann aber aufgrund der bisher vorliegenden strukturellen Daten wie TCR-Protein- Kristallstrukturen (Garcia et al., 1998; Ding et al., 1998) nicht ausgeschlossen werden. Zu einer erhöhten Sicherheit bei der Anwendung des adoptiven TCR-Transfers gilt es daher, solche Hybridformen so weit wie möglich auszuschließen. Da die murinen TCR-Ketten weitgehend, zumindest im Bereich der konstanten Domänen, die maßgeblich die Dimerisierung diktieren (Li et al., 1996), humanisiert werden sollen, um Abstoßungsreaktionen gegen diese im Empfänger zu vermeiden, besteht eine Gefahr der Heterodimerisierung solcher chimären Ketten um so mehr. Im Fall eines partiell humanisierten MDM2-spezifιschen TCR gibt es hierfür bereits erste experimentelle Hinweise.
Ein Lösungsweg zur Umgehung der ungewünschten Kettenpaarung ist das Design von Ein- zelketten-T-Zell-Rezeptoren. Dieses scTCR-Konzept dient dazu, ungewünschte Kettenpaarungen von endogenen zu exogenen Ketten zu verhindern. Solche Konstrukte sind gentechnisch beliebig konzipierbar und gewährleisten eine kovalente l:l-Stöchiometrie der hetero- dimeren, variablen Domänen (siehe Figur lb). Das scTCR-Konzept wurde ursprünglich für Antikörper entwickelt (Eshhar et al., 1993; 2001), konnte aber aufgrund der strukturellen Homologien zwischen Antikörpern und T-Zell-Rezeptoren auf letztere übertragen werden. (Chung et al., 1994; Weijtens et al., 1998; Willemsen et al., 2000). Hierbei werden die variablen Domänen über ein kurzes Peptid, einen "Linker", miteinander kovalent unter Wegfall der einen von beiden konstanten Domänen verknüpft. Solche Konstrukte sind gentechnisch beliebig konzipierbar und gewährleisten eine biochemisch gekoppelte 1 : 1 -Stöchiometrie der hete- rodimeren, variablen Domänen. Alternativ werden an die jeweiligen Ketten des heterodimeren Moleküls kurze Peptidsequen- zen als Affinitäts-Anhängsel gentechnisch angefügt, die für eine spezifische Kettenpaarung Sorge tragen-, hierzu wurden T-Zell-Rezeptoren 30 Aminosäure lange, carboxyterminale "tags", ein sogenannter "leucine zipper", als Dimerisierungsmotiv angefügt (Chang et al., 1994). Diese letztgenannten Verfahren haben den Nachteil, aufgrund ihres rekombinanten Charakters potentielle Fremdantigene darzustellen, die zu Abstoßungsreaktionen im Empfängerorganismus führen.
In der Vergangenheit zeigt sich, daß die Stabilität und Funktionalität der scTCR über die Kopplung an die Vollängen ζ-Kette des CD3 -Komplexes erheblich verbessert werden konnte (Chung et al., 1994; Willemsen et al., 2000). Auch Doppelketten-TCR in Fusion zur CD3ζ- Kette werden eingesetzt (Willemsen et al., 2000).
Statt der konstanten TCR-Domäne werden auch invariante Domänen funktionsfremder (Membran-) Proteine verwendet: CH2 / CH3 von Antikörpern, die Transmembrane des Kore- zeptors CD4 (Weijtens et al., 1998), die membranverankernde / signalgebende Domäne des FcεRIγ- (Hombach et al., 2000).
Es wurden bisher zahlreiche Chimäre eines MDM2(81-88)-spezifischen scTCR entwickelt, die sich exprimieren ließen, aber bisher keine Effektorfunktion nach Transfer in humane T- Zellen aufwiesen. Eine Effektorfunktion zeigten bisher nur solche scTCR, die in Fusion zur humanen CD3ζ-Kette konzipiert wurden (Willemsen et al., 2000; Chung et al., 1994). Die CD3ζ-Domäne dient hierbei der Signaltransduktion.
Wesentlicher Nachteil der scTCR-CD3ζ-Konstrukte ist die Notwendigkeit der Kopplung an das eigentlich signalgebende Molekül CD3ζ der T-Zelle. Dies könnte ein Risiko der T-Zell- Aktivierung darstellen, aus der allo-Reaktivitäten (Autoimmun-Reaktionen) entstehen. Zudem ist der chimäre Charakter der scTCR-CD3ζ-Ketten derart erhöht, daß Immunreaktionen gegen das Fremdprotein, insbesondere gegen den Fusionsbereich zur humanen CD3ζ-Kette zu befürchten sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfugung zu stellen, das die Herstellung eines Einzelketten-Antigen-erkennenden rekombinanten genetischen Konstrukts (scARC) mit einer verbesserten Expressionstabilisierung ermöglicht, so daß zum Beispiel bei der Herstellung rekombinanter scTCR nicht gemischte Pärchen mit den endogenen Ketten der T-Zellen ausgebildet werden. Zusätzlich zu der Stabilisierung der Zell- Oberflächenexpression des scTCR sollte eine meßbare - und vor allem spezifische - Effektor- Funktion der humanen T-Zelle erreicht werden. Das Verfahren der Stabilisierung durch die geeignete Koexpression sollte sich zudem auch auf andere Einzelketten-Antigen-erkennende rekombinante genetische Konstrukte anwenden lassen, wie zum Beispiel scFv-Fragmente (Eshhar et al., 1993).
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Einzelketten-Antigen-erkennenden genetischen Konstrukts (scARC) gelöst. Das Verfahren umfaßt die Schritte von: a) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts des scARC, umfassend die Domänen Vι/2-Li-V2/ι-C4/3, b) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende hetero-/(homo-)dimere konstante Domäne C3/4, direktes Einbringen der genetischen Konstrukte über nicht-viralen Gentransfer und/oder indirektes Einbringen der genetischen Konstrukte über viralen Gentransfer der scARC -Fragmente in eine Zelle, d) Koexpression der genetischen Konstrukte der scARC-Fragmente, und e) Präsentation des stabilisierten heterodimeren scARC durch die Zelle (siehe dazu schematisch Figur lc).
Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei der scARC ein Einzelketten-TCR (scTCR) oder ein Antikörper scFv-Fragment ist. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Einzelketten-TCR (scTCR). Das Verfahren umfaßt die Schritte von: a) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend den scTCR mit einer konstanten Domäne, b) zur Verfugung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende hetero-/(homo-)dimere konstante Domäne, c) Einbringen der genetischen Konstrukte der TCR-Fragmente in eine T-Zelle, d) Koexpression der genetischen Konstrukte der TCR-Fragmente, und e) Präsentation des stabilisierten heterodimeren scTCR durch die T-Zelle. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten scFv-Fragments. Das Verfahren umfaßt die Schritte von: a) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend das scFv-Konstrukt mit einer konstanten Domäne, b) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende hetero-/(homo-)dimere konstante Domäne, c) Einbringen der genetischen Konstrukte des scFv-Fragments in eine geeignete humane Zelle, d) Koexpression der geneti- sehen Konstrukte des scFv-Fragments, und e)Produktion des stabilisierten heterodimeren scFv-Fragments durch die Zelle.
Der erfindungsmäßige Ansatz basiert somit auf einer Expressionstabilisierung von Einzelketten-TCR (scTCR) durch die Koexpression der hetero-/(homo-)dimeren konstanten Domäne als Bindungspartner und auf einer Expressionstabilisierung von scFv-Fragmenten durch die Koexpression der hetero-/(homo-)dimeren konstanten Domäne als Bindungspartner.
