JP5706225B2 - Ｔ細胞同時刺激シグナル２（ｂ７／ｃｄ２８相互作用）を遮断することによる免疫抑制 - Google Patents

Description

本発明は、異種移植片拒絶の抑制に関する。

（発明の背景）
同種異系の臓器移植の成功は、ここ数十年において確立されているが、ドナー臓器の供給が限定されていることは、多くの患者が、移植される臓器（例えば、腎臓、心臓、または肝臓）を受ける機会がほとんどかまたは全くないことを意味する。これらの人々の非常に多くが、臓器を待っている間に死亡する。１つの潜在的な解決案は、「異種移植」、すなわち、ヒト以外の（「異種」）動物ドナー由来の臓器の使用である。

ブタドナー臓器は、適切な候補であると考えられる。なぜなら、ブタは、解剖学的および生理学的にヒトに類似しており、そして供給が豊富であるからである。しかし、ブタの臓器は、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）と呼ばれる体液性のプロセスによって、血管再生の際に迅速に拒絶される。これは、異種移植片の内皮細胞（ＥＣ）上の抗原を認識し、そしてそれと交差反応する、レシピエント中に天然に存在する抗体によって引き起こされる。この認識は、補体カスケードを誘発し、これは次いで拒絶を導く。

欧州特許第０４９５８５２号（Ｉｍｕｔｒａｎ）は、宿主補体の膜結合調節因子が、臓器レシピエント中の補体の完全な活性化を防止するために、異種移植片上で発現されるべきであることを示唆する。このアプローチは、超急性拒絶を生き延びるように設計された臓器を有するトランスジェニック動物を作製するために開発および応用されている（例えば、参考文献１および２）。

しかし、ＨＡＲを生存する臓器は、遅延型異種移植片拒絶（ＤＸＲ）に供される。これは、レシピエントの炎症性細胞の浸潤および移植片血管の血栓（虚血を導く）によって特徴づけられる。ＷＯ９８／４２８５０は、異種移植片の表面上での凝固インヒビターの発現が、この型の拒絶の血栓症的局面を阻害し得ることを示す。

ＨＡＲおよびＤＸＲの後には、宿主のＴリンパ球媒介応答が続く。Ｔ細胞が異種抗原に対して感作され得る、「直接」および「間接」の２つの経路が存在する。直接経路には、異種のドナー細胞上のＴ細胞とＭＨＣ分子との間の相互作用が含まれる。一方、間接経路には、ＭＨＣクラスＩＩの状況における宿主ＡＰＣによるプロセスされた異種抗原の提示が含まれる。間接Ｔ細胞応答は、同種抗原に対してよりも異種抗原に対してより強力であり（３）、これは、直接経路についての知見（４）とは対照的であり、これは、異種抗原に対する直接および間接のヒトＴ細胞応答の両方が、異種移植が効果的である場合には抑制されなければならないことを示す。

抗異種移植片間接Ｔ細胞応答の抑制は、異種移植の最大の挑戦の１つであるようである（５，６）。持続的な間接的免疫原性に起因する慢性異種移植片拒絶を予防するのに必要とされる免疫抑制のレベルを維持することは、従来の全身的免疫抑制薬物を使用したのでは、感染および新生物形成の危険性が増大するために、実行することができない（例えば、７）。異種移植が臨床的に成功すべき場合、移植片特異的免疫抑制を促進するための方法が、全身性治療の必要性を減少させるために必要となる。

Ｔ細胞活性化は、２つの別々のシグナルを必要とする。シグナル１の送達は、単独で、続く抗原への曝露の後のＩＬ−２を産生することができないとして規定される寛容の状態（「アネルギー」）を誘導する。完全な活性化が生じるためには、その細胞は、シグナル２で同時刺激されなければならない。

インビボで、シグナル１は、ＴＣＲ／ＣＤ４複合体の、同種異系ＭＨＣまたは自己ＭＨＣと複合体化した抗原性ペプチドのいずれかとの相互作用によって提供される；シグナル２は、Ｔ細胞上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＣＤ２８上のＢ７分子（Ｂ７．１およびＢ７．２、それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６としても知られる）間の相互作用によって供給される。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｔ細胞活性化の研究において重要な役割を果たしてきた。シグナル１は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対して指向されるｍＡｂによって供給され得、そしてＣＤ２８に対して指向されるｍＡｂは、シグナル２を提供し得る。実際、Ｔ細胞は、２つの適切なｍＡｂによって、ＡＰＣの非存在下でさえ、活性化され得る。活性化はまた、ｍＡｂを使用して、提供されるというよりもむしろ、防止され得る。シグナル２は、例えば、Ｂ７またはＣＤ２８のいずれかを遮断するｍＡｂを使用して遮断され得る。

シグナル２はまた、ＣＴＬＡ−４（Ｂ７の高親和性リガンド）の改変形態を使用して遮断され得る。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の天然の負の調節因子であり、活性化されたＴ細胞上でのＣＴＬＡ−４に対するＢ７結合は、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用によって提供される同時刺激シグナルをアンタゴナイズする。抗体の定常ドメインに結合したＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインからなるＣＴＬＡ−４の可溶性形態は、Ｔ細胞活性化を遮断するように構築されている（８，９）。これらの分子（「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」または「ＣＴＬＡ４−Ｆｃ」）は、抗Ｂ７抗体に対して類似の様式で振る舞い、そしてインビトロおよびインビボで、Ｂ７の同時刺激機能を予防するため、従って、寛容を促進するために使用されてきた（１０）。

移植片抗原に対するインビボでのＴ細胞感作を防止するためにＢ７／ＣＤ２８相互作用を標的化することは、移植片生存を増強する有効なストラテジーであることが示されている。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを使用して、延長された生存が種々の同種移植片モデルにおいて（例えば、１１）、およびヒト対マウス島異種移植片モデルにおいて（１２）、得られている。異種移植片モデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ投与は、直接反応性Ｔ細胞をアネルギー性にすることによって、異種抗原に対して完全な寛容を引き起こした。

従って、本発明の目的は、異種移植片特異的免疫抑制を促進するための手段を提供することである。特に、本発明の目的は、異種移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を、臓器レシピエントのＴ細胞が臓器に対する免疫応答を高めることを防止することによって阻害することである。より詳細には、この免疫応答を、異種移植された臓器を認識するレシピエントのＴ細胞におけるアネルギーを誘導し、結果として異種移植片特異的Ｔ細胞寛容を生じることによって防止することが目的である。

（発明の説明）
本発明は、異種移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を、レシピエントにおける異種反応性Ｔ細胞の活性化を予防するために、同時刺激シグナル２の送達を遮断することによって阻害するための方法および生物学的試薬を提供する。

これは、図１に示される３つの局面において具体化される。これらの３つの局面は、単独で、または種々の組み合わせで使用され得る。さらに、従来の免疫抑制技術は、本発明の技術とともに使用され得る。

以下は、第８頁から始まる「定義」と題された節と合わせて読まれるべきである。

（第１の局面）
第１の局面において、シグナル２による同時刺激は、臓器レシピエントに、異種ドナー臓器からの可溶性形態のＣＴＬＡ−４を投与することによって防止される。例えば、ブタ臓器（ドナー）がヒト（レシピエント）に移植された場合、可溶性形態のブタＣＴＬＡ−４（以下を参照のこと）が、ヒトに投与される。

ある生物（例えば、ブタ）由来のＣＴＬＡ−４は、別の生物（例えば、ヒト）由来のＢ７に結合し得るが、最も高いアビディティーが、同種異系Ｂ７に対して見出される。従って、ドナー生物由来の可溶性ＣＴＬＡ−４は、レシピエントＢ７（正常細胞上の）およびドナーＢ７（異種移植された細胞上の）の両方に結合し得るが、それは、優先的に異種移植片上のＢ７に結合する。これは、全身性の免疫抑制を導く傾向があるレシピエント生物からのＣＴＬＡ−４の投与とは異なり、異種移植片特異的免疫抑制を生じる。異種ドナー細胞上のＢ７とレシピエントＴ細胞上のＣＤ２８との間の相互作用を遮断することにより、同時刺激シグナル２は、レシピエントのＴ細胞に送達されない。それゆえ、異種反応性レシピエントＴ細胞は、アネルギー性にされる。

従って、本発明は、臓器レシピエントにおける異種移植片寛容を誘導する方法を提供し、この方法は、そのレシピエントに、異種ドナー生物由来の可溶性形態のＣＴＬＡ−４タンパク質を投与する工程を包含する。

可溶性形態のＣＴＬＡ−４は、好ましくは、Ｂ７に結合する能力を維持しているドナー生物由来のＣＴＬＡ−４のフラグメントを含む。このフラグメントは、好ましくは、ＣＴＬＡ−４の完全な細胞外ドメインである。

好ましくは、可溶性タンパク質は、免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、ＩｇＧ１のＣγ１鎖）をさらに含む。好ましくは、これは、この分子のこの部分に対する免疫応答を予防するために、レシピエント生物由来である。

それゆえ、ブタ対ヒト移植のための代表的な実施態様において、可溶性タンパク質は、ヒトＣγ１配列に融合したブタＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを包含し得る。

他の生物由来のＣＴＬＡ−４の可溶性形態は、例えば、参考文献８（ヒトＣＴＬＡ−４／ヒトＩｇγ１定常領域）および９（マウスＣＴＬＡ−４／ヒトＩｇγ１）に記載される。

本発明はまた、臓器レシピエントにおいて異種移植片寛容を誘導するための医薬の調製における異種ＣＴＬＡ−４の可溶性形態の使用を提供する。

タンパク質は、異種移植の前、間、または後に投与され得る。前異種移植投与は、レシピエントが異種細胞への曝露を包含する前移植免疫プログラムを実行しているとき、最も有用である。

ドナー生物がブタの状況において、本発明は、ブタ細胞からクローニングされたＣＴＬＡ−４である、配列番号１として図２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。これは、本発明における使用のためのＣＴＬＡ−４の好ましい形態である。このタンパク質の細胞外ドメインはまた、図２に示される。

本発明はまた、タンパク質配列番号１（またはそのフラグメント）をコードする核酸を提供する。これは、好ましくは、配列番号２として図３に示されるヌクレオチド配列を含む。

さらに、本発明は、本発明の核酸を包含するベクターおよびこのようなベクターで形質転換された細胞を提供する。

（第２の局面）
第２の局面において、シグナル２による同時刺激は、異種ドナー細胞上のＣＴＬＡ−４についてのリガンドを発現することによってアンタゴナイズされる。このリガンドは、レシピエントの活性化されたＴ細胞上のＣＴＬＡ−４に結合し、そしてドナーＢ７とレシピエントＣＤ２８との間の相互作用によって提供される同時刺激シグナルをアンタゴナイズする。これは、異種反応性Ｔ細胞をアネルギー性にする。

従って、本発明は、ＣＴＬＡ−４に結合し得る膜結合タンパク質を提供する。

これは、代表的には、ＣＴＬＡ−４結合領域および膜結合領域を含むキメラタンパク質（すなわち、異なるタンパク質の領域を１つのタンパク質へ組み合わせることによって産生されるタンパク質）である。従って、その最も単純な形態において、タンパク質は、このように、融合タンパク質である。

「膜結合タンパク質」により、タンパク質は、その細胞外ドメインがＣＴＬＡ−４に結合し得るように、細胞膜に結合していることを意味する。そのタンパク質を細胞膜に結合させるために、そのタンパク質は、例えば、膜タンパク質からの膜貫通配列、またはＧＰＩアンカーを含み得る。好ましい膜貫通配列は、ＣＤ４またはＣＤ８の膜貫通配列である。あるいは、そのタンパク質は、それをそのタンパク質自体が細胞膜に挿入されることなしに、膜タンパク質と細胞外で結合するようにする配列を含み得る。

そのタンパク質が、細胞膜に標的化されるように、そのタンパク質がその膜貫通領域（例えば、ＣＤ８細胞質ドメイン）と通常結合する細胞質ドメインを含むこともまた望ましいかもしれない。同様に、そのタンパク質が、ＣＴＬＡ−４結合ドメインが細胞膜から分離するために、細胞膜と直に並列する細胞外配列（例えば、ＣＤ４ドメイン３および４）を含むことは望ましいかもしれない。グリシンリンカーのような合成リンカーは、同じ目的で使用され得る。

タンパク質のＣＴＬＡ−４結合ドメインは、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に対する特異性を有する抗体を含む。これは、好ましくは、１本鎖抗体（ｓＦｖ）である。それは、好ましくは、レシピエント生物のＣＴＬＡ−４に対して特異的である。

従って、代表的な実施態様において、第２の局面のタンパク質は、リンカーを介してＣＤ８の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合した１本鎖抗体を含み得る。

本発明はまた、第２の局面のタンパク質をコードする核酸を提供する。

さらに、本発明は、本発明のその核酸を含むベクター、およびそのベクターで形質転換された細胞を提供する。

本発明はまた、本発明の第２の局面に従う核酸および／またはベクターを包含する送達システム、およびこの材料を標的細胞に送達する手段を提供する。

さらに、本発明は、好ましくは、そのタンパク質が利用可能なＣＴＬＡ−４に結合し得るように、その表面上に第２の局面のタンパク質を発現する細胞を提供する。

細胞がレシピエントＴ細胞に結合し得るように、その細胞はまた、好ましくは、その表面上にＭＨＣ（クラスＩまたはクラスＩＩ）を発現する。従って、適切には、本発明の細胞は、ドナープロフェッショナルＡＰＣである。しかし、抗ＣＴＬＡ−４タンパク質によって提供されるアンタゴニスト的シグナルのために、これらのプロフェッショナルＡＰＣは、Ｂ７ネガティブ細胞として機能的に振る舞う。