Es wurde erfindungsgemäß bevorzugt eine Cα-Domäne konzipiert, die mit einem scTCR kotransferiert und somit koexprimiert werden kann. Hiermit sollte eine Stabilisierung der Zell-Oberflächenexpression des scTCR und eine meßbare Effektor-Funktion der humanen T- Zelle erreicht werden. Zusätzlich kann hierdurch eine unerwünschte Paarung mit endogenen Ketten verhindert werden. Nach dem Einschleusen der Kettenkombinationen in humane T- Zellen mußten diese in Hinblick auf ihre strukturelle Avidität, d.h. ihre strukturelle Integrität, als auch in Hinblick auf ihre funktioneile Avidität, d.h. das Aufrechterhalten der Peptid- abhängigen Effektor -Funktion, getestet werden (Bullock et all., 2001). Als Modellsystem dienten die in unserem Labor identifizierten murinen MDM2(81-88)-spezifιschen T-Zell- Rezeptoren. MDM2 ist ein humanes, regulatorisches Proto-Onkoprotein, das die Expression des Tumorsuppressor-Proteins p53 gegenreguliert (Stanislawski & Voss et al., 2001). Die zusätzlich vorhandene, im scTCR jeweils fehlende konstante Domäne, dient der Stabilisierung des Einzelketten-T-Zell-Rezeptors. Mit der Erhöhung der Stabilität ist eine Verbesserung der Expression und der Funktionalität im Kontext der T-Zell-Effektor-Funktion verbunden.
Durch die stabilisierende Wirkung der zusätzlichen konstanten Domäne in Kombination mit einem scTCR ist es gelungen, funktionsfähige chimäre Rezeptoren ohne eine notwendige Fusion zur CD3ζ-Kette, zu entwickeln. Es ist möglich, dieses erfindungsgemäße Konzept allgemein auch auf humanisierte bzw. humane Konstrukte auszuweiten.
Die Kotransduktion mit (z.B.) Cα komplettiert die im Wildtyp-TCR vorhandenen vier ex- tracytosolischen Domänen Cα, Cß, Vα, Vß und verändert ausschließlich die Verknüpfung dieser vier Domänen. Im cytosolischen und transmembranen Bereich als maßgebliche, signalinduzierende Wirkorte ergibt sich somit kein struktureller Unterschied zum heterodimeren Wildtyp-TCR, ganz im Gegensatz zum TCR-CD3ζ-Konzept (Figur lc). Ein analoges Konzept besteht für den Fall der Komplettierung von konstanten Domänen bei scFv- Fragmenten. Zudem wird der Anteil der variablen Domänen der scARC, welcher der Antige- nerkennung dient, durch die koexprimierte Domäne nicht sterisch benachteiligt.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei die Zelle eine Säuger-, insbesondere humane, T-Zelle ist. Weiter bevorzugt wird der scTCR in der Orientierung SP-Vα-Li-Vß-Cß zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cα oder der scTCR in der Orientierung SP-Vß-Li-Vα-Cα zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cß koexprimiert. Diese Paarungen bilden dann optimale stabilisierte und richtig gepaarte scTCR aus. Das Si- gnalpeptid (SP) wird normalerweise im Endoplasmatischen Retikulum (ER) abgespalten, kann aber in artifiziellen Fusionen zum Memebranprotein auch weiterhin existent sein.
Neben dem MHC-restringierten scTCR-Konzept ermöglicht das oben genannte scFv-Konzept die MHC -unabhängige Erkennung von Antigenen: hierbei werden die Antigen-spezifischen variablen Domänen der schweren und leichten Kette eines Antikörpers mittels eines mindestens 14 Aminosäuren langen Linkers verknüpft und üblicherweise über eine "hinge"-Region, die als Abstandshalter zur Zellmembran dient, an membranständige, signalgebende Moleküle der CD3ζ-Kette oder der γ-Kette des Immunglobulin-Rezeptors FcR fusioniert. Als Abstandshalter fungieren die "hinge"-Region von CD8, die "hinge" -Region von IgGl (Eshhar, 1997) bzw. die Immunglobulin-ähnlichen Domänen CH2CH3 von Antikörpern (Weijtens et al., 1998). Das scFv-Konzept impliziert, daß beliebige der oben erwähnten "hinge"-Regionen mit beliebigen der oben zitierten signalgebenden Komponenten chimärisiert werden können und diese mit beliebigen Antigen(Ag)-spezifιschen Einzelketten-Fv-Fragmenten fusioniert werden können. Das hier beschriebene Konzept zur Stabilisierung und Funktionssteigerung von Ein- zelketten-TZR unter Wegfall der signalgebenden Komponente (CD3ζ) mittels der komplementären konstanten Domäne ist auf das scFv-Konzept projezierbar: scFv-Fragmente werden z.B. an die konstante Cß eines beliebigen TZR fusioniert und analog mit einer Cα-Domäne kotransferiert. Auch ist es vorstellbar, die CmCm-Domänen eines Antikörpers zu verwenden, die auf der einen Seite mit dem scFv und auf der anderen Seite mit der membranständigen Domäne eines TCR chimärisiert wurden. Entsprechend wird eine Chimäre aus SP - CH2CH3 - TM(TCR) - Cyt(TCR) hergestellt (Kürzel siehe Erklärung unten), die als komplementäre Domäne mit dem chimären scFv heterodimerisiert (Roberts et al., 1994). Analog den natürlichen Gegebenheiten eines Antikörpers homodimerisieren die CmCi-tf-Domänen unter Ausbildung eines bivalenten Antigen-spezifischen Moleküls. Sowohl CH2CH3-Domänen untereinan- der als auch Cα/Cß-Domänen zwischeneinander bilden stabilisierende Disulfidbrücken aus. Denkbar wäre auch die in den Fab-Fragmenten von Antikörpern liegende CL-Domäne der leichten Kette mit der Cm-Domäne der schweren Kette zu heterodimerisieren.
Diesen beschriebenen konstanten Domänen gemeinsam ist ihre Immunglobulin-ähnliche Faltung und ihre Neigung, sich durch Homo- bzw. Heterodimeriserung zu einer komplementären Domäne zu stabilisieren. Beispielhaft sind folgende TCR-abgeleitete wie auch Antikörperabgeleitete Chimäre vorstellbar:
SP - scTCR[Vα - Li - Vß] - Cß - TM(Cß) - Cyt(Cß) und
SP - Cα - TM(Cα) - Cyt(Cα)
SP - scFv[VL - Li - VH] - Hinge - Cß - TM(Cß) - Cyt(Cß) und
I I I
SP - Cα - TM(Cα) - Cyt(Cα)
SP = Signalpeptid
VL = Fy-Fragment der leichten Kette eines Antikörpers
VH = Fy-Fragment der schweren Kette eines Antikörpers
Hinge = Verknüpfungsregion aus Antikörpern
TM(Cß) = Transmembrane der konstanten Domäne eines ß-Ketten TCR
Cyt(Cß) = Cytoplasmatische Anteil der konstanten Domäne eines ß-Ketten TCR
Die Beschreibung in den eckigen Klammern präzisiert das zuvor benannte Einzelketten(sc)-
Konstrukt. Senkrechte Striche deuten Wechselwirkungen zwischen benachbarten Domänen an.
Die Integration einer aus Antikörpern entnommenen "hinge"-Region gilt nicht notwendig. Das in diesem Absatz beschriebene Konzept läßt die Bedeutung und Notwendigkeit der α-CPM-Domäne der α-Kette eines TCR im Fall der Verwendung von CH2CH3 bzw. CH I oder C unberücksichtigt. Vorstellbar wäre die Integration von CH2CH3 bzw. CH I oder CL anstelle der in oben skizzierten Konstrukten verwendeten Cß bzw. Cα. Die Anordnung der variablen Domänen in den Einzelketten (z.B. Vα-Li-Vß versus Vß-Li-Vα) ist beliebig und diktiert nicht notwendigerweise die Verwendung der sich direkt anschließenden konstanten Domäne (z.B. Vα versus Vß).
Das "T-body"-genannte Konzept umfaßt alle chimären Doppelketten- und Einzelketten- Rezeptoren, die neben dem Membrananker als wesentliches Bestandteil die variablen Domänen Antigen-spezifischer Antikörper (Anti-"body") beinhalten (Eshhar et al; 1993, 1997) und z.B. durch viralen und/oder nicht-viralen Gentransfer in einen Thymozyt ("T"-cell) eingebracht werden.