本発明はまた、このような細胞を含む生物学的組織を提供する。

本発明はさらに、第２の局面に従う細胞および／または生物学的組織を含む動物を提供する。

本発明はまた、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供し、このプロセスは、その生物学的組織を、それがその細胞の表面上の第２の局面に従う１つ以上のタンパク質を発現するように処理する工程を包含する。

本発明はまた、ドナー動物（例えば、ブタ）から異種レシピエント動物（例えば、ヒト）へ、本発明に従う生物学的組織を移植する工程を包含する移植の方法を提供する。

さらに、本発明の細胞は、前移植投与に適切である。これは、異種移植片自体が移植される前にレシピエントＴ細胞において誘導される寛容をもたらす。このような前移植レジメンにおいて使用される細胞が、好ましくは、ＭＨＣクラスＩＩを発現するのに対し、その細胞はプロフェッショナルＡＰＣである必要はないことが理解される。

さらに、本発明は、医薬として使用するための第２の局面に従うタンパク質または核酸を提供する。

本発明はまた、異種移植片レシピエントまたはドナーへの投与のための処方物の製造における、第２の局面に従うタンパク質、核酸、ベクター、または送達システムの使用を提供する。

（第３の局面）
第３の局面において、シグナル２による同時刺激は、異種ドナー臓器の細胞の表面上で、レシピエント生物ＭＨＣクラスＩＩを発現することによって防止される。例えば、ブタ臓器（ドナー）が、ヒト（レシピエント）に移植される場合、そのブタ臓器は、ヒトＭＨＣクラスＩＩを発現する。

レシピエントＴ細胞の直接的活性化が、例えば、上記の本発明の最初の２つの局面の一方または両方を利用することによって回避される場合でも、間接的活性化は、なお生じ得、レシピエントＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩに対する異種抗原のプロセシングおよび提示を包含する。

レシピエントＭＨＣクラスＩＩを異種ドナーの細胞上に発現することにより、ドナー細胞は、自己ＭＨＣクラスＩＩの状況において異種抗原をレシピエントＴ細胞に提示する。ドナー細胞がＢ７を発現しない場合、またはＢ７が遮断されている場合、異種反応性レシピエントＴ細胞は、同時刺激シグナル２を受けず、そしてそのレシピエントのＡＰＣが異種抗原自体を提示する機会を有する前に、アネルギー性になる。

従って、本発明は、その細胞表面上に、異なる生物のＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞を提供する。好ましくは、これは、その表面上にヒトＭＨＣクラスＩＩを発現するブタ細胞である。

ＭＨＣクラスＩＩは、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲファミリーのものである。

ＭＨＣクラスＩＩは、好ましくは、細胞の表面上に構成的に発現される。

同種異系抗ＭＨＣクラスＩＩ応答を防止するために、ＭＨＣクラスＩＩは、好ましくは、その特定のレシピエントと最大適合性の組織型である。これは、代表的には、例えば、異種ドナー細胞上に発現されるＨＬＡ−ＤＲが、特定のレシピエントのＨＬＡ−ＤＲと整合するはずであることを確実にすることを包含する。

異種抗原が、プロフェッショナルＡＰＣ上に見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子ミラーの溝内に提示することを確実にするために、その細胞は、以下の３つのタンパク質（そのそれぞれが、抗原プロセッシングにおいて重要な役割を有する（不変鎖（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ）、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβ））の１つ以上をまた、発現するはずであることが好ましい。

その細胞は、好ましくは、同時刺激分子（例えば、Ｂ７）をその表面上に発現しない。従って、代表的には、ドナー細胞は、プロフェッショナルＡＰＣではない。しかし、トランスフェクトされた非免疫原性ＡＰＣ（例えば、Ｂ７⁺であり得る、未成熟樹状細胞）であり得る。

本発明はまた、第３の局面に従う細胞を含む生物学的組織を提供する。

本発明はさらに、第３の局面に従う細胞および／または生物学的組織を含む動物を提供する。

本発明はまた、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供し、そのプロセスは、それが異種ＭＨＣクラスＩＩをその細胞の表面上に発現するように、その生物学的組織を処置する工程を包含する。

好ましくは、このプロセスは、異種生物由来の非免疫原性細胞（すなわち、同時刺激シグナルを提供し得ない細胞、例えば、Ｂ７ネガティブ細胞）を単離する工程、およびこれらの細胞をＨＬＡ−ＤＲでトランスフェクトする工程を包含する。ＨＬＡ−ＤＲは、特定のレシピエントに対して好ましい組織型である。さらに、その細胞はまた、効率的な抗原プロセッシングのために必要とされる他のタンパク質でトランスフェクトされ得る。適切な非免疫原性細胞の例には、Ｂ７ネガティブであり、そして同種異系移植の齧歯類モデルにおける寛容を誘導することが示されている腎尿細管上皮細胞が含まれる。

本発明はまた、ドナー動物（例えば、ブタ）から異種レシピエント動物（例えば、ヒト）へ、第３の局面に従う生物学的組織を移植する工程を包含する移植の方法を提供する。

さらに、本発明の細胞は、前移植投与に適切である。これは、異種移植片自体が移植される前にレシピエントＴ細胞において誘導される、寛容をもたらす。

さらに、本発明は、医薬としての使用のための第３の局面に従う細胞を提供する。

本発明はまた、異種移植レシピエントに投与するための処方物の製造における第３の局面に従う細胞または生物学的組織の使用を提供する。

本発明はまた、異種移植ドナーに投与するための処方物の調製における異種ＭＨＣクラスＩＩまたは異種ＭＨＣクラスＩＩをコードする核酸の使用を提供する。

（定義）
上記のように、用語「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれるが、改変された核酸および合成核酸もまた、含まれる。例えば、核酸は、合成（例えば、ＰＮＡ）であり得るか、または改変されたヌクレオチド間連結（例えば、ホスホロチオエート）を有し得る。さらに、その用語は、センスおよびアンチセンス核酸配列の両方、ならびに二本鎖配列を含む。

好ましくは、核酸は、本発明に従うタンパク質の発現を制御するために適切な配列を含む。この発現は、好ましくは、細胞特異的制御、誘導性制御、または時間的制御のように、制御され得る。

上記で使用されるように、用語「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移入し得る分子を意味し、そして多数の適切なベクターが当該分野で公知である。

好ましくは、そのベクターは、トランスジェニック動物の産生について適切である。例えば、トランスジェニックブタの生成のために適切なベクターは、参考文献１３、１４、１５、１６、および１７に記載される。

上記で使用されるように、用語「送達システム」は、遺伝子材料を標的細胞に送達するための手段をいう。

上記の特定のベクターはまた、適切な送達システムとして機能し得る。同様に、特定の送達システムはまた、固有にベクターであり得るが、必ずしもそうであるとは限らない。例えば、ウイルスベクターはまた、送達システムとして機能し得るが、リポソーム送達システムは、ベクターではない。送達システムは、ウイルスであってもよく、またはウイルスでなくてもよい。リポソームのような非ウイルスシステムは、大規模産生の費用、発現の持続性の悪さ、安全性に関する懸念のような、ウイルスベースのシステムに関連するいくつかの困難性を回避する。好ましくは、送達システムは、遺伝子療法において使用するのに適している。多数の適切な送達システムが、当該分野で公知である。