Durch die Möglichkeit in dem hier vorgestellten, neuen Verfahren auf die signalgebende CD3ζ-Domäne am C-Terminus der scTCR- bzw. scFv-Chimären verzichten zu können, könnten funktioneil andere signalgebende Molelüle wie die der zu der Syk-Familie gehörigen Tyrosinkinasen fusioniert werden (Fitzer- Attas et al., 1998). Hierdurch kann neben dem Erhalt der konformationellen Stabilität zusätzlich eine Optimierung der Signaltransduktion erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der Linker (Li) ausgewählt ist aus Li(Gly4Ser)3, Li218 (Whitlow et al., 1993) und LiSL7 (Robinson et al., 1998). Es können aber auch andere geeignete Linker verwendet werden, da das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die hier genannten Linker beschränkt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für alle Einzelketten-Antigen-erkennenden Konstrukte verwendet werden. Als Antigene kommen alle durch diese Konstrukte erkannten Antigene in Frage, so zum Beispiel Erkrankungs-spezifische Oberflächen-Antigene, wie zum Beispiel TAA oder Infektions-spezifische Oberflächen-Antigene, wie zum Beispiel HIV-spezifische Oberflächen-Antigene oder CMV-spezifische Oberflächen-Antigene. Natürlich können auch weitere eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, in dem die oben genannten Schritte c) und d) durch die folgenden Schritte ersetzt werden: c')/tt v/tro-Translation oder in v/vo-Translation der genetischen Konstrukte aus Schritt a) und/oder b) und gegebenenfalls anschließende Isolierung und/oder Reinigung der solubili- sierten scARC-Fragmente, und d') Rekonstitution der translatierten scARC-Fragmente in eine T-Zelle ("Liposomen- Transfer").
Die Einbringung in die T-Zielzellen kann auf jede bekannte Weise erfolgen, die eine anschließende Expression des stabilisierten scTCR durch die T-Zelle ermöglicht. Wege sind zum Beispiel über die Induktion von Phagocytose durch die Zellen oder ein Verfahren, wobei die Einbringung durch Lipid-vermittelten Transfer, wie zum Beispiel über Micellen oder Li- posomen-Transfer erfolgt. Eine Übersicht über die Verwendung von Liposomen gibt u.a. der Artikel Banerjee R. Liposomes: applications in medicine. J Biomater Appl 2001 Jul;16(l):3- 21. Der Transfer über Mizellen ist dem Fachmann im Stand der Technik aus zahlreichen Publikationen bekannt.
Dabei erfolgt somit eine Expression des z.B. scTCR außerhalb der zuletzt vorgesehenen ex- primierenden T-Zelle und eine anschließende Einbringung des scTCR und der ebenfalls vorhandenen heterologen konstanten Domäne in dieselbe. Bei der in vitro Translation kann die Translation in zellfreien Systemen erfolgen, die käuflich erhältlich sind. Die "Translation" umfaßt aber auch die rein synthetische Herstellung der Peptidketten, die weiter unten im Rahmen der Peptide genauer erläutert wird. Im Falle der in vivo Translation kann diese in einer geeigneten Wirtszelle erfolgen, die vorher mit einem Expressionskonstrukt der Kette transformiert wurde und diese anschließend herstellt. Geeignete Vektoren und Verfahren zur Expression sind dem Fachmann im Stand der Technik ausreichend bekannt. Nach der Expression kann es erforderlich sein, die Expressionsprodukte entweder aus den Zellen zu reinigen oder aus dem Medium zu extrahieren, in das sie gegebenenfalls durch die Wirtszelle sekretiert wurden. Geeignete Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und können Hefe, CHO-Zellen, Insektenzellen, Bakterien oder andere sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können beide scARC-Fragmente auf einem genetischen Konstrukt lokalisiert sein. Dadurch werden der scARC und die heterologe konstante Domäne in der richtigen Stöchiometrie von 1 : 1 exprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können die Bestandteile der scARC -Fragmente aus einem Säugetier stammen, und insbesondere humanen und/oder murinen Ursprungs sein. So können gemäß einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren die zu mutierenden Domänen der scTCR-Ketten ausgewählt sein aus Säugetier-, und dabei insbesondere aus menschlichen und/oder Maus-Domänen. Besonders bevorzugt ist dabei eine scTCR-Kette oder scFv-Fragment, die/das humanisiert ist, was zu u.a. einer verbesserten Verträglichkeit des TCR oder Fragments führt.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als scARC ein humanisierter oder partiell humanisierter scARC, ein mit zusätzlichen (funktioneilen) Domänen versehener scARC oder ein mit alternativen Domänen versehener scARC, z.B mit einer anderen Transmembran-Domäne als Membrananker versehener scARC, verwendet.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß als scTCR ein alpha/beta scTCR, gamma/delta scTCR, einen humanisierten oder partiell humanisierten scTCR, einen mit zusätzlichen (funktioneilen) Domänen versehenen scTCR oder einen mit alternativen Domänen versehenen scTCR, z.B mit einer anderen Transmembran-Domäne als Membrananker versehenen scTCR verwendet. Dabei können als alpha-Kette und beta-Kette die alpha- und beta-Ketten eines MDM2(81-88)-spezifιschen scTCR verwendet werden. Anhand dieses scTCR konnte das erfindungsgemäße Prinzip erstmals erfolgreich angewendet werden.
Bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei als Transfektionssystem ein retroviraler Vektor, insbesondere pBullet verwendet wird. In den Vektoren können auch IRES-Elemente verwendet werden (Jackson et al., Jang et al., 1990).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen stabilisierten scARC, der nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Weiter besonders bevorzugt ist ein erfmdungsgemäß stabilisiertes scARC, der ein TAA-spezifischer scTCR oder ein TAA-spezifischer scFv-ARC ist, insbesondere ein mutierter MDM2(81-88)-spezifischer TCR. Dieser stabilisierte scTCR gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in Form eines Fusionsproteins, umfassend die erfindungsgemäß modifizierten Polypeptide oder Teile davon vorliegen. Das Fusionsprotein kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es die ζ-Region von CD3 oder CD8 oder CD 16 oder Teile davon umfaßt, insbesondere die ζ-Region von humanem CD3 oder CD8 oder CD 16 oder Teile davon. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Fusionsprotein die ζ-Kette des CD3 -Komplexes oder ITAM-Motive der ζ-Kette oder Teile davon umfassen, insbesondere die ζ-Kette von humanem CD3 oder Teile davon. Das Fusionsprotein kann weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, daß es CD8α oder das Lck- Bindungsmotiv von CD8α umfaßt oder Teile davon, insbesondere von humanem CD8α. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure, die eine für eine konstante Domäne SP-Cα oder konstante Domäne SP-Cßl oder SP-Cß2 kodierende Sequenz eines stabilisierten scTCR umfaßt. Diese erfindungs gemäße Nukleinsäure kann eine DNA, RNA, PNA (Peptide nucleic acid) oder p-NA (Pyranosyl nucleic acid), vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA mit einer Länge von mindestens 8 Nukleoti- den, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleoti- den sein. Die Nukleinsäure kann dadurch gekennzeichnet sein, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Sie kann auch in Form ihrer antisense-Sequenz vorliegen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft auch ein DNA- oder RNA- Vektormolekül, das mindestens eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäure(n) umfaßt und das in Zellen exprimierbar ist. Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Konsensus Sequenz (Ko- zak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15:8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt. Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ist die Konstruktion von anti- sense Oligonukleotiden (Zheng und Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100:380-2) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sei. 54:1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15:921-2). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verringern und oder die Translation der erfmdungsgemäßen Nukleinsäure inhibieren. So kann beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Oligonukleotide können sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich beispielsweise auch für Haut, epidermale und dermale Zellen, insbesondere, wenn die antisense Oligonukleotide mit Liposomen komplexiert werden (Smyth et al., 1997, J. In- vest. Dermatol. 108:523-6; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112:699-705). Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.
Neben den aus Zellen isolierten natürliche Nukleinsäuren können alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder deren Teile auch synthetisch hergestellt worden sein. Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584).
Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einfuhrung von einer oder mehrerer Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht- Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht- Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid- Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetami- datbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, adenoviralen Vektors, retroviralen Vektors (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) und/oder gentherapeutisch wirksamen Vektors, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten sein. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor T-Zell-spezifische regulatorische Sequenzen, die funktioneil mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden sind. Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC- Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus- Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40- Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.
Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL 1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin- Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetierzellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expression in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und/oder Repressorsequen- zen. Beispiel für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, CMV-LTR-Hybride, SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV. Ein Beispiel für ein regulierbares Element, das eine regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglicht, ist der Tetracycli- noperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die T-Zell spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in diesen Zelltypen exprimiert werden. Beispiele für regulierbare Elemente, die Zellzyklus-spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6). Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukosemangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zur Transfektion einer Wirtszelle verwendet werden, bei der es sich bevorzugterweise um eine T-Zelle handelt. Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie auf ihrer Oberfläche einen erfindungsgemäß stabilisierten scTCR oder Fusionsprotein oder stabilisiertes scFv-Fragment exprimiert. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids zur Diagnose und/oder Behandlung von mit Onkoproteinen in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure auf geeignete Weise exprimiert wird.
Das Polypeptid wird so beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, In- sektenzellinien, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.
Um die Einführung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transduktion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors oder Partikels vorliegen. Als virale Vektoren oder Partikel eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Retroviren, Adenoviren, adenoas- soziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Träger eignen sich hierbei besonders: Viro- somen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Ade- novirusvektoren oder retrovirale Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al, 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Weijtens et al. "A retroviral vector system ,'STITCH'; in combination with an optimized Single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T-lymphocytes", Gene Therapy (1998) 5,1995-1203).
Ein bevorzugter Mechanismus, erfindungsgemäße Polypeptide in vivo zur Expression zu bringen, ist der virale Gen-Transfer, insbesondere mit Hilfe retroviraler Partikel. Diese werden vorzugsweise genutzt, entsprechende Zielzellen, vorzugsweise T-Lymphozyten, des Patienten ex vivo mit den für erfindungsgemäße Polypeptide kodierenden Genen oder Nukleo- tidsequenzen durch Transduktion zu versehen. Die Zielzellen können daraufhin im Sinne eines adoptiven Zelltransfers wieder in den Patienten reinfundiert werden, um mit der de novo eingefügten Spezifität tumorizide und/oder immunmodulierende Effektorfunktionen zu übernehmen. Jüngst wurden auf diesem Wege sehr gute gentherapeutische Erfolge in der Behandlung der durch Immuninkompetenz gekennzeichneten SCID-Xl- Krankheit bei Neugeborenen erzielt, in dem hämatologische Vorläuferzellen mit einem analogen intakten Transgen einer in den Kindern vorkommenden nicht-funktionellen mutierten Variante des γ- Kettengens, das für die Differenzierung in die verschiedenen Effektorzellen des adaptiven Immunsystems essentiell ist, retroviral versehen wurden (Cavazzana-Calvo et al., 2000).
Weiterhin besteht die Möglichkeit den Gentransfer in vivo durchzuführen, einerseits durch präferentiell stereotaktische Injektion der infektiösen Partikel, andererseits durch direkte Applikation von Viren-produzierenden Zellen (Oldfield, et al. Hum. Gen. Ther., 1993, 4:39-69).
Die zum Transfer von Genen häufig eingesetzten viralen Vektoren sind nach heutigem Stand der Technik vorwiegend retrovirale, lentivirale, adenovirale und adeno-assoziierte virale Vektoren. Diese sind von natürlichen Viren abgeleitete zirkuläre Nukleotidsequenzen, in denen zumindest die viralen Strukturprotein-kodierenden Gene durch das zu transferierende Konstrukt ausgetauscht werden.
Retrovirale Vektorsysteme schaffen die Voraussetzung für eine langanhaltende Expression des Transgens durch die stabile, aber ungerichtete Integration in das Wirtsgenom. Vektoren der jüngeren Generation besitzen keine irrelevanten und potentiell immunogenen Proteine, des weiteren gibt es keine vorbestehende Immunität des Empfängers gegenüber dem Vektor. Retroviren enthalten ein RNA-Genom, das in eine Lipidhülle verpackt ist, die aus Teilen der Wirtszellmembran und Virusproteinen besteht. Zur Expression viraler Gene wird das RNS- Genom revers transkribiert und mit dem Enzym Integrase in die Zielzell-DNS integriert. Diese kann daraufhin von der infizierten Zelle transkribiert und translatiert werden, wodurch virale Bestandteile entstehen, die sich zu Retroviren zusammenfügen. RNS wird ausschließlich dann in die neu entstandenen Viren eingefügt. Das Genom der Retroviren besitzt drei essentielle Gene: gag, das für virale Strukturproteine, sogenannte gruppenspezifische Antigene kodiert, pol für Enzyme wie Reverse Transkriptase und Integrase und env für das Hüllprotein ("envelope"), das für die Bindung des wirtsspezifischen Rezeptors verantwortlich ist. Die Produktion der replikationsinkompetenten Viren findet nach Transfektion in sogenannten Verpackungszelllinien statt, die zusätzlich mit den gag/pol-kodierenden Genen ausgestattet wurden und diese "in trans" exprimieren und somit die Ausbildung replikationsinkompetenter (d.h. gag/pol-deletierter) transgener Viruspartikel komplementieren. Eine Alternative ist die Cotransfektion der essentiellen Virusgene, wobei nur der das Transgen enthaltende Vektor das Verpackungssignal trägt.
Die Separation dieser Gene ermöglicht einerseits die beliebige Kombination des gal/pol- Leserahmens mit aus verschiedenen Stämmen gewonnenen ew-Leserahmen, wodurch Pseu- dotypen mit verändertem Wirtstropismus entstehen, andererseits kann dadurch die Bildung replikationskompetenter Viren innerhalb von Verpackungszellen drastisch reduziert werden. Das aus "gibbon ape leukemia virus" (GALV) abgeleitete Hüllprotein, das im "stitch" bzw. "bullet"- Vektorsystem Verwendung findet, ist in der Lage humane Zellen zu transduzieren und ist in der Verpackungszelllinie PG13 mit amphotropen Wirtsbereich etabliert (Miller et al., 1991). Zusätzlich wird die Sicherheit durch selektive Deletion von nicht-essentiellen Virussequenzen zur Verhinderung einer homologen Rekombination und somit der Produktion replikationskompetenter Partikel erhöht.
Neue, nicht-virale Vektoren bestehen aus autonomen, sich selbst-integrierenden DNS- Sequenzen, den Transposonen, die durch z.B. liposomale Transfektion in die Wirtszelle eingeschleust werden und erstmals erfolgreich zur Expression humaner Transgene in Säugerzellen eingesetzt wurden (Yant et al., 2000).
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfϊn- dungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfekti- onseffizienz, insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Hilfsstoffe, die den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, bevorzugt in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112:775-81).
Für die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA- Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3 '- Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 478-482).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die ein DNA- oder RNA- Vektormolekül gemäß der Erfindung enthält. Diese kann insbesondere eine T-Zelle sein, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einem anderen erfindungsgemäßen Gen- konstrukt transformiert ist. Wirtszellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Wirtszellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.
Ein weiterer Aspekt betrifft somit eine rekombinante T-Zelle, die mindestens einen stabilisierten scTCR gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert. Eine besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine transgene T- Vorläuferzelle oder eine Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt. Verfahren zur Transformation oder Transduktion von Wirtszellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Bei- spiel Elektroporation oder Mikroinjektion. Eine besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine patienteneigene T-Zelle, die nach der Entnahme mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transfiziert wird. Erfindungsgemäße Wirtszellen können insbesondere dadurch erhalten werden, daß dem Patienten eine oder mehrere Zellen, bevorzugterweise T-Zellen, insbesondere CD8+-T-Zellen entnommen werden, die dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen Konstrukten transfiziert oder transduziert werden, um so erfindungsgemäße Wirtszellen zu erhalten. Die ex vivo generierten spezifischen T-Zellen können dann anschließend in den Patienten reimplantiert werden. Das Verfahren ähnelt somit dem bei Darcy et al. ("Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000, 164:3705-3712) beschriebenen Verfahren unter der Verwendung von scFv anti-CEA Rezeptor transduzierten ZTL, Perforin und γ-IFN.