好ましくは、送達システムは、本発明に従う分子が、異種移植のために適切な細胞、または移植されている細胞によって取り込まれるように、標的化される。より好ましくは、送達システムは、これらの細胞に特異的である。例えば、送達システムは、特定の臓器（例えば、心臓または腎臓）、または特定の細胞型（例えば、内皮細胞またはプロフェッショナルＡＰＣ）に標的化され得る。

これを達成するために、その送達システムは、例えば、標的細胞上に見出されるレセプターに標的化されたレセプター媒介送達システムであり得る。例えば、送達システムは、心臓細胞上に見出されるレセプター、好ましくは、心臓細胞上に独占的に見出されるレセプターに標的化され得るか、または内皮細胞上に見出されるレセプター、好ましくは、内皮細胞上に独占的に見出されるレセプターに標的化され得る。

その送達システムは、好ましくは、トランスジェニック動物の作製に適している。例えば、送達システムは、配偶子、接合子、または胚幹細胞に標的化され得る。

本発明のベクターおよび送達システムは、細胞をトランスフェクトして、本発明に従う細胞を生成するために使用され得る。トランスフェクションは、インビボまたはエキソビボで生じ得る。

上記で使用される用語「生物学的組織」には、細胞、組織、および臓器の集団（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が含まれる。従って、その定義には、例えば、線維芽細胞、角膜、神経組織、心臓、肝臓、または腎臓が含まれる。

本発明の第２および第３の局面が「動物」を提供する場合、その動物は、好ましくは、異種移植のための臓器および／または本発明の細胞（例えば、異種移植片レシピエントへの前異種移植片投与のための細胞）の作製に適切である。好ましくは、その動物は哺乳動物であり、そしてより好ましくは、それはトランスジェニックブタまたはトランスジェニックヒツジである。

その動物は、それがトランスジェニック生物学的組織を含む（すなわち、遺伝子治療によって処置される）ように、生存している間に処置され得る。好ましくは、生存動物は、トランスジェニック動物を産生するために、本発明に従うベクターでトランスフェクトされる。例えば、本発明に従うベクターは、異種移植のために適切な生物学的組織を産生するためにブタの心臓に特異的に送達され得る。

あるいは、動物は、トランスジェニック動物として生まれ得る。このようなトランスジェニック動物を作製するための多くの適切なアプローチが、当該分野で公知である（例えば、参考文献１８、１９、２０）。例えば、ＤＮＡのマイクロインジェクションによる接合子または初期胚の直接的操作は、周知であり、胚幹細胞のような多能性の細胞のインビトロ操作も同様である。初期胚のレトロウイルス感染は、種々の種で成功していることが証明されており、そして帯を含まない（ｚｏｎａ−ｆｒｅｅ）卵のアデノウイルス感染が報告されている。ヒツジの核移入による遺伝子導入およびクローニングがまた記載されている（例えば、ＷＯ９７／０７６６８）。

本発明が、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供する場合、その生物学的組織は、インビボまたはエキソビボのいずれかでそのようにされ得る。例えば、動物の臓器は、本発明のベクターでインビボでトランスフェクトされ得るか、または臓器は、移植前にエキソビボでもしくは移植後にインビボでトランスフェクトされ得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） レシピエントにおいて異種反応性Ｔ細胞の活性化を防止するために同時刺激シグナル２の送達を遮断することによって、異種移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害し得る、生物学的試薬。
（項目２） 異種移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害するための方法であって、レシピエントにおける異種反応性Ｔ細胞の活性化を防止するために、同時刺激シグナル２の送達を遮断する工程を包含する、方法。
（項目３） 異種ドナー生物由来の可溶性形態のＣＴＬＡ−４タンパク質を、前記レシピエントに投与することを包含する、請求項２に記載の方法。
（項目４） 前記可溶性タンパク質が、ヒトＣγ１配列に融合したブタＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含む、請求項３に記載の方法。
（項目５） 医薬として使用するための、可溶性形態の異種ＣＴＬＡ−４。
（項目６） 配列番号１のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目７） 請求項６に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目８） 前記試薬が、ＣＴＬＡ−４に結合し得る膜結合タンパク質である、請求項１に記載の生物学的試薬。
（項目９） ＣＴＬＡ−４に特異的な一本鎖抗体を含む、請求項８に記載のタンパク質。
（項目１０） 請求項８または請求項９に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目１１） その表面に請求項８または請求項９に記載のタンパク質を発現する、細胞。
（項目１２） 請求項１１に記載の細胞を含む、生物学的組織。
（項目１３） 請求項１１に記載の細胞および／または請求項１２に記載の生物学的組織を含む、動物。
（項目１４） ドナー動物から異種レシピエント動物へ、請求項１２に記載の生物学的組織を移植する工程を包含する、移植法。
（項目１５） 生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスであって、該生物学的組織が請求項８または請求項９に記載のタンパク質をその細胞表面上に発現するように、該生物学的組織を処置する工程を包含する、プロセス。
（項目１６） 医薬として使用するための、請求項８もしくは請求項９に記載のタンパク質、または請求項１０に記載の核酸。
（項目１７） 異種移植片レシピエントまたはドナーに投与するための処方物の調製における、請求項８もしくは請求項９に記載のタンパク質、または請求項１０に記載の核酸の、使用。
（項目１８） 前記試薬が、異なる生物のＭＨＣクラスＩＩをその表面上に発現する細胞である、請求項１に記載の生物学的試薬。
（項目１９） 前記細胞が、ヒトＭＨＣクラスＩＩをその表面に発現するブタ細胞である、請求項１８に記載の細胞。
（項目２０） 前記細胞が、その表面上にＢ７を発現しない、請求項１８または請求項１９に記載の細胞。
（項目２１） 前記細胞が、トランスフェクトされた未成熟樹状細胞である、請求項１８または請求項１９に記載の細胞。
（項目２２） 請求項１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の細胞を含む、生物学的組織。
（項目２３） 請求項２２に記載の生物学的組織を含む、動物。
（項目２４） ドナー動物から異種レシピエント動物へ、請求項２２に記載の生物学的組織を移植する工程を包含する、移植法。
（項目２５） 生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスであって、該生物学的組織がその細胞の表面上に異種ＭＨＣクラスＩＩを発現するように、該生物学的組織を処置する工程を包含する、プロセス。
（項目２６） 医薬として使用するための、請求項１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２７） 異種移植レシピエントに投与するための処方物の製造における、請求項２２に記載の生物学的組織の使用。
（項目２８） 異種移植ドナーに投与するための処方物の調製における、異種ＭＨＣクラスＩＩまたは異種ＭＨＣクラスＩＩをコードする核酸の、使用。