Die erfindungsgemäß modifizierten (Poly)peptide und deren Derivate können zum Beispiel auch zur aktiven und/oder passiven Immunisierung von Patienten mit Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, die zum Beispiel mit MDM2 in Zusammenhang stehen, eingesetzt werden. Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine Verwendung bei der eine Krebserkrankung behandelt wird, insbesondere eine Krebserkrankung, die mit einer veränderten Expression von MDM2 in Zusammenhang steht, um so die Induktion, Erzeugung und Zunahme vom Onkogen-spezifischen, z.B. MDM2- spezifischen ZTL zu erreichen und die Tumor- und Leukämiezellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten. Solche Erkrankungen umfassen zum Beispiel solide Tumorerkrankungen, lymphohämatopoetische Neoplasien, maligne hämatologische Erkrankungen, auch in Form eines multiplen Myeloms (oder Plastozytoms), eines histiozytischen Lymphoms und eines CML-Blastenschubs. Damit zusamenhängende TAAs, gegen die entsprechende TCR entwickelt werden können, sind zum Beispiel p53, Her-2/neu, Ras, Tyrosinase, MART, GplOO, MAGE, BAGE, MUC-1, TRP-1, TRP-2, CD45, CD19 und PRDI-BF1.
Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch eine Zusammensetzung, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzung, die eine rekombinante T- Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung eines stabilisierten scTCR gemäß der vorliegenden Erfindung, eines mutierten TCR gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einer rekombinanten T-Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Therapeutika und/oder Prophylaktika zur Behandlung von Krebserkrankungen. Bei einer besonders bevorzugten Art der Behandlung wird dem Patienten eine oder mehrere Zellen, bevorzugterweise T-Zellen, insbesondere CD8+-T-Zellen entnommen, die dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen Konstrukten transduziert oder transfiziert werden. Die ex vivo generierten spezifischen T-Zellen können dann anschließend in den Patienten re-implantiert werden. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel zur Indikation und Therapie von mit Onkoprotein-Protein assoziierten Erkrankungen, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatzoder Hilfsstoffe enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung von mit Onkoprotein-Protein assoziierten Erkrankungen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird. Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe, rekombinante Partikel oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) das erfindungsgemäße stabilisierte scTCR-Rezeptor Polypeptid und/oder seine Derivate und/oder (b) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten und/oder (c) in vitro oder ex vivo erzeugte T-Lymphozyten, die einen spezifisch mutierten gegen On- koprotein gerichteten scTCR enthalten.
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel und/oder rekombinanter Partikel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.
Es ist denkbar, die Effizienz des Cα/scTCR-Konzeptes weiter durch Chimärisierung an signalgebende Domänen wie CD3ζ oder Tyrosinkinasen zu verbessern (z.B. Cα-ζ/scTCR-ζ). Verschiedene scTCR-Konstrukte, unabhängig ob humanen oder murinen Ursprungs sowie der Natur des Linkers und der gewählten Orientierung der variablen Domänen, werden in diesem Ansatz mitberücksichtigt.
CD3ζ-Ketten besitzen neben ihrer signalgebenden Funktion, das Potential zur Homodimeri- sierung und erleichtern somit die Assoziation einer chimären Cαζ-Kette mit dem chimären scTCRζ (Bolliger, Johannsson, 1999). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, inverse scTCR-Konstrukte der Orientierung SP-Vß-Li-Vα-Cα zu konzipieren, welche anstelle der Cß-Domäne eine Cα-Domäne beinhalten und in Kombination mit einer SP-Cß-Domäne kotransferiert werden (Figur lb). Ferner ist es denkbar, beliebige variable Domänen, von Antikörpern oder T-Zell-Rezeptoren abgeleitet, an beliebige invariante Domänen in ihrer Funktion als a) Abstandshalter zur Transmembranen, b) als Dimerisierungsdomäne, c) als Membrananker und d) als Adapterprotein zur Signalkopplung zu fusionieren (Figur lc). Das vorgestellte Konzept ist zudem Spezies-unabhängig und kann auf humane Moleküle übertragen werden.
Zudem ist es denkbar, daß das scTCR stabilisierende konstante Domänen-Konzept auf Einzelketten- Antikörper (scFv) durch die Koexpression der komplementären CHL- bzw CL-Kette auszudehnen. Das Konzept ist somit generalisiert (Figur lc).
Alle bisher und künftig entwickelten TAA-spezifischen TCR, ob murinen oder auch humanen Ursprungs, die in der adoptiven Immuntherapie durch Gentransfer in humane T-Zellen von Tumorpatienten verwendet werden sollen, können mit geringem Aufwand nach beschriebenem Modell entwickelt werden. Der vorgestellte Ansatz könnte somit eine weite Verbreitung in der klinischen Applikation finden (Bolhuis et al., 1998; Cavazzana-Calvo et al., 2000; Fischer et al., 2002).
Der Begriff "stabilisierter scARC" bezieht sich auf ein stabilisiertes Einzelketten- antigenerkennendes genetisches Konstrukt (scARC), bei dem zusätzlich zu dem herkömmlichen Vι/2-Li-V2/ι-C4/ -sc-Konstrukt eine entsprechende heterodimere konstante Domäne C3/ koexprimiert wird. Bevorzugterweise handelt es sich bei den scARC um stabilisierte Einzelketten-TCR (scTCR) oder stabilisierte Antikörper-scFv-Fragmente, die weiter bevorzugt tu- morassoziierte Peptidantigene (TAA) erkennen. Der Begriff "stabilisierter scTCR" bezieht sich auf die Kombination des jeweiligen scTCR, z.B. in der Orientierung SP-Vα-Li-Vß-Cß zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cα oder des scTCR in der Orientierung SP-Vß-Li- Vα-Cα zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cß. Diese Paarungen bilden dann optimale stabilisierte und richtig gepaarte scTCR aus. Dabei können die stabilisierten scTCR aus der Expression eines oder zweier verschiedener genetischer Konstrukte stammen.
Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Vorläufer kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen am 5' und/oder 3 '-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen Aktivität wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte "funktioneile Varianten" der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Die Erfindung soll nun weiter anhand der beigefügten Beispiele und Figuren erläutert werden, ohne durch diese eingeschränkt zu werden. Es zeigt:
SEQ ID Nr. 1 : die Nukleinsäuresequenz des Konstrukts SP-Cα-Domäne, und SEQ ID Nr. 2: die Aminosäuresequenz des Konstrukts SP-Cα-Domäne.
Figur 1 zeigt eine Darstellung der einzelnen Modellsysteme: a) Schematische Darstellung eines Wildtyp T-Zell-Rezeptor bestehend aus konstanter α- und ß-Domäne, sowie variabler α- und ß-Domäne. b) Einzelketten-TCR in zwei Orientierungen. Die beiden variablen Domänen sind jeweils über einen Linker miteinander verbunden. Die jeweils nicht im scTCR vorhandene konstante Domäne wird koexprimiert und f hrt zu einer Stabilisierung des Konstruktes. c) Generalisierte Darstellung des erfindungsgemäßen stabilisierten scARC -Konzepts. Vι 2 bezeichnet variable Domänen, während C3/4 für invariante Domänen steht. Das Konzept läßt sich sowohl für scTCR als auch scFv-Fragmente verwenden. Figur 2 zeigt eine Superposition des Protein-Rückgrats von Protein-Kristallstrukturen eines murinen H2-Kb-restringierten (ltcr, Garcia et al. 1998) und eines humanen HLA-A2- restringierten (lbd2, Ding et al., 1998) T-Zell-Rezeptors. Der heterodimere humane TCR ist dunkelgrau (in der farbigen Darstellung: rot) (αTCR) und hellgrau (in der farbigen Darstellung: blau) (ßTCR) für die jeweiligen Ketten dargestellt; der murine TCR ohne Farbcodierung für die einzelnen Ketten insgesamt grau.