本発明は、添付の図面を参照して記載される。
図１は、本発明の３つの局面を例示する。「Ｘ」は異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）細胞（または、間接的活性化経路においては、異種抗原（ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎ）提示レシピエントＡＰＣ）を示し、「Ｔ」はレシピエントＴ細胞を示す。実施態様Ｉにおいて、同時刺激シグナル２の送達は、ＣＴＬＡ−４の可溶性形態を用いることによって妨げられる。実施態様ＩＩにおいて、抗ＣＴＬＡ−４を使用して、シグナル２を拮抗する。実施態様ＩＩＩにおいて、ＸはレシピエントＭＨＣ−ＩＩを発現するが、Ｂ７を発現しない。 図２は、ｐＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。以下の接合部を「^*」によって例示する：シグナルペプチド／細胞外ドメイン；細胞外ドメイン／膜貫通ドメイン；膜貫通ドメイン／細胞質ドメイン。ヒト配列とウシ配列とアラインメントもまた示される。ｐＣＴＬＡ４との相同性は以下のとおりである：

図３は、類似のアラインメントを示すが、ヌクレオチドレベルにおいてである。相同性は以下のとおりである：

図３は、類似のアラインメントを示すが、ヌクレオチドレベルにおいてである。相同性は以下のとおりである：

図４は、ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ構築物のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列は、可撓性リンカーＧＧＳＧＧＡＡを示し、これはまた、ｐＣＴＬＡ４ドメインとＩｇＧ１ドメインとの間の接合部を示す。 図５は、ヒトＢ７（下の２つの線）またはブタＢ７（上の２つの線）のいずれかでトランスフェクトしたヒト線維芽細胞に結合するｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白丸および白四角）およびｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白菱形および白三角）のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図６は、ヒトＢ７（白四角および白丸）またはブタＢ７（白菱形および白三角）によって同時刺激した場合の、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白四角および白菱形）と比較した、ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白丸および白三角）による増殖の選択的阻害を示す。 図７は、ＭＨＣ−クラスＩＩを発現するヒト細胞（７Ａ）またはブタ細胞（７Ｂ）を５日間混合した白血球反応における刺激剤として使用した場合の、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白四角）またはｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ（白菱形）によるヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞増殖の阻害を示す。 図８は、抗ヒトＣＴＬＡ−４ ｓＦｖのヌクレオチド配列を示す。 図９は、抗ヒトＣＴＬＡ−４ ｓＦｖの推測タンパク質配列を示す。図９に示したセリン−グリシンリンカーによって重鎖および軽鎖が連結される。 図１０は、４つの抗マウスＣＴＬＡ−４ ｓＦｖのヌクレオチド配列を示す。 図１０は、４つの抗マウスＣＴＬＡ−４ ｓＦｖのヌクレオチド配列を示す。 図１１は、４つの抗マウスＣＴＬＡ−４ ｓＦｖの推測タンパク質配列を示す。図１１に示したセリン−グリシンリンカーによって重鎖および軽鎖が連結される。 図１２は、ＣＴＬＡ−４特異的ｓＦＶの可溶性Ｉｇ融合物をコードする構築物を示す。 図１３は、抗ｈＣＴＬＡ−４ ｓＦｖ（白四角）またはコントロールｓＦｖ（白丸）のいずれかを発現する細胞によるＴ細胞増殖の阻害を示す。 図１４は、抗ＣＴＬＡ−４ ｓＦｖの膜結合形態をコードする構築物を示す。 図１５は、ヒトＣＴＬＡ−４のヌクレオチド配列（Ａ）およびアミノ酸配列（Ｂ）を示す。開始コドンに下線を付す。−２１位では、その配列はＧｅｎＢａｎｋ配列Ｌ１５００６とは異なり、そして１１０位では、その配列はＬ１５００６およびＭ７４３６３の両方と異なる。 図１６は、クローニングしたヒトＣＤ８αの配列を示す。これは、２３１位（Ｔ→Ｇ）、２４４位（Ａ→Ｇ）、２６６位（Ｔ→Ｃ）、および４３７位（Ｔ→Ｃ）においてＧｅｎＢａｎｋ配列と異なる。 図１７は、Ｂ７ネガティブまたはＢ７ポジティブとしてクローンを規定するための、ヒトおよびマウスのＣＴＬＡ４−ＩｇのＩＰＥＣへの結合を示す。 図１８は、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂ Ｌ２４３のトランスフェクト細胞に対する結合を示す。 図１９は、ＨＬＡ−ＤＲ−１でトランスフェクトしたＩＰＥＣに対するヒトＴ細胞による増殖を示す。 図２０は、ＨＬＡ−ＤＲ−１でトランスフェクトした細胞をインキュベーション下２日後の、ヒトＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。Ｘ軸は、増殖アッセイの第２工程において使用した刺激細胞を示す。黒棒は、Ｂ７ポジティブトランスフェクタントでプライムしたＣＤ４ Ｔ細胞での結果を示す；白棒（見るのは困難である）は、Ｂ７ネガティブトランスフェクタントでプライムした後の結果を示す。第１のグラフは、３日で採取した細胞での結果を示す；第２のグラフは、６日目での採取物からの結果を示す。 図２１は、ＩＰＥＣに対して惹起された、ＡＰＣ依存性ＨＬＡ−ＤＲ−１拘束Ｔ細胞株の増殖を示す。刺激剤集団を、Ｘ軸上に示す。

（実施態様の説明）
（可溶性ブタＣＴＬＡ−４）
ブタＣＴＬＡ−４（「ｐＣＴＬＡ４」）を、ＰＨＡ活性化ブタＴ細胞からクローニングした。ＲＮＡを、標準的な技術を用いて調製し、そしてｐＣＴＬＡ−４を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：

得られた７００ｂｐのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を図３に示す。この図はまた、ヒトおよびウシのＣＴＬＡ−４配列との比較を示す。

ｐＣＴＬＡ４の予測したアミノ酸配列を、ヒトおよびウシと比較しながら図２に示す。重要なことは、残基９７における推定アミノ酸の差異であり、この残基はＢ７結合において重要であり、保存されたヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹの一部である。ｐＣＴＬＡ４において、残基９７はロイシンである（ＬＹＰＰＰＹとなる）のに対し、（ロイシンもまた、ウシＣＤ２８において見出さされているが（２１））他の種はメチオニンを有する。この重要なアミノ酸差異は、ｐＣＴＬＡ４のヒトおよびブタＢ７への有利に異なる結合の重要な鍵であると考えられる。

ｐＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを、上記の５’プライマーおよび以下のプライマーを用いて増幅した：