Figur 3 zeigt eine Darstellung des Protein-Rückgrats von ltcr mit ausschließlich denjenigen Seitenketten, die zu lbd2 identisch sind. Die obere Graphik illustriert das Vorhandensein weniger identischer Reste im Kontaktbereich der variablen Domänen (Vα, Vß) der beiden Ketten. Die untere Graphik ist zur oberen um die Achse in der Papierebene derart gedreht, so dass diese das zahlreiche Vorhandensein identischer Aminosäuren im Kontaktbereich der konstanten Domänen (Cα, Cß) dokumentiert.
Figur 4 zeigt die Aminosäure- bzw. Basensequenz des Konstruktes SP-Cα-Domäne analog zu SEQ ID No. 1. Das Signalpeptid der Vα-Domäne wurde mittels PCR zur konstanten Cα- Domäne fusioniert. Die Basensequenz ist jeweils in die zugehörige Aminosäuresequenz übersetzt und wird im 1 -Buchstaben-Code dargestellt.
Figur 5 zeigt eine FACS-Analyse der humanen transduzierten T-Zellen, die die beschriebenen Konstrukte exprimieren. Dargestellt ist eine 2-fach-Färbung von vbeta6-FITC und CD8-PC5: nur CD8-positive, transduzierte T-Zellen zeigen die gewünschte Effektorfunktion. Die vß6- Anfärbung erbringt den Nachweis der ß-Kette.
Figur 6 zeigt einen Cytotoxizitäts-Test (Stanislawski & Voss et al., 2001) mit den beschriebenen Konstrukten. TAP-defiziente T2 wurden exogen mit den angegebenen MDM2(81-88)- Peptid-Konzentrationen beladen und auf Erkennung durch die transduzierten T-Zellen getestet: das Ausmaß der Lyse spiegelt sich in der Quantität des zellulär aufgenommenen und durch Lyse freigesetzten 51Cr wieder. Als irrelevantes Peptid diente ein p53 -abgeleitetes Peptid. Es sind sowohl die "Effektor: Target" - Verhältnisse, als auch die korrigierten CD8+vß6+- Verhältnisse dargestellt.
Beispiele Die Konzeption der z.B. Cα-Domäne sollte derart erfolgen, daß diese stabil an der Zelloberfläche exprimiert werden kann und zudem durch die Interaktion mit der Cß -Domäne eines scTCR dessen Oberflächenexpression stabilisiert und letztendlich zu einer erleichterten Si- gnaltransduktion und somit Effektorfunktion der humanen T-Zelle führt. Hierzu wird der Cα- Domäne das Signalpeptid der αTCR-Kette vorgeschaltet. Dies dient nur als Beispiel, es können auch andere als die von der αTCR-Kette abgeleiteten Signalpeptide verwendet werden, solange wie die Proteine korrekt post-translational prozessiert werden. Somit besteht das vorhandene Konstrukt aus dem angefügten aminoterminal gelegenen Signalpeptid, der konstanten Domäne mit der sich direkt anschließenden α-CPM, einer transmembranen Region und der carboxyterminal gelegenen cytoplasmatischen Region. Sowohl die DNA-Sequenz des Signalpeptides als auch die der darauf folgenden Cα-Domäne wurden von der DNA-Sequenz des o.g. murinen MDM2(81-88)-spezifischen T-Zell-Rezeptors übernommen. Die entsprechende Fusion zwischen Signalpeptid und Cα-Domäne wurde mit Hilfe einer konventionellen Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) durchgeführt. Hierbei wurde das Signalpeptid mittels des 5'-komplementären Primers eingefügt. Das entstandene PCR-Produkt wurde in den retrovira- len Vektor pBullet Moniert (Willemsen et al., 2000). Das Transfektionssystem (Weijtens et al., 1998), das eine Kotransfektion einzelner Plasmide, jeweils kodierend für einen Einzel- ketten-T-Zell-Rezeptor oder für die Cα-Domäne vorsieht, ermöglichte die Kombination verschiedener Einzelketten-TCR-Konstrukte mit dem Konstrukt der Cα-Domäne in Fusion zum Signalpeptid. Die scTCR sollten für sich sowie in Kombination mit dem beschriebenen SP- Ca-Konstrukt strukturell über FACS-Analyse und funktionell über cytotoxische Lyse von antigenpräsentierenden Zellen (APC) analysiert werden. Die in den humanen T-Zellen vorliegenden endogenen TCR störten hierbei die Analyse der exogen transferierten Konstrukte nicht, da die scTCR eine unerwünschte Paarung mit den endogenen Rezeptoren verhindern und dadurch keine funktionellen, autoreaktiven T-Zell-Rezeptoren gebildet werden. Zudem ist es von Bedeutung, diese Experimente in einem experimentellen "setting" durchzuführen, das möglichst nahe an der klinischen Applikation liegt.
Die variablen Domänen werden hierbei über ein kurzes Peptid, einen "Linker" (Li), unter Wegfall einer von beiden konstanten Domänen, in diesem Modell-System unter Wegfall der Cα-Domäne, kovalent miteinander verknüpft. Um eine stabile Zeil-Oberflächen Expression zu erreichen, werden diese TCR der Orientierung SP-Vα-Li-Vß-Cß zusammen mit der im Konstrukt nicht vorhandenen Cα-Domäne in humane T-Zellen kotransferiert. Dabei bilden jeweils ein Cystein der Cα- bzw. Cß-Domäne eine Disulfidbrücke. Der Ansatz beruht auf der vergleichbaren Struktur und Funktion der Cα-Domäne mit der pTα-Kette. Um eine membranständige Expression der Cα-Domäne zu erreichen, ist diese mit dem Signalpeptid (SP) der αTCR-Kette fusioniert (Figur 4). Dieses wird im Wege der posttranslationalen Modifikation im Endoplas atischen Re iculum (ER) durch Signalpep idasen abgespalten. Das gewählte Signalpeptid besteht aus 21 überwiegend hydrophoben Aminosäuren des scTCR, welches für die membranständige Verankerung im ER und spätere Translokation der T-Zell- Rezeptor-Ketten in der Zellmembran benötigt wird. Des weiteren erfüllt die Cα-Domäne Aufgaben der Signaltransduktion, die nach Antigen-Erkennung in Gang gesetzt wird. Hierbei ist besonders ein konserviertes Motiv innerhalb der CP-Domäne mit folgender Struktur von Bedeutung: FETDxNLN. Dieses Motiv vermittelt einen Signaltransfer zwischen TCR und CD3ζ-Komplex (Bäckström et äl., 1996; Trop et al., 1999).
Um davon auszugehen, daß alle T-Zellen das Transgen beherbergen, wurden nach Transduk- tion die T-Zellen über G418 (Selektionsmarker für die SP-Cα-Domäne, über ein IRES- Element dem Transgen nachgeschaltet), als auch über Puromycin selektiert (Selektionsmarker für die Einzelketten-T-Zell-Rezeptor-Ketten). Somit überlebten nur diejenigen T-Zellen, die sowohl die bicistronische mRNA aus SP-Cα-Domäne und G418-Marker als auch die bici- stronische mRNA aus scTCR-Transgen und Puromycin bildeten. Unterschiede in der FACS- Anfarbung rühren daher nicht von unterschiedlichen Transduktionseffizienzen der humanen T-Zellen her, sondern sind Ausdruck der jeweiligen TCR-Stabilität. Die strukturelle Avidität als Ausdruck stabiler Expression der verschiedenen TCR-Konstrukte wurde über die subfa- milienspezifische Anfärbung der ß-Kette analysiert (vß6-FITC; Figur 5). Es zeichnet sich bereits in der vß6-Anfärbung ab, daß die kotransduzierten T-Zellen (scTCR / Cα) eine deutlich stabilere scTCR-Expression (vß6+) aufweisen, als diejenigen, die lediglich den scTCR exprimieren. Im FACS als auch im Cytotoxizitätstest wurden drei verschiedene scTCR analysiert, die sich jeweils in ihrer Linkersequenz sowie Linkerlänge unterscheiden. Das scTCR- Li218-Konstrukt weist eine Linkerlänge von 18 AS auf (Whitlow et al., 1993), während der Linker von scTCR-LiSL7 aus 19 AS besteht (Robinson et al., 1998). Hinsichtlich der Sequenz läßt sich Linker SL7 mit dem Standardlinker (GGGGS)3 vergleichen, jedoch weist Linker SL7 eine differente Abfolge der Aminosäuren Glycin und Serin auf. Zusätzlich befindet sich an Position 2 die AS Threonin. Für diesen Linker ist eine erhöhte thermodynamische und auch proteolytische Stabilität gegenüber Proteolyse sowie eine verbesserte Expressionseigenschaft im Vergleich zu Standardlinkern beschrieben (Robinson et al., 1998).
Die Lyseeffizienz als Maß der funktionellen Avidität wurde im Chrom-Freisetzungstest oder auch Cytotoxizitätstest gemessen. Hierzu wurde die Zelllinie T2, die nicht in der Lage ist, endogen prozessierte Peptide auf MHC-Moleküle zu laden und diese Komplexe an die Zelloberfläche zu transportieren, exogen mit dem MDM2(81-88)-Peptid konzentrationsabhängig beladen und in einer Peptidtitration die halbmaximalen Lysen als Maß der Erkennung gemessen. Die unterschiedliche vß6- als auch CD8-Positivität der transduzierten T-Zell- Populationen wurde unter Angabe der CD8+vß6+:T - Verhältnis zuzüglich zu den üblichen E:T (Effektor zu Target)-Verhältnissen angegeben: Unterschiede in der Lyseeffizienz sind somit ein Spiegelbild der verschieden kombinierten TCR-Konstrukte unter Korrektur der beiden T-Zell-Phänotyp-Marker als Ausdruck der prozentualen Expressionsstärke des ßTCR (vß6+) und der prozentualen Stärke der cytotoxischen T-Zell-Population (CD8+). Aus den funktionellen Daten konnte abgelesen werden, daß die cotransduzierten humanen T-Zellen, die sowohl ein Einzelketten-TCR-Konstrukt als auch die SP-Cα-Domäne exprimieren, spezi- fische Lyse gegenüber MDM2(81-88) Peptid-beladenen Zielzellen bis zu 10" M aufweisen (Figur 6). Im Vergleich dazu zeigten die transduzierten humanen T-Zellen, die nur ein Einzelketten-TCR-Konstrukt exprimieren, keine nachweisbare Cytotoxizität. Als Kontrollen dienten MDM2(81-88)-spezifιsche-TCR (Mu WT TCR, Positivkontrolle) sowie mit Leervektor (Mock, Negativkontrolle) transduzierte T-Zellen.
Die Daten der strukturellen und funktionellen Avidität sind somit kongruent und belegen die Wirksamkeit der gewählten scTCR-Konstrukte in Kombination zu einer SP-Cα-Domäne. Es wird eine Stabilisierung des Rezeptorkomplexes und daraus resultierende Effektorfunktion erreicht.
Transduktion humaner peripherer Blut Lymphozyten (PBLs)
Zur Transduktion humaner peripherer T-Lymphozyten wurde ein funktionelles Derivat des pStitch-Systems (Weijtens et al., 1999) verwendet. Die zur Verpackung notwendigen retrovi- ralen Gene werden über individuelle Plasmide im Wege einer Cotransfektion der Verpak- kungszellinie 293T kodiert (Soneoka et al., 1995): pHit60 kodiert für die gag-pol - Struktur- und Polymerase - Gene aus dem Moloney murinen Leukämie Virus (MoMuLV), pColt-Galv für das env - Hüllprotein des "gibbon ape leukemia virus", das imstande ist, an den Na+- /Phosphat-Synporter Pit humaner Zellen zu binden und damit letztere zu transduzieren. Die chimären Viruspartikel besitzen somit einen amphotropen Pseudotyp und können verschiedene Säugerzellen, außer Maus, transduzieren.
Transfektion der Verpackungszelllinie 293T
Die isolierten bakteriellen Klone der in das pStitch-Derivat klonierten T-Zell-Rezeptor-Gene wurden über Plasmid-Präparationen, die eine Entfernung residueller Endotoxine versprechen (Qiagen, Produkt 12362), gereinigt und zu 1 μg/μl eingestellt. Die DNS wurde über die Cal- ciumphosphat-Präzipitation transient in die Verpackungszelllinie 293T eingeführt (GiboBRL- Life Technologies, Produkt 18306-019). Hierbei werden im Rahmen der stabilisierten T-Zell- Rezeptoren αTCR und ßTCR bis zu 80 μg DNS eingesetzt:
20 μg αTCR - Konstrukt
20 μg ßTCR - Konstrukt
20 μg pColt-Galv
20 μg pHit 60
Im Fall von Einzelketten-TCRs werden 60 μg DNS eingesetzt. 293 T wurde in einem modifizierten DMEM-Medium (DMEM/H) kultiviert:
DMEM, 4,5% Glucose (BioWhittaker)
10% hitzeinaktiviertes FKS
2mM Glutamin lx Penicillin/Streptomycin lx nicht-essentielle Aminosäuren
25 raM HEPES
Am Vortag der Transfektion wurden die Zellen 293T auf 0,9*106 Zellen pro T25-Flasche und Transfektionsansatz in 5ml DMEM/H ausgesät. 4 h vor Transfektion wurde das Medium gegen frisches, auf Raumtemperatur (RT) erwärmtes DMEM-H (3ml) ersetzt. Die Transfektion erfolgte laut Vorschrift des kommerziellen Protokolls (Invitrogen). 1 ml des Transfektionsan- satzes wurde zu der jeweiligen Flasche unter vorsichtigem Hinzutropfen pipettiert. Das DNS- Ca3(PO )2-Präzipität sollte fein verteilt sich auf den adhärenten Zellen niederlegen. Am darauffolgenden Morgen wurde das Medium gegen frisches, auf RT erwärmtes DMEM/H ausgetauscht. 6 h später erfolgte die Kokultivierung mit den aktivierten PBLs .
Transduktion der aktivierten PBLs - Aktivierung peripherer Blut-Lymphozyten (PBLs)
3 Tage vor der angesetzten Kokultivierung wurden fikollisierte PBLs zu 2* 106 Zellen/ml in huRPMI-P jeweils in 2 ml einer 24 Well-Platte (Zellgewebe-behandelte Oberflächen) ausgesät. Die Aktivierung erfolgte über den kreuz-vernetzenden Antikörper OKT-3 (Orthoclone- Diagnostics) zu 20 ng ml.
huRPMI-P:
RPMI 1640 (2mM Glutamin) ohne Phosphat (Life Tee, 11877-032 ) 10 % humanes, hitzeinaktiviertes AB-Serum (HLA-A2.1 seropositiv) 25 mMHEPES
1 x Penicillin/Streptomycin (Life Tee.) Die Platten wurden in einem Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Kokultivierung
Zur Kokultivierung wurden die aktivierten PBLs aus den jeweiligen Vertiefungen einer 24- Well-Platte vereinigt und gezählt. Adhärente Monozyten wurden verworfen. Die Zellen werden abzentrifugiert (1500 U/min, 5 min, RT) und in einer Konzentration von 2,5* 106 Zellen/ml in frischem huRPMI-P aufgenommen und in den Brutschrank zurückgestellt. Das Medium wurde zuvor zu 400 U/ml IL-2 (Chiron) und 5 μg/ml Polybren (Sigma) eingestellt.
Jeder Transfektionsansatz wurde 6h nach Mediumwechsel nacheinander trypsiniert: hierzu wurde jede T25 mit 3 ml HBSS (Life Technologies) gewaschen, mit 1 ml Trypsin-EDTA (Life Technologies) für maximal 5 Minuten inkubiert, die gelösten Zellen quantitativ aufgenommen und in 4ml vorgelegtes huRPMI-P (RT) unter Rühren getropft. Die 293T Zellen werden mit 2500 Rad bestrahlt. Diese werden abzentrifugiert (1500 U/min, 5 min, RT) und in
4 ml frisches, eingestelltes huRPMI-P, mit 400U/ml IL-2 und 5μg/ml Polybren supplemen- tiert, resuspendiert. Zu dem Ansatz wurde 1 ml der eingestellten PBLs gegeben und der Ansatz (0,5* 106 PBLs/ml) für drei Tage im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert.