これを４８４位から増幅し、リンカーＧＧＳＧＧＡＡ配列（下線を付した）をコードする１８塩基対のセグメントを導入し、そしてＰｓｔＩ部位（太字）を導入してヒトＩｇＧ１のヒンジ領域へのインフレーム連結を可能にした。得られた５００ｂｐのフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩｇＧ１（ゲノムＤＮＡコードイントロン性配列ならびにＰｓｔＩ／Ｎｏｔ１部位の間のヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および３’非翻訳エキソンを含む）にサブクローニングした。得られた可溶性ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇのアミノ酸配列を図４に示す。

（ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現）
キメラｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ ＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＸＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから遊離させ、そして発現ベクターｐＨＯＯＫ−３^TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。これを使用して、標準的なリン酸カルシウム沈殿を用いてＤＡＰ．３細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトした。Ｇ４１８耐性細胞を、ＣａｐｔｕｒｅＴｅｃ^TMシステムを用いて分離した。これらのトランスフェクト細胞を、組織培養フラスコ中でコンフルエントになるまで増殖させ、コンフルエントになった時点で、培地を交換し、そして細胞を培養物中でさらに３日間維持した。この段階で、培地を採取し、そしてプロテインＧカラムを通して灌流した。ｐＣＴＬＡ−４−Ｉｇを酸性条件下で溶出させた。この溶出したタンパク質の濃度を、ヒトＩｇＧ１に対する抗体および標準的なヒトＩｇＧ１骨髄腫タンパク質を用いるＥＬＩＳＡを用いて計算した。

ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合特徴を、ヒトＢ７−１またはブタＢ７−２のいずれかでトランスフェクトしたヒト線維芽細胞を用いるフローサイトメトリー分析を使用して、ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合特徴と比較した。これらの実験に関して、ブタおよびヒトのＣＴＬＡ４−Ｉｇの濃度は、ＥＬＩＳＡによってアッセイしたとき、等しかった。図５に例示したように、ヒトおよびブタＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ブタＢ７を発現するヒト細胞において類似の結合特徴を有するようであった。しかし、ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇとは異なり、ｐＣＴＬＡ４−ＩｇはヒトＢ７には結合しなかった。このことは、ｐＣＴＬＡ４−ＩｇがブタＢ７に優先的に結合し、そして種特異的試薬として有用であることを意味する。

ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇを使用して、種々の刺激剤に対するヒトＴ細胞増殖応答を阻害した。これらのアッセイにおいて、Ｔ細胞応答の同時刺激は、プロフェッショナルＡＰＣにおいてトランスフェクションまたは天然のいずれかによって発現された、ブタまたはヒトのいずれかのＢ７によって提供された。これらの実験を、図６および７において実証する。

トランスフェクトした線維芽細胞刺激剤（ＨＬＡクラスＩＩおよびヒトＢ７またはブタＢ７のいずれかを発現する）を用いる実験について、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇは全ての増殖応答を阻害した（図６、白四角および白菱形）。対照的に、ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇのみが、刺激剤がブタＢ７を発現した場合の応答を完全に阻害した（白三角）；ヒトＢ７を発現する細胞に対する増殖応答は、最小限に影響されたのみであった（白丸）。

類似の実験において、ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ＭＨＣクラスＩＩおよびヒトＢ７を発現するヒト細胞への増殖応答に対する有意な阻害効果を有しなかったが、ブタ刺激剤に対する応答は阻害した（図７）。

これらの結果は、Ｔ細胞の同時刺激シグナルがブタＢ７によって提供された場合のｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの有効な阻害特性を強調する。同時刺激がヒトＢ７によって媒介される場合にＴ細胞増殖を防止できないことはまた、種特異的作用を実証する。ｐＣＴＡＬ４−Ｉｇは、ブタＢ７に対して種特異的結合を示し、ブタＢ７の機能的効果の阻害を示すが、ヒトＢ７に対しては種特異的結合を示さず、その機能的効果の阻害も示さないと、結論付け得る。

（ｐＣＴＬＡ−４−Ｉｇの特性）
ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇのヒトおよびブタの両方のＢ７ファミリー分子に対する結合特徴は、例えば、以下の試験を用いて、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合特徴と比較され得る：
（ｉ）ブタおよびヒトのＡＰＣに対する結合、およびブタまたはヒトのＢ７を発現するトランスフェクタントに対する結合のフローサイトメトリー分析（上記を参照のこと）
（ｉｉ）Ｂｉａｃｏｒｅ^TMを用いる結合の定量的特徴づけ
（ｉｉｉ）ヒト抗ブタおよびヒト同種異系混合したリンパ球培養物に対するＣＴＬＡ４−Ｉｇの効果の機能的分析
（ｉｖ）ｐＣＴＬＡ４−ＩｇのＢ６マウスへの移植後のブタ島異種移植生存を延長する能力の機能的評価。

（ＣＴＬＡ−４に結合する膜結合型タンパク質）
１０¹²の半合成可変配列を含むファージディスプレイライブラリーを、ヒトまたはマウスのＣＴＬＡ４−ＩｇおよびコントロールヒトＩｇＧ１骨髄腫タンパク質を用いてスクリーニングした。４回のスクリーニング後にヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質への差示的な結合を提示するファージからｓＦｖを単離し、そして標準的な技術を用いて精製した。そのヌクレオチド配列および推測したアミノ酸配列を、図８、９、１０、および１１に示す。

ｓＦｖを、ヌクレオチド配列に基づく特異的プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。プライマーの遠位部分は、ｐＨＯＯＫ１内の配列に基づいた。５’プライマーはＡｐａＩ部位を含み、そして３’プライマーはＳａｌＩ部位を含んだ。これらは両方とも、独特であると予測された。得られたｓＦｖを、配列決定のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングして、忠実な増幅を決定した。次いでＡｐａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＨＯＯＫ１にサブクローニングした。ここでは、ＡｐａＩ／ＳａｌＩフラグメントは、上流ではマウスＩｇκ鎖からのインフレームのシグナル配列および血球凝集素Ａエピトープ配列に、そして下流では２つのインフレームのｍｙｃ配列およびＰＤＧＦレセプターからの膜貫通配列に隣接する。

ｐＨＯＯＫ１からのｍｙｃ配列を、ＮｏｔＩ部位（下線を付した）を含む以下の５’プライマー：

およびＰｓｔＩ部位（下線を付した）を導入した以下の３’プライマー：

を用いてＰＣＲにより増幅した。得られた１１３塩基対のフラグメントを、ＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。

ｓＦｖを、ｐＨＯＯＫ１からＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして遊離させ、そしてＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩｇＧ１に、ＮｏｔＩ／ＰｓｔＩ ＰＣＲ産物とともに連結した（図１２）。この構築物は、ＣＴＬＡ−４特異的ｓＦｖの可溶性Ｉｇ融合物をコードする。真核生物細胞における発現のために、この構築物を、ｐＨＯＯＫ３にＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＸＩフラグメントとしてサブクローニングした。

ｓＦｖの細胞表面発現を確認するために、ｐＨＯＯＫ構築物を、既にＨＬＡ−ＤＲ分子およびヒトＢ７を発現している細胞にトランスフェクトした。Ｇ４１８またはミコフェノール酸（使用したベクターに依存する）に耐性である細胞を、培養において増殖させた。その細胞表面上で抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖ構築物を発現する細胞を、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇを使用してフローサイトメトリー分析によって同定した。これらの細胞を、限定希釈によってクローニングし、そして５日間の培養におけるＴ細胞の増殖の刺激剤として使用した。１つの実験の結果を図１３に示す。抗ｈＣＴＬＡ４ ｓＦｖを発現する細胞は、Ｔ細胞増殖を刺激しないが（白四角）、一方コントロールｓＦｖを発現する細胞は、正常細胞と同じ方法で増殖を刺激した（白丸）。

異なる実験において、図１２に示した構築物のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｈＣＤ８由来のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した）とともに、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに同時連結した（図１４）。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、発現ベクターｐＨβＡｐｒ−１−ｎｅｏまたはシスターベクターｐＨβＡｐｒ−１−ｇｐｔにサブクローニングした。これらを、既にＨＬＡ−ＤＲ分子およびＢ７を発現している細胞にトランスフェクトし、そしてｐＨＯＯＫ構築物について上記のように選択した。

（膜結合型ＣＴＬＡ−４構築物）
活性化Ｔ細胞によるＣＴＬＡ−４の発現は、一過性であるのみであり、それゆえ、抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖの機能的特徴を試験するために、ヒトまたはマウスのＣＴＬＡ４の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列、ならびにヒトＣＤ８の膜貫通／細胞質配列を含むキメラ構築物を作製した。これらの構築物を発現する細胞を、抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖタンパク質の研究のために使用し得る。

ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞由来のＲＮＡを、標準的な技術を用いて調製した。ｈＣＴＬＡ４を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する（５’プライマー）

ＥｃｏＲＩ部位を導入する（３’プライマー）

得られたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を、図１５に示す。これは、ヒトＣＴＬＡ−４についてのＧｅｎＢａｎｋリスト配列とは１つの塩基（４３９位）が異なる。ｈＣＴＬＡ４の推定アミノ酸配列もまた示す。

ｈＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを、上記の５’プライマーおよび以下のプライマーを用いて増幅した：

これは、４５７位から増幅され、そして可撓性ＧＧＳＧＧアミノ酸リンカーをコードする１５塩基のセグメント（下線を付した）を、独特のＳａｌＩ部位（強調表示）とともに含んでいだ。得られたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、そして配列決定した。

ｈＣＤ８を、得られたＴ細胞から以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する（５’プライマー）

ＥｃｏＲＩ部位を導入する（３’プライマー）

得られたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なＴ３プライマーおよびＴ７プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を、図１６に示す。このクローンは、ＧｅｎＢａｎｋに登録された配列とは４つの位置で異なっていたが、これらはいずれも、続いて増幅した領域内では存在しなかった。

ｈＣＤ８の膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（Ｃ）ドメインを、上記の３’プライマーおよび以下の５’プライマーを用いて増幅した：

これは、５３２位から増幅され、そして可撓性ＧＧＳＧＧアミノ酸リンカーをコードする１５塩基のセグメント（下線を付した）を、独特のＳａｌＩ部位（強調表示）とともに含んでいた。得られたフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｈＣＤ８と称した。

ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして切り出し、そしてＣＤ８のＴＭ−ＩＣドメインを、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出した。これらをともに、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに再び連結した。次いで、全ＣＴＬＡ−４−ＣＤ８キメラを単一のＥｃｏＲＩフラグメントとして取り出し、そしてヒトＴ細胞白血病株Ｊ６への発現のための多数の発現ベクターにサブクローニングした。

（細胞表面抗ＣＴＬＡ４タンパク質の特性）
細胞表面抗ＣＴＬＡ−４タンパク質は、以下の機能性試験によってさらに特徴付けられ得る：
（ｉ）膜結合抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖ−ＣＤ８タンパク質を発現する細胞と、可溶性ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する細胞との間の相互作用のフローサイトメトリー評価
（ｉｉ）Ｂｉａｃｏｒｅ^TMを用いる、可溶性抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖ−Ｉｇ融合タンパク質と可溶性ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇとの間の相互作用の定量的評価
（ｉｉｉ）抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖ−ＣＤ８融合タンパク質を発現するＪ６トランスフェクタントへの可溶性ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合から生じるシグナル伝達事象についての分析
（ｉｖ）同種異系混合リンパ球応答における刺激が、ＨＬＡ−ＤＲポジティブ、Ｂ７ポジティブ、抗ＣＴＬＡ４−ｓＦｖ−ＣＤ８ポジティブ細胞株によって提供される場合のＴ細胞応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、アネルギー誘導）の分析。

（マウスＭＨＣクラスＩＩを発現するＢ７ネガティブブタ細胞）
５０のクローニングした不死化した大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を、ＰＡＥＣの単層から、ｐＺｉｐＳＶＵ１９ ＤＮＡ（２２）を用いる核内マイクロインジェクションにより生成した。不死化細胞（ＩＰＥＣ）から、Ｂ７ネガティブクローンを、ｈＣＴＬＡ４−ＩｇおよびｍＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いてフローサイトメトリースクリーニングによって同定した（図１７を参照のこと）。次いで、これらを、プラスミド発現ベクターｐｃＥｘＶ１−ｇｐｔおよびｐＨβＡｐｒ−１ｎｅｏ中のＨＬＡ−ＤＲＡおよびＤＲＢ１^*０１０１をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして細胞を、ＭＸＨおよびＧ４１８での選択下に置いた。比較のために、Ｂ７−ポジティブＩＰＥＣコントロールを同様に生成した（４）。

マウスＭＨＣクラスＩＩ分子Ｉ−Ａ^bを発現するＩＰＥＣトランスフェクタントの別のシリーズもまた、マウスにおける実験のために生成した。

トランスフェクトＩＰＥＣ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩの表面発現を、モノクローナル抗体Ｌ２４３（ＨＬＡ−ＤＲに特異的）（図１８）またはＭ５−１１４（マウスＭＨＣクラスＩＩに特異的）を用いて検出した。ＭＨＣクラスＩＩポジティブ細胞は、限界希釈によるクローニングの前に数回の蛍光活性化細胞ソーティングを受けた。

トランスフェクタントの第２のバッチを、発現ベクターｐＣＭＵ中のＨＬＡ−ＤＭＡおよびＨＬＡ−ＤＭＢおよびｐ３１Ｉｉ（不変鎖）をコードするさらなるトランスフェクトｃＤＮＡを用いて正確に同じ方法で調製した。

（ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞による同種異系Ｔ細胞におけるアネルギー誘導）
ヒトＴ細胞を、標準的なプロトコルを使用して精製した（３）。一次増幅アッセイのために、ガラス繊維フィルターへの採取の１６時間前に１マイクロＣｉ³Ｈ−チミジンの添加の前に、Ｔ細胞を、一定数の照射した刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）とともに５日間インキュベートした。このフィルターを、シンチレーションカウンターにおいて読み取った。