Am Tag 3 nach Kokultivierung wurden die suspendierten PBLs abgenommen und in frischem, mit 40 U/ml IL-2 (Chiron) und 2,5 μl CD3/CD28-Beads supplementiertem Medium huRPMTP zu 1*106 Zellen/ml resuspendiert. 3 Tage später erfolgte ein neuerlicher Split in frisches Medium. In diesen 7 Tagen wurde maximal expandiert bis zum Übergang auf T75- Flaschen. Diese Zellen konnten direkt in einer immunologischen Anfärbung (FACS-Analyse) oder in einem klassischen 51 Chrom-Freisetzungstest eingesetzt werden.
Beispiele der FACS-Analyse
Die oben beschriebenen Konstrukte wurden nach retroviraler Transduktion im "fluorescence activated cell sorting" (FACS) analysiert. Hierzu wurden 0,25* 106 Zellen sättigend mit Fluo- rophor-markierten Antikörpern gefärbt: die heterolog exprimierte mutierte ß-Kette wurde mit anti-vß6-FITC (BD) nachgewiesen; die Gesamtheit der CTL über den Marker anti-CD8-PC5 (Coulter-Beckman). Als Negativ-Kontrolle diente eine mit dem leeren pStitch-Derivat trans- duzierte Probe. Die Expression konnte in verschiedenen Donoren HLA-A2 - positiver T- Zellen reproduziert werden.
Cytolytische Aktivität der transduzierten T-Zellen
Die transduzierten T-Zellen wurden in einem klassischen 51 Chrom-Freisetzungstest auf ihre zytotoxische Spezifität hin überprüft. In diesem System wurden Zielzellen radioaktiv durch Inkorporation von 51 Chrom markiert. Erkannten die retroviral modifizierten Effektorzellen die Zielzelle peptidspezifisch, wurden letztere durch die Effektorfunktionen der T-Zelle in die Apoptose getrieben und durch Lyse getötet. Das Ausmaß des freigesetzten Chrom-Nuklids trifft eine Aussage über die Effektivität der Zeil-Erkennung und Lyse. Die Effektivität wurde über einen weiten Bereich des Verhältnisses eingesetzter Effektor-Zellen zu Zielzellen (E:T) getestet. Als Referenz diente ein muriner MDM2-81-88 peptidspezifischer T-Zell-Klon, aus dem T-Zell-Rezeptor-Gene isoliert wurden. Als Zielzelle diente:
T2: humane TAP-defiziente Zelllinie die exogen mit beliebigem Peptid zu beladen war. Das spezifische mutierte Peptid war MDM2-81-88, ein irrelevantes Kontroll-Peptid entstammte p53 (AS 264-272).
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Einzelketten- Antigen-erkennenden genetischen Konstrukts (scARC), umfassend a) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts des scARC, umfassend die Domänen
Figure imgf000035_0001
b) zur Verfügung stellen eines genetischen Konstrukts umfassend die entsprechende hetero- /(homo-)dimere Domäne C3/ , c) direktes Einbringen der genetischen Konstrukte über nicht-viralen Gentransfer und/oder indirektes Einbringen der genetischen Konstrukte über viralen Gentransfer der scARC- Fragmente in eine Zelle, d) Koexpression der genetischen Konstrukte der scARC-Fragmente, und e) Präsentation des stabilisierten heterodimeren scARC durch die Zelle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der scARC ein Einzelketten-TCR (scTCR) oder ein Antikörper scFv-Fragment ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle eine Säuger-, insbesondere humane, T- Zelle ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der scARC in der Orientierung SP- Vα-Linker-Vß-Cß zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cα oder der scARC in der Orientierung SP-Vß-Linker- Vα-Cα zusammen mit der konstanten Domäne SP-Cß koexprimiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Linker (Li) ausgewählt ist aus Li(Gly4Ser)3, Li218 und LiSL7.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Antigen ausgewählt ist aus Er- krankungs-spezifischen Oberflächen-Antigenen, wie zum Beispiel TAA oder Infektionsspezifischen Oberflächen-Antigenen, wie zum Beispiel HIV-spezifischen Oberflächen- Antigenen oder CMV-spezifischen Oberflächen-Antigenen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Schritte c) und d) durch folgende Schritte ersetzt werden: c') In vttro-Translation oder in v/vo-Translation der genetischen Konstrukte aus Schritt a) und/oder b) und gegebenenfalls anschließende Isolierung und/oder Reinigung der solubili- sierten scARC -Fragmente, und d') Rekonstitution der translatierten scARC-Fragmente in eine T-Zelle.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die in vivo Translation in einer Wirtszelle erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei beide scARC-Fragmente auf einem genetischen Konstrukt lokalisiert sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bestandteile der scARC- Fragmente aus einem Säugetier stammen, und insbesondere humanen und/oder murinen Ursprungs sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei dem scARC um einen humanisierten oder partiell humanisierten scARC, einen mit zusätzlichen (funktionellen) Domänen versehenen scARC oder einen mit alternativen Domänen versehenen scARC, z.B mit einer anderen Transmembran-Domäne als Membrananker versehenen scARC handelt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei es sich bei dem scTCR um einen alpha/beta scTCR, gamma/delta scTCR, einen humanisierten oder partiell humanisierten scTCR, einen mit zusätzlichen (funktionellen) Domänen versehenen scTCR oder einen mit alternativen Domänen versehenen scTCR, z.B mit einer anderen Transmembran-Domäne als Membrananker versehenen scTCR handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei als alpha-Kette und beta-Kette die alpha- und beta- Ketten eines MDM2(81-88)-spezifischen TCR verwendet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei als Transfektionssystem ein retroviraler Vektor, insbesondere pBullet verwendet wird.
15. Stabilisierter scARC, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
16. Stabilisierter scTCR nach Anspruch 15, der ein TAA-spezifischer scTCR oder ein TAA- spezifischer scFv-ARC ist.
17. Stabilisierter scTCR nach Anspruch 16, der ein MDM2(81-88)-spezifischer scTCR ist.
18. Isolierte Nukleinsäure, die für eine konstante Domäne SP-Cα insbesondere nach SEQ ID Nr. 1 oder konstante Domäne SP-Cß kodierende Sequenz eines stabilisierten scARC nach einem der Ansprüche 15 bis 17 umfaßt.
19. DNA- oder RNA-Vektormolekül, das mindestens eine oder mehrere Nukleinsäure(n) nach Anspruch 18 umfaßt und das in Zellen exprimierbar ist.
20. Wirtszelle, die ein DNA- oder RNA-Vektormolekül gemäß Anspruch 19 exprimiert oder einen stabilisierten scARC nach einem der Ansprüche 15 bis 17 präsentiert.
21. Rekombinante T-Zelle, die mindestens ein DNA- oder RNA-Vektormolekül gemäß Anspruch 19 exprimiert oder einen stabilisierten scARC nach einem der Ansprüche 15 bis 17 präsentiert.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine rekombinante T-Zelle gemäß Anspruch 21 umfaßt.
23. Verwendung eines stabilisierten scARC nach einem der Ansprüche 15 bis 17 und/oder einer rekombinanten T-Zelle gemäß Anspruch 21 zur Herstellung von Therapeutika und/oder Prophylaktika zur Behandlung von Krebserkrankungen.
24. Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei eine Krebserkrankung behandelt wird, die mit einer veränderten Expression von MDM2, p53, Her-2/neu, Ras, Tyrosinase, MART, GplOO, MAGE, BAGE, MUC-1, TRP-1, TRP-2, CD45, CD 19 oder PRDI-BF1 in Zusammenhang steht.
PCT/EP2003/014565 2002-12-19 2003-12-18 Verfahren zur herstellung eines t-zell-rezeptors (tcr), der aus einem einzelketten-tcr (sctcr) und einer konstanten region eines tcr besteht WO2004056845A2 (de)

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