Ｂ７ポジティブＩＰＥＣは、有意な抗ＤＲ１特異的増殖応答を生じ、一方Ｂ７ネガティブＩＰＥＣは任意の増殖応答を開始しなかった（図１９）。

２工程のアネルギー誘導アッセイを、標準的なプロトコルによって確立した（２３）。一次寛容性誘導工程において、Ｂ７ポジティブＩＰＥＣとともにインキュベートしたＴ細胞を、プライムされた二次免疫応答（３日で最大）の動力学を用いる二次工程における抗ＤＲ１増殖応答をマウントした。しかし、一次工程においてＢ７ネガティブＩＰＥＣとともにインキュベートしたＴ細胞は、ＤＲ１に対して寛容になり、そしてＢ７ポジティブＩＰＥＣにおいて発現されたＤＲ１に対する続く曝露の際に、応答をマウントしなかった（図２０）。

（ＤＲ１を発現するブタ細胞によるＤＲ１拘束Ｔ細胞におけるアネルギー誘導）
ＤＲ１を発現する個体由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞を、標準的な手順に従って精製した。一次増殖アッセイにおいて、それらは、ＨＬＡ−ＤＲ１でトランスフェクトしたＢ７ポジティブＩＰＥＣに増殖した。このことは、ＤＲ１が、ブタペプチド特異的Ｔ細胞についての制限エレメントとして機能し得ることを示す。Ｂ７ポジティブおよびＢ７ネガティブＤＲ１＋トランスフェクタントに対する増殖応答を比較するアッセイを行っている。

２工程のアネルギー導入アッセイもまた、ＤＲ１でトランスフェクトしたＢ７ネガティブブタ細胞がＨＬＡ−ＤＲ拘束ヒトＴ細胞においてアネルギーを誘導することを実証するために行い得る。

（ＨＬＡ−ＤＲにおける提示についてのプロフェッショナルヒトＡＰＣによってプロセスされたブタペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲでトランスフェクトしたＩＰＥＣのＭＨＣクラスＩＩにおいて提示されるものとの間の重複）
野生型ＩＰＥＣに対するヒトＴ細胞株を、ヒトＰＢＭＣから得た。この株の増殖応答は、ヒトＡＰＣの存在に依存し、そしてＨＬＡ−ＤＲに対する抗体によって阻害可能であり、これらのことは、この株が、ヒトＡＰＣによって提示される、プロセスされたブタ異種抗原（ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎ）に対する間接的な特異性を有した。

少なくともいくつかのプロセスされたブタペプチドがプロフェッショナルヒトＡＰＣによって間接的に提示されることを意味する、Ｂ７ポジティブＨＬＡ−ＤＲ１でトランスフェクトされたＩＰＥＣに対して増殖したこの株（図２１）もまた、トランスフェクトされたブタ細胞によって提示された。

（ブタ島対マウスモデルにおける研究）
インビボでは、ブタ膵島細胞は、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）処置した糖尿病マウスの腎臓被膜下に移植され得る。島異種移植片（非血管性である）は、Ｔ細胞によって単に拒絶される。ブタ島を、末梢麻酔下でブタの膵臓から調製し、そしてレシピエントにおけるその生存を、正常血糖値の維持によって評価する。マウスに、ブタ島の移植前に、Ｂ７ネガティブのＩ−Ａ^bを発現するＩＰＥＣを静脈内注射する。このストラテジーを、本発明の他の局面と組み合わせて、Ｔ細胞認識の直接経路を寛容化し、直接経路を介する拒絶が生じないことを確実にする。特定のストラテジーが特異的Ｔ細胞寛容性を誘導したか否かを評価するために、島保有腎臓の腎摘出を、同一のブタ島または第三者のブタ島の再移植の前に行う（生存する腎臓の被膜下）。

本発明は、例示のみのために上に記載され、そして本発明の範囲および精神内に残る間は改変がなされ得ることが理解される。

（参考文献（その内容を完全に援用する）

Claims (29)

1. 免疫グロブリンに融合された、配列番号１のアミノ酸配列を含む、単離されたブタＣＴＬＡ−４タンパク質。
2. 前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記ヒト免疫グロブリンが免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である、請求項２に記載のタンパク質。
4. 前記免疫グロブリンγがヒトＣγ１サブタイプの定常領域を含む、請求項３に記載のタンパク質。
5. リンカーが前記ブタＣＴＬＡ−４を前記免疫グロブリンに接続する、請求項１に記載のタンパク質。
6. 前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＳＧＧＡＡを含む、請求項５に記載のタンパク質。
7. 免疫グロブリンに融合された、配列番号１のアミノ酸配列番号３８〜１６１を含むブタＣＴＬＡ−４タンパク質の単離された細胞外ドメイン。
8. 前記免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項７に記載のタンパク質。
9. 前記ヒト免疫グロブリンが免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である、請求項８に記載のタンパク質。
10. 前記免疫グロブリンγがヒトＣγ１サブタイプの定常領域を含む、請求項９に記載のタンパク質。
11. リンカーが前記ブタＣＴＬＡ−４を前記免疫グロブリンに接続する、請求項７に記載のタンパク質。
12. 前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＳＧＧＡＡを含む、請求項１１に記載のタンパク質。
13. 前記タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のタンパク質。
14. 可溶性形態の、請求項１または８のいずれかに記載のタンパク質。
15. 配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；またはＢ７に結合する能力を維持するそのフラグメントであって、該タンパク質またはそのフラグメントは、免疫グロブリンに融合されている、タンパク質またはそのフラグメント。
16. ブタＣＴＬＡ−４タンパク質またはそのフラグメントをコードする単離された核酸であって、該ＣＴＬＡ−４タンパク質は、請求項１に記載のタンパク質の細胞外ドメインを含む、核酸。
17. 前記タンパク質が、ヒトＣγ１配列に融合されたブタＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含む、請求項１６に記載の核酸。
18. 前記タンパク質が配列番号１を含む、請求項１７に記載の核酸。
19. 請求項１または１５に記載のタンパク質をコードする核酸。
20. 配列番号２を含む核酸。
21. 請求項１６、１８、１９または２０のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
22. 請求項２１に記載のベクターで形質転換された非ヒト細胞。
23. 医薬として使用するための、請求項１に記載のタンパク質または請求項１６もしくは１９に記載の核酸。
24. レシピエント生物による移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害するための医薬の製造における、請求項１６または１９に記載の核酸の使用。
25. レシピエント生物による移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害するための医薬の製造における、請求項１に記載のタンパク質の使用。
26. 前記レシピエント生物がヒトである、請求項２４または２５に記載の使用。
27. レシピエント生物による移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害するための、請求項１６または１９に記載の核酸を含む組成物。
28. レシピエント生物による移植された臓器のＴ細胞媒介拒絶を阻害するための、請求項１に記載のタンパク質を含む組成物。
29. 前記レシピエント生物がヒトである、請求項２７または２８に記載の組成物。
    

